CN101144818B - 检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其酶联免疫试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其专用酶联免疫试剂盒。该试剂盒，包括猪瘟病毒抗原和酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体；所述猪瘟病毒抗原为含有一个或一个以上的序列1所述氨基酸残基序列的多肽。本发明的猪瘟病毒特异性抗体的检测试剂，可以通过固相抗原竞争酶联免疫法(阻断法)对猪瘟病毒特异性抗体进行有效的检测；所选用的猪瘟病毒毒株特有的B细胞表位保证了鉴别诊断，而该表位在各毒株间的高度保守性又保证了检测的特异性。

Description

检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其酶联免疫试剂盒 

技术领域

本发明涉及一种检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其专用酶联免疫试剂盒。 

背景技术

猪瘟是由猪瘟病毒引起的一种高度传染性、高致病性和高致死性的烈性动物疫病，对养猪业危害巨大，是世界动物卫生组织确定的法定报告的烈性传染病之一，也是我国确定的一类动物疫病之一。一直以来，我国对于猪瘟疫情所采取的措施是“防制”。防，就是通过免疫的方式，用减毒活疫苗(猪瘟兔化弱毒疫苗)进行预防接种；制，就是对疫情进行控制，进行监测、隔离，甚至是局部的“扑杀”。在猪瘟的防制工作中，监测和检测猪血清中猪瘟病毒特异性抗体的水平是非常重要的一个环节。对于尚未接种的猪只，血清中的猪瘟病毒特异性抗体既可能反映了母源抗体的影响，也可能反映了隐性感染的迹象。母源抗体含量在一定水平之上和隐性感染的存在都会影响到减毒活疫苗接种的效果，甚至可能使疫苗无效，无法产生对病毒的免疫防护，导致免疫失败。对于已经接种的猪只，血清中的猪瘟病毒特异性抗体的水平则反映了免疫的效果。 

由于猪瘟病毒和同属的牛病毒性腹泻病毒以及羊边界病毒，在抗原结构上有共同抗原决定簇，因此，由这三种病毒制备的抗血清具有较强的交叉反应；牛病毒性腹泻病毒和羊边界病毒也可以感染猪只。另一方面，猪瘟病毒的各个毒株虽然同属于一个血清型，但在毒力、致病性和抗原性等生物学特性上存在着复杂性、多样性和可变性，国内外制备的猪瘟病毒特异性单克隆抗体中，能广泛识别多个毒株的，屈指可数。猪瘟病毒的血清学诊断是一项极为重要而细致的工作，既需要对毒种有“特异”的鉴别诊断作用，又需要能广泛识别猪瘟病毒的不同毒株的广谱作用。在诊断方法和诊断试剂的生产工艺上，还需要快速、简便、实用和降低生产成本，以适应于田间大规模推广。 

发明内容

本发明的目的是提供一种检测猪瘟病毒特异性抗体的方法及其专用酶联免疫试剂盒。 

本发明所提供的检测猪瘟病毒特异性抗体的酶联免疫试剂盒，包括猪瘟病毒抗原多肽和酶标猪瘟病毒特异性抗体；所述猪瘟病毒抗原为含有一个或一个以上的序列1所述氨基酸残基序列的多肽。 

所述试剂盒还包括酶标板、阳性血清对照、阴性血清对照、显色剂、洗涤液、终止液。 

所述酶标猪瘟病毒特异性抗体为辣根过氧化酶标记猪瘟病毒特异性抗体；所述猪瘟病毒特异性抗体是以猪瘟病毒为免疫原得到的多克隆抗体，用偶联有上述猪瘟病毒抗原的免疫亲和层析柱经层析纯化后得到的针对具有序列1所述的氨基酸残基序列的猪瘟病毒表位抗原的猪瘟病毒特异性抗体。 

所述猪瘟病毒优选为猪瘟病毒兔化弱毒。 

所述猪瘟病毒抗原多肽是以PBS为溶剂的猪瘟病毒抗原溶液，在包被酶标板时用0.1M，pH9.6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；所述酶标猪瘟病毒特异性抗体是以PBS为溶剂的酶标猪瘟病毒特异性抗体溶液。 

所述阳性血清对照为猪瘟病毒兔高免血清；所述阴性血清对照为未感染过猪瘟病毒的健康兔血清。 

所述洗涤液为含有体积百分含量为0.05％的Tween-20的PBS缓冲液；所述终止液为2mol/L硫酸溶液；所述封闭液为含有质量百分含量为0.25％的明胶的PBS溶液。 

所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为含有1mg/ml OPDpH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，显色液B为过氧化氢。 

