ES2929274T3 - Inactivación de patógenos y producción de vacunas inactivadas altamente inmunógenas utilizando un proceso de oxidación dual - Google Patents

Inactivación de patógenos y producción de vacunas inactivadas altamente inmunógenas utilizando un proceso de oxidación dual Download PDF

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Abstract

Se proporcionan métodos sorprendentemente efectivos para inactivar patógenos y para producir composiciones de vacunas altamente inmunogénicas que contienen un patógeno inactivado que se vuelve no infeccioso por exposición a un reactivo de Fenton, o por exposición a un reactivo de Fenton o un componente del mismo en combinación con un reactivo de metisazona seleccionado del grupo que consta de metisazona, análogos de metisazona, grupo(s) funcional(es)/subestructura(s) de metisazona y combinaciones de los mismos. Los métodos inactivan eficazmente los patógenos, al tiempo que retienen sustancialmente la antigenicidad y/o inmunogenicidad de los patógenos, y son adecuados para inactivar patógenos o para la preparación de vacunas para una amplia variedad de patógenos con genomas que comprenden ARN o ADN, incluidos virus y bacterias. También se proporcionan composiciones de vacunas inactivadas altamente inmunogénicas preparadas mediante el uso de cualquiera de los métodos descritos y métodos para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto mediante la administración de tales composiciones de vacunas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Inactivación de patógenos y producción de vacunas inactivadas altamente inmunógenas utilizando un proceso de oxidación dual
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones. Los aspectos de la presente descripción se refieren generalmente a procedimientos para inactivar patógenos y producir vacunas inactivadas altamente inmunógenas contra patógenos, se refieren, en aspectos más particulares, a procedimientos sorprendentemente eficaces para inactivar patógenos y producir vacunas inactivadas altamente inmunógenas contra patógenos que tienen genomas de ARN o ADN, incluyendo, pero sin limitación, patógenos virales y bacterianos, usando procesos de oxidación dual que emplean química de tipo Fenton, y se refieren, en aspectos aún más particulares, al uso de procesos de oxidación simple o los procesos de oxidación dual descritos, en combinación con un reactivo de metisazona (por ejemplo, metisazona, análogos de metisazona, o uno o más grupos/subestructuras funcionales de metisazona, o combinaciones de los mismos), para proporcionar ventajas sustanciales sobre el uso de procesos de oxidación simple o dual para la inactivación de virus, bacterias, hongos o parásitos y la producción de vacunas.
ANTECEDENTES
Las vacunas inactivadas representan un componente crítico del sistema de asistencia sanitaria para los campos de la medicina humana y veterinaria. Sin embargo, el proceso de inactivación (por ejemplo, inactivación por formaldehído, p-propiolactona (BPL), inactivación de etilenimina binaria (BEI) y peróxido de hidrógeno (H2O2)) puede dañar los epítopos antigénicos clave de los patógenos diana, lo que lleva a respuestas in vitro e in vivo subóptimas en vacunas y reducciones en la eficacia de vacunas in vivo.
Un trabajo reciente (véanse, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N.° 8.124.397 y 8.716.000) ha demostrado que los agentes oxidantes químicos (por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2)), aunque anteriormente se conocían y usaban en la técnica solo por la capacidad de destruir y matar patógenos, podrían usarse en procedimientos para preparar vacunas virales inactivadas inmunógenas. Sin embargo, incluso estos agentes oxidantes químicos simples pueden dar resultados subóptimos al dañar, hasta cierto punto, epítopos antigénicos clave, y para sortear este problema, todavía existe la necesidad insatisfecha pronunciada de procedimientos mejores y ampliamente aplicables para inactivar de manera eficiente los patógenos (virales, bacterianos, fúngicos y parasitarios) conservando al mismo tiempo de manera óptima la inmunogenicidad.
La influenza, por ejemplo, comúnmente conocida como "la gripe", es una enfermedad infecciosa causada por un virus influenza, virus de ARN que constituyen tres de los cinco géneros de la familia Orthomyxoviridae.La gripe se propaga por todo el mundo en un brote anual, lo que provoca entre tres y cinco millones de casos de enfermedad grave y entre 250.000 y 500.000 muertes.
El virus del dengue (DENV), por ejemplo, es la causa de la fiebre del dengue. Es un virus de ARN monocatenario positivo transmitido por mosquitos de la familia Flaviviridae; género Flavivirus.Se han encontrado cinco serotipos del virus, todos los cuales pueden causar el espectro completo de la enfermedad. Su genoma codifica tres proteínas estructurales (proteína C de la cápside, proteína M de membrana, proteína E de la envoltura) y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5). También incluye regiones cortas no codificantes en los extremos 5' y 3'.
El virus chikungunya (CHIKV), por ejemplo, es un miembro del género alphavirus, y la familia Togaviridae. Es un virus de ARN con un genoma monocatenario positivo de aproximadamente 11,6 kb. Es un miembro del complejo del virus del bosque Semliki y está estrechamente relacionado con el virus del río Ross, el virus O'nyong'nyong y el virus del bosque Semliki. Debido a que se transmite por artrópodos, concretamente, mosquitos, también puede denominarse arbovirus (virus transmitido por artrópodos). En los Estados Unidos, se clasifica como un patógeno prioritario de categoría C, y el trabajo requiere precauciones de nivel III de bioseguridad. Los síntomas incluyen fiebre y dolor en las articulaciones, que típicamente se producen de dos a doce días después de la exposición. Otros síntomas pueden incluir dolor de cabeza, dolor muscular, hinchazón de las articulaciones y sarpullido. La mayoría de las personas mejoran en una semana; sin embargo, ocasionalmente el dolor articular puede durar meses. El riesgo de muerte es de aproximadamente 1 entre 1.000. Las personas muy jóvenes, los ancianos y aquellos con otros problemas de salud corren el riesgo de padecer una enfermedad más grave.
La Campylobacter (bacteria gramnegativa), por ejemplo, representa un patógeno humano global y es responsable de hasta 400-500 millones de casos de gastroenteritis bacteriana cada año. La carga económica de esta enfermedad bacteriana es sustancial, con costes anuales en los EE.UU. estimados en hasta 5.600 millones de dólares. No existe una vacuna comercial disponible para las infecciones humanas por Campylobacter y el desarrollo de una vacuna segura y eficaz representa una importante necesidad clínica no satisfecha. Las especies reportadas con mayor frecuencia en enfermedades humanas son C. jejuni (subespecie jejuni) y C. coli. También se han aislado otras especies, tales como C. lari y C. upsaliensis de pacientes con enfermedad diarreica, pero se notifican con menos frecuencia.
La Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes; bacteria grampositiva) es uno de los patógenos transmitidos por los alimentos más virulentos, con tasas de mortalidad debidas a la listeriosis transmitida por los alimentos que alcanzan del 20 al 30 % en individuos de alto riesgo. Responsable de aproximadamente 1.600 enfermedades y 260 muertes en los Estados Unidos (EE.UU.) anualmente, la listeriosis ocupa el tercer lugar en el número total de muertes entre los patógenos bacterianos transmitidos por los alimentos, con tasas de mortalidad que superan incluso a la Salmonella y Clostridium botulinum. En la Unión Europea, las tasas de listeriosis han seguido una tendencia ascendente que comenzó en 2008, provocando 2161 casos confirmados y 210 muertes notificadas en 2014, un 16 % más que en 2013. Al igual que en EE.UU., las tasas de mortalidad por listeriosis también son más altas en la UE en comparación con otros patógenos transmitidos por los alimentos.
La Shigella (por ejemplo, Shigella dysenteriae; bacteria gramnegativa) es una de las principales causas bacterianas de diarrea en todo el mundo, provocando una estimación 80-165 millones de casos anualmente. La cantidad de muertes que provoca cada año se estima entre 74.000 y 600.000, y se encuentra entre los cuatro principales patógenos que causan diarrea de moderada a grave en niños africanos y del sur de Asia. S. flexneri es la especie aislada con mayor frecuencia en todo el mundo y representa el 60 % de los casos en el mundo en desarrollo; S. sonnei provoca el 77 % de los casos en el mundo desarrollado, en comparación con solo el 15 % de los casos en el mundo en desarrollo; y S. dysenteriae suele ser la causa de epidemias de disentería, sobre todo en poblaciones confinadas tales como los campos de refugiados.
La presente descripción satisface estas y otras necesidades de mejores vacunas.
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones. Los solicitantes del presente documento describen y demuestran por primera vez que el uso de un sistema de oxidación dual, que emplea química de tipo Fenton con, por ejemplo, CuCl2 y H2O2, así como el uso de H2O2 con otras combinaciones de metales de transición/H2O2 (combinaciones de reacción de Fenton), proporcionó una ventaja significativa tanto en la inactivación como en el desarrollo de vacunas sobre el uso de enfoques de oxidación simple. Ni el H2O2 ni el CuCb solos, por ejemplo, pudieron mantener una antigenicidad fuerte y al mismo tiempo garantizar la inactivación viral completa, los cuales son componentes críticos que subyacen a las vacunas inactivadas con éxito. Sorprendentemente, usando una combinación de, por ejemplo, tanto CuCl2 como H2O2, se proporcionó una amplia diversidad de vacunas antigénicas e inmunógenas, por ejemplo, para el virus chikungunya (CHIKV, familia: Togaviridae, género: Alphavirus), serotipos 1-4 del virus del dengue (DENV 1-4) y virus de la fiebre amarilla (YFV), familia: Flaviviridae, género: Flavivirus), virus vaccinia (VV), familia: Poxviridae, género: Orthopoxvirus) o virus influenza (familia: Orthomyxoviridae, género: Influenzavirus).
Por lo tanto, aspectos particulares, como se describe con más detalle a continuación, proporcionan un procedimiento eficaz de oxidación dual que implica química de tipo Fenton (reacciones oxidativas) usando metales de transición activos redox Cu y/o Fe en combinación con peróxido de hidrógeno (H2O2) para formar subproductos oxidativos, lo que conduce a la inactivación microbiana con una retención sorprendentemente eficaz de la inmunogenicidad.
En aspectos sorprendentes adicionales, los procedimientos de oxidación dual descritos que implican química de tipo Fenton comprenden además, como se describe con más detalle a continuación, el uso de metisazona, análogos de metisazona o uno o más grupos/subestructuras funcionales de metisazona, proporcionando una inactivación microbiana incluso más eficaz en relación con la oxidación dual sola, y con una retención de la inmunogenicidad aún más eficaz en relación con la oxidación dual sola.
Otros aspectos sorprendentes proporcionan procedimientos eficaces de oxidación simple que implican peróxido de hidrógeno (H2O2) que comprenden además, como se describe en más detalle a continuación, el uso de metisazona, análogos de metisazona, o uno o más grupos/subestructuras de metisazona, proporcionando una inactivación microbiana más eficiente con respecto a H2O2 solo, y con una retención eficaz de la inmunogenicidad.
Se proporcionan, por ejemplo, procedimientos para producir una composición de vacuna inmunógena que comprende un patógeno inactivado, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto un patógeno con un reactivo de Fenton, que comprende peróxido de hidrógeno en combinación con un metal de transición, en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para que el agente haga que el patógeno no sea infeccioso, conservando al mismo tiempo la inmunogenicidad del patógeno. Los procedimientos pueden comprender además verificar la inmunogenicidad del patógeno no infeccioso utilizando un anticuerpo específico del patógeno, inmunoensayos de linfocitos B o T, ensayos de aglutinación u otros ensayos adecuados. En los procedimientos que usan un reactivo de Fenton, el reactivo de Fenton comprende peróxido de hidrógeno en combinación con al menos un ion de metal de transición seleccionado de, por ejemplo, Cu, Fe, Cs, etc., como se reconoce en la técnica. Para los procedimientos que usan un reactivo de Fenton, se puede usar un solo metal de transición o una mezcla de metales de transición en combinación con peróxido de hidrógeno. Los procedimientos son ampliamente aplicables cuando el patógeno a inactivar manteniendo la inmunogenicidad es un patógeno que tiene un genoma que comprende ARN o ADN, incluyendo, pero sin limitación, virus y bacterias, como se describe en esta invención. En aspectos particulares de los procedimientos que usan un reactivo de Fenton, el patógeno es un virus (por ejemplo, familia Togaviridae, Flaviviridae, o Orthomyxoviridae) o una bacteria (por ejemplo, Campylobacter es C. coli o C. jejuni). En aspectos más particulares, el patógeno es un virus (por ejemplo, Togaviridae, género: Alphavirus), familia: Flaviviridae, género: Flavivirus) o familia: Orthomyxoviridae, género: Influenzavirus) o una bacteria (por ejemplo, Campylobacter).En aspectos particulares, el patógeno es un virus chikungunya (CHIKV, familia: Togaviridae, género: Alphavirus), serotipos 1-4 del virus del dengue y virus de la fiebre amarilla (De NV 1-4, YFV, familia: Flaviviridae, género: Flavivirus) o un virus influenza (familia: Orthomyxoviridae, género: Influenzavirus.En aspectos particulares, el patógeno es una bacteria tal como, pero sin limitación, Campylobacter (por ejemplo, C. coli o C. jejuni), Shigella spp, Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogene), etc., como se descrita en esta invención.
En los procedimientos de oxidación dual o de oxidación simple descritos en esta invención, el patógeno se aísla o se purifica preferentemente antes de ponerlo en contacto con el reactivo de Fenton.
También se describen procedimientos para inactivar un patógeno, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto un patógeno con peróxido de hidrógeno, o con un reactivo de Fenton que contiene peróxido de hidrógeno en combinación con un metal de transición, y un reactivo de metisazona, en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para que el patógeno no sea infeccioso.
Los procedimientos de oxidación dual descritos en esta invención para inactivar patógenos, y para la producción de vacunas inactivando patógenos conservando al mismo tiempo la inmunogenicidad, pueden comprender poner en contacto el patógeno con el reactivo de Fenton y un "reactivo de metisazona", tal como metisazona, uno o más análogos de metisazona, o uno o más grupos/subestructuras funcionales de metisazona, o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, los procedimientos de oxidación dual descritos en esta invención pueden comprender poner en contacto el pató eno con el reactivo de Fenton y un compuesto que tiene la fórmula I:
Figure imgf000004_0001
en donde R1 es independientemente H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH o por arilo; y en donde X es independientemente H o halógeno (por ejemplo, Cl, Br, I, F, etc.); y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo. En aspectos particulares, X y R2 son H; y R1 es independientemente H (isatin p-tiosemicarbazona), -CH3 (N-metil-isatin p-tiosemicarbazona (metisazona)) o propilo (N-propil-isatin ptiosemicarbazona).
Preferentemente, X y R2 son H; y R1 es -CH3 (N-metil-isatin p-tiosemicarbazona (metisazona)). Preferentemente se utiliza metisazona:
Figure imgf000004_0002
Como alternativa, o además, los procedimientos de oxidación dual descritos en esta invención pueden comprender poner en contacto el patógeno con el reactivo de Fenton y uno o más compuestos, cada uno de los cuales tiene una de las fórmulas II-V:
Figure imgf000005_0001
en donde Ri es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; y en donde X es independientemente H o halógeno (por ejemplo, Cl, Br, I, F, etc.); y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables de los mismos;
Figure imgf000005_0002
en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; en donde X es independientemente H o halógeno (por ejemplo, Cl, Br, I, F, etc.); y en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH, o por arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables de los mismos;
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en donde R2 y R3 son independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH, o por arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; y combinaciones de dichos compuestos, teniendo cada uno una de las fórmulas II-V (o teniendo una de las fórmulas I-V). Preferentemente: X de fórmula II es H, y R1 de fórmula (II) es H (isatina), -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatin); X, R1 y R2 de fórmula (III) son H (indol, 2,3-diona, 3-hidrazona); R2 y R3 de fórmula (IV) son H (tiosemicarbazida); y R2 y R3 de fórmula (V) son H (semicarbazida). Preferentemente, poner en contacto el patógeno comprende poner en contacto el patógeno
Figure imgf000005_0004
en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4). Preferentemente, R1 de fórmula VI es H (isatina), -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatina). Preferentemente, R1 de fórmula VI es H (¡satina):
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Además, se proporcionan procedimientos para inactivar un patógeno, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto un patógeno con un reactivo de Fenton, que comprende peróxido de hidrógeno en combinación con un metal de transición, y un reactivo de metisazona, en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para que el agente haga que el patógeno no sea infeccioso.
Los procedimientos son ampliamente aplicables para producir vacunas inactivadas altamente inmunógenas contra patógenos que tienen genomas de ARN o ADN, incluyendo, pero sin limitación, patógenos virales y bacterianos.
La utilidad/eficacia/resultados son sorprendentes e inesperados por al menos seis razones. En primer lugar, anterior a las Patentes de EE.UU. N.° 8.124.397 y 8.716.000 de los Solicitantes (en lo sucesivo en esta invención las patentes "'397" y "'000" que tienen reivindicaciones que abarcan el uso de H2O2 solo en reacciones oxidativas para la producción de vacunas), el H2O2 se consideraba un oxidante fuerte y, por lo tanto, se conocían las reacciones de H2O2 y se usaban en la técnica solo por la capacidad de destruir y matar patógenos de manera eficaz, y no había ningún uso, sugerencia o expectativa razonable de usar reacciones oxidativas de H2O2 para la producción de vacunas inmunógenas como se describe sorprendentemente en las patentes '397 y '000 anteriores del Solicitante. Del mismo modo, antes de la presente descripción de los solicitantes, y como se analiza con más detalle a continuación, las reacciones oxidativas de tipo Fenton (H2O2 iones de metales de transición) se conocían en la técnica solo por su capacidad para destruir y matar patógenos de manera eficaz, y no había ningún uso, sugerencia o expectativa razonable de usar reacciones oxidativas de tipo Fenton para la producción de vacunas inmunógenas como se describe y reivindica actualmente.
En segundo lugar, durante el curso inicial de investigación del enfoque de oxidación dual descrito actualmente usando química de tipo Fenton (H2O2 iones de metales de transición), se descubrió que la inactivación de virus usando química de tipo Fenton dependía de la concentración de proteína viral, completamente diferente al caso de H2O2 solo, que no depende de proteínas (compárense las figuras 1A y 1B en esta invención), lo que indica que un mecanismo fundamentalmente diferente estuvo implicado con la inactivación de patógenos basada en la química de tipo Fenton (sistema de oxidación dual) en comparación con la inactivación de patógenos basada en H2O2 solo (sistema de oxidación simple). Además, en el sistema de oxidación dual, la tasa de inactivación disminuyó a concentraciones de proteína viral más altas, lo que indica que la inclusión de la química de tipo Fenton puede dirigirse a antígenos de proteína viral, lo que contraindicó el uso de la inactivación de patógenos basada en la química de tipo Fenton en los procedimientos que buscan conservar la integridad/inmunogenicidad de la proteína viral. Por lo tanto, fue sorprendente e inesperado que la inactivación de patógenos basada en la química de tipo Fenton realmente mejorara sustancialmente la retención de la integridad/inmunogenicidad de la proteína viral, como se describe en esta invención.
En tercer lugar, con respecto a los procedimientos de oxidación dual que comprenden además el uso de un reactivo de metisazona, no había ningún uso o sugerencia en la técnica para usar un reactivo de metisazona (por ejemplo, metisazona) en combinación con un reactivo de Fenton (por ejemplo, con H2O2 y Cu) y, por lo tanto, no hay ningún conocimiento en la técnica sobre los efectos potenciales, si los hay, de la metisazona en la química de tipo Fenton en ningún contexto, incluido ningún contexto de preparación de vacunas. Los Solicitantes son, de hecho, los primeros en describir el uso de un reactivo de metisazona en combinación con un reactivo de Fenton, como se describe y se reivindica en esta invención.
En cuarto lugar, como se analiza en más detalle a continuación, se sabía en la técnica que la metisazona se combinaba tanto con ácido nucleico como con una proteína y, por lo tanto, estaría contraindicada para su uso en métodos tales como los descritos en esta invención, cuyos métodos tienen como objetivo conservar al máximo la integridad y la inmunogenicidad de los epítopos de proteínas patógenas, y particularmente cuando los epítopos de proteínas patógenas relevantes están expuestos en la superficie del patógeno, en relación con el ácido nucleico secuestrado internamente del patógeno. Además, la afinidad proteica de la metisazona fue particularmente preocupante dado el hallazgo inicial de los Solicitantes, como se ha analizado anteriormente, de que las reacciones de oxidación dual de los Solicitantes dependían de la concentración de proteína viral (disminuyendo la tasa de inactivación con el aumento de la concentración de proteína viral; figura 1B en esta invención), lo que contraindica la adición de otro agente más que se combine con la proteína o se dirija a ella.
En quinto lugar, se sabe en la técnica que la metisazona forma complejos/secuestra iones de metales de transición, lo que indicaría a un experto habitual en la técnica química que la metisazona podría interferir competitivamente con la química de tipo Fenton (H2O2 iones de metales de transición, tales como Cu), contraindicando así su uso en combinación con la química de tipo Fenton. Como se analiza con más detalle a continuación, los iones metálicos son catalizadores en las reacciones de oxidación de tipo Fenton y, por lo tanto, el secuestro de tales catalizadores por los reactivos de metisazona sería de particular preocupación. Sorprendentemente, sin embargo, los reactivos de metisazona aumentaron sustancialmente tanto la tasa de inactivación de patógenos mediada por química de tipo Fenton como la retención de la integridad de la proteína/inmunogenicidad de los patógenos inactivados.
En sexto lugar, con respecto a los procedimientos descritos para inactivar un patógeno, nadie en la técnica ha inactivado previamente un patógeno usando peróxido de hidrógeno más un reactivo de metisazona, o usando la química de Fenton más un reactivo de metisazona, e independientemente de las consideraciones de retención de inmunogenicidad, nadie podría haber predicho mayores tasas de inactivación de patógenos en relación con el peróxido de hidrógeno solo o la química Fenton sola.
Por lo menos por estas seis razones, por lo tanto, los resultados descritos en esta invención fueron sorprendentes e inesperados, y no podrían haberse predicho basándose en la técnica anterior o al trabajo previo de los propios Solicitantes con agentes oxidantes químicos simples (por ejemplo, H2O2) (Patentes de EE.UU. N.° 8.124.397 y 8.716.000).