本发明所提供的检测猪瘟病毒特异性抗体的方法，是利用上述的酶联免疫试剂盒，用固相抗原竞争酶联免疫法(又称“阻断法”)检测猪瘟病毒特异性抗体。 

本发明的猪瘟病毒特异性抗体的检测试剂，主要成分是针对猪瘟病毒结构蛋白E2上一个高度保守表位(TAVSPTTLR)的特异性抗体和含有该表位的抗原多肽。实验证明利用表位合成肽作为抗原包被，并配以酶标TAVSPTTLR表位特异性的血清抗体(从兔高免血清中纯化)，可以通过固相抗原竞争酶联免疫法(阻断法)对猪瘟病毒特异性抗体进行有效的检测；猪瘟病毒毒种特有的该B细胞表位保证了鉴别诊断，而该表位在各毒株间的高度保守性又保证了检测的特异性。 

附图说明

图1为抗原在工作浓度的确定结果 

图2为本发明的试剂盒对含有猪瘟病毒抗体的猪血清进行检测的结果 

具体实施方式

下述实施例的方法，如无特别说明，均为常规方法； 

下述实施例中所述的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。 

实施例1、检测猪瘟病毒特异性抗体的酶联免疫试剂盒的制备 

本发明的检测猪瘟病毒特异性抗体的酶联免疫试剂盒，包括下述试剂： 

1)酶标猪瘟病毒单表位特异性的抗体工作液； 

2)包被用猪瘟病毒抗原工作液：含有氨基酸残基序列为序列1所示序列的表位的多肽溶液；10μg/ml，溶剂为包被缓冲液，即0.1M，pH9.6碳酸氢钠缓冲液； 

3)酶标板 

4)阳性血清对照：猪瘟病毒兔高免血清； 

5)阴性血清对照：未接触猪瘟病毒的健康兔血清； 

6)洗涤液：含有体积百分含量为0.05％的Tween-20的PBS缓冲液(PBS缓冲液为含5.54g/L Na₂HPO₄·12H₂O，0.39g/L NaH₂PO₄·2H₂O，8.5g/L NaCl，pH7.2的溶液)； 

7)终止液：2mol/L硫酸溶液； 

8)底物显色液：显色液A：含有1mg/ml OPD pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，显色液B：过氧化氢；临用前将显色液A与显色液B按体积比为5000∶9的比例，混合充分后使用； 

9)封闭液：含质量百分含量为0.25％的明胶的PBS溶液。 

其中，酶标猪瘟病毒单表位特异性的抗体、猪瘟病毒抗原、猪瘟病毒高免血清的制备方法如下： 

猪瘟病毒主要保护性抗原E2蛋白上一个B细胞表位，该表位的序列(TAVSPTTLR，序列1)在猪瘟病毒中是高度保守的。本发明制备猪瘟病毒结构蛋白E2上高度保守表位(TAVSPTTLR)的特异性抗体作为猪瘟病毒单表位特异性的抗体用于制备酶标猪瘟病毒单表位特异性的抗体，用含有该表位的多肽抗原作为猪瘟病毒抗原包被原。 

一、酶标猪瘟病毒单表位特异性的抗体工作液的制备 

1、猪瘟病毒单表位特异性的抗体的制备 

1)猪瘟病毒兔高免血清的制备 

将100个兔体最小感染量(100个RMID)的猪瘟病毒兔化弱毒疫苗(乾元浩生物股份有限公司)经静脉接种大耳白兔。第一次接种后，以2周为间隔，进行反复接种(剂量仍是100个RMID)。于第三次接种后7天起，采血，制备猪瘟病毒兔高免血清。 

2)表位特异性亲和柱的制备 

①合成具有两个拷贝序列1所示表位序列(TAVSPTTLR)的多肽抗原：CTAVSPTTLRGSTAVSPTTLR(序列表中序列2，标有下划线的序列为序列1所示的表位)；用去离子水配制高浓度的多肽抗原溶液(4-10mg/ml)，并用偶联缓冲液(0.1M，pH7.7的NaHCO₃溶液)将多肽溶液稀释至0.25mg/ml； 

②取NHS-activated Sepharose^TM4 Fast Flow柱材(GE Healthcare)0.5ml，加入4.5ml 1mM盐酸，混匀，1500rpm离心1分钟，弃去上清，重复2次；加入4.5ml耦联缓冲液(0.1M，pH7.7的NaHCO₃溶液)，混匀，1500rpm离心1分钟，弃去上清；在沉淀中加入250μl步骤①得到的多肽溶液，混匀，室温反应2-4小时或4℃反应过夜； 