Los procedimientos avanzados de oxidación dual se aplicaron con éxito a ocho dianas de vacunas virales de ejemplo que representan cuatro familias de virus no relacionadas (por ejemplo, CHIKV, (familia: Togaviridae, género: Alphavirus), serotipos 1 -4 del virus del dengue y virus de la fiebre amarilla (DENV 1 -4, YFV, familia: Flaviviridae, género: Flavivirus), virus vaccinia (VV), familia: Poxviridae, género: Orthopoxvirus) y virus influenza (familia: Orthomyxoviridae, género: Influenzavirus A)), y con respecto a los cuales se encontró que la oxidación simple (por ejemplo, con H2O2 solo) era subóptima.
Además, sorprendentemente, los procedimientos avanzados de oxidación dual también se aplicaron con éxito a dianas de vacunas bacterianas (por ejemplo, Campylobacter, Lsteria, Shigella, etc.), en las que se descubrió que la oxidación simple (por ejemplo, con H2O2 solo) era demasiado destructiva para el desarrollo de vacunas (por ejemplo, en el caso de Campylobacter).
Los procedimientos de oxidación dual descritos realizados usando química de tipo Fenton (y de manera óptima los procedimientos descritos en esta invención que comprenden además el uso de un reactivo de tipo metisazona seleccionado del grupo que consiste en metisazona, análogos de metisazona, uno o más grupos/subestructuras funcionales de metisazona y combinaciones de los mismos) proporcionan una inactivación robusta de patógenos con propiedades antigénicas mantenidas para proporcionar vacunas altamente eficaces, lo que conduce a respuestas inmunitarias mejoradas después de la vacunación.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS
Las figuras 1A y 1B muestran, según aspectos particulares, que la cinética de inactivación de virus usando el sistema de oxidación dual por H2O2/CuCl2 depende de la concentración de proteína, mientras que la inactivación de virus estándar basada en H2O2 es independiente de la concentración de proteína.
Las figuras 2A y 2B muestran, según aspectos particulares, que la inactivación estándar basada en H2O2 daña los epítopos neutralizantes específicos de CHIKV y no logra inducir respuestas neutralizantes in vivo después de la vacunación.
Las figuras 3A, 3B y 3C muestran, según aspectos particulares, que el uso del sistema de oxidación de tipo Fenton de oxidación dual descrito proporciona una inactivación eficiente al mismo tiempo que mejora el mantenimiento de los epítopos neutralizantes específicos de CHIKV.
La figura 4 muestra, según aspectos particulares, que la vacunación contra el CHIKV con CuCh/H2O2 induce respuestas rápidas de anticuerpos neutralizantes.
Las figuras 5A y 5B muestran, según aspectos particulares, que la vacunación contra el CHIKV con CuCh/H2O2 protege frente a una patología asociada al CHIKV.
Las figuras 6A y 6B muestran, según aspectos particulares, que el uso del enfoque de oxidación dual descrito con el virus de la fiebre amarilla (YFV) demuestra una mayor retención de la unión del anticuerpo a los epítopos neutralizantes (antigenicidad) y una inmunogenicidad mejorada después de la vacunación.
La figura 7 muestra, según aspectos particulares, que el uso del sistema de oxidación de tipo Fenton de doble oxidación descrito demuestra una inactivación mejorada manteniendo al mismo tiempo los epítopos neutralizantes específicos del virus del dengue 3.
La figura 8 muestra, según aspectos particulares, que el uso del sistema de oxidación dual por H2O2/CuCl2 descrito mejora la inmunogenicidad in vivo en 3 de 4 serogrupos DENV después de la inmunización con una vacuna tetravalente contra el DENV en macacos rhesus (RM).
La figura 9 muestra, según aspectos particulares, que el uso del sistema de oxidación dual por H2O2/CuCl2 descrito mejora la inmunogenicidad in vivo en 4 de 4 serogrupos DENV después de la inmunización con una vacuna tetravalente contra el DENV en ratones.
La figura 10 muestra, según aspectos particulares, que la inactivación del virus basada en CuCh/H2O2 descrita mantiene la actividad de hemaglutinación de la influenza significativamente mejor que el H2O2 solo.
Las figuras 11A y 11B muestran, según aspectos particulares, que la influenza inactivada con CuCh/H2O2 induce fuertes valores de inhibición de hemaglutinación y protege contra una exposición letal.
Las figuras 12A, 12B y 12C muestran, según aspectos particulares, una comparación de metales redox activos de ejemplo para los procedimientos de inactivación de virus basados en oxidación dual descritos.
La figura 13 muestra, según aspectos particulares, que se pueden utilizar combinaciones de metales para conseguir una inactivación completa manteniendo una buena antigenicidad.
Las figuras 14A, 14B y 14C muestran, según aspectos particulares, el uso del sistema de oxidación de tipo Fenton de doble oxidación descrito para la inactivación optimizada de Campylobacter para mejorar el mantenimiento de la morfología bacteriana.
La figura 15 muestra, según aspectos particulares, que la exposición a una fórmula optimizada de CuCh/H2O2 dio como resultado una rápida inactivación de Campylobacter.
Las figuras 16A, 16B y 16C muestran, según aspectos particulares, que CuCh/H2O2-C. coli es inmunógeno y protege a los macacos rhesus (RM) contra la infección por Campylobacter adquirida de forma natural.
Las figuras 17A, 17B y 17C muestran, según aspectos particulares, que la metisazona mejoró la tasa de inactivación de virus basada tanto oxidación simple como dual.
Las figuras 18A, 18B y 18C muestran, según aspectos particulares, que la metisazona mejoró la tasa de inactivación bacteriana basada en oxidación dual.
Las figuras 19A y 19B muestran, según aspectos particulares, que la metisazona mejoró las tasas de inactivación manteniendo al mismo tiempo la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual.
Las figuras 20A, 20B y 20C muestran, según aspectos particulares, que los análogos químicos de metisazona, o grupos/subestructuras funcionales de metisazona, mejoran la inactivación y el mantenimiento de la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual.
La figura 21 muestra, según aspectos particulares, que los niveles crecientes de metisazona con respecto al componente de metal de transición del sistema de oxidación dual mejoraron la antigenicidad y el perfil de inactivación del sistema de oxidación dual.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Si bien las vacunas inactivadas representan un componente crítico del sistema de atención médica para los campos de la medicina tanto humana como veterinaria, los procesos de inactivación de la técnica anterior dañan los epítopos antigénicos clave de los patógenos diana (por ejemplo, virales y bacterianos), lo que lleva a respuestas subóptimas en vacunas y reducciones en la eficacia de las vacunas.
Los aspectos particulares de la presente descripción evitan este problema al proporcionar un nuevo enfoque de oxidación dual que implica la química de tipo Fenton. Las reacciones oxidativas de tipo Fenton requieren el uso de metales de transición redox activos (por ejemplo, Cu, Fe, Cs, etc.) en combinación con peróxido de hidrógeno (H2O2) para formar subproductos oxidativos, lo que conduce a la inactivación microbiana.
El proceso avanzado de oxidación dual de tipo Fenton descrito se aplicó con éxito a patógenos con genomas de ARN o ADN, incluidas tres bacterias de ejemplo (tanto grampositivas como gramnegativas, todas con genomas de ADN) incluyendo Campylobacter (por ejemplo, C. coli o C. jejuni), Shigella spp, y Listeria (por ejemplo, Listeria monocytogenes), y ocho virus (7 virus con genoma de ARN y 1 virus con genoma de ADN) en cuatro familias de virus no relacionadas como dianas vacunales (por ejemplo, virus chikungunya (CHIKV, familia: Togaviridae, género: Alphavirus), serotipos 1-4 del virus del dengue (d En V1, DENV2, DENV3, De NV4) y virus de la fiebre amarilla (YFV), familia: Flaviviridae, género: Flavivirus), virus vaccinia (VV), familia: Poxviridae, género: Orthopoxvirus) y virus influenza (familia: Orthomyxoviridae, género: Influenzavirus A)) en los que se encontró que la oxidación simple (por ejemplo, peróxido de hidrógeno (H2O2) solo) era subóptima. Para CHIKv , DENV y YFV, la antigenicidad in vitro se evaluó mediante pruebas ELISA específicas de virus basadas en anticuerpos monoclonales dirigidos a epítopos neutralizantes sensibles. La antigenicidad para la influenza se evaluó a través de la actividad de hemaglutinación (HA), una medición directa de la función de la proteína viral.La potenciación in vivo de los antígenos vacunales se evaluó mediante ensayos inmunitarios humorales funcionales, tales como valores de anticuerpos neutralizantes (CHIKV, DENV y YFV) o respuestas de inhibición de la hemaglutinación (HAI, influenza) después de la vacunación.
Se demostró con éxito que las condiciones de inactivación basadas en la oxidación dual descrita mejoran el mantenimiento de la antigenicidad in vitro en comparación, por ejemplo, con H2O2 solo, y para CHIKV, DENV, YFV e influenza, el enfoque de inactivación basado en la oxidación dual demostró una alta antigenicidad, así como la inactivación completa del virus. Cuando estas vacunas se ensayaron in vivo, proporcionaron respuestas inmunitarias antivirales equivalentes o superiores a las que se logran mediante condiciones estándar de inactivación basada en H2O2 y, en algunos casos, equivalentes a las observadas con virus vivos. Por lo tanto, la oxidación dual descrita realizada usando química de tipo Fenton proporciona una fuerte inactivación de patógenos con propiedades antigénicas mantenidas, y mejora las respuestas inmunitarias después de la vacunación.
Reacciones de tipo Fenton
Las reacciones químicas de tipo Fenton se describen generalmente (por ejemplo, por Barbusinski, K., Fenton Reaction - Controversy concerning the chemistry. Ecological Chemistry and Engineering, 2009. 16(3): pág. 347-358; usando la siguiente ecuación química:
Mn+ H2O2 ^ M(n+1)+ HO- HO^ (ec. 1)
En la ecuación 1, M es un metal de transición que puede interactuar con H2O2. Esta reacción conduce a la descomposición de H2O2, dando como resultado la producción de un ion hidroxilo (HO-) y el radical hidroxilo altamente reactivo (HO^). Cabe apreciar que determinados metales de transición, tales como Fe y Cu, se consideran particularmente activos redox y más eficientes para promover esta reacción. En la reacción completa, el ion metálico vuelve a su estado de oxidación original a través de una reacción adicional con H2O2, lo que convierte al ion metálico en un verdadero catalizador (/d).Como ejemplo, la reacción general con Cu2+ se puede escribir de la siguiente manera:
Cu2+ H2O2 ^ Cu+ HO2 ^ H+ (ec. 2)
Cu+ H2O2 ^ Cu2+ HO- HO^ (ec. 3)
En la ecuación 2, H2O2 actúa como agente reductor, reduciendo Cu2+ en Cu+. En la ecuación 3, Cu+, a su vez, reduce el H2O2, lo que conduce a la producción del radical hidroxilo reactivo y vuelve al estado de oxidación de Cu2+, lo que permite rondas posteriores de catálisis. Como se ha descrito, puede haber reacciones secundarias adicionales que se produzcan durante las reacciones de tipo Fenton (/d).
El uso de la técnica anterior de la oxidación de tipo Fenton era solo como un sistema de esterilización y descontaminación de patógenos de base amplia.
Como se ha mencionado anteriormente, similar al caso de los usos desinfectantes independientes de H2O2 antes de las Patentes de EE.UU. N.° 8.124.397 y 8.716.000 de los Solicitantes, anteriores a la presente descripción, las reacciones de tipo Fenton se conocían en la técnica solo para la inactivación/esterilización de patógenos microbianos (por ejemplo, véase Sagripanti, J.L., L.B. Routson y C.D. Lytle, Virus inactivation by copper or iron ions alone and in the presence of peroxide. Appl Environ Microbiol, 1993. 59(12): pág. 4374-6; Nieto-Juarez, J.I., et al., Inactivation of MS2 coliphage in Fenton and Fenton-like systems: role of transition metals, hydrogen peroxide and sunlight. Environ Sci Technol, 2010. 44(9): pág. 3351-6).
Por ejemplo, la oxidación de tipo Fenton ha sido reconocida por múltiples grupos como una potente plataforma antimicrobiana. Los investigadores de la FDA detallaron por primera vez el estudio sistemático de las reacciones de tipo Fenton como un enfoque antimicrobiano, específicamente dirigido al uso en la esterilización de dispositivos médicos (Sagripanti, J.L., Metal-based formulations with high microbicidal activity. Appl Environ Microbiol, 1992. 58(9): pág. 3157-62). Utilizando el virus Junin (ARNmc, género: Arenavirus) como patógeno modelo, se observó una rápida inactivación tanto con Fe3+ como con Cu2+ como catalizadores en la reacción redox (ec. 1), funcionando tan bien como los enfoques de esterilización estándar (2 % de glutaraldehído) tras la optimización. Como señaló el autor en ese momento, el uso de cualquiera de estos metales era particularmente atractivo para fines médicos, dado que el suero humano normal contiene cantidades relativamente altas de Fe y Cu. Por ejemplo, los niveles totales de Cu en suero en sujetos normales varía entre 700-1500 pg/l (11-24 pM) (McClatchey, K.D., Clinical laboratory medicine. 2a ed. 2002, Filadelfia: Lippincott Wiliams & Wilkins. xiv, pág. 452), mientras que los niveles de Fe varían de 500-1700 pg/l (9-30 pM) (Lippincott Williams & Wilkins., Nursing. Deciphering diagnostic tests. Nursing. 2008, Filadelfia, PA: Wolters Kluwer/Lippincott Williams & Wilkins. vii, pág. 13). Este mismo grupo de investigación continuó ampliando la reacción de Fenton basada en Cu, demostrando actividad antimicrobiana contra múltiples dianas virales tal como el bacteriófago 9X174 (ADNmc), el bacteriófago T7 (ADNbc), virus del herpes simple ( h S v , ADNbc) y el bacteriófago 96 (ADNbc) (Sagripanti, J.L., L.B. Routson y C.D. Lytle, Virus inactivation by copper or iron ions alone and in the presence of peroxide. Appl Environ Microbiol, 1993. 59(12): pág. 4374-6). Estudios adicionales con HSV usando el sistema H2O2/Cu2+ (H2O2 al 0,01 %, Cu2+ 16 pM) confirmaron la rápida inactivación y sugirieron que la oxidación directa del ácido nucleico sustenta la inactivación viral (Sagripanti, J.L., et al., Mechanism of copper-mediated inactivation of herpes simplex virus. Antimicrob Agents Chemother, 1997. 41(4): pág. 812-7), con estudios de apoyo que demuestran la alta afinidad de Cu2+ por los ácidos nucleicos (Sagripanti, J.L., P.L. Goering y A. Lamanna, Interaction of copper with DNA and antagonism by other metals. Toxicol Appl Pharmacol, 1991. 110(3): pág. 477-85) y la capacidad de los sistemas H2O2/Cu2+ para inducir roturas catenarias en los ácidos nucleicos (Toyokuni, S. y J.L. Sagripanti, Association between 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine formation and DNA strand breaks mediated by copper and iron, in Free Radic Biol Med. 1996: United States. pág. 859-64). Varios otros grupos también han demostrado el potencial de inactivación de patógenos de los sistemas H2O2/Cu2+. Nieto-Juarez, et al., demostraron una rápida inactivación del bacteriófago MS2 (ARNmc) utilizando H2O2 50 pM (0,00017 %) y Cu2+ 1 pM, sugiriendo los autores su potencial para la descontaminación de aguas residuales (Nieto-Juarez, J.I., et al., Inactivation of MS2 coliphage in Fenton and Fentonlike systems: role of transition metals, hydrogen peroxide and sunlight. Environ Sci Technol, 2010. 44(9): pág. 3351-6) (véase también Nguyen, T.T., et al., Microbial inactivation by cupric ion in combination with H2O2: role of reactive oxidants. Environ Sci Technol, 2013. 47(23): pág. 13661-7).
En total, estos estudios de la técnica anterior se realizaron estrictamente en el contexto de la descontaminación y simplemente demostraron que se sabía que el sistema H2O2/Cu2+ era capaz de destruir/esterilizar eficazmente patógenos modelo.
La oxidación simple con H2O2 limitó la inmunogenicidad de la vacuna con determinados patógenos
Los solicitantes han demostrado previamente (por ejemplo, Patentes de EE.UU. N.° 8.124.397 y 8.716.000) que el uso exclusivo de H2O2 como agente de oxidación simple proporciona un agente de inactivación adecuado para diversas vacunas candidatas.
Sin embargo, durante el desarrollo continuo de la oxidación con H2O2 solo, se encontraron casos con determinados patógenos en los que la antigenicidad y la inmunogenicidad se redujeron durante el proceso de inactivación. Por ejemplo, durante el reciente desarrollo en etapa temprana de una vacuna candidata contra el virus chikungunya (CHIKV), se encontró, como se presenta en esta invención en el Ejemplo de trabajo 1, que el tratamiento con H2O2 al 3 % en condiciones estándar destruyó los epítopos neutralizantes y condujo a una pérdida casi completa de antigenicidad, según lo juzgado a través de pruebas de potencia in vitro utilizando MAb específicos de la envoltura (figura 2A). Esta pérdida de antigenicidad medida tuvo implicaciones significativas para la inmunogenicidad in vivo ya que los animales inmunizados con CHIKV inactivados con H2O2 no pudieron generar respuestas de anticuerpos antivirales neutralizantes medibles (figura 2B).
Los Solicitantes encontraron que la inactivación microbiana basada en la oxidación dual tiene un mecanismo fundamentalmente diferente en comparación con la oxidación simple con H2O2 solo, lo que desalentó inicialmente el uso potencial de la inactivación microbiana basada en la oxidación dual para el desarrollo de antígenos vacunales eficaces avanzados.
Si bien las reacciones de tipo Fenton solo se han utilizado en el estado de la técnica para destruir patógenos, y no se han utilizado ni sugerido para su uso en el desarrollo de vacunas, los Solicitantes ensayaron, no obstante, como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 2, tales reacciones para determinar el potencial para inactivar patógenos microbianos con el fin de producir vacunas. Los datos iniciales de inactivación fueron sorprendentes e inesperados porque, a diferencia de H2O2, se encontró que la concentración de proteína total de la solución durante el procedimiento de inactivación afecta a la cinética de inactivación con oxidación dual por H2O2/CuCl2. Se había demostrado previamente que la concentración de proteína no tiene impacto en la inactivación viral utilizando el enfoque estándar de H2O2 de los Solicitantes. Como se muestra en las figuras 1A y 1B para DENV2, utilizando el enfoque de oxidación dual, la concentración de proteína tuvo un impacto sustancial en la cinética de inactivación viral, con niveles más altos de proteína que llevaron a una inactivación más lenta del virus.
La dependencia inesperada de la concentración de proteína total de la solución durante la inactivación dual indicó que estaba involucrado un mecanismo fundamentalmente diferente en comparación con H2O2 solo, solo como en los procedimientos anteriores basados en oxidación simple de los Solicitantes (por ejemplo, con H2O2 solo) (por ejemplo, Patentes de EE.UU. N.° 8.124.397 y 8.716.000) y, por lo tanto, la eficacia/uso de un procedimiento de inactivación basado en oxidación dual para la producción eficaz de vacunas era totalmente cuestionable e impredecible.
Los solicitantes, a pesar del descubrimiento de un mecanismo dependiente de la concentración de proteína diferente, realizaron no obstante experimentos adicionales analizados en esta invención e incluidos en los ejemplos de trabajo a continuación, para mostrar que las reacciones de oxidación dual de tipo Fenton se pueden usar sorprendentemente para inactivar patógenos microbianos de manera eficaz y proporcionar vacunas altamente inmunógenas y eficaces.
Inactivación basada en oxidación dual en el desarrollo de antígenos vacunales avanzados.
La oxidación de tipo Fenton (por ejemplo, el sistema H2O2/Cu2+) no se ha usado ni sugerido para su uso en la técnica para el desarrollo de vacunas. A pesar del descubrimiento de los Solicitantes de que estaba involucrado un mecanismo fundamentalmente diferente (es decir, la dependencia de la concentración de proteína), los Solicitantes exploraron la utilidad de este sistema en el desarrollo de una vacuna candidata contra el CHlKv, ya que esta diana había demostrado una inmunogenicidad deficiente sin inducción de anticuerpos neutralizantes usando un enfoque estándar de inactivación de H2O2 (figuras 2A y 2B).
En primer lugar, se evaluó cada componente del sistema solo (H2O2 o CuCl2, una fuente de iones Cu2+) en términos de su capacidad respectiva para inactivar completamente el virus manteniendo la antigenicidad apropiada. La antigenicidad se define por la capacidad de medir epítopos de proteína intactos en la superficie del virus utilizando anticuerpos monoclonales que se unen a epítopos neutralizantes de virus específicos. Como alternativa, la antigenicidad estructural también se puede definir mediante ensayos de función/unión de proteínas fisiológicas, tales como los que se usan para medir la actividad de hemaglutinación del virus de la influenza. Los resultados de antigenicidad basados en la unión de anticuerpos monoclonales a CHIKV se muestran en esta invención en el Ejemplo de trabajo 3.
Las concentraciones crecientes de cualquiera de los reactivos de descontaminación (figuras 3A y 3B) condujeron a una inactivación mejorada, pero a expensas de una antigenicidad significativamente menor debido al daño de los epítopos neutralizantes.
Sorprendentemente, por el contrario, utilizando el sistema combinado de H2O2/CUCI2, se identificó una condición de inactivación óptima que mantuvo completamente la antigenicidad mientras conducía a la inactivación viral completa (figura 3C).
La vacunación contra el CHIKV con CuCl?/H?O7 generó valores de anticuerpos neutralizantes rápidos y sólidos, y demostró una protección total contra la enfermedad artrítica.
Para evaluar la inmunogenicidad del CHIKV candidato tratado con H2O2/CuCl2, se formuló un antígeno vacunal con adyuvante de alumbre y se usó para inmunizar ratones a varios niveles de dosis (10 o 40 pg por animal). Como se muestra en el presente documento en el Ejemplo de trabajo 4, la vacunación contra el CHIKV con CuCl2/H2O2 generó valores de anticuerpos neutralizantes rápidos y sólidos (figura 4), y demostró una protección total contra la enfermedad artrítica (figura 5).
La oxidación basada en ^ Q y/CuCb se utilizó con éxito en el desarrollo de una vacuna contra el YFV inactivado.
Basándose en los resultados alentadores demostrados con CHIKV, un alfavirus modelo, se exploró la utilidad del sistema para flavivirus tales como YFV.
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 5, el análisis preliminar sugirió que una concentración de H2O2 al 0,002 % y CuCl21 pM representaba un equilibrio funcional entre la antigenicidad y la inactivación rápida del virus (figura 6A). Utilizando una condición optimizada adicional de H2O2 al 0,10 % y CuCl21 pM (para asegurar la inactivación completa), se produjo material vacunal para YFV y se utilizó para inmunizar ratones BALB/c adultos. Después de la vacunación, todos los animales demostraron valores de neutralización medibles con un valor de neutralización promedio de 240, en comparación con un valor de neutralización de menos de 40 para los animales inmunizados con la vacuna contra el YFV preparada usando solo H2O2 solo (figura 6B). Estas diferencias en inmunogenicidad después de la vacunación podrían anticiparse basándose en el daño grave a los epítopos neutralizantes (es decir, antigenicidad) observado cuando el YFV se trató con H2O2 al 3 % durante 20 horas. Las figuras 6A y 6B muestran que la oxidación basada en H2O2/CuCl2 se utilizó con éxito en el desarrollo de una vacuna contra el YFV inactivado.
La oxidación basada en H2O2/CuCl2 se utilizó con éxito en el desarrollo de una vacuna contra el DENV inactivado.
Basándose en los resultados alentadores demostrados con el YFV, se ensayó otro flavivirus modelo, el dengue 3 (DENV3), en el sistema H2O2/CuCl2.
Como se muestra en el presente documento en el Ejemplo de trabajo 6, al igual que con el YFV, las pruebas iniciales indicaron que una concentración de H2O2 al 0,002 % y CuCl2 1 pM representaba un enfoque óptimo para mantener una alta antigenicidad al mismo tiempo que proporcionaba la inactivación completa del virus (figura 7). Utilizando estas condiciones de inactivación con H2O2/CuCl2 preliminares, se produjeron lotes de vacunas de cada serotipo de DENV, se formularon en una vacuna tetravalente contra el dengue adyuvada con hidróxido de aluminio al 0,10 % y se utilizaron para inmunizar macacos rhesus adultos. Después de una única inmunización de refuerzo, todos los monos se seroconvirtieron (NT50 S10), demostrando el enfoque de inactivación con H2O2/CuCl2 una mejora en las respuestas de anticuerpos neutralizantes para 3 de los 4 serotipos del virus del dengue y un aumento promedio de 8 veces en los valores medios geométricos en comparación a la inactivación con H2O2 solo (figura 8). Hubo una pequeña diferencia en la dosis de antígeno (1 pg/serotipo frente a 2 pg/serotipo) en estos estudios, por lo que el experimento se repitió en ratones que fueron vacunados con la misma dosis de antígeno de vacuna tetravalente contra el dengue (figura 9).
En estos experimentos, el enfoque de oxidación dual de la inactivación con H2O2/CuCl2 fue más inmunógeno que el H2O2 al 3 % para los 4 serotipos del virus del dengue y dio como resultado un aumento de 8 a >800 veces en los valores de anticuerpos neutralizantes.
La oxidación basada en CuCly/HyOy demostró una antigenicidad mejorada con el virus de la influenza
Dados los resultados positivos observados en dos familias de virus (Togaviridae y Flaviviridae), se eligió una familia de virus adicional a ensayar usando esta nueva plataforma de inactivación.
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo, la inactivación del virus de la influenza A (familia Orthomyxoviridae) se ensayó usando un enfoque estándar de H2O2 al 3 %, inactivación ultravioleta o el sistema optimizado de CuCl2/H2O2 (H2O2 al 0,002 % y CuCl2 1 pM). Para evaluar la antigenicidad, se utilizó un ensayo de valoración de actividad de hemaglutinación (HA). Los virus influenza aglutinan de forma natural los glóbulos rojos, y el mantenimiento de esta actividad durante la inactivación se considera clave para la inmunogenicidad del producto vacunal final. Como se muestra en la figura 10, el sistema de CuCh/H2O2 de los Solicitantes mantuvo valores de HA similares a los observados para el antígeno vivo no tratado. En comparación, la inactivación UV redujo la actividad de HA a un nivel insignificante. La consecuencia in vivo de esta destrucción de HA se puede ver en la figura 11, induciendo CuCl2/H2O2 valores sólidos de inhibición de hemaglutinina (HAI) de anticuerpos séricos protectores, mientras que el antígeno tratado con UV no indujo anticuerpos funcionales en ratones e indujo una protección mínima frente a una exposición letal.
Se pueden utilizar múltiples metales de transición en el enfoque de oxidación dual para el desarrollo de antígenos vacunales
Cu2+ (en forma de CuCb) fue el metal inicial ensayado en los estudios de desarrollo de antígenos vacunales de oxidación dual descritos para CHIKV, DENV, YFV y virus de la influenza. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, otros metales también tienen el potencial de funcionar de manera similar.
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 8, utilizando DENV3 como un virus modelo, los estudios de inactivación que consisten en CuCl2 (Cu2+), FeCb (Fe3+) o CsCl (Cs+) y diluciones de H2O2 se ensayaron para determinar su potencial en el desarrollo de antígeno vacunal.
Como se muestra en las figuras 12A-12C, los tres metales proporcionaron condiciones que mantuvieron altos niveles de antigenicidad mientras demostraban la inactivación completa del virus.
Las combinaciones de metales de transición demuestran una sinergia en el sistema de vacunas de oxidación dual
Como se ha mostrado anteriormente en la figura 11 y el Ejemplo de trabajo 8, se pueden usar diferentes metales en combinación para mejorar la inactivación con H2O2 de virus.
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 9, para investigar los efectos sinérgicos potenciales, el virus modelo DENV3 se inactivó con combinaciones de CuCh (Cu2+) y FeCb (Fe3+) en una cantidad establecida de H2O2 (0,01 %). Varias condiciones de CuCb/FeCb proporcionaron una inactivación completa manteniendo una buena antigenicidad, lo que demuestra que es factible usar varios metales en la misma condición de inactivación (figura 13). De hecho, a concentraciones de CuCl2 de 0,05 pM y 0,10 pM, el aumento de las concentraciones de FeCb mejoró la antigenicidad, lo que indica una sinergia con estos dos metales.
Se utilizó oxidación dual para proporcionar una inactivación optimizada de Campylobacter para un mejor mantenimiento de la morfología bacteriana
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 10, Campylobacter son pequeñas bacterias en forma de sacacorchos que típicamente tienen ~0,2 pm de diámetro y ~2-8 pm de longitud (figura 14A).
Después de la inactivación con una solución estándar de H2O2 al 3 % durante 5 horas a temperatura ambiente, las bacterias se dañaron sustancialmente con cambios claros en la morfología, incluida la pérdida de la estructura celular bruta y la formación de aglutinaciones sustanciales (figura 14B).
Sin embargo, tras la optimización de un enfoque de oxidación dual utilizando H2O2 al 0,01 % y CuCb 2 pM, los Solicitantes encontraron sorprendentemente que la oxidación dual podía inactivar por completo Campylobacter coli (C. coli) mientras mantenía una excelente morfología bacteriana durante todo el período de tratamiento con microbios que permanecían indistinguibles de los controles no tratados (figura 14C).
Además de la estructura conservada, un parámetro crítico para preparar una vacuna de células completas inactivadas es asegurar la inactivación completa de los microbios. Utilizando las condiciones óptimas descritas anteriormente, se realizaron estudios de cinética de inactivación. Como se muestra en la figura 15, C. coli demostró una rápida inactivación, con una semivida de tasa de descomposición de (T1/2) de -15 minutos. Estas cinéticas indican >20 log de inactivación durante el período completo de inactivación de 20 h. Según los valores bacterianos en los lotes de fabricación piloto (~109 UFC/ml), este nivel de inactivación proporciona un alto margen de seguridad durante el proceso de fabricación (hasta 100 millones de veces de inactivación en exceso teórica) mientras se mantiene la estructura bacteriana general (figura 14C).
La vacunación contra C. coli con CuCb/HyQ? proporcionó inmunidad protectora en macacos rhesus
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 11, los Solicitantes determinaron la eficacia de la vacuna en 60 macacos rhesus inmunizados contra C. coli con CuCb/H2O2 de dos grupos de alojamientos protegidos al aire libre, y a continuación controlaron a los animales para determinar enfermedades entéricas confirmadas por cultivo de Campylobacter.
Para este estudio, los animales se vacunaron por vía intramuscular con la vacuna candidata contra C. coli de CuCb/H2O2 (inactivada usando H2O2 al 0,01 % y CuCl2 2 pM), con una dosis de refuerzo administrada 6 meses después. Los grupos vacunados se seleccionaron en función del historial previo de la enfermedad, y se dio preferencia a los grupos que tenían tasas de incidencia históricamente altas de infección por Campylobacter. Este enfoque proporcionó una mayor solidez en la evaluación de la eficacia protectora. Todos los adultos/jóvenes (n = 59) recibieron una dosis con adyuvante de alumbre de 40 pg, y 2 lactantes pequeños (<2 kg de peso corporal) recibieron la mitad de la dosis (20 pg). Según el protocolo, cualquier animal diagnosticado con diarrea asociada a Campylobacter durante los primeros 14 días después de la vacunación sería excluido ya que es poco probable que ocurra protección mediada por la vacuna durante este período temprano. Un animal adulto fue excluido del estudio debido a diarrea asociada a Campylobacter el día después de la vacunación. Se recogieron muestras de suero de todos los animales vacunados restantes (n = 59) el día 0 y 6 meses después de la vacunación primaria, momento en el que los animales recibieron una dosis de refuerzo de la vacuna.
Después de la vacunación primaria, los Solicitantes observaron un aumento significativo en los valores de anticuerpos séricos específicos de Campylobacter (figura 16A, P <0,001) además de protección contra la enfermedad diarreica asociada a Campylobacter en comparación con años anteriores dentro del mismo grupo de refugio (figura 16B, P = 0,038) o en comparación con otros grupos de refugio durante la temporada de Campylobacter de 2015 (figura 16C, P = 0,020). La salud de los PNH se controla a diario y los casos de enfermedades diarreicas se documentan en una base de datos central consultable. La incidencia de diarrea se controló en la cohorte vacunada y se comparó con aproximadamente 1.000 animales de control no vacunados en otros grupos de refugio similares. Se recogieron muestras fecales de cualquier animal que experimentara un episodio de diarrea y se analizaron para detectar C. coli, C. jejuni y Shigella spp. ya que estos representan los principales patógenos entéricos asociados con la diarrea entre los animales.
El análisis intermedio a los 6 meses después de la vacunación primaria no demostró casos de diarrea asociada a C. coli o C. jejuni en el grupo vacunado frente a 76 casos de diarrea asociada a Campylobacter entre los animales no vacunados, lo que representa un efecto protector estadísticamente significativo contra la enfermedad diarreica con cultivo positivo para Campylobacter (P =0,035) después de una sola vacunación.
Dado que casi todas las vacunas humanas requieren al menos dos dosis para una eficacia protectora óptima y la durabilidad de la memoria inmunológica a menudo mejora después de la vacunación de refuerzo, los Solicitantes siguieron el enfoque conservador de administrar una vacunación de refuerzo en el punto temporal de 6 meses y a continuación continuando controlando la incidencia de enfermedades diarreicas entre los PNH. A los 250 días después de la vacunación primaria, continuaron acumulándose más casos de enfermedad entérica asociada a Campylobacter entre la población no vacunada (alcanzando el 8,7 % o un total de 92 animales), mientras que ninguno de los animales (0/59) de la cohorte vacunada mostró signos de la enfermedad y la significación estadística entre los dos grupos aumentó a P = 0,020.
Reactivos de metisazona
Como se ha descrito y analizado en detalle anteriormente, los metales de transición oxidantes (por ejemplo, Cu2+, Fe3+, etc.) se pueden usar junto con la plataforma de desarrollo de vacunas a base de peróxido para mejorar la inactivación de virus y limitar el daño antigénico. Sin embargo, para algunos patógenos se observó que la degradación antigénica puede producirse incluso cuando se usa este enfoque avanzado de oxidación dual. Para mejorar aún más el desarrollo de vacunas, se buscaron/seleccionaron compuestos adicionales en busca de la capacidad de interactuar sinérgicamente con este enfoque de inactivación basado en oxidación dual descrito para aumentar la tasa de inactivación y reducir aún más el daño a los antígenos proteicos inmunógenos. A través de esta búsqueda, la metisazona (N-metilisatin p-tiosemicarbazona, CAS 1910-68-5; C10H10N4OS; PM 234,3 Da; sinónimos: metisazona; Marboran; Marborano; 33T57; M-IBT; 1 -metilisatin 3-tiosemicarbazida; N-metilisatin p-tiosemicarbazona) se identificó por los Solicitantes. La metisazona es uno de una serie de fármacos antivirales desarrollados por la Wellcome Foundation en la década de 1950 (Thompson RL, et al., J Immunol. 1953;70:229-34; Bauer DJ., Br J Exp Pathol.
1955;36:105-14). Basándose en estudios de eficacia en animales pequeños con ortopoxvirus, la metisazona se convirtió en el producto comercial, Marboran®, y se ensayó en varios ensayos clínicos, incluido el tratamiento de las complicaciones de vaccinia, así como la profilaxis y el tratamiento de la viruela (Bauer DJ., Ann N YAcad Sci.
1965;130:110-7).
Según Bauer (Id), los primeros informes de casos para el uso de metisazona en el tratamiento de complicaciones de vaccinia (eczema vaccinatum y vaccinia gangrenosa) indican que puede haber sido eficaz, pero la falta de controles y el uso concomitante de gamma globulina antivacuna (en algunos casos) hace que sea difícil confirmar la eficacia. Sin embargo, la falta de eventos adversos graves es alentadora. Las dosis iniciales medias fueron de 152 mg/kg, con una dosis promedio total de 809 mg/kg administrada durante 3,75 días. Para un sujeto humano con un peso estimado de 70 kg, esto se traduciría en -10 g por dosis y -60 g por ciclo de tratamiento. Bauer menciona que la metisazona se usó profilácticamente antes de la vacunación contra vaccinia y se informó que reducía las complicaciones (Id).
Por lo tanto, los datos históricos in vivo demuestran que la metisazona es segura e incluso las cantidades mínimas de este compuesto no serán un problema en las nuevas vacunas y productos farmacéuticos.
Algunos de los datos más impresionantes para la metisazona se refieren a la profilaxis de la viruela como se informó durante un brote en Madrás, India (Bauer DJ et al., Lancet, 1963;2:494-6). De los contactos cercanos que recibieron metisazona, solo 3/1101 (0,27 %) desarrollaron viruela leve (ninguna muerte), mientras que 78/1126 (6,9 %) desarrollaron viruela, con 12 muertes. Al centrarse solo en sujetos no vacunados, 2/102 sujetos tratados con metisazona contrajeron viruela (2 %) mientras que 28/100 (28 %) de los controles no tratados contrajeron viruela, con 11 muertes. Las dosis se modificaron un poco a lo largo del ensayo y consistieron en (1) 1,5 g por vía oral dos veces al día después de las comidas durante 4 días (12 g en total); (2) 3 g por vía oral dos veces al día después de las comidas durante 4 días (24 g en total); (3) dos dosis de 3 g por vía oral en un período de 12 h (6 g en total). La metisazona, en combinación con CuSO4 , se ha descrito para la descontaminación de virus (Fox MP, et al., Ann N Y Acad Sci. 1977;284:533-43; Logan JC, et al., J Gen Virol. 1975;28:271-83), pero no para la producción de vacunas, y nunca se ha utilizado junto con H2O2.
Química de tipo Fenton más reactivos de metisazona
Sorprendentemente, los Solicitantes descubrieron que los reactivos de metisazona, como se describe en esta invención, interactúan sinérgicamente con el enfoque de inactivación basado en oxidación dual descrito actualmente para aumentar sustancialmente la tasa de inactivación reduciendo al mismo tiempo adicionalmente el daño a los antígenos proteicos inmunógenos.
Por lo tanto, en aspectos adicionales, los procedimientos de oxidación dual descritos que implican química de tipo Fenton comprenden además, como se describe con más detalle a continuación en los Ejemplos de trabajo, el uso de metisazona, análogos de metisazona o uno o más grupos/subestructuras funcionales de metisazona, proporcionando una inactivación microbiana incluso más eficaz en relación con la oxidación dual sola, y con una retención de la inmunogenicidad aún más eficaz en relación con la oxidación dual sola.
El modo de acción exacto de la metisazona en los procedimientos descritos no está claro, aunque los estudios han demostrado que la metisazona puede formar complejos con el cobre, y este complejo tiene la capacidad de unirse tanto a un ácido nucleico (Mikelens PE, et al., Biochem Pharmacol. 1976;25:821-7) como una proteína (Rohde W, et al., J Inorg Biochem. 1979;10:183-94). Para explicar los resultados de los Solicitantes, sin quedar ligados por el mecanismo, los Solicitantes plantearon la hipótesis de que el complejo de metisazona-cobre podría unirse preferentemente al ácido nucleico de todo el patógeno y, una vez unido, a continuación el H2O2 podría interactuar con el Cu2+ del complejo de metisazona-cobre en una reacción de tipo Fenton convencional para liberar radicales hidroxilo altamente activos en la proximidad del ácido nucleico unido (por ejemplo, una oxidación centrada en ácido nucleico). A continuación, esta liberación de radicales oxidativos puede conducir a un daño sustancial, pero localizado, del ácido nucleico y a la inactivación del patógeno. Por lo tanto, los Solicitantes especularon que podrían usarse cantidades más bajas de H2O2 que las que típicamente se necesitarían para inactivar patógenos, limitando así el daño externo/colateral a los epítopos de proteínas. Además, o como alternativa, también se ha demostrado que los compuestos de isatin p -tiosemicarbazona se unen directamente al ácido nucleico (Pakravan y Masoudian, Iran J Pharm Res. 2015;14:111-23), lo que sugiere que esta clase de compuestos solo puede abrir macromoléculas de ácido nucleico (por ejemplo, por intercalación y/o unión al surco menor). El Solicitante especuló que si esto fuera cierto, podría permitir un mayor acceso de los agentes oxidantes a la diana del ácido nucleico para mejorar la inactivación del virus basada en la oxidación.
La metisazona mejoró la tasa de inactivación de virus basada en oxidación simple y doble
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 12, los Solicitantes determinaron que la metisazona mejoró la tasa de inactivación de virus basada en oxidación simple y doble. Como se muestra en las figuras 17A-C, la adición de metisazona pudo aumentar sustancialmente la tasa de inactivación basada en la oxidación dual para el virus vaccinia (VV, genoma de ADN), así como el serotipo 4 del virus del dengue (DENV4, genoma de ARN) y el virus chikungunya (CHIKV, genoma de ARN).
Además, mientras que la metisazona sola tuvo un impacto mínimo en la inactivación del virus (figuras 17B y 17C), la metisazona y el H2O2 juntos (incluso en ausencia de cobre) demostraron una mejora sinérgica para la inactivación del virus. Por lo tanto, otros aspectos sorprendentes proporcionan procedimientos eficaces de oxidación simple que implican peróxido de hidrógeno (H2O2) que comprenden además, como se describe en más detalle a continuación, el uso de metisazona, análogos de metisazona, o uno o más grupos/subestructuras de metisazona, proporcionando una inactivación microbiana más eficiente con respecto a H2O2 solo, y con una retención eficaz de la inmunogenicidad.
La metisazona mejoró la tasa de inactivación bacteriana basada en oxidación dual
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 13, los Solicitantes determinaron que la metisazona mejoró la tasa de inactivación bacteriana basada en oxidación dual.
Los resultados del Ejemplo de trabajo 12 se extendieron a las bacterias codificadas por ADN (figuras 18A-C), en donde de nuevo la adición de metisazona al enfoque de oxidación dual (por ejemplo, H2O2/CuCb ) mejoró sustancialmente las tasas de inactivación de Campylobacter coli (una bacteria gramnegativa de ejemplo), Listeria monocytogenes (una bacteria grampositiva de ejemplo) y Shigella dysenteriae (una bacteria gramnegativa de ejemplo).
La metisazona mejoró las tasas de inactivación mientras mantenía la antigenicidad durante la inactivación de virus basada en oxidación dual
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 14, los Solicitantes determinaron que la metisazona mejoraba las tasas de inactivación mientras mantenía la antigenicidad durante la inactivación de virus basada en oxidación dual. Para evaluar el impacto de la metisazona en la antigenicidad durante la inactivación, los virus modelo de ejemplo CHIKV y DENV4 se trataron con múltiples enfoques de inactivación: alta concentración de H2O2 (sistema de oxidación simple), oxidación dual (como se describe en esta invención) u oxidación dual con metisazona. Como muestran los datos de ELISA en las figuras 19A (virus Chikungunya (CHIKV)) y 19B (serotipo 4 del virus del dengue (DENV4)), la adición de metisazona al enfoque de oxidación dual mantuvo o mejoró significativamente la antigenicidad al reducir el daño a los epítopos neutralizantes, al tiempo que aumentó la tasa de inactivación en aproximadamente 10 a 20 veces.
Análogos químicos de metisazona, o grupos/subestructuras funcionales de metisazona o combinaciones de los mismos que mejoran la inactivación y el mantenimiento de la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 15, los Solicitantes determinaron que los análogos químicos de metisazona, o grupos/subestructuras funcionales de metisazona o combinaciones de los mismos, mejoraron la inactivación y el mantenimiento de la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual.
Se ensayaron varios compuestos relacionados para determinar si proporcionaban mejoras similares a la inactivación de patógenos para el desarrollo de vacunas (figuras 20A-C). Como se muestra con el virus modelo de ejemplo DENV4, varios de estos compuestos, tales como isatin p-tiosemicarbazona y N-propilisatin p-tiosemicarbazona, demostraron resultados similares a los de la metisazona, incluidas tasas mejoradas de inactivación, mientras mantienen una antigenicidad superior en el sistema de oxidación dual. Curiosamente, cuando se usa solo el resto de tiosemicarbazida, aún se observa una mejora de la inactivación y una antigenicidad superior, mientras que la isatina o la semicarbazida no parecen aumentar la tasa de inactivación, pero aún demuestran protección de los antígenos de proteína contra el daño oxidativo durante la inactivación. Para explorar si los componentes principales separados (grupos/subestructuras funcionales) de los compuestos relacionados con la metisazona podrían combinarse para recapitular la inactivación óptima, se ensayaron mezclas de isatina tiosemicarbazida o isatina semicarbazida. Si bien la isatina semicarbazida aún demostraron protección antigénica, no hubo mejora de la inactivación del virus. Por el contrario, isatina tiosemicarbazida dieron como resultado tanto una rápida inactivación (más rápida que cualquiera de los componentes solos), así como en un gran aumento de la antigenicidad.