③加入4.5ml封闭液(0.1M，pH8.3的Tris-HCL缓冲液)，混匀，室温封闭2-4小时或4℃封闭过夜；1500rpm离心1分钟，弃去上清； 

④加入1.5ml低pH值缓冲液(含0.5M NaCl的0.1M乙酸缓冲液)，振荡，1500rpm离心1分钟，弃去上清；加入1.5ml封闭液，振荡，1500rpm离心1分钟，弃去上清；重复此步骤3～6次；得到偶联了具有序列2所示氨基酸残基序列的多肽抗原的表位特异性亲和柱材，用20％的乙醇保存偶联好的柱材，并保存于4℃，备用。 

3)从猪瘟病毒高免血清中制备表位特异性的抗体 

①血清预处理： 

将PK-15细胞培养于37℃，5％CO₂，含5％胎牛血清的DMEM培养基中；用胰酶-EDTA-Na₂消化液(含有质量百分含量0.25％胰酶，0.02％EDTA-Na₂，PBS)消化已经致密生长的细胞，用生理盐水洗涤后，将细胞沉淀冻存备用。 

在步骤1)制备的高免血清中加入上述制备的PK-15细胞，在4℃搅拌过夜；4500rpm离心，去除沉淀(PK-15细胞成分可以吸附一部分与细胞成分反应的血清抗体)；加入二氧化硅粉末，在室温搅拌30min；4500rpm离心，去除沉淀(二氧化硅能吸附脂蛋白)。 

②装柱：将步骤2)制备的表位特异性亲和柱材装柱，注意确认柱子底部的筛板有很好的通透性；用pH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS)平衡亲和柱。 

③上样：将步骤①预处理后的血清先用0.45μm的微孔滤膜进行过滤；然后将滤液过柱收集其流出液，再反复上样多次；然后用5倍柱床体积以上的PBS(pH7.2)洗柱，直到流出液用考马斯亮蓝G-250不能检测到蛋白。 

④洗脱：待柱上的PBS流出后，向柱上加入1ml洗脱液(0.1M，pH2.5甘氨酸缓冲液)，并用预先加有200μl 1M pH9.0 Tris-HCl缓冲液的收集管收集留出液，用考马斯亮蓝G-250进行检测；显示有蛋白存在的各收集管中，得到的是纯化的抗体。 

重复上面步骤，继续用1ml的洗脱液进行洗脱，直到考马斯亮蓝G-250检测不到蛋白的存在；得到纯化的序列1所述表位的特异性抗体溶液。 

2、猪瘟病毒单表位特异性的抗体的鉴定 

1)纯化抗体溶液的浓缩和缓冲液更换 

用浓缩管将纯化的抗体溶液进行浓缩，以缩小样品体积；或用偶联有Protein G、Protein A的亲和柱浓缩抗体。 

用透析或者脱盐的方式，将样品的缓冲液更换为0.2mol/L，pH9.5碳酸钠缓冲液(准备进行抗体的辣根过氧化物酶标记的偶联缓冲液)； 

抗体浓度用Bradford法测定(用牛血清白蛋白作标准曲线)，也可由紫外分光光度计测定(1.44OD≈1mg/ml)。 

2)纯化抗体的特异性由间接ELISA确定 

分别以含有猪瘟病毒特异性表位(TAVSPTTLR)的合成肽：CTAVSPTTLRGSTAVSPTTLR/不含有猪瘟病毒特异性表位(TAVSPTTLR)的合成肽(无关抗原)：CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT(人工合成)、PK-15细胞裂解上清液(将培养的PK-15细胞反复冻融离心后的上清液)等作为抗原包被酶标板，进行间接ELISA检测步骤1制备的抗体的特异性，具体方法如下所述： 

分别用上述抗原(5μg/ml，50μl，0.1M，pH9.6碳酸氢钠缓冲液作为包被缓冲液)包被酶标板过夜；然后用洗涤液(PBST：含有体积百分含量0.05％的Tween-20的PBS缓冲液)洗涤，待洗涤液(PBST：含有0.05％的Tween-20的PBS缓冲液)洗涤酶标板1次后，用封闭液封闭酶标板30min；再用洗涤液洗涤酶标板3次后，在包被有不同抗原的孔内加入梯度稀释后的步骤1得到的特异性抗体溶液样品，孵育45min；再用洗涤液(PBST：含有0.05％的Tween-20的PBS缓冲液)洗涤酶标板3次后，加入酶标二抗(DAKO，P0448)，孵育45min；再用洗涤液(PBST：含有0.05％的Tween-20的PBS缓冲液)洗涤酶标板5次后，加入50μl底物显色液(OPD 10mg溶于10ml pH5.0柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，临用前加入18μl过氧化氢，混合充分后使用)，避光显色10min，然后用50μl 2M硫酸终止反应，显色结果由酶标仪读出(波长为490nm)。结果表明所纯化的单表位特异性多克隆抗体对CTAVSPTTLRGSTAVSPTTLR多肽具有特异性识别，而对无关多肽CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT和PK-15细胞裂解上清液没有识别(用肉眼观察即可看出明显的显色和不显色的差别；用酶标仪读数，可以用P/N≥2.1判断)。 