Niveles crecientes de metisazona con respecto al componente de metal de transición del sistema de oxidación dual mejoraron la antigenicidad y el perfil de inactivación del sistema de oxidación dual
Como se muestra en esta invención en el Ejemplo de trabajo 16, los Solicitantes determinaron que los niveles crecientes de metisazona con respecto al componente de metal de transición del sistema de oxidación dual mejoraron la antigenicidad y el perfil de inactivación del sistema de oxidación dual.
Se examinó el impacto de las concentraciones relativas de metisazona y el metal de transición en el sistema de oxidación dual (figura 21). Se descubrió que el aumento de las concentraciones de metisazona en relación con el metal de transición demostró mejoras concomitantes tanto en la antigenicidad conservada como en el aumento de las tasas de inactivación del virus, con una relación molar preferida de 10:1 (metisazona:metal de transición).
Los procedimientos de inactivación basados en oxidación dual, e incluidos aquellos que comprenden además el uso de un reactivo de metisazona, tienen una amplia utilidad en el desarrollo de vacunas avanzadas contra patógenos que tienen genomas de ARN o ADN, incluyendo, pero sin limitación, patógenos virales y bacterianos.
Como se ha analizado anteriormente, y se muestra en los ejemplos de trabajo en esta invención, se demostró que los procedimientos de inactivación basados en oxidación dual, e incluidos aquellos que comprenden además el uso de un reactivo de metisazona, tienen utilidad en no solo ocho virus en cuatro familias virales diferentes, sino también para tres especies bacterianas de ejemplo (por ejemplo, Campylobacter, una bacteria gramnegativa, de las cuales al menos una docena de especies se han visto implicadas en enfermedades humanas, siendo C. jejuni y C. coli las más comunes), Listeria monocytogenes (una bacteria grampositiva de ejemplo) y Shigella dysenteriae (una bacteria gramnegativa de ejemplo).
Según aspectos adicionales, los procedimientos de inactivación basados en oxidación dual, e incluyendo aquellos que comprenden además el uso de un reactivo de metisazona, tienen utilidad para producir vacunas altamente inmunógenas usando, pero sin limitación, los siguientes microbios ejemplo:
Virus.Los ejemplos no limitantes de virus que pueden inactivarse usando oxidación dual incluyen las siguientes familias: Adenoviridae, Alloherpesviridae, Alphaflexiviridae, Alphaherpesvirinae, Alphatetraviridae, Alvernaviridae, Amalgaviridae, Ampullaviridae, Anelloviridae, Arenaviridae, Arteriviridae, Ascoviridae, Asfarviridae, Astroviridae, Autographivirinae, Avsunviroidae, Baculoviridae, Barnaviridae, Benyviridae, Betaflexiviridae, Betaherpesvirinae, Bicaudaviridae, Bidnaviridae, Birnaviridae, Bornaviridae, Bromoviridae, Bunyaviridae, Caliciviridae, Carmotetraviridae, Caulimoviridae, Chordopoxvirinae, Chrysoviridae, Circoviridae, Clavaviridae, Closteroviridae, Comovirinae, Coronaviridae, Coronavirinae, Corticoviridae, Cystoviridae, Densovirinae, Dicistroviridae, Endornaviridae, Entomopoxvirinae, Eucampyvirinae, Filoviridae, Flaviviridae, Fuselloviridae, Gammaflexiviridae, Gammaherpesvirinae, Geminiviridae, Globuloviridae, Gokushovirinae, Guttaviridae, Hepadnaviridae, Hepeviridae, Herpesviridae, Hypoviridae, Hytrosaviridae, Iflaviridae, Inoviridae, Iridoviridae, Leviviridae, Lipothrixviridae, Luteoviridae, Malacoherpesviridae, Marnaviridae, Marseilleviridae, Megabirnaviridae, Mesoniviridae, Metaviridae, Microviridae, Mimiviridae, Myoviridae, Nanoviridae, Narnaviridae, Nimaviridae, Nodaviridae, Nudiviridae, Nyamiviridae, Ophioviridae, Orthomyxoviridae, Orthoretrovirinae, Papillomaviridae, Paramyxoviridae, Paramyxovirinae, Partitiviridae, Parvoviridae, Parvovirinae, Peduovirinae, Permutotetraviridae, Phycodnaviridae, Picobirnaviridae, Picornaviridae, Picovirinae, Plasmaviridae, Pneumovirinae, Podoviridae, Polydnaviridae, Polyomaviridae, Pospiviroidae, Potyviridae, Poxviridae, Pseudoviridae, Quadriviridae, Reoviridae, Retroviridae, Rhabdoviridae, Roniviridae, Rudiviridae, Secoviridae, Sedoreovirinae, Siphoviridae, Sphaerolipoviridae, Spinareovirinae, Spiraviridae, Spounavirinae, Spumaretrovirinae, Tectiviridae, Tevenvirinae, Togaviridae, Tombusviridae, Torovirinae, Totiviridae, Turriviridae, Tymoviridae y Virgaviridae.
Las especies virales de ejemplo incluyen poliovirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de la parainfluenza, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la rubéola, virus de la encefalitis equina oriental, occidental y venezolana, virus lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus del Nilo Occidental, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis japonesa, virus de Zika, virus varicela zóster, citomegalovirus, virus del herpes simple, retrovirus, incluido el VIH (virus de la inmunodeficiencia humana), virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de la influenza, virus de la rabia, molusco contagioso, virus de la viruela, virus vaccinia, virus sindbis, virus de la influenza porcina, parvovirus porcino, circovirus porcino, virus chikungunya, virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino, virus del moquillo canino, parvovirus canino, adenovirus canino tipo 2, virus de la parainfluenza canina y coronavirus canino.
Bacterias. Los patógenos bacterianos también se pueden inactivar usando oxidación dual, e incluyendo oxidación dual que comprende además el uso de un reactivo de metisazona, para su uso en la producción de composiciones vacunales altamente inmunógenas. Los ejemplos no limitantes de bacterias que se pueden inactivar mediante oxidación dual incluyen las siguientes familias:
Acanthopleuribacteraceae, Acetobacteraceae, Acholeplasmataceae, Acholeplasmataceae, Acidaminococcaceae, Acidilobaceae, Acidimicrobiaceae, Acidimicrobiaceae, Acidithiobacillaceae, Acidobacteriaceae, Acidothermaceae, Actinomycetaceae, Actinopolysporaceae, Actinospicaceae, Actinosynnemataceae, Aerococcaceae, Aeromonadaceae, Akkermansiaceae, Alcaligenaceae, Alcaligenaceae, Alcanivoracaceae, Algiphilaceae, Alicyclobacillaceae, Alteromonadaceae, Anaerolineaceae, Anaeroplasmataceae, Anaeroplasmataceae, Anaplasmataceae, Aquificaceae, Aquificaceae, Archaeoglobaceae, Armatimonadaceae, Aurantimonadaceae, Bacillaceae, Bacteriovoracaceae, Bacteroidaceae, Bacteroidaceae, Bartonellaceae, Bartonellaceae, Bdellovibrionaceae, Beijerinckiaceae, Beijerinckiaceae, Beutenbergiaceae, Bifidobacteriaceae, Blattabacteriaceae, Bogoriellaceae, Brachyspiraceae, Bradyrhizobiaceae, Bradyrhizobiaceae, Brevibacteriaceae, Brevinemataceae, Brucellaceae, Brucellaceae, Burkholderiaceae, Burkholderiaceae, Caldicoprobacteraceae, Caldilineaceae, Caldisericaceae, Caldisphaeraceae, Campylobacteraceae, Cardiobacteriaceae, Carnobacteriaceae, Caryophanaceae, Catalimonadaceae, Catenulisporaceae, Caulobacteraceae, Caulobacteraceae, Celerinatantimonadaceae, Cellulomonadaceae, Chitinophagaceae, Chlamydiaceae, Chlamydiaceae, Chlorobiaceae, Chlorobiaceae, Chloroflexaceae, Christensenellaceae, Chromatiaceae, Chrysiogenaceae, Chrysiogenaceae, Chthonomonadaceae, Clostridiaceae, Cohaesibacteraceae, Colwelliaceae, Comamonadaceae, Comamonadaceae, Conexibacteraceae, Coriobacteriaceae, Coriobacteriaceae, Corynebacteriaceae, Coxiellaceae, Crenotrichaceae, Cryomorphaceae, Cryptosporangiaceae, Cyclobacteriaceae, Cystobacteraceae, Cytophagaceae, Deferribacteraceae, Deferribacteraceae, Defluviitaleaceae, Dehalococcoidaceae, Deinococcaceae, Demequinaceae, Dermabacteraceae, Dermacoccaceae, Dermatophilaceae, Desulfarculaceae, Desulfobacteraceae, Desulfobulbaceae, Desulfohalobiaceae, Desulfomicrobiaceae, Desulfonatronaceae, Desulfovibrionaceae, Desulfurellaceae, Desulfurobacteriaceae, Desulfurococcaceae, Desulfuromonadaceae, Dictyoglomaceae, Dictyoglomaceae, Dietziaceae, Ectothiorhodospiraceae, Ehrlichiaceae, Elusimicrobiaceae, Enterobacteriaceae, Enterococcaceae, Entomoplasmataceae, Entomoplasmataceae, Erysipelotrichaceae, Erysipelotrichaceae, Erythrobacteraceae, Eubacteriaceae, Euzebyaceae, Ferrimonadaceae, Ferroplasmaceae, Fervidicoccaceae, Fibrobacteraceae, Fimbriimonadaceae, Flammeovirgaceae, Flavobacteriaceae, Flexibacteraceae, Francisellaceae, Frankiaceae, Fusobacteriaceae, Fusobacteriaceae, Gaiellaceae, Gallionellaceae, Gemmatimonadaceae, Geobacteraceae, Geodermatophilaceae, Glycomycetaceae, Gordoniaceae, Gracilibacteraceae, Granulosicoccaceae, Hahellaceae, Halanaerobiaceae, Halobacteriaceae, Halobacteroidaceae, Halomonadaceae, Haloplasmataceae, Halothiobacillaceae, Helicobacteraceae, Heliobacteriaceae, Herpetosiphonaceae, Holophagaceae, Holosporaceae, Holosporaceae, Hydrogenophilaceae, Hydrogenophilales, Hydrogenothermaceae, Hydrogenothermaceae, Hyphomicrobiaceae, Hyphomicrobiaceae, Hyphomonadaceae, Iamiaceae, Idiomarinaceae, Ignavibacteriaceae, Intrasporangiaceae, Jiangellaceae, Jonesiaceae, Kiloniellaceae, Kineosporiaceae, Kofleriaceae, Kordiimonadaceae, Ktedonobacteraceae, Lachnospiraceae, Lactobacillaceae, Legionellaceae, Lentisphaeraceae, Leptospiraceae, Leptospiraceae, Leptotrichiaceae, Leuconostocaceae, Listeriaceae, Litoricolaceae, Magnetococcaceae, Marinilabiliaceae, Methanobacteriaceae, Methanocaldococcaceae, Methanocellaceae, Methanococcaceae, Methanocorpusculaceae, Methanomicrobiaceae, Methanopyraceae, Methanoregulaceae, Methanosaetaceae (ilegítima), Methanosarcinaceae, Methanospirillaceae, Methanothermaceae, Methermicoccaceae, Methylobacteriaceae, Methylobacteriaceae, Methylococcaceae, Methylocystaceae, Methylocystaceae, Methylophilaceae, Methylophilaceae, Microbacteriaceae, Micrococcaceae, Micromonosporaceae, Microsphaeraceae, Mooreiaceae, Moraxellaceae, Moritellaceae, Mycobacteriaceae, Mycoplasmataceae, Mycoplasmataceae, Myroidaceae, Myxococcaceae, Nakamurellaceae, Nannocystaceae, Natranaerobiaceae, Nautiliaceae, Neisseriaceae, Nevskiaceae, Nitriliruptoraceae, Nitrosomonadaceae, Nitrospinaceae, Nocardiaceae, Nocardioidaceae, Nocardioidaceae, Nocardiopsaceae, Oceanospirillaceae, Oleiphilaceae, Oligosphaeraceae, Opitutaceae, Orbaceae, Oscillochloridaceae, Oscillospiraceae, Oxalobacteraceae, Oxalobacteraceae, Paenibacillaceae, Parachlamydiaceae, Parachlamydiaceae, Parvularculaceae, Pasteurellaceae, Pasteuriaceae, Patulibacteraceae, Peptococcaceae, Peptostreptococcaceae, Peredibacteraceae, Phaselicystidaceae, Phycisphaeraceae, Phyllobacteriaceae, Phyllobacteriaceae, Picrophilaceae, Piscirickettsiaceae, Planctomycetacea, Planctomycetaceae, Planococcaceae, Polyangiaceae, Porphyromonadaceae, Porphyromonadaceae, Prevotellaceae, Prevotellaceae, Promicromonosporaceae, Propionibacteriaceae, Pseudoalteromonadaceae, Pseudomonadaceae, Pseudonocardiaceae, Psychromonadaceae, Puniceicoccaceae, Pyrodictiaceae, Rarobacteraceae, Rhabdochlamydiaceae, Rhizobiaceae, Rhizobiaceae, Rhodobacteraceae, Rhodobacteraceae, Rhodobiaceae, Rhodobiaceae, Rhodocyclaceae, Rhodospirillaceae, Rhodospirillaceae, Rhodothermaceae, Rickettsiaceae, Rickettsiaceae, Rikenellaceae, Rikenellaceae, Roseiflexaceae, Ruaniaceae, Rubritaleaceae, Rubrobacteraceae, Rubrobacteraceae, Ruminococcaceae, Sandaracinaceae, Sanguibacteraceae, Saprospiraceae, Schleiferiaceae, Segniliparaceae, Serpulinaceae, Shewanellaceae, Simkaniaceae, Simkaniaceae, Sinobacteraceae, Sneathiellaceae, Solimonadaceae, Solirubrobacteraceae, Sphaerobacteraceae, Sphaerobacteraceae, Sphingobacteriaceae, Sphingomonadaceae, Sphingomonadaceae, Spirillaceae, Spirochaetaceae, Spirochetaceae, Spiroplasmataceae, Spiroplasmataceae, Sporichthyaceae, Sporolactobacillaceae, Staphylococcaceae, Streptococcaceae, Streptomycetaceae, Streptosporangiaceae, Succinivibrionaceae, Sulfolobaceae, Sutterellaceae, Synergistaceae, Syntrophaceae, Syntrophobacteraceae, Syntrophomonadaceae, Syntrophorhabdaceae, Thermaceae, Thermithiobacillaceae, Thermoactinomycetaceae, Thermoanaerobacteraceae, Thermoanaerobacteriaceae, Thermococcaceae, Thermodesulfobacteriaceae, Thermodesulfobacteriaceae, Thermodesulfobiaceae, Thermofilaceae, Thermogemmatisporaceae, Thermoleophilaceae, Thermolithobacteraceae, Thermomicrobiaceae, Thermomonosporaceae, Thermoplasmataceae, Thermoproteaceae, Thermosporotrichaceae, Thermotogaceae, Thioalkalispiraceae, Thiotrichaceae, Trueperaceae, Tsukamurellaceae, Turicibacteraceae, Veillonellaceae, Verrucomicrobiaceae, Verrucomicrobiaceae, Vibrionaceae, Victivallaceae, Waddliaceae, Waddliaceae, Williamsiaceae, Xanthobacteraceae, Xanthomonadaceae, Yaniellaceae, Aurantimonadaceae, Cenarchaeaceae, Haliangiaceae, Hydrogenimonaceae, Kordiimonadaceae, Mariprofundaceae, Nitrospiraceae, Parvularculaceae, Procabacteriaceae, Saccharospirillaceae y Salinisphaeraceae.
Las especies bacterianas de ejemplo incluyen especies (spp.) de Campylobacter, Shigella spp., Mycobacterium spp., Neisseria spp., Brucella spp., Borrelia spp., Chlamydia spp., Listeria monocytogenes, Bordatella pertussis, Clostridium spp., Enterococcus spp., Escherichia spp., Francisella tularensis, Haemophilus influenzae, Helicobacter pylori, Legionella pneumophila, Leptospira interrogans, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Rickettsia rickettsii, Salmonella spp., Staphylococcus aureus, y Bacillum anthracis.Generalmente se abarcan las bacterias grampositivas y gramnegativas, por ejemplo.
Hongos. Las composiciones vacunales altamente inmunógenas también se pueden producir a partir de patógenos fúngicos inactivados mediante oxidación dual. Los patógenos fúngicos de ejemplo incluyen: Aspergillus spp., Candida spp, Blastomyces spp., Coccidioides spp., Cryptococcus spp., Fusarium spp., Histoplasma spp., Mucorales spp., Pneumocystis spp., Trichophyton spp., Epidermophyton spp., Microsporum spp, Sporothrix spp., Exserohilum spp. y Cladosporium spp.
Parásitos. Los procedimientos descritos en esta invención también se pueden usar para inactivar parásitos (por ejemplo, parásitos intracelulares) para vacunas altamente inmunógenas, y especialmente parásitos protozoarios, tales como Plasmodium falciparum y otras especies de Plasmodium spp., Leishmania spp., Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, Trypanosoma spp., así como especies de Toxoplasma, Eimeria, Theileria y Babesia. Composiciones inmunógenas
Utilizando los procedimientos descritos, también se describen composiciones inmunógenas, tales como vacunas que contienen un patógeno inactivado, pero no se reivindican. Por ejemplo, la composición (o medicamento) puede ser una composición inmunógena liofilizada (por ejemplo, preparación vacunal) que contiene un patógeno que conserva uno o más epítopos antigénicos predominantes del patógeno biológicamente activo a partir del cual se preparó. La composición liofilizada puede prepararse sin conservantes y sin ningún agente inactivante (por ejemplo, sin H2O2, etc.). La composición también puede ser un líquido preparado reconstituyendo una composición liofilizada en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, la composición puede incluir un adyuvante adecuado que aumente la eficacia antigénica del antígeno.
La inactivación con el enfoque de oxidación dual descrito actualmente, e incluyendo aquellos que comprenden además el uso de un reactivo de metisazona, no solo proporciona procedimientos mejorados para la producción de vacunas, incluso para patógenos para los que no se pueden producir vacunas eficaces por otros procedimientos (incluyendo mediante peróxido solo), sino que también proporciona varios beneficios significativos adicionales en comparación con la inactivación UV, la inactivación por calor o la inactivación con formaldehído o betapropiolactona.
En primer lugar, la oxidación dual con peróxido de hidrógeno más iones de metales de transición (reacción de tipo Fenton), e incluyendo la oxidación dual que comprende además el uso de un reactivo de metisazona, es significativamente mejor que cualquiera de los otros procedimientos para mantener los epítopos inmunógenos. Por lo tanto, la inactivación por oxidación dual, e incluyendo la oxidación dual que comprende además el uso de un reactivo de metisazona, produce composiciones inmunógenas altamente eficaces, tales como vacunas, que se pueden usar para producir una respuesta inmunitaria que es mucho más probable que proteja contra la infección posterior por el patógeno vivo que las vacunas producidas utilizando procedimientos que desnaturalizan o destruyen epítopos inmunológicamente importantes.
En segundo lugar, a diferencia de otros agentes inactivadores químicos, tales como formaldehído o betapropiolactona, los iones de Cu y Fe utilizados en los procedimientos de oxidación dual descritos actualmente no solo se producen de forma natural en los sujetos, sino que están presentes en las reacciones en cantidades no tóxicas. Además, los metales de transición residuales y/o los reactivos de metisazona pueden eliminarse mediante purificación cadena abajo utilizando, por ejemplo, cromatografía de intercambio aniónico, filtración de flujo (por ejemplo, filtración de flujo tangencial), cromatografía de exclusión por tamaño, columnas de desalinización, diafiltración, diálisis, ultracentrifugación, purificación de gradiente de sacarosa, cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), etc.
Del mismo modo, cualquier peróxido de hidrógeno residual puede eliminarse de forma sustancial o completa de la composición vacunal mediante el uso de etapas de purificación posteriores como se ha descrito anteriormente para la eliminación opcional de metales de transición, o mediante el uso de liofilización. Por ejemplo, una solución que contiene un patógeno y peróxido de hidrógeno e iones de metales de transición se puede dispensar y liofilizar en viales estériles. Durante el proceso de liofilización, el peróxido de hidrógeno se elimina en forma de vapor, dejando una composición vacunal estable y estéril, que se puede almacenar fácilmente hasta que se necesite. La liofilización elimina parte, la mayoría o incluso todo el peróxido de hidrógeno detectable de la composición vacunal y, cuando se desee, produce una composición vacunal que está sustancialmente libre de peróxido de hidrógeno. La liofilización se puede realizar esencialmente mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica siempre que la temperatura se mantenga por debajo de aquella a la que se produce la desnaturalización por calor de los epítopos inmunógenos. Por lo tanto, la liofilización se puede realizar después de la congelación previa de la solución de peróxido de hidrógeno/patógeno) o sin congelación previa (por ejemplo, a temperatura ambiente por encima del punto de congelación, por ejemplo, utilizando un concentrador SPEED-VAC® en condiciones que mantienen la temperatura ambiente entre aproximadamente 0-4 °C y aproximadamente 42 °C). Con el propósito de fabricar composiciones inmunógenas, tales como vacunas, para la administración a sujetos humanos o animales, la liofilización se realiza típicamente según los buenos procedimientos de fabricación actuales (cGMP) para la producción de vacunas. La inactivación y la liofilización se pueden lograr sin ninguna etapa de procesamiento intermedia, tal como dilución, dialización, centrifugación o purificación. Siempre que la solución de patógeno/peróxido de hidrógeno se dispense (o se divida en alícuotas) en recipientes limpios y estériles (por ejemplo, viales, ampollas, tubos, etc.) antes de la liofilización, la composición vacunal resultante es estéril y no es necesario añadir conservantes adicionales antes de la administración. Por ejemplo, si la composición vacunal se va a administrar en una sola dosis, la composición vacunal liofilizada simplemente se suspende (o se disuelve) en un diluyente farmacéuticamente aceptable para producir una composición vacunal líquida sin conservantes. En el caso de que la composición vacunal liofilizada esté destinada a múltiples administraciones (por ejemplo, administración secuencial múltiple a un solo sujeto, o una o más administraciones a múltiples sujetos), el diluyente puede incluir un conservante farmacéuticamente aceptable.
Si se desea, los iones de metales de transición y/o el peróxido de hidrógeno se pueden eliminar mediante etapas de purificación como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, el H2O2 residual y los metales de transición (por ejemplo, Cu o Fe) se pueden eliminar mediante el uso de uno o más enfoques de purificación, tales como filtración de flujo tangencial, diálisis, columnas de desalinización, cromatografía de intercambio iónico (en condiciones que se unen al virus pero no a los componentes de inactivación residuales), cromatografía de afinidad, cromatografía de exclusión por tamaño, etc.
Como alternativa, se puede usar tanto bisulfito de sodio (NaHSO3) y/o metabisulfito de sodio (Na2S2Os) para neutralizar H2O2 (1 mol de metabisulfito se descompone en dos moles de bisulfito, que a continuación reaccionan directamente con H2O2).
Na2S2O5 2H2O ^ 2NaHSO3 H2O (1)
2NaHSO3 2H2O2 ^ 2NaHSO4 2H2O (2)
Antes del uso, la vacuna se puede reconstituir utilizando un diluyente farmacéuticamente aceptable para facilitar el suministro por medios de administración convencionales. Esto permite la producción de una composición vacunal estéril que no contiene cantidades dañinas de compuestos tóxicos y cancerosos, aumentando así la seguridad de la vacuna.
Además, después de la inactivación por oxidación dual, o la oxidación dual que comprende además el uso de un reactivo de metisazona, no hay necesidad de añadir un conservante (tal como timerosal) a la composición vacunal resultante. La composición estéril se puede mantener durante largos periodos de tiempo (por ejemplo, en estado liofilizado), haciendo innecesaria la adición de conservantes potencialmente tóxicos. Por lo tanto, las composiciones se pueden hacer para que estén sustancial o completamente libres de conservantes. Opcionalmente, se pueden proporcionar conservantes en la composición.
Los procedimientos de oxidación dual, e incluyendo aquellos que comprenden además el uso de un reactivo de metisazona, proporcionan composiciones inmunógenas, tales como una vacuna, y por lo tanto proporcionan procedimientos para preparar un medicamento que incluye un patógeno inactivado. Los procedimientos proporcionan composiciones que contienen un patógeno no infeccioso inmunológicamente activo que conserva epítopos inmunológicos predominantes del patógeno infeccioso a partir del cual se produce. Típicamente, el patógeno inactivado conserva uno, o más de uno, epítopos inmunológicamente dominantes que provocan una respuesta inmunitaria protectora contra el patógeno. Este procedimiento es adecuado para producir una composición inmunógena (por ejemplo, una vacuna) que contenga patógenos inactivados, incluidos virus, bacterias, hongos y parásitos, tales como parásitos intracelulares (por ejemplo, parásitos protozoarios). Opcionalmente, las composiciones contienen más de una especie o cepa de patógeno, por ejemplo, se pueden producir vacunas combinadas usando los procedimientos. Las composiciones pueden incluir una pluralidad de virus, por ejemplo, virus de las paperas, virus del sarampión y virus de la rubéola, y/u otros virus como se describe en esta invención. De manera similar, la composición puede incluir una pluralidad de bacterias, por ejemplo, especies de Campylobacter (spp.), Corynebacterium diphtheriae, Bordetella pertussis y Clostridium tetani, los agentes causantes de la diarrea, la difteria, la tos ferina y el tétanos, respectivamente, y/u otras bacterias como se describe en esta invención. La composición también puede incluir una pluralidad de patógenos seleccionados de diferentes clasificaciones (familias) de organismos.
Los procedimientos de oxidación dual implican poner en contacto el patógeno con una solución que contiene una cantidad eficaz del agente de oxidación dual (por ejemplo, reactivos de Fenton; peróxido de hidrógeno (H2O2) más iones de metales de transición), o con el agente de oxidación dual y un reactivo de metisazona, durante un período suficiente para que el patógeno no sea infeccioso. Opcionalmente, el patógeno se purifica o se aísla antes de ponerlo en contacto con el agente de oxidación dual.
Típicamente, la solución incluye al menos aproximadamente el 0,001 % o el 0,002 % de peróxido de hidrógeno (p/vol), y puede contener hasta aproximadamente el 0,10 % de peróxido de hidrógeno. Típicamente, la solución incluye al menos 1 pM o 2 pM de metal de transición (por ejemplo, CuCh). Más típicamente, se utiliza al menos el 0,001 % o el 0,002 % de peróxido de hidrógeno (p/vol) en combinación con al menos 1 pM o 2 pM de metal de transición (por ejemplo, CuCh). Por ejemplo, la solución puede incluir aproximadamente el 0,002 % de peróxido de hidrógeno (p/vol) y aproximadamente 1 pM o 2 pM de CuCh. En realizaciones adicionales, la concentración de peróxido de hidrógeno puede ser tan baja como del 0,0001 %, o tan alta como del 1,0 %, en combinación con los niveles de metal de transición descritos anteriormente. El intervalo de concentración de metales de transición puede ser tan bajo como 0,001 pM, o tan alto como 1000 pM, de nuevo con cualquiera de los niveles de peróxido de hidrógeno descritos. En las reacciones que comprenden un reactivo de metisazona, la cantidad preferida de reactivo de metisazona, análogos de metisazona o productos químicos que representan grupos funcionales de metisazona o subestructuras funcionales de metisazona puede ser tan baja como 0,01 pM o tan alta como 10.000 pM con cualquiera de los niveles de peróxido de hidrógeno o metales de transición descritos.
Si bien se encontró que el mecanismo de la inactivación de oxidación dual era sorprendentemente diferente (es decir, se encontró que dependía de la concentración de proteína) al de la oxidación mediada por peróxido de hidrógeno simple, los presentes Solicitantes han encontrado, no obstante, que las cantidades absolutas y/o relativas de peróxido de hidrógeno (peso/vol) y los iones de metales de transición (por ejemplo, CuCh) se pueden variar y ajustar para optimizar la inactivación mientras se mantiene la inmunogenicidad para una amplia gama de patógenos. Los Solicitantes han encontrado que tener dos variables (concentración de peróxido de hidrógeno y concentración de metal de transición) para variar, e incluso tres variables en reacción usando un reactivo de metisazona, proporciona una capacidad de ajuste preciso mejorada sobre los procedimientos de la técnica anterior que usaban un solo agente. Además, los Solicitantes han encontrado sorprendentemente (como se muestra en esta invención en los ejemplos de trabajo), que los dos componentes de Fenton (concentración de peróxido de hidrógeno y concentración de metales de transición), así como los reactivos de metisazona en reacciones que los incluyen, actúan en sinergia para proporcionar resultados que no pueden alcanzarse usando agentes únicos solos. Además, se pueden emplear combinaciones de metales de transición (por ejemplo, CuCh (Cu2+), FeCb (Fe3+) o CsCl (Cs+)), y reactivos de metisazona para aprovechar los efectos sinérgicos. Por ejemplo, a concentraciones de CuCh de 0,05 pM y 0,10 pM, el aumento de las concentraciones de FeCb mejoró la antigenicidad, lo que indica una sinergia con estos dos metales. Estos aspectos sinérgicos y de ajuste preciso respaldan una amplia utilidad para el enfoque de oxidación dual descrito actualmente.
El tiempo suficiente para inactivar completamente un patógeno puede variar entre varios minutos y varias horas. Por ejemplo, el patógeno puede ponerse en contacto con la solución de oxidación dual, o la solución de oxidación dual que comprende además un reactivo de metisazona, durante un tiempo dentro de un intervalo de aproximadamente 1 hora a 24 horas, o períodos más cortos. Típicamente, para las reacciones de oxidación dual, se usan aproximadamente 20 horas (más o menos 2 horas) cuando se usa al menos el 0,001 % o el 0,002 % de peróxido de hidrógeno (p/vol) en combinación con al menos 1 pM o 2 pM de metal de transición (por ejemplo, CuCh). Generalmente, el tiempo suficiente para inactivar el patógeno depende del patógeno particular y de la concentración de los reactivos, y un experto en la materia podrá determinar empíricamente la concentración de los reactivos, el tiempo de reacción requerido, y la temperatura de reacción, basándose en las presentes enseñanzas descritas. En realizaciones adicionales, la concentración de peróxido de hidrógeno puede ser tan baja como del 0,0001 %, o tan alta como del 1,0 %, en combinación con los niveles de metal de transición descritos anteriormente. El intervalo de concentración de metales de transición puede ser tan bajo como 0,001 pM, o tan alto como 1000 pM, de nuevo con cualquiera de los niveles de peróxido de hidrógeno descritos. La concentración preferida de reactivo de metisazona, análogos de metisazona o productos químicos que representan grupos funcionales de metisazona o subestructuras funcionales de metisazona puede ser tan baja como 0,01 pM o tan alta como 10.000 pM con cualquiera de los niveles de peróxido de hidrógeno o metales de transición descritos.
La inactivación de patógenos puede realizarse a cualquier temperatura entre la congelación y la temperatura a la que se desnaturalizan los epítopos inmunológicamente relevantes. Lo más común es que el proceso de inactivación se realice a una temperatura igual o superior a 4 °C y por debajo de aproximadamente 42 °C. Por ejemplo, a menudo es conveniente realizar la inactivación a temperatura ambiente o aproximadamente 25 °C.
En términos generales, se determina que las condiciones de oxidación dual, incluidas aquellas que comprenden además un reactivo de metisazona, proporcionan un alto margen de seguridad durante el proceso de fabricación (por ejemplo, inactivación teórica en exceso de hasta 100 millones de veces) mientras se mantiene la estructura antigénica general.
A continuación, el patógeno inactivado puede almacenarse durante períodos prolongados (por ejemplo, durante más de varios meses o más de 1 año). A continuación, la solución que contiene el patógeno inactivado puede administrarse directamente a un sujeto con el fin de provocar una respuesta inmunitaria contra el patógeno, por ejemplo, como una vacuna. Más comúnmente, la solución que incluye el patógeno inactivado se procesa o se liofiliza adicionalmente, como se ha descrito anteriormente, para producir una composición inmunógena.
Por lo tanto, la descripción proporciona composiciones inmunógenas (por ejemplo, vacunas) producidas según los procedimientos descritos en esta invención. Por ejemplo, la composición (por ejemplo, un medicamento) es una composición liofilizada y/o purificada que incluye un patógeno inactivado que conserva uno o más epítopos antigénicos predominantes del patógeno biológicamente activo. Típicamente, la composición está sustancial o completamente libre de conservantes o agentes inactivantes, tales como peróxido de hidrógeno, formaldehído o betapropiolactona. En otra realización, la composición es un líquido producido suspendiendo o disolviendo (solubilizando) la composición liofilizada o purificada en un diluyente farmacéuticamente aceptable. Opcionalmente, el diluyente contiene un conservante. Opcionalmente, la composición vacunal incluye un adyuvante. En forma liofilizada, el adyuvante puede ser, por ejemplo, un adyuvante de aluminio (por ejemplo, alumbre o una sal de aluminio). Tras la preparación de una formulación líquida a partir de la composición vacunal liofilizada, el adyuvante puede ser una formulación lipídica (por ejemplo, un aceite capaz de formar una emulsión). El genoma del patógeno inactivado puede comprender ARN o ADN.
TÉRMINOS
A menos que se indique de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la materia a la que pertenece la presente descripción. Pueden encontrarse definiciones de términos comunes en biología molecular en Benjamin Lewin, Genes V, publicado por Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew, et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, publicado por Blackwell Science Ltd., 1994 ( I S b N 0-632-02182-9); y Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, publicado por VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8).
Los términos singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referentes plurales, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, la palabra "o" pretende incluir "y" a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Aunque se pueden usar procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta invención en la práctica o ensayo de esta descripción, a continuación se describen procedimientos y materiales adecuados. El término "comprende" significa "incluye". La abreviatura, "p. ej." se deriva del latín exempli gratis, y se usa en esta invención para indicar un ejemplo no limitativo. Por lo tanto, la abreviatura "p. ej." es sinónimo de la expresión "por ejemplo".
Para facilitar la revisión de las diversas realizaciones de esta descripción, se proporcionan las siguientes explicaciones de términos específicos:
"Una composición inmunógena" o "composición vacunal" o "vacuna" es una composición de materia adecuada para su administración a un sujeto humano o animal que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria específica, por ejemplo, contra un patógeno. Como tal, una vacuna o composición inmunógena incluye uno o más antígenos o epítopos antigénicos. El antígeno puede estar en el contexto de una proteína aislada o un fragmento peptídico de una proteína, o puede ser una preparación parcialmente purificada derivada de un patógeno. Como alternativa, el antígeno puede estar en el contexto de un patógeno inactivado o vivo completo. Típicamente, cuando una vacuna o composición inmunógena incluye un patógeno vivo, el patógeno está atenuado, es decir, es incapaz de causar una enfermedad en un sujeto inmunológicamente competente. En otros casos, una vacuna o composición inmunógena incluye un patógeno inactivado (o muerto) completo. El patógeno inactivado puede ser un organismo patógeno de tipo natural que de otro modo (si no está inactivado) causaría una enfermedad en al menos una parte de los sujetos inmunológicamente competentes, o una cepa atenuada o mutante o un aislado del patógeno. En el contexto de esta descripción, las composiciones inmunógenas y/o vacunales contienen un patógeno completo (de tipo natural, atenuado o mutante).
Una "respuesta inmunitaria" es una respuesta de una célula del sistema inmunitario, tal como un linfocito B, un linfocito T o un monocito, a un estímulo. En algunos casos, una respuesta inmunitaria es una respuesta de linfocitos T, como una respuesta CD4+ o una respuesta CD8+. Como alternativa, la respuesta es una respuesta de linfocitos B, y da como resultado la producción de anticuerpos específicos. En algunos casos, la respuesta es específica para un antígeno particular (es decir, una "respuesta específica de antígeno"). Si el antígeno se deriva de un patógeno, la respuesta específica de antígeno es una "respuesta específica de patógeno". Una "respuesta inmunitaria protectora" es una respuesta inmunitaria que inhibe una función o actividad perjudicial de un patógeno, reduce la infección por un patógeno o disminuye los síntomas (incluida la muerte) que son resultado de la infección por el patógeno. Una respuesta inmunitaria protectora puede medirse, por ejemplo, mediante la inhibición de la replicación viral o la formación de placas en un ensayo de reducción de placas o un ensayo de neutralización ELISA, o midiendo la resistencia a la exposición viral in vivo.
Una "cantidad inmunológicamente eficaz" es una cantidad de una composición utilizada para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En el contexto de la administración de una vacuna, el resultado deseado es típicamente una respuesta inmunitaria protectora específica del patógeno. Sin embargo, para obtener inmunidad protectora frente a un patógeno en un sujeto inmunocompetente, normalmente se requieren múltiples administraciones de la composición vacunal. Por lo tanto, en el contexto de esta descripción, la expresión cantidad inmunológicamente eficaz abarca una dosis fraccionada que contribuye en combinación con administraciones previas o posteriores a lograr una respuesta inmunitaria protectora.
Un "antígeno" es un compuesto, composición o sustancia que puede estimular la producción de anticuerpos y/o una respuesta de linfocitos T en un animal, incluidas las composiciones que se inyectan, se absorben o se introducen de otro modo en un animal. El término "antígeno" incluye todos los epítopos antigénicos relacionados. El término "epítopo" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio en un antígeno al que responden los linfocitos B y/o T.
Los "epítopos antigénicos predominantes" son aquellos epítopos en los que se produce una respuesta inmunitaria del huésped funcionalmente significativa, por ejemplo, una respuesta de anticuerpos o una respuesta de linfocitos T. Por lo tanto, con respecto a una respuesta inmunitaria protectora frente a un patógeno, los epítopos antigénicos predominantes son aquellos restos antigénicos que, cuando son reconocidos por el sistema inmunitario del huésped, dan como resultado la protección frente a la enfermedad provocada por el patógeno.
El término "antigenicidad" se refiere al mantenimiento relativo de una o más estructuras epitópicas inmunógenas según se determina, por ejemplo, mediante diversas mediciones in vitro, tal como la unión de anticuerpos monoclonales específicos o ensayos de hemaglutinación. La "antigenicidad" en el contexto in vivo se denomina típicamente en esta invención como "inmunogenicidad".
Un "adyuvante" es un agente que potencia la producción de una respuesta inmunitaria de manera no específica. Los adyuvantes comunes incluyen suspensiones de minerales (por ejemplo, alumbre, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio) sobre las que se adsorbe el antígeno; o emulsiones de agua en aceite en las que se emulsiona una solución de antígeno en aceite (MF-59, adyuvante incompleto de Freund). Se pueden encontrar detalles adicionales sobre diversos adyuvantes en Derek O'Hagan Vaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Methods in Molecular Medicine) Humana Press, 2000.
Como se usa en esta invención, el término "patógeno" se refiere a un organismo que tiene un genoma de ARN o ADN, y abarca virus (tanto basados en genomas de ARN como de ADN), bacterias (basadas en genomas de ADN, tanto grampositivas como gramnegativas), hongos y parásitos. En aspectos preferidos particulares, "patógeno" se refiere a un organismo que tiene un genoma de ARN o ADN, y abarca virus (tanto basados en genoma de ARN como de ADN) y bacterias (basadas en el genoma de ADN, tanto grampositivas como gramnegativas).
La expresión "patógeno completo" se refiere a un organismo patógeno, tal como un virus, una bacteria, un hongo o un parásito, que incluye todos o sustancialmente todos los constituyentes de la forma infecciosa del organismo. Típicamente, un patógeno completo es capaz de replicarse. No obstante, la expresión "patógeno completo" es distinta de la expresión patógeno "de tipo natural", y la expresión "patógeno completo" abarca formas de tipo natural, así como atenuadas y otras formas mutantes del organismo patógeno. Por lo tanto, un patógeno completo puede ser un patógeno atenuado incapaz de provocar una enfermedad en un huésped inmunocompetente, pero que sin embargo incluye todos o sustancialmente todos los constituyentes de un patógeno infeccioso. De manera similar, un patógeno completo puede ser una forma mutante del patógeno, que carece de uno o más genes intactos (de tipo natural) y/o proteínas. El genoma del patógeno puede comprender ARN o ADN.
Un "patógeno inactivado" es un patógeno completo que se ha vuelto incapaz de provocar una enfermedad (por ejemplo, se ha vuelto no infeccioso) por medios artificiales. Típicamente, un patógeno inactivado es un "patógeno muerto" que es incapaz de replicarse. Un patógeno no es infeccioso cuando es incapaz de replicarse o no puede replicarse a niveles suficientes para provocar una enfermedad.
Como se usa en esta invención en relación con los métodos de los Solicitantes, una "vacuna inmunógenamente activa" es un patógeno inactivado por los procedimientos descritos que es capaz de provocar una respuesta inmunitaria cuando se introduce en un sujeto inmunológicamente competente. La respuesta inmunitaria producida en respuesta a la exposición a una vacuna inmunógenamente activa que comprende el patógeno inactivado como se describe en esta invención es preferentemente idéntica, sustancialmente idéntica o superior con respecto a la producida por los epítopos antigénicos predominantes del patógeno infeccioso respectivo.
El "peróxido de hidrógeno" (H2O2) es un ejemplo de agente de oxidación preferido con un potencial de electrodo estándar de 1,78 voltios. Con fines de consistencia, la proporción de peróxido de hidrógeno en una solución, como en los Ejemplos de trabajo descritos en esta invención, se da como peso por volumen (p/vol). Por ejemplo, H2O2 al 0,01 % se refiere a que H2O2 está presente al 0,01 % p/vol.
Como se usa en esta invención, un "agente de oxidación dual" se refiere a un reactivo de oxidación dual de tipo Fenton que comprende peróxido de hidrógeno y al menos un metal de transición (por ejemplo, CuCl2 (Cu2+), FeCh (Fe3+) o CsCl (Cs+)).
Una "solución que comprende el uno o más agentes de oxidación dual" incluye la combinación de cualquier mezcla de un disolvente y uno o más agentes de oxidación dual. Más comúnmente, en el contexto de los procedimientos descritos en esta invención, el disolvente es agua, por ejemplo, agua desionizada o una solución salina tamponada acuosa. Típicamente, el término solución incluye soluciones en fase líquida. Con fines de consistencia, la proporción de peróxido de hidrógeno en una solución se da como peso por volumen (p/vol).
La expresión "sustancialmente libre de peróxido de hidrógeno" indica que no hay más que cantidades traza (cantidades detectables empíricamente como fondo) en la composición.
El verbo "liofilizar" significa liofilizar al vacío. El proceso se denomina "liofilización". En algunos casos, la muestra que se va a secar (por ejemplo, deshidratar) se congela antes del secado. En otros casos, el material a secar se somete al proceso de secado sin cambio de fase previo. Durante el proceso de liofilización, la evaporación del disolvente da como resultado el enfriamiento de la muestra a temperaturas por debajo de la temperatura de fusión de la mezcla disolvente/soluto, lo que da como resultado la congelación de la muestra. El disolvente se elimina de la muestra congelada por sublimación. Un producto que se ha sometido a liofilización se "liofiliza". Como se usa en esta descripción, el término liofilización también abarca procedimientos funcionalmente equivalentes que aceleran el proceso de secado sin exponer la muestra a un calor excesivo, incluyendo específicamente: secado por aspersión y secado por congelación por aspersión.
El término "metisazona" y la expresión "análogo de metisazona", como se usan en esta invención en aspectos
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en donde R1 es independientemente H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH, por ejemplo, en donde R1 es H, -CH3 o propilo, etc.; en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH o arilo; en donde X es independientemente H o halógeno (por ejemplo, I, Br, Cl, F); y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables, de los mismos. Preferentemente, en donde X y R2 son H; y en donde R1 es H (isatin p-tiosemicarbazona), -CH3 (N-metil-isatin p-tiosemicarbazona (metisazona)) o propilo (N-propil-isatin p-tiosemicarbazona). Preferentemente se utiliza metisazona:
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La expresión "grupo funcional de metisazona" o "subestructura funcional de metisazona", como se usa en esta invención en aspectos particulares, se refiere a compuestos que tienen las siguientes fórmulas:
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en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH, por ejemplo, en donde X es H y en donde R1 es H (isatina) o -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatina), etc.; en donde X es independientemente H o halógeno (por ejemplo, I, Br, Cl, F); y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables, de los mismos;
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en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH, por ejemplo, en donde X es H y en donde R1 es H (indol, 2,3-diona, 3-hidrazona) etc.; en donde X es independientemente H o halógeno (por ejemplo, I, Br, Cl, F); en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por-OH o arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables, de los mismos; y H H
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en donde R2 y R3 son independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH o arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables, de los mismos; y combinaciones de los mismos.