3、表位特异性抗体的辣根过氧化物酶标记 

1)称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于1ml双蒸水中，加200μl新配制的0.1mol/L的NaIO₄，室温下避光搅拌20min，勿超过此时间，此时溶液呈棕绿色。迅速将该溶液于4℃，用1mM，pH4.4醋酸钠缓冲液透析过夜。 

2)在步骤1)得到的溶液中加入20μl 0.2mol/L，pH9.5碳酸钠缓冲液，使溶液pH提升至约9～9.5，检测一下调整后的pH值，立即加入1ml(10mg/ml)步骤2的 步骤1)得到的特异性抗体溶液，室温避光轻轻搅拌2h。 

3)在步骤2)得到的溶液中继续加入100μl新配制的NaBH₄，混匀，至于4℃2h。于4℃，对0.15M，pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)透析过夜，得到酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体。所得样品可进行进一步纯化，也可以直接使用。 

4、酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体工作液的制备 

所制得的酶标抗体，尽快进行工作浓度标定，并进行分装，冻存于-20℃或以下，备用(每一个批次的酶标抗体都要进行工作浓度标定)。 

用步骤2的步骤2)所述间接ELISA进行酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体工作浓度的确定，其中， 

抗原包被：使用序列标中序列2所述的多肽抗原(人工合成)为包被抗原，包被浓度为1μg/ml，100μl，包被缓冲液为0.1M，pH9.6碳酸氢钠。 

酶标抗体按照1∶100、1∶200、1∶400、1∶600、1∶1000、1∶1200、······的顺序进行稀释(每孔加入100μl)，以OD值为纵坐标，稀释度为横坐标作滴定曲线，滴定曲线上OD值为1.0左右，且斜率最大时的酶标抗体稀释度为其工作浓度(工作浓度在具体的ELISA试验系统中可进一步优化)，结果表明上述制备的酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体工作浓度为1∶1000。 

将酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体用含10mg/ml BSA的PBS稀释到工作浓度，制成酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体工作液，进行分装，于-20或-40℃保存，避免反复冻融。 

二、包被抗原工作液的制备 

1、固相抗原竞争ELISA的抗原包被浓度确定 

合成氨基酸序列为序列表中序列2的含两个拷贝TAVSPTTLR表位的多肽作为抗原，以不同抗原浓度包被酶标板：50μl/孔，浓度为10、5、2.5、…μg/ml(以包被缓冲液为溶剂，包被缓冲液为0.1M，pH9.6碳酸氢钠缓冲液)，4℃过夜；倒去包被液，用洗涤液洗涤酶标板1次；用封闭液封闭酶标板30min；分别加入50μl按照步骤一的步骤1中1)的方法制备的猪瘟病毒兔高免血清(原倍)或未接触过猪瘟病毒的健康兔血清(原倍)，于封闭后的酶标板上室温孵育4h；倒去酶标板上的血清，用洗涤液(含有体积百分含量为0.05％的Tween-20的PBS缓冲液)洗涤酶标板3次；加入100μl步骤一中步骤4制备的酶标猪瘟病毒单表位特异性抗体工作液，室温孵育30min；倒去酶标板上的液体，用洗涤液洗涤酶标板5次；加入底物显色液(OPD10mg溶于10ml pH5.0柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，临用前加入18μl过氧化氢，混合充分后使用)避光显色10min，用终止液终止，用酶标仪读数(OD₄₉₀)。结果如图1所 示，选取加入两种血清后差异最为显著的浓度为工作浓度，即10μg/ml。将合成氨基酸序列为序列表中序列2的含两个拷贝TAVSPTTLR表位的多肽用包被缓冲液配成工作浓度(10μg/ml)，分装得到包被抗原工作液。 