En aspectos particulares, se utilizan las siguientes combinaciones de "grupo funcional de metisazona" o "subestructura funcional de metisazona":
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tiosemicarbazida
en donde Ri es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4), por ejemplo, en donde Ri es H (¡satina) o -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatina), etc., y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables, de los mismos.
En aspectos particulares, se utiliza la siguiente combinación de "grupos funcionales de metisazona" o "subestructuras funcionales de metisazona":
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En el contexto de esta descripción, "temperatura ambiente" se refiere a cualquier temperatura dentro de un intervalo de temperaturas entre aproximadamente 16 °C (aproximadamente 61 °F) y aproximadamente 25 °C (aproximadamente 77 °F). Por lo general, la temperatura ambiente está entre 20 °C y 22 °C (68 °F-72 °F). Generalmente, la expresión temperatura ambiente se usa para indicar que no se gasta energía adicional enfriando (por ejemplo, refrigerando) o calentando la muestra o la temperatura ambiente.
Un "conservante" es un agente que se añade a una composición para evitar la descomposición debida a cambios químicos o la acción microbiana. En el contexto de la producción de vacunas, típicamente se añade un conservante para prevenir el crecimiento microbiano (por ejemplo, bacteriano y fúngico). El conservante más común utilizado en la producción de vacunas es timerosal, un compuesto orgánico que contiene mercurio. Por lo tanto, la expresión "sin conservantes" indica que no se añade ningún conservante a (o no hay ninguno presente en) la composición.
El término "purificación" (por ejemplo, con respecto a un patógeno o una composición que contiene un patógeno) se refiere al proceso de eliminación de componentes de una composición, cuya presencia no se desea. La purificación es un término relativo y no requiere que ninguna de las trazas del componente no deseable se elimine de la composición. En el contexto de la producción de vacunas, la purificación incluye procesos tales como centrifugación, dialización, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño, purificación por afinidad, precipitación y otros procedimientos descritos en esta invención (por ejemplo, liofilización, etc.). Dichos procesos de purificación se pueden usar para separar los componentes patógenos inactivados de los reactivos utilizados para inactivar el patógeno respectivo como se describe en esta invención. Por ejemplo, el peróxido de hidrógeno, reactivos metálicos, "metisazona", "análogos de metisazona", "grupos funcionales de metisazona" o "subestructuras funcionales de metisazona" se pueden separar de los componentes patógenos inactivados para proporcionar composiciones vacunales purificadas. Por ejemplo, la metisazona residual, los análogos de metisazona o los productos químicos que representan grupos funcionales de metisazona o subestructuras funcionales de metisazona pueden variar de 0,0001 a 10 mM cuando se utilizan para la preparación de antígenos vacunales. Se puede utilizar una variedad de técnicas de purificación estándar para eliminar o separar estos componentes residuales del antígeno vacunal antes de la formulación final, incluyendo, pero sin limitación, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de modo mixto/multimodal, filtración en gel/cromatografía de exclusión por tamaño, cromatografía de desalación, filtración/diafiltración de flujo tangencial, centrifugación en gradiente de densidad, filtración centrífuga, diálisis, precipitación de antígeno vacunal o adsorción de antígeno vacunal.
El adjetivo "farmacéuticamente aceptable" indica que el sujeto es fisiológicamente aceptable para su administración a un sujeto (por ejemplo, un sujeto humano o animal). Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición (1975), describe composiciones y formulaciones (incluyendo diluyentes) adecuadas para el suministro farmacéutico de composiciones terapéuticas y/o profilácticas, incluyendo vacunas.
En general, la naturaleza del diluyente dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. En determinadas formulaciones (por ejemplo, composiciones sólidas, tales como formas en polvo, píldora, comprimido o cápsula), no se emplea un diluyente líquido. En dichas formulaciones, se pueden usar portadores sólidos no tóxicos, incluyendo, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio.
La expresión "buenas prácticas de fabricación" o "GMP" (por sus siglas en inglés) con respecto a los métodos y procedimientos empleados en la producción de vacunas se refiere específicamente al conjunto de procedimientos, protocolos y procedimientos establecidos por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA, por sus siglas en inglés). La Organización Mundial de la Salud promulga recomendaciones y directrices similares. La abreviatura "cGMP" designa específicamente aquellos protocolos y procedimientos que actualmente están aprobados por la FDA (por ejemplo, bajo el Código 21 de Regulaciones Federales, partes 210 y 211, disponibles en www.fda.gov/cder/dmpq). Con el tiempo, los procedimientos compatibles con cGMP pueden cambiar. Cualquier procedimiento descrito en esta invención se puede adaptar según los nuevos requisitos de cGMP según lo dispuesto por la FDA.
Inactivación de patógenos
Para inactivar un patógeno utilizando uno o más agentes de oxidación dual, incluyendo los que además comprenden un reactivo de metisazona, el patógeno vivo se cultiva hasta una densidad deseada (por ejemplo, densidad de saturación en cultivo), según cualquier procedimiento aceptable en la técnica para cultivo (por ejemplo, cultivo del organismo específico). Típicamente, para patógenos celulares, es deseable cultivar el patógeno hasta la fase estacionaria; ya que tales organismos son generalmente más resistentes al estrés en el procesamiento posterior que los recogidos en la fase logarítmica. El crecimiento en cultivo puede controlarse utilizando procedimientos conocidos en la técnica, tales como medición de la densidad óptica del cultivo usando espectrofotometría. Cuando el patógeno es un virus, el crecimiento puede controlarse mediante la valoración del virus utilizando procedimientos estándar establecidos para el virus seleccionado. Por ejemplo, se pueden encontrar procedimientos para cultivar virus animales, por ejemplo, en DNA Viruses: A Practical Approach, Alan J. Cann (ed.) Oxford University Press, 2000; Robinson y Cranage (eds.) Vaccine Protocols (Methods in Molecular Medicine) Humana Press, 2003, y referencias mencionadas en los mismos. También se conocen en la técnica procedimientos para cultivar bacterias patógenas, y pueden encontrarse en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., vol. 1-3, ed. Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. También se conocen en la técnica procedimientos para cultivar parásitos, tales como la malaria, por ejemplo, Denise Doolan (ed.) Malaria Methods and Protocols (Methods in Molecular Medicine) Humana Press, 2002, y referencias mencionadas en el mismo.
Típicamente, los organismos patógenos pueden tener genomas de ARN o ADN (por ejemplo, virus, bacterias, hongos o parásitos) y se purifican del medio en el que crecen o se cultivan, y en el caso de patógenos que se replican dentro de una célula, se purifican de los demás componentes celulares. Por ejemplo, la concentración relativa de componentes no patógenos de una suspensión, incluidos los patógenos, puede reducirse al menos un 50 %, tal como aproximadamente un 70 %, o hasta un 80 %, o incluso un 90 %, 95 % o más, con respecto a una preparación en bruto de patógeno. Los patógenos intracelulares, tales como los virus, pueden aislarse o purificarse a partir de los diversos componentes de las células que infectan mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, los virus para la producción de vacunas típicamente se cultivan en condiciones controladas en una línea celular certificada utilizando un medio de cultivo biológica y químicamente definido según los procedimientos cGMP. Las células normalmente se infectan con virus a una multiplicidad de infección (MOI, por sus siglas en inglés) apropiada, y las células se mantienen en cultivo en condiciones y durante un período de tiempo suficiente para permitir la replicación del virus a un valor alto. A continuación, las células se recogen mediante centrifugación (después de la liberación de la superficie de cultivo en el caso de células adherentes) y se suspenden de nuevo en una solución tamponada adecuada. Para facilitar la recuperación, la solución tamponada suele ser hipotónica con respecto a las células, lo que hace que las células se hinchen. Opcionalmente, la suspensión celular se agita periódicamente para asegurar una exposición más uniforme de las células a la solución hipotónica. A continuación, las células se lisan, por ejemplo, mediante homogeneización, para liberar el virus. El lisado se centrifuga para eliminar materia particulada grande, tal como núcleos celulares, y el sobrenadante se filtra para eliminar residuos celulares adicionales. A continuación, el virus se puede purificar aún más estratificando el sobrenadante filtrado en un medio de separación adecuado, tal como un gradiente de densidad de sacarosa. Opcionalmente, el sedimento nuclear puede procesarse adicionalmente para aumentar el rendimiento viral. El sedimento nuclear se resuspende de nuevo en tampón hipotónico y se homogeneiza. El lisado nuclear se centrifuga y el sobrenadante resultante se filtra antes de estratificarlo sobre el medio de separación. Opcionalmente, las dos suspensiones virales se combinan para lograr un gradiente de separación de volumen aproximadamente equivalente. A continuación, la suspensión del medio de separación/virus se procesa mediante ultracentrifugación (por ejemplo, a 55.000 x g durante 1-1,5 horas a 4 °C). El virus se recoge en un sedimento mediante este proceso, mientras que los residuos celulares membranosos permanecen en la interfase. El sobrenadante se elimina (típicamente por aspiración) y el sedimento se resuspende en tampón. A continuación, el virus purificado se puede evaluar para determinar su recuperación y viabilidad (por ejemplo, determinando la concentración de proteína y mediante ensayos de placas, respectivamente). Si se desea, el virus recuperado puede congelarse y almacenarse hasta su uso.
Se conocen procedimientos similares en la técnica para purificar patógenos no virales, tales como parásitos intracelulares (por ejemplo, parásitos protozoarios, incluyendo Plasmodium falciparum y otras especies de Plasmodium, Leishmania (sp.), Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, así como especies de Toxoplasma, Eimeria, Theileria y Babesia).
Reconstitución y administración
Las composiciones inmunógenas, tales como las vacunas, que se producen en forma de polvos (por ejemplo, polvos liofilizados) típicamente se mezclan con un líquido para su administración. Este proceso se conoce como "reconstitución" y el líquido utilizado se conoce comúnmente como "diluyente". Para fines de administración, especialmente a sujetos humanos, es importante que el diluyente sea una formulación farmacéuticamente aceptable. La reconstitución de la composición liofilizada típicamente se realiza utilizando una jeringa y una aguja estériles para cada vial de diluyente. Se utiliza el diluyente correcto para cada tipo y lote para garantizar la potencia, seguridad y esterilidad adecuadas de la mezcla resultante. Los diluyentes están diseñados específicamente para optimizar el suministro y la eficacia de la composición seleccionada. Los diluyentes comunes incluyen aditivos tales como: estabilizadores para mejorar la termoestabilidad de la vacuna; agentes, tales como tensioactivos, para ayudar a disolver el polvo en un líquido; y tampones para asegurar el equilibrio ácido correcto de la composición reconstituida. Opcionalmente, el diluyente puede contener un conservante (por ejemplo, un bactericida y/o un fungicida) para mantener la esterilidad después de la reconstitución. Típicamente se requieren conservantes (por ejemplo, por la FDA) cuando la composición se reconstituye en una formulación multidosis.
Administración de composiciones inmunógenas tales como vacunas (procedimientos terapéuticos)
Las composiciones inmunógenas (tales como vacunas u otros medicamentos) descritas en esta invención se pueden administrar a un sujeto para provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno. Más comúnmente, las composiciones se administran para provocar una respuesta inmunitaria profiláctica contra un organismo patógeno al que el sujeto aún no ha estado expuesto. Por ejemplo, las composiciones vacunales que incluyen patógenos inactivados por oxidación dual se pueden administrar como parte de un esfuerzo de vacunación localizado o generalizado. Una respuesta inmunitaria provocada por la administración de dichas composiciones vacunales incluye típicamente una respuesta de anticuerpos neutralizantes y puede incluir además una respuesta de linfocitos T, por ejemplo, una respuesta de linfocitos T citotóxicos que se dirige a patógenos celulares. Por consiguiente, se incluyen en esta invención procedimientos para preparar un medicamento o una composición farmacéutica que contiene patógenos inactivados por oxidación dual. Las composiciones farmacéuticas (medicamentos) incluyen al menos un patógeno inactivado por contacto con una solución que contiene el uno o más agentes de oxidación dual, o por contacto con los agentes de oxidación dual que comprenden además un reactivo de metisazona, en un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En algunos casos, la composición inmunógena puede incluir una combinación de patógenos, tal como una combinación de virus (por ejemplo, virus de las paperas, virus del sarampión, virus de la rubéola), o una combinación de bacterias (por ejemplo, especies de Campylobacter (spp.), Corynebacterium diptheriae, Bordatella pertussis y Clostridium tetani), o una combinación de patógenos seleccionados de diferentes clases de organismos, por ejemplo, uno o más virus y una o más bacterias, una o más bacterias y uno o más parásitos, y similares.
La cantidad de patógeno incluida en la composición es suficiente para provocar una respuesta inmunitaria cuando se administra a un sujeto. Por ejemplo, cuando se administra a un sujeto en una o más dosis, una composición vacunal que contiene un patógeno inactivado provoca favorablemente una respuesta inmunitaria protectora contra el patógeno. Una dosis de la composición vacunal puede incluir de al menos aproximadamente el 0,1 % p/p de patógeno inactivado a aproximadamente el 99 % p/p de patógeno inactivado, y el resto de la composición vacunal se compone de constituyentes farmacéuticamente aceptables, tales como un portador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Se pueden encontrar directrices relativas a la formulación de vacunas, por ejemplo, en las Patentes de EE.UU. N.° 6.890.542 y 6.651.655. En un ejemplo específico, no limitante, la composición vacunal (medicamento) incluye al menos aproximadamente el 1 %, tal como aproximadamente el 5 %, aproximadamente el 10 %, aproximadamente el 20 %, aproximadamente el 30 % o aproximadamente el 50 % peso/peso de patógeno inactivado. Como será evidente para un experto en la materia, la cantidad de patógeno presente en la formulación de la vacuna depende de si la composición es líquida o sólida. La cantidad de patógeno inactivado en una composición sólida puede exceder la tolerable en una composición líquida. La cantidad de patógeno inactivado puede calcularse alternativamente con respecto a la cantidad comparable de patógeno vivo o inactivado necesaria para dar una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, se puede incluir en una dosis de la composición vacunal una dosis equivalente en partículas virales de aproximadamente 106 a aproximadamente 1012 unidades formadoras de placas (UFP) de virus vivo o atenuado. De manera similar, una composición de vacuna puede incluir una cantidad de patógeno inactivado (por ejemplo, con genoma de ARN o ADN), tal como un virus, bacteria, hongo o parásito, equivalente a entre aproximadamente 103 a aproximadamente 10r organismos vivos. Como alternativa, la dosificación se puede proporcionar en términos de contenido o concentración de proteínas. Por ejemplo, una dosis puede incluir de aproximadamente 0,1 pg, tal como al menos aproximadamente 0,5 pg de proteína. Por ejemplo, una dosis puede incluir aproximadamente 1 pg de un virus aislado o purificado u otro patógeno hasta aproximadamente 100 pg o más de un patógeno seleccionado. Aunque las dosis equivalentes en unidades infecciosas (por ejemplo, UFP) pueden variar de un patógeno a otro, la dosis de proteína adecuada puede extrapolarse (por ejemplo, a partir de UFP) o determinarse empíricamente. Por ejemplo, en una preparación típica, 1 pg de virus vaccinia purificado equivale a aproximadamente 2 x 106 UFP. Se pueden determinar conversiones similares para cualquier patógeno de interés.
Típicamente, la preparación de una composición vacunal (medicamento) implica preparar una composición farmacéutica que esté esencialmente libre de pirógenos, así como de cualquier otra impureza que pueda ser dañina para seres humanos o animales. Típicamente, la composición farmacéutica contiene sales y tampones apropiados para hacer que los componentes de la composición sean estables y permitir el procesamiento y la presentación apropiados del antígeno vacunal por parte de las células presentadoras de antígeno. Dichos componentes pueden suministrarse en forma liofilizada o pueden incluirse en un diluyente utilizado para la reconstitución de una forma liofilizada en una forma líquida adecuada para la administración. Como alternativa, cuando el patógeno inactivado se prepara para su administración en estado sólido (por ejemplo, como polvo o gránulo), se incluye en la formulación un portador sólido adecuado.
Las composiciones acuosas típicamente incluyen una cantidad eficaz del patógeno inactivado disperso (por ejemplo, disuelto o suspendido) en un medio acuoso o diluyente farmacéuticamente aceptable. La expresión "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades y composiciones moleculares que no producen una reacción adversa, alérgica u otra reacción no deseada cuando se administran a un sujeto humano o animal. Como se usa en esta invención, "portador farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. Opcionalmente, un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable puede incluir un conservante antibacteriano, antifúngico u otro. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con la producción de una respuesta inmunitaria por parte de un patógeno inactivado, se contempla su uso en las composiciones inmunógenas. También se pueden incorporar a las composiciones principios activos complementarios. Por ejemplo, determinadas composiciones farmacéuticas pueden incluir el patógeno inactivado en un diluyente acuoso, mezclado con un tensioactivo adecuado, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también se pueden preparar en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En algunos casos (por ejemplo, cuando las formulaciones líquidas se consideran deseables, o cuando la composición de vacuna liofilizada se reconstituye para dosis múltiples en un solo recipiente), estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.
Los portadores, excipientes y diluyentes farmacéuticamente aceptables son conocidos por los expertos en lo descrito, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, de E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15a edición (1975), que describe composiciones y formulaciones adecuadas para el suministro farmacéutico de patógenos inactivados.
En general, la naturaleza del portador dependerá del modo particular de administración que se emplee. Por ejemplo, las formulaciones parenterales normalmente comprenden fluidos inyectables que incluyen fluidos farmacéutica y fisiológicamente aceptables tales como agua, solución salina fisiológica, soluciones salinas equilibradas, dextrosa acuosa, glicerol o similares como vehículo. Para las composiciones sólidas (por ejemplo, formas en polvo, píldora, comprimido o cápsula), los portadores sólidos no tóxicos convencionales pueden incluir, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón o estearato de magnesio. Además de los portadores biológicamente neutros, las composiciones farmacéuticas a administrar pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares no tóxicas, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes y agentes tamponantes del pH y similares, por ejemplo, acetato de sodio o monolaurato de sorbitán.
Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas (medicamentos) pueden incluir uno o más de un detergente estabilizante, un agente formador de micelas y un aceite. Los detergentes estabilizantes, los agentes formadores de micelas y los aceites adecuados se detallan en la Patente de EE.UU. N.° 5.585.103; Patente de EE.UU. N.° 5.709.860; Patente de EE.UU. N.° 5.270.202; y Patente de EE.UU. N.° 5.695.770. Un detergente estabilizante es cualquier detergente que permite que los componentes de la emulsión permanezcan como una emulsión estable. Dichos detergentes incluyen polisorbato, 80 (TWEEN80) (Sorbitanmono-9-octadecenoato-poli(oxi-1,2-etanodiilo; fabricado por ICI Americas, Wilmington, DE), TWEEN 40TM, TWEEN 20TM, TWEEN 60TM, ZwittergentTM 3-12, TEEPOL HB7TM y SPAN 85TM. Estos detergentes normalmente se proporcionan en una cantidad de aproximadamente el 0,05 al 0,5 %, tal como aproximadamente el 0,2 %. Un agente formador de micelas es un agente capaz de estabilizar la emulsión formada con los demás componentes de tal manera que se forma una estructura de tipo micela. Dichos agentes generalmente causan cierta irritación en el sitio de la inyección para reclutar macrófagos para mejorar la respuesta celular. Los ejemplos de dichos agentes incluyen tensioactivos poliméricos descritos, por ejemplo, por Schmolka, J. Am. Oil. Chem. Soc. 54:110, 1977, y Hunter et al., J. Immunol 129:1244, 1981, y agentes tales como PLURONICTM L62LF, L101 y L64, PEG1000, y TETRONICTM 1501, 150R1, 701, 901, 1301 y 130R1. Las estructuras químicas de dichos agentes se conocen bien en la técnica. En una realización, el agente se elige para que tenga un equilibrio hidrófilo-lipófilo (HLB) de entre 0 y 2, como se define por Hunter y Bennett, J. Immun. 133:3167, 1984. El agente se puede proporcionar en una cantidad eficaz, por ejemplo, entre el 0,5 y el 10 %, o en una cantidad entre el 1,25 y el 5 %.
El aceite incluido en la composición se elige para promover la retención del patógeno en la emulsión de aceite en agua, y preferentemente tiene una temperatura de fusión de menos de 65 °C, de modo que la emulsión se forma a temperatura ambiente o una vez que la temperatura de la emulsión se ajusta a temperatura ambiente. Los ejemplos de dichos aceites incluyen escualeno, escualano, EICOSANETM, tetratetracontano, glicerol y aceite de cacahuete u otros aceites vegetales. En un ejemplo específico, no limitativo, el aceite se proporciona en una cantidad entre el 1 y el 10 %, o entre el 2,5 y el 5 %. El aceite debe ser tanto biodegradable como biocompatible para que el cuerpo pueda descomponer el aceite con el tiempo, y para que no sean evidentes los efectos adversos con el uso del aceite.
Opcionalmente, las composiciones farmacéuticas o medicamentos pueden incluir un adyuvante adecuado para aumentar la respuesta inmunitaria contra el patógeno. Como se usa en esta invención, un "adyuvante" es cualquier potenciador o mejorador de una respuesta inmunitaria. El término "adecuado" pretende incluir cualquier sustancia que pueda usarse en combinación con el patógeno seleccionado para aumentar la respuesta inmunitaria, sin producir reacciones adversas en el sujeto vacunado. Las cantidades eficaces de un adyuvante específico pueden determinarse fácilmente para optimizar el efecto de potenciación del adyuvante sobre la respuesta inmunitaria de un sujeto vacunado. Por ejemplo, los adyuvantes adecuados en el contexto de las formulaciones de vacunas incluyen el 03 %-5 % (por ejemplo, 2 %) de hidróxido de aluminio (o fosfato de aluminio) y emulsión de aceite MF-59 (polisorbato 80 al 0,5 % y trioleato de sorbitán al 0,5 %. El escualeno (emulsión acuosa al 5,0 %) es otro adyuvante que se ha utilizado favorablemente en el contexto de las vacunas. Por ejemplo, el adyuvante puede ser una mezcla de detergentes estabilizadores, agente formador de micelas y aceite disponible con el nombre de Provax® (DEC Pharmaceuticals, San Diego, CA). Un adyuvante también puede ser un ácido nucleico inmunoestimulador, tal como un ácido nucleico que incluye un motivo CpG. Otros adyuvantes incluyen aceite mineral, vegetal o de pescado con emulsiones acuosas, adyuvante incompleto de Freund, E. coli J5, sulfato de dextrano, sulfato de hierro, óxido de hierro, alginato de sodio, Bacto-Adyuvante, determinados polímeros sintéticos tales como Carbopol (BF Goodrich Company, Cleveland, Ohio), poliaminoácidos y copolímeros de aminoácidos, saponina, carragenina, REGRESSIN (Vetrepharm, Atenas, Ga.), AVRIDINE (N,N-dioctadecil-N',N'-bis(2-hidroxietil)-propanodiamina), polímeros de manono .beta. (1,4) enlazados polidispersados de cadena larga intercalados con grupos O-acetilados (por ejemplo, ACEMANNAN), extractos de pared celular desproteinizados altamente purificados derivados de una cepa no patógena de especies de Mycobacterium (por ejemplo, EQUIMLTNE, Vetrepharm Research Inc., Atenas, Ga.), monooleato de manita, aceite de parafina y dipéptido de muramilo. Un experto en la materia puede seleccionar un adyuvante adecuado.
Las composiciones farmacéuticas (medicamentos) pueden prepararse para su uso en regímenes terapéuticos o profilácticos (por ejemplo, vacunas) y administrarse a sujetos humanos o no humanos para provocar una respuesta inmunitaria contra uno o más patógenos. Por ejemplo, las composiciones descritas en esta invención se pueden administrar a un sujeto humano (o no humano) para provocar una respuesta inmunitaria protectora contra uno o más patógenos. Para provocar una respuesta inmunitaria, una cantidad terapéuticamente eficaz (por ejemplo, inmunológicamente eficaz) del patógeno inactivado se administra a un sujeto, tal como un sujeto humano (o no humano).
Una "cantidad terapéuticamente eficaz" es una cantidad de una composición utilizada para lograr un efecto deseado en un sujeto que se está tratando. Por ejemplo, esta puede ser la cantidad necesaria para estimular una respuesta inmunitaria, prevenir infecciones, reducir síntomas o inhibir la transmisión de un patógeno. Cuando se administra a un sujeto, generalmente se usará una dosificación que logrará concentraciones de tejido diana (por ejemplo, en células presentadoras de antígeno) que se determina empíricamente para lograr un efecto in vitro. Dichas dosificaciones se pueden determinar sin demasiada experimentación por los expertos en la materia.
Una composición inmunógena, tal como una composición de vacuna que contiene un patógeno inactivado, se puede administrar por cualquier medio conocido por un experto en la materia, tal como por inyección intramuscular, subcutánea o intravenosa, pero incluso se contemplan por vía oral, nasal y transdérmica. En una realización, la administración es por inyección subcutánea o intramuscular. Para extender el tiempo durante el cual el patógeno inactivado está disponible para estimular una respuesta, el péptido se puede proporcionar como una inyección oleosa, como un sistema de partículas o como un implante. El sistema de partículas puede ser una micropartícula, una microcápsula, una microesfera, una nanocápsula o una partícula similar. Se ha demostrado que un portador de partículas basado en un polímero sintético actúa como adyuvante para mejorar la respuesta inmunitaria, además de proporcionar una liberación controlada.
Como alternativa a las formulaciones líquidas, la composición se puede administrar en forma sólida, por ejemplo, en forma de polvo, gránulo o comprimido. Por ejemplo, la composición vacunal se puede administrar en forma de polvo utilizando un dispositivo de inyección transdérmica sin aguja, tal como el dispositivo de inyección POWDERJECT® alimentado con helio. Este aparato usa gas helio presurizado para impulsar una formulación en polvo de una composición vacunal, por ejemplo, que contiene un patógeno inactivado, a alta velocidad de manera que las partículas de vacuna perforan el estrato córneo y aterrizan en la epidermis.
También se pueden utilizar polímeros también para liberación controlada. En la técnica se conocen diversas matrices poliméricas degradables y no degradables para su uso en el suministro controlado de fármacos (Langer, Accounts Chem. Res. 26:537, 1993). Por ejemplo, el copolímero de bloques, polaxámero 407, existe en forma de un líquido viscoso pero móvil a bajas temperaturas, pero forma un gel semisólido a la temperatura corporal. Ha demostrado ser un vehículo eficaz para la formulación y suministro sostenido de interleucina-2 recombinante y ureasa (Johnston, et al., Pharm. Res. 9:425, 1992; y Pec, J. Parent. Sci. Tech. 44(2):58, 1990). Como alternativa, se ha usado hidroxiapatita como un microportador para la liberación controlada de proteínas (Ijntema, et al., Int. J. Pharm. 112:215, 1994). En otro aspecto más, los liposomas se usan para la liberación controlada, así como para el direccionamiento del fármaco del fármaco encapsulado en lípidos (Betageri, et al., Liposome Drug Delivery Systems, Technomic Publishing Co., Inc., Lancaster, PA, 1993). Se conocen numerosos sistemas adicionales para el suministro controlado de proteínas terapéuticas (por ejemplo, Patente de EE.UU. N.° 5.055.303; Patente de EE.UU. N.° 5.188.837; Patente de EE.UU. N.° 4.235.871; Patente de EE.UU. N.° 4.501.728; Patente de EE.UU. N.° 4.837.028; Patente de EE.UU. N.° 4.957.735; y Patente de EE.UU. N.° 5.019.369; Patente de EE.UU. N.° 5.055.303; Patente de EE.UU. N.° 5.514.670; Patente de EE.UU. N.° 5.413.797; Patente de EE.UU. N.° 5.268.164; Patente de EE.UU. N.° 5.004.697; Patente de EE.UU. N.° 4.902.505; Patente de EE.UU. N.° 5.506.206; Patente de EE.UU. N.° 5.271.961; Patente de EE.UU. N.° 5.254.342; y Patente de EE.UU. N.° 533096).
En ejemplos específicos, no limitantes, el patógeno inactivado (por ejemplo, un parásito, tal como un parásito protozoario, o un patógeno bacteriano) se administra para provocar una respuesta inmunitaria celular (por ejemplo, una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL)). Se conocen varios medios para inducir respuestas celulares, tanto in vitro como in vivo. Los lípidos se han identificado como agentes capaces de ayudar a cebar las respuestas de CTL in vivo contra diversos antígenos. Por ejemplo, como se describe en la Patente de EE.UU. N.° 5.662.907, los residuos de ácido palmítico se pueden unir a los grupos alfa y épsilon amino de un residuo de lisina y a continuación enlazarse (por ejemplo, a través de uno o más residuos de enlace, tales como glicina, glicina-glicina, serina, serina-serina, o similares) a un péptido o proteína inmunógena. A continuación, el péptido lipidado puede inyectarse directamente en forma micelar, incorporarse en un liposoma o emulsionarse en un adyuvante. Como otro ejemplo, las lipoproteínas de E coli, tales como tripalmitoil-S-glicerilcisteinliseril-serina, pueden usarse para cebar CTL específicos de tumor cuando se unen covalentemente a un péptido apropiado (véase, Deres et al., Nature 342:561, 1989). Además, como la inducción de anticuerpos neutralizantes también se puede cebar con la misma molécula conjugada con un péptido que muestra un epítopo apropiado, se pueden combinar dos composiciones para provocar respuestas humorales y mediadas por células cuando se considere deseable.
Se administran dosis de patógeno inactivado que son suficientes para provocar una respuesta inmunitaria, por ejemplo, una respuesta inmunitaria protectora, en un sujeto. Con respecto a los patógenos virales, la dosis típicamente se calcula basándose en la cantidad de materia biológica equivalente a un valor específico de virus infeccioso (por ejemplo, virulento o atenuado). Por ejemplo, se puede administrar una dosis equivalente a aproximadamente 106, o aproximadamente 107, o aproximadamente 108, o aproximadamente 109, o aproximadamente 10r , o aproximadamente 1011 o aproximadamente 1012, o incluso más virus vivo por dosis para provocar una respuesta inmunitaria en un sujeto. En algunos casos, la dosis incluye una cantidad superior a la cantidad de virus vivo utilizada para provocar una respuesta inmunitaria, porque la vacuna inactivada es incapaz de aumentar en número después de la administración al sujeto. Cuando se calcula la cantidad de un patógeno celular, por ejemplo, una bacteria, un hongo o un parásito, la cantidad se puede calcular comparándola con una dosis de bacterias vivas, por ejemplo, de aproximadamente 103 células u organismos a aproximadamente 10r organismos vivos, dependiendo de la formulación. Por ejemplo, la dosis puede incluir al menos aproximadamente 100 nanogramos (o 200 nanogramos, o 500 nanogramos, o 1 microgramo) de antígeno proteico por dosis a aproximadamente 25 mg (por ejemplo, aproximadamente 10 mg, o aproximadamente 15 mg, o aproximadamente 20 mg), o incluso más de un patógeno inactivado. Típicamente, la composición vacunal incluye constituyentes o componentes farmacéuticamente aceptables adicionales. Por consiguiente, la composición vacunal puede incluir de al menos aproximadamente el 0,1 % p/p de patógeno inactivado a aproximadamente el 99 % p/p de patógeno inactivado, y el resto de la composición vacunal se compone de constituyentes farmacéuticamente aceptables, tales como uno o más portadores farmacéuticamente aceptables, un estabilizador farmacéuticamente aceptable y/o un diluyente farmacéuticamente aceptable. Se pueden encontrar directrices relativas a la formulación de vacunas, por ejemplo, en las Patentes de EE.u U. N.° 6.890.542 y 6.651.655. Las dosis se pueden calcular en función de la concentración de proteínas (o unidades infecciosas, tales como PRJ, de equivalentes de unidades infecciosas). La dosis óptima se puede determinar empíricamente, por ejemplo, en estudios preclínicos en ratones y primates no humanos, seguidos de pruebas en seres humanos en un ensayo clínico de Fase I. Los métodos reales para preparar composiciones administrables serán conocidos o resultarán evidentes para los expertos en la materia y se describen con más detalle en publicaciones tales como Remington's Pharmaceutical Sciences, 19a Ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvania, 1995.
Típicamente, pero no siempre, las composiciones vacunales se administran antes de la exposición de un sujeto a un patógeno, por ejemplo, como una vacuna. Las composiciones vacunales se pueden preparar inactivando una amplia gama de patógenos usando condiciones de oxidación dual, o usando condiciones de oxidación dual que comprenden además uno o más reactivos de metisazona, según los procedimientos descritos en esta invención. Por ejemplo, las composiciones vacunales se pueden preparar inactivando un virus patógeno con una solución que contiene uno o más reactivos de oxidación dual, o con una solución que contiene uno o más reactivos de oxidación dual, comprendiendo además uno o más reactivos de metisazona. En esta invención se describen ejemplos no limitativos de virus que pueden inactivarse mediante los procedimientos de oxidación dual para la producción de vacunas.
Los patógenos bacterianos también se pueden inactivar utilizando uno o más reactivos de oxidación dual, o utilizando condiciones de oxidación dual que comprenden además uno o más reactivos de metisazona, para su uso en composiciones vacunales. En esta invención se describen ejemplos no limitativos de bacterias que pueden inactivarse mediante los procedimientos de oxidación dual para la producción de vacunas.
Las composiciones vacunales también se pueden producir a partir de patógenos fúngicos inactivados usando uno o más reactivos de oxidación dual, o usando condiciones de oxidación dual que comprenden además uno o más reactivos de metisazona. En esta invención se describen ejemplos no limitativos de patógenos fúngicos que pueden inactivarse mediante los procedimientos de oxidación dual para la producción de vacunas.
Las composiciones vacunales también se pueden producir a partir de patógenos parasitarios inactivados usando uno o más reactivos de oxidación dual, o usando condiciones de oxidación dual que comprenden además uno o más reactivos de metisazona. En esta invención se describen ejemplos no limitativos de patógenos parasitarios que pueden inactivarse mediante los procedimientos de oxidación dual para la producción de vacunas.
Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar determinadas características y/o realizaciones particulares. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes de la invención descripción con respecto a las características o realizaciones particulares descritas.
EJEMPLO 1
(Se demostró que la inactivación estándar basada en H 2 O 2 inactiva el CHIKV, pero también dañó los epítopos neutralizantes específicos de CHIKV y no logró inducir respuestas neutralizantes in vivo después de la vacunación)
La figura 2 muestra que la inactivación estándar basada en H2O2 interrumpe los epítopos neutralizantes específicos de CHIKV y no logra inducir respuestas neutralizantes in vivo después de la vacunación.
En la figura 2A, las muestras del virus chikungunya (CHIKV) no recibieron tratamiento (CHIKV vivo) o se trataron con una concentración estándar de H2O2 (3 % de H2O2 CHIKV) durante 7 horas a temperatura ambiente. Después del tratamiento, se ensayó el antígeno con un ELISA tipo sándwich específico para CHIKV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para las proteínas estructurales E1 y E2. Los valores de ELISA se expresan como porcentaje de controles de virus vivos.
En la figura 2B, se ensayó CHIKV tratado con H2O2 (3 % de H2O2 CHIKV) y se encontró negativo para virus vivos residuales, se formuló con alumbre al 0,1 %, y se usó para inmunizar ratones BALB/c adultos (n = 8) los días 0 y 28. Se inmunizaron ratones de control (simulado, n = 3) con el mismo programa con alumbre en diluyente. Dos semanas después de la inmunización final, se extrajo sangre periférica, se procesó para suero y se combinó para cada grupo. El suero agrupado se analizó utilizando un ensayo estándar de neutralización de reducción de placas de CHIKV al 50 % (PRNT50). Las muestras de los grupos vacunados contra el CHIKV al 3 % con H2O2 y vacunados de forma simulada fueron seronegativas, con un valor de PRNT50 inferior a 10, como se indica con la línea discontinua. A modo de comparación, se muestra un grupo de ratones C57BL/6 (n = 5) inmunizados con CHIKV vivo por vía intradérmica en la almohadilla plantar (1.000 UFP de CHIKV-SL15649) (gráfico de barras del extremo izquierdo de la figura 2B), con valores neutralizantes analizados 36 días después de la infección. El límite de detección (LOD) se indica mediante la línea discontinua.
EJEMPLO 2
(Los Solicitantes encontraron que la inactivación microbiana basada en la oxidación dual tiene un mecanismo fundamentalmente diferente en comparación con la oxidación simple con H 2 O 2 solo, lo que desalienta el uso potencial de la inactivación microbiana basada en oxidación dual para el desarrollo de antígenos vacunales eficaces avanzados)
Aunque las reacciones de tipo Fenton solo se han usado para destruir patógenos, y no se han usado ni sugerido para usar en el desarrollo de vacunas, no obstante, tales reacciones se ensayaron para determinar el potencial de inactivar patógenos microbianos con el fin de producir vacunas. Los datos iniciales de inactivación fueron sorprendentes e inesperados porque, a diferencia de H2O2, se encontró que la concentración de proteína total de la solución durante el procedimiento de inactivación afecta a la cinética de inactivación con oxidación dual por H2O2/CuCl2. Este resultado del sistema H2O2/CuCl2 fue inesperado porque se había demostrado previamente que la concentración de proteína no tiene impacto en la inactivación viral utilizando el enfoque estándar de H2O2 de los Solicitantes. Sin embargo, como se muestra en las figuras 1A y 1B para DENV2, la concentración de proteína tuvo un impacto sustancial en la cinética de inactivación viral, con niveles más altos de proteína que llevaron a una inactivación más lenta del virus.
Específicamente, las figuras 1A y 1B muestran que la cinética de inactivación de virus usando el sistema de oxidación dual con H2O2/CuCl2 depende de la concentración de proteína, mientras que la inactivación de virus estándar basada en H2O2 es independiente de la concentración de proteína. En la figura 1A, el DENV2 purificado se trató con H2O2 al 3 %, o en la figura 1B con H2O2 al 0,01 % y CuCl21 pM a temperatura ambiente, con concentraciones crecientes de proteína viral total como se indica. Las muestras se extrajeron en puntos temporales preespecificados y se evaluaron para determinar los valores virales utilizando un ensayo estándar de unidades formadoras de placas (UFP). El límite de detección (LOD) se indica mediante la línea discontinua.
La dependencia de la concentración de proteína total de la solución durante el procedimiento de inactivación dual fue inesperada, lo que indica que estaba involucrado un mecanismo fundamentalmente diferente en comparación con H2O2 solo y, por lo tanto, la eficacia/uso de un procedimiento de inactivación basado en oxidación dual para la producción de vacunas eficaces era cuestionable e impredecible en vista de los procedimientos anteriores basados en la oxidación simple de los Solicitantes (por ejemplo, con H2O2 solo) (por ejemplo, Patentes de EE.UU. N.° 8.124.397 y 8.716.000).
EJEMPLO 3
(Se usó un sistema de oxidación de tipo Fenton de oxidación dual para proporcionar una inactivación eficiente y al mismo tiempo mejorar el mantenimiento de los epítopos neutralizantes específicos de CHIKV)
La figura 3 muestra que el uso de un sistema de oxidación de tipo Fenton de oxidación dual proporciona una inactivación eficaz, mejorando al mismo tiempo el mantenimiento de los epítopos neutralizantes específicos de CHIKV.
En la figura 3A, se trató el CHIKV purificado con concentraciones crecientes de H2O2 solo.
En la figura 3B, se trató el CHIKV purificado con CuCl2 solo.
En la figura 3C, se trató el CHIKV purificado con CuCl2 (10 pM) con concentraciones crecientes de H2O2 para lograr un sistema de tipo Fenton de oxidación dual. Se permitió que prosiguieran los tratamientos con antígeno durante 20 horas a temperatura ambiente.
Después de los tratamientos, se ensayó el antígeno con un ELISA tipo sándwich específico para CHIKV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para las proteínas estructurales E1 y E2. Los valores de ELISA se expresan como porcentaje de controles de virus vivos. Después del tratamiento, el material también se ensayó en busca de virus vivo utilizando un ensayo estándar de unidades formadoras de placas (UFP). Se indican los valores de virus resultantes (UFP/ml) para cada condición. Las concentraciones crecientes de cualquiera de los reactivos de descontaminación (figuras 3A y 3B) condujeron a una inactivación mejorada, pero a expensas de una antigenicidad significativamente menor. Sorprendentemente, por el contrario, utilizando el sistema combinado de H2O2/CuCl2, se identificó una condición de inactivación óptima que mantuvo completamente la antigenicidad mientras conducía a la inactivación viral completa (figura 3C). Las condiciones exitosas que no demostraron virus vivo detectable (<50 UFP/ml) se indican con un asterisco. Cabe apreciar que solo las condiciones óptimas de CuCl210 pM y H2O2 al 0,002 % lograron una antigenicidad retenida >90 % (indicada por la línea discontinua) y al mismo tiempo demostraron que no había virus vivo detectable.
EJEMPLO 4
(La vacunación contra el CHIKV con CUCI 2 JH 2 O 2 indujo respuestas rápidas de anticuerpos neutralizantes y protegió contra la patología asociada con CHIKV)
Para evaluar la inmunogenicidad del CHIKV candidato tratado con H2O2/CuCl2, se formuló un antígeno vacunal con adyuvante de alumbre y se usó para inmunizar ratones a varios niveles de dosis (10 o 40 pg por animal). Como se muestra en la figura 4, la vacunación generó valores de anticuerpos neutralizantes rápidos y sólidos, en marcado contraste con el enfoque convencional de H2O2 (figura 2). Como prueba final de la eficacia de la vacuna, los ratones inmunizados se expusieron a CHIKV de tipo natural y demostraron una protección total contra la enfermedad artrítica (figura 5).
La figura 4 muestra que la vacuna contra el CHIKV de CuCh/H2O2 indujo respuestas rápidas de anticuerpos neutralizantes. Específicamente, se formuló una vacuna optimizada contra el CHIKV de CuCh/H2O2 con alumbre al 0,1 % a una dosis de 10 pg o 40 pg con una dosis primaria administrada el día 0 y una dosis de refuerzo el día 14 (mostrado por flechas). Las muestras de suero se recogieron en los puntos temporales indicados y se ensayaron para determinar la actividad neutralizante específica de CHIKV utilizando un ensayo de valor de neutralización por reducción de placas estándar (PRNT50). Los valores de neutralización para el grupo de 10 pg finalizan el día 20 después de la vacunación primaria porque este es el último punto temporal antes de que los animales fueran expuestos a CHIKV el día 21. Se muestran los promedios del grupo (±SEM) para cada punto temporal. El límite de detección (LOD) para este estudio se indica mediante la línea discontinua. También se ensayaron controles no vacunados y sin tratamiento previo y se encontró que estaban por debajo del LOD.
Las figuras 5A y 5B muestran que la vacunación contra el CHIKV con CuCh /H2O2 indujo respuestas rápidas de anticuerpos neutralizantes y protegió contra la patología asociada con CHIKV. Específicamente, la vacuna contra el CHIKV de CuCl2/H2O2 se formuló con alumbre a una dosis de 10 pg o 40 pg con una inmunización primaria administrada el día 0 y una dosis de refuerzo administrada el día 14 en ratones C57BL/6 adultos (n = 5 por grupo) o controles vacunados simulados (alumbre solo). Se expuso a los ratones en la almohadilla plantar derecha a 1000 UFP de CHIKV-SL15649, una cepa virulenta de CHIKV, a los 32 días (grupo de 40 pg) o 21 días (grupo de 10 pg) después de la vacunación primaria. La hinchazón plantar asociada con CHIKV se midió con calibradores durante 14 días en ratones vacunados con (figura 5A) una dosis de 40 pg o (figura 5B) una dosis de 10 pg. Las diferencias significativas se indican mediante asteriscos (prueba de la t de Student, P<0,05).
La vacunación contra el CHIKV con CuCl2/H2Ü2 generó valores de anticuerpos neutralizantes rápidos y sólidos (figura 4), y demostró una protección total contra la enfermedad artrítica (figura 5).