三、阳性血清对照的制备 

猪瘟病毒兔高免血清：将100个兔体最小感染量(100RMID)的猪瘟兔化弱毒疫苗(乾元浩生物股份有限公司)经静脉接种大耳白兔。第一次接种后，以2周为间隔，进行反复接种(剂量仍是100个RMID)。于第三次接种后7天起，采血，制备猪瘟病毒兔高免血清。 

实施例2、本发明试剂盒的检测效果实验 

用实施例1制备的酶联免疫试剂盒检测含猪瘟病毒抗体的血清，具体步骤如下： 

1、用实施例1制备的包被抗原工作液加入到酶标板，每孔50μl，4℃过夜； 

2、倒去包被液，用洗液洗涤酶标板1次； 

3、用封闭液封闭酶标板30min； 

4、分别在步骤3封闭后的酶标板上每孔加入50μl实施例1的步骤三制备的阳性血清对照(原倍猪瘟病毒兔高免血清)、阴性血清对照(未接触过猪瘟病毒的健康兔血清)和待检的感染猪瘟病毒的猪血清(购自中国兽药监察所，包括原倍血清、10倍稀释血清和100倍稀释血清，用生理盐水或PBS稀释)，室温孵育4h； 

5、倒去酶标板上的血清，用洗涤液洗涤酶标板3次； 

6、加入酶标猪瘟病毒单表位特异性的抗体工作液，每孔100μl，室温孵育30min；倒去酶标板上的液体，用洗涤液洗涤酶标板5次； 

7、加入底物显色液(显色液A与显色液B按5000∶9的比例，混合充分后的溶液)避光显色10min，用终止液终止，用酶标仪读数(OD₄₉₀)。 

由于存在表位竞争的关系，若待检样品中含有猪瘟病毒抗体(阳性样品)，则酶标抗体不能或不能完全与包被抗原结合，其结合被待检样品中的抗体阻断，从而显色结果较浅(与阳性对照相当)；若待检样品中不含有猪瘟病毒抗体(阴性样品)，则酶标抗体可与包被抗原充分结合，其结合不能为待检样品中的抗体所阻断，从而显色结果较深(与阴性对照相当)。 

结果如图2所示，结果表明原倍血清和10倍稀释血清与阳性血清对照相当，与阴性血清对照差别显著，可以肉眼区别。说明本发明试剂盒可以准确的在10～100倍稀释的血清中检测到猪瘟病毒特异性的抗体。另取10份感染猪瘟病毒的猪血清进行同样检测，结果均检测到猪瘟病毒特异性的抗体。 

序列表 

<160>2 

<210>1 

<211>9 

<212>PRT 

<213>猪瘟病毒(classical swine fever virus) 

<400>1 

Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg 

1               5 

<210>2 

<211>21 

<212>PRT 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400>2 

Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Gly Ser Thr Ala Val Ser 

1               5                   10                  15 

Pro Thr Thr Leu Arg 

            20 

Claims (8)

1.一种检测猪瘟病毒特异性抗体的酶联免疫试剂盒，包括猪瘟病毒抗原和酶标猪瘟病毒特异性抗体；所述猪瘟病毒抗原为含有一个或一个以上的序列1所示氨基酸残基序列的多肽；所述猪瘟病毒特异性抗体是以猪瘟病毒为免疫原得到的多克隆抗体，用偶联有所述猪瘟病毒抗原的免疫亲和层析柱经层析纯化后得到的针对具有序列1所示氨基酸残基序列的猪瘟病毒表位抗原的猪瘟病毒特异性抗体。

2.根据权利要求1所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括酶标板、阳性血清对照、阴性血清对照、显色剂、洗涤液和终止液。

3.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述酶标猪瘟病毒特异性抗体为辣根过氧化酶标记猪瘟病毒单表位特异性抗体。

4.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述猪瘟病毒为猪瘟兔化弱毒。

5.根据权利要求1或2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述猪瘟病毒抗原多肽是以PBS为溶剂的猪瘟病毒抗原溶液；所述酶标猪瘟病毒特异性抗体是以PBS为溶剂的酶标猪瘟病毒特异性抗体溶液。

6.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述阳性血清对照为猪瘟病毒兔高免血清；所述阴性血清对照为未感染过猪瘟病毒的健康兔血清。

7.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述洗涤液为含有体积百分含量为0.05％的Tween-20的PBS缓冲液；所述终止液为2mol/L硫酸溶液；封闭液为含有质量百分含量为0.25％的明胶的PBS溶液。

8.根据权利要求2所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述显色剂由显色液A液和显色液B液组成，显色液A液为含有1mg/ml OPD pH5.0的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，显色液B为过氧化氢。

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