EJEMPLO 5
(Se utilizó oxidación basada en H 2 O 2 /CUCI 2 para desarrollar una vacuna eficaz contra el YFVinactivado)
Basándose en los resultados alentadores demostrados con CHIKV, un alfavirus modelo, se exploró la utilidad del sistema para flavivirus tales como YFV. El análisis preliminar sugirió que una concentración de H2O2 al 0,002 % y CuCl21 pM representaba un equilibrio funcional entre la antigenicidad y la inactivación rápida del virus (figura 6A).
Utilizando una condición optimizada adicional de H2O2 al 0,010 % y CuCl2 1 pM (para asegurar la inactivación completa), se produjo material vacunal para YFV y se utilizó para inmunizar ratones BALB/c adultos. Después de la vacunación, todos los animales demostraron valores de neutralización medibles con un valor de neutralización promedio de 240, en comparación con un valor de neutralización de menos de 40 para los animales inmunizados con la vacuna contra el YFV preparada usando solo H2O2 solo (figura 6B). Estas diferencias en inmunogenicidad después de la vacunación podrían anticiparse basándose en el daño grave a los epítopos neutralizantes (es decir, antigenicidad) observado cuando el YFV se trató con H2O2 al 3 % durante 20 horas.
Las figuras 6A y 6B muestran que la oxidación basada en H2O2/CuCl2 se utilizó con éxito en el desarrollo de una vacuna contra el YFV inactivado y demostró una mayor retención de la unión del anticuerpo a los epítopos neutralizantes (antigenicidad) y una inmunogenicidad mejorada después de la vacunación.
Específicamente, como se muestra en la figura 6A, el YFV purificado se trató con las condiciones indicadas durante 20 horas a temperatura ambiente. Después del tratamiento, se ensayó el antígeno utilizando un ELISA de tipo sándwich específico para el YFV compuesto por un anticuerpo monoclonal neutralizante específico para la proteína estructural de la envoltura. Los valores de ELISA se expresan como porcentaje de control de virus vivo. Después del tratamiento, el material también se analizó en busca de YFV vivo utilizando un ensayo estándar de unidades formadoras de placas (UFP). Se indican los valores de virus resultantes (UFP/ml) para cada condición. Las condiciones exitosas que no demostraron virus vivo detectable se indican con un asterisco.
Específicamente, como se muestra en la figura 6B, la inmunización de ratones con el YFV inactivado basado en H2O2 estándar (H2O2 al 3 % durante 7 horas) se comparó con una condición optimizada de H2O2/CuCl2 (H2O2 al 0,01 %, CuCl2 1 uM, 20 horas a temperatura ambiente). Después de la inactivación, las preparaciones de vacunas se ensayaron y resultaron negativas para el virus vivo. Cada vacuna se formuló con alumbre a una dosis de 5 pg (H2O2 al 3 %) o 10 pg (H2O2 al 0,01 %, CuCl21 pM) con una inmunización primaria administrada el día 0 y dosis de refuerzo administradas los días 14 y 25 en ratones BALB/c adultos (n = 5 por grupo). Los animales se ensayaron para determinar los valores de anticuerpos neutralizantes el día 42. El límite de detección (LOD) se indica mediante la línea discontinua.
Por lo tanto, se utilizó con éxito la oxidación basada en H2O2/CuCl2 en el desarrollo de una vacuna contra el YFV inactivado y demostró una mayor retención de la unión del anticuerpo a los epítopos neutralizantes (antigenicidad) y una inmunogenicidad mejorada después de la vacunación.
EJEMPLO 6
(Se utilizó con éxito la oxidación basada en H 2 O 2/CuCl 2 en el desarrollo de una vacuna contra el DENV inactivado)
Basándose en los resultados alentadores demostrados con el YFV, se ensayó otro flavivirus modelo, el dengue 3 (DENV3), en el sistema H2O2/CuCl2.
Al igual que con el YFV, las pruebas iniciales indicaron que una concentración de H2O2 al 0,002 % y CuCl2 1 pM representaba un enfoque óptimo para mantener una alta antigenicidad al mismo tiempo que proporcionaba la inactivación completa del virus (figura 7).
Específicamente, la figura 7 muestra que el uso de un sistema de oxidación de tipo Fenton de oxidación dual demostró una inactivación mejorada mientras se mantenían los epítopos neutralizantes específicos del virus del dengue 3. El virus del dengue 3 (DENV3) purificado se trató con las condiciones indicadas durante 20 horas a temperatura ambiente Después del tratamiento, se ensayó el antígeno con un ELISA de tipo sándwich específico para el DENV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para la proteína estructural de la envoltura. Los valores de ELISA se expresan como porcentaje de control de virus vivo. Después del tratamiento, el material también se ensayó en busca del DENV3 vivo utilizando un ensayo estándar de unidades formadoras de placas (UFP). Se indican los valores de virus resultantes (UFP/ml) para cada condición. Las condiciones exitosas que no demostraron virus vivo detectable (<50 UFP/ml) se indican con un asterisco. Cabe apreciar que solo las condiciones óptimas de CuCl21 pM y H2O2 al 0,002 % conservaron una alta antigenicidad y al mismo tiempo demostraron que no había virus vivo detectable.
Utilizando estas condiciones de inactivación con H2O2/C i i Cl2 preliminares, se produjeron lotes de vacunas de cada serotipo de DENV, se formularon en una vacuna tetravalente contra el dengue adyuvada con hidróxido de aluminio al 0,10 % y se utilizaron para inmunizar macacos rhesus adultos. Después de una única inmunización de refuerzo, todos los monos se seroconvirtieron (NT50 S10), demostrando el enfoque de inactivación con H2O2/CuCl2 una mejora en las respuestas de anticuerpos neutralizantes para 3 de los 4 serotipos del virus del dengue y un aumento promedio de 8 veces en los valores medios geométricos en comparación a la inactivación con H2O2 solo (figura 8).
Específicamente, la figura 8 muestra que el sistema de oxidación dual por H2O2/CuCl2 mejoró la inmunogenicidad in vivo frente a una vacuna tetravalente contra el DENV en macacos rhesus. Se trató el DENV purificado con H2O2 al 3 % (7 horas, temperatura ambiente) o H2O2/CuCl2 (H2O2 al 0,002 % y CuCl21 pM durante 20 horas, temperatura ambiente). La inactivación completa se confirmó a través del ensayo de placas estándar y el cocultivo. Los antígenos vacunales se mezclaron a concentraciones equivalentes (1 pg por serotipo para H2O2 al 3 %, o 2 pg por serotipo para H2O2/CuCL) y se formularon con alumbre al 0,1 %. Se inmunizaron macacos rhesus adultos (n = 4 por grupo) por vía intramuscular el día 0 y el día 28, con valores de neutralización (NT50) medidos 1 mes después de la inmunización de refuerzo. El límite de detección (LOD) se indica mediante la línea discontinua.
Hubo una pequeña diferencia en la dosis de antígeno (1 pg/serotipo frente a 2 pg/serotipo) en estos estudios, por lo que el experimento se repitió en ratones que fueron vacunados con la misma dosis de antígeno de vacuna tetravalente contra el dengue (figura 9).
Específicamente, la figura 9 muestra que el sistema de oxidación dual por H2O2/CuCl2 mejora la inmunogenicidad in vivo frente a una vacuna tetravalente contra el DENV en ratones. Se trató el DENV purificado con H2O2 al 3 % (7 horas, temperatura ambiente) o H2O2/CuCl2 (H2O2 al 0,002 % y CuCl2 1 pM durante 20 horas, temperatura ambiente). La inactivación completa se confirmó a través del ensayo de placas estándar y el cocultivo. Los antígenos vacunales se mezclaron en concentraciones equivalentes (2 pg por serotipo) y se formularon con alumbre al 0,1 %. Se inmunizaron por vía subcutánea ratones BALB/c adultos (n = 4-5 por grupo) los días 0, 14 y 28, midiendo los valores de neutralización (NT50) dos semanas después de la inmunización final. El límite de detección (LOD) se indica mediante la línea discontinua.
En estos experimentos, el enfoque de oxidación dual de la inactivación con H2O2/CnCh fue más inmunógeno que el H2O2 al 3 % para los 4 serotipos del virus del dengue y dio como resultado una mejora de 8 a >800 veces en los valores de anticuerpos neutralizantes.
EJEMPLO 7
(La oxidación basada en CUCI 2 JH 2 O 2 demostró una antigenicidad mejorada con el virus de la influenza)
Dados los resultados positivos observados en dos familias de virus (Togaviridae y Flaviviridae), se eligió una familia de virus adicional a ensayar usando esta nueva plataforma de inactivación.
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, la inactivación del virus de la influenza A (familia Orthomyxoviridae) se ensayó usando un enfoque estándar de H2O2 al 3 %, inactivación ultravioleta o el sistema optimizado de CuCL/H2O2 (H2O2 al 0,002 % y CuCl2 1 pM). Para evaluar la antigenicidad, se utilizó un ensayo de valoración de actividad de hemaglutinación ( H a ) . Los virus influenza aglutinan de forma natural los glóbulos rojos, y el mantenimiento de esta actividad durante la inactivación se considera clave para la inmunogenicidad del producto vacunal final. Como se muestra en la figura 10, el sistema de CuCL/H2O2 de los Solicitantes mantuvo valores de HA similares a los observados para el antígeno vivo no tratado.
Específicamente, la figura 10 muestra que la inactivación de virus basada en CuCh/H2O2 mantuvo la actividad de hemaglutinación de la influenza mejor que el H2O2 solo. La influenza A/PR/8/34 (H1N1) purificada se inactivó con H2O2 (3 % durante 2 horas, temperatura ambiente) CuCL/H2O2 (CuCl21 pM, H2O2 al 0,002 % durante 20 horas, temperatura ambiente), luz ultravioleta (UV, 10 julios) o se dejó sin tratar (Viva). Después de la inactivación, las preparaciones de antígeno se ensayaron directamente para determinar la actividad de hemaglutinación (HA). Las preparaciones de antígenos se puntuaron según la concentración de antígeno más baja que todavía demostraba actividad completa de HA, y se representó gráficamente el recíproco de esta concentración. CuCL/H2O2 mantuvo la función proteica (es decir, la actividad de hemaglutinación) a niveles que eran indistinguibles de la influenza viva.
En comparación, la inactivación UV redujo la actividad de HA a un nivel insignificante. La consecuencia in vivo de esta destrucción de HA se puede ver en la figura 11, induciendo CuCb/H2O2 valores sólidos de inhibición de hemaglutinina (HAI) de anticuerpos séricos protectores, mientras que el antígeno tratado con UV no indujo anticuerpos funcionales en ratones e indujo una protección mínima frente a una exposición letal.
Específicamente, la figura 11 muestra que la influenza inactivada con CuCb/H2O2 indujo una sólida inhibición de la hemaglutinación y protegió frente a una exposición letal. La influenza A/PR/8/34 (H1N1) purificada se inactivó con H2O2 (3 % durante 2 horas, temperatura ambiente), CuCb/H2O2 (CuCl2 1 pM, H2O2 al 0,002 % durante 20 horas, temperatura ambiente) o luz ultravioleta (UV, 10 julios), con inactivación completa confirmada mediante pruebas de viabilidad del ensayo de formación de focos. Después de la inactivación, las preparaciones de antígeno se normalizaron según el contenido de proteínas y se formularon con hidróxido de aluminio al 0,10 %. Se inmunizaron ratones BALB/c hembra adultos por vía subcutánea con 5 pg de vacuna.
La figura 11A muestra que se determinaron los valores de inhibición de hemaglutinina (HAI) específicos de influenza en suero para animales dos meses después de la vacunación. Los resultados de los ratones de control no vacunados se muestran a modo de comparación. El límite de detección (LOD) para el ensayo se indica mediante la línea discontinua.
La figura 11B muestra que dos meses después de la inmunización, los ratones se expusieron por vía intranasal a 6 x104 EID50 de influenza viva (A/PR/8/34 (H1N1), 20 DL50) y se les hizo un seguimiento diario para detectar cambios en el peso corporal. Todos los animales que alcanzaron <75 % del peso inicial se sacrificaron de forma humanitaria.
Los ratones vacunados con virus inactivado con CuCb/H2O2 o virus inactivado con H2O2 mostraron una protección muy significativa después de la exposición a influenza (P = 0,0031 y P = 0,015, respectivamente). Mientras que los ratones vacunados con virus inactivados por UV no demostraron una protección significativa (P = 0,25).
EJEMPLO 8
(Se utilizaron con éxito múltiples metales de transición en el enfoque de oxidación dual para el desarrollo de antígenos vacunales)
Cu2+ (en forma de CuCb) fue el metal inicial ensayado en los estudios de desarrollo de antígenos vacunales de oxidación dual descritos para CHIKV, DENV, YFV y virus de la influenza. Sin embargo, como se ha descrito anteriormente, los Solicitantes determinaron que otros metales también tienen el potencial de funcionar de manera similar.
Como se muestra en este ejemplo usando DENV3 como un virus modelo, los estudios de inactivación que consisten en CuCl2 (Cu2+), FeCb (Fe3+) o CsCl (Cs+) y diluciones de H2O2 se ensayaron para determinar su potencial en el desarrollo de antígeno vacunal.
Como se muestra en las figuras 12 A-C, los tres metales proporcionaron condiciones que mantuvieron altos niveles de antigenicidad mientras demostraban la inactivación completa del virus.
Específicamente, las figuras 12 A-C muestran una comparación de metales activos redox para la inactivación de virus basada en oxidación dual. Se trató el DENV3 purificado con un intervalo de concentraciones de H2O2 según lo indicado (20 horas, temperatura ambiente) en presencia de concentraciones crecientes de CuCl2 (figura 12A), FeCb (figura 12 B) y CsCl (figura 12C). Después del tratamiento, se midió el mantenimiento de los sitios de unión de anticuerpos neutralizantes (es decir, la antigenicidad) utilizando un ELISA tipo sándwich específico para DENV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para la proteína de la envoltura de DENV. Los valores de ELISA se expresan como porcentaje de control de virus vivo. Después del tratamiento, el material también se ensayó en busca del DENV3 vivo utilizando un ensayo estándar de unidades formadoras de placas (UFP). Las condiciones exitosas que no demostraron virus vivo detectable (<50 UFP/ml) se indican con un asterisco (y en donde "N.E." es no ensayado).
Los tres metales proporcionaron condiciones que mantuvieron altos niveles de antigenicidad mientras demostraban la inactivación completa del virus.
EJEMPLO 9
(Las combinaciones de metales de transición demostraron sinergia en el sistema de vacunas de oxidación dual)
Como se ha mostrado anteriormente en la figura 12 y el Ejemplo de trabajo 8, se pueden usar diferentes metales en combinación para mejorar la inactivación con H2O2 de virus.
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, para investigar los efectos sinérgicos potenciales, el virus modelo DENV3 se inactivó con combinaciones de CuCl2 (Cu2+) y FeCb (Fe3+) en una cantidad establecida de H2O2 (0,01 %). Varias condiciones de CuCb/FeCb proporcionaron una inactivación completa manteniendo una buena antigenicidad, lo que demuestra que es factible usar varios metales en la misma condición de inactivación (figura 13). De hecho, a concentraciones de CuCl2 de 0,05 pM y 0,10 pM, el aumento de las concentraciones de FeCb mejoró la antigenicidad, lo que indica una sinergia con estos dos metales.
Específicamente, la figura 13 muestra que las combinaciones de metales pueden lograr una inactivación completa manteniendo una buena antigenicidad. Se trató el DENV3 purificado con H2O2 (0,01 %) y el intervalo indicado de concentraciones de CuCl2 y FeCb. Después del tratamiento, se ensayó el antígeno con un ELISA de tipo sándwich específico para el DENV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para la proteína estructural de la envoltura. Los valores de ELISA se expresan como porcentaje de control de virus vivo. Después del tratamiento, el material también se ensayó en busca del DENV3 vivo utilizando un ensayo estándar de unidades formadoras de placas (UFP). Las condiciones exitosas que no demostraron virus vivo detectable (<50 UFP/ml) se indican con un asterisco. A concentraciones de CuCl2 de 0,05 pM y 0,10 pM, el aumento de las concentraciones de FeCb mejoró la antigenicidad, lo que indica una sinergia con estos dos metales.
EJEMPLO 10
(Se utilizó oxidación dual para proporcionar una inactivación optimizada de Campylobacter para un mejor mantenimiento de la morfología bacteriana)
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, Campylobacter son pequeñas bacterias en forma de sacacorchos que típicamente tienen ~0,2 pm de diámetro y ~2-8 pm de longitud (figura 14A).
Después de la inactivación con una solución estándar de H2O2 al 3 % durante 5 horas a temperatura ambiente, las bacterias se dañaron sustancialmente con cambios claros en la morfología, incluida la pérdida de la estructura celular bruta y la formación de aglutinaciones sustanciales (figura 14B). Sin embargo, tras la optimización de un enfoque de oxidación dual utilizando H2O2 al 0,01 % y CuCb 2 uM, los Solicitantes encontraron sorprendentemente que la oxidación dual podía inactivar por completo a las bacterias mientras mantenía una excelente morfología bacteriana durante todo el período de tratamiento con microbios que permanecían indistinguibles de los controles no tratados (figura 14C).
Específicamente, las figuras 14A-14C muestran la inactivación optimizada de Campylobacter para mejorar el mantenimiento de la morfología bacteriana.
En la figura 14A, se cultivó C. coli, se purificó y se dejó sin tratar.
En la figura 14B, se cultivó C. coli, se purificó y se inactivó con una concentración alta pero destructiva de H2O2 (H2O2 al 3 % durante 5 h).
En la figura 14C, se cultivó C. coli, se purificó y se inactivó con CuCl22 pM y H2O2 al 0,01 %. Los datos muestran muestras de cada condición que se aplicaron a portaobjetos y se tiñeron con Gram safranina.
Además de la estructura conservada, un parámetro crítico para preparar una vacuna de células completas inactivadas es asegurar la inactivación completa de los microbios. Utilizando las condiciones óptimas descritas anteriormente, se realizaron estudios de cinética de inactivación. Como se muestra en la figura 15, C. coli demostró una rápida inactivación, con una semivida de tasa de descomposición de (T1/2) de ~15 minutos.
Específicamente, la figura 15 muestra que la exposición a una fórmula optimizada de CuCb/H2O2 da como resultado una rápida inactivación de Campylobacter. Las preparaciones purificadas de C. coli se trataron con una fórmula optimizada de CuCb/H2O2 y una condición de tampón, o se inactivaron de forma simulada (sin CuCh/H2O2). Se tomaron muestras en los puntos indicados y se analizaron para determinar Campylobacter viables.Los símbolos de color blanco indican la ausencia de bacterias vivas. La línea discontinua muestra el límite de detección. Estas cinéticas indican >20 log de inactivación durante el período completo de inactivación de 20 h. Según los valores bacterianos en los lotes de fabricación piloto (~109 UFC/ml), este nivel de inactivación proporciona un alto margen de seguridad durante el proceso de fabricación (hasta 100 millones de veces de inactivación en exceso teórica) mientras se mantiene la estructura bacteriana general (figura 14C).
EJEMPLO 11
(La vacunación contra Campylobacter por oxidación dual proporciona inmunidad protectora en los macacos rhesus)
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, los Solicitantes determinaron la eficacia de la vacuna a través del control de las tasas de enfermedad entérica confirmadas por cultivo de Campylobacter en 60 macacos rhesus inmunizados contra C. coli con CuCb/H2O2 en comparación con animales de control no vacunados.
Para este estudio, los animales se vacunaron por vía intramuscular con la vacuna candidata de contra C. coli de C11CI2/H2O2 (inactivada usando H2O2 al 0,01 % y CuCl22 |j M), con una dosis de refuerzo administrada 6 meses después. Los grupos vacunados se seleccionaron en función del historial previo de la enfermedad, y se dio preferencia a los grupos que tenían tasas de incidencia históricamente altas de infección por Campylobacter. Este enfoque proporcionó una mayor solidez en la evaluación de la eficacia protectora. Todos los adultos/jóvenes (n = 59) recibieron una dosis con adyuvante de alumbre de 40 jg , y 2 lactantes pequeños (<2 kg de peso corporal) recibieron la mitad de la dosis (20 jg). Según el protocolo, cualquier animal diagnosticado con diarrea asociada a Campylobacter durante los primeros 14 días después de la vacunación sería excluido ya que es poco probable que ocurra protección mediada por la vacuna durante este período temprano. Un animal adulto fue excluido del estudio debido a diarrea asociada a Campylobacter el día después de la vacunación. Se recogieron muestras de suero de todos los animales vacunados restantes (n = 59) el día 0 y 6 meses después de la vacunación primaria, momento en el que los animales recibieron una dosis de refuerzo de la vacuna.
Después de la vacunación primaria, se observó un aumento significativo en los valores de anticuerpos séricos específicos de Campylobacter (figura 16A, P <0,001) además de protección contra la enfermedad diarreica asociada a Campylobacter en comparación con años anteriores dentro del mismo grupo de refugio (figura 16B, P = 0,038) o en comparación con otros grupos de refugio durante la temporada de Campylobacter de 2015 (figura 16C, P = 0,020). La salud de los PNH se controla a diario y los casos de enfermedades diarreicas se documentan en una base de datos central consultable. La incidencia de diarrea se controló en la cohorte vacunada y se comparó con aproximadamente 1.000 animales de control no vacunados en otros grupos de refugio similares. Se recogieron muestras fecales de cualquier animal que experimentara un episodio de diarrea y se analizaron para detectar C. coli, C. jejuni y Shigella spp. ya que estos representan los principales patógenos entéricos asociados con la diarrea entre los animales.
Específicamente, las figuras 16A-16C muestran que la oxidación dual-C. coli es inmunógena y protege a RM contra la infección por Campylobacter adquirida de forma natural.
En la figura 16A, se recogieron muestras de suero de animales justo antes de la vacunación, o 6 meses después de la inmunización primaria y se ensayaron para determinar las respuestas de anticuerpos específicos de Campylobacter utilizando un ELISA de células completas optimizado, estando todas las muestras de suero preadsorbidas contra Shigella (una bacteria entérica gramnegativa) para reducir la unión no específica. La prueba de significación se realizó utilizando una prueba de la t de Student para datos emparejados.
Después de la vacunación, se hizo un seguimiento de los animales durante 8 meses para determinar la diarrea asociada a C. coli y se compararon (figura 16B) con las tasas de diarrea del año anterior dentro del mismo refugio, o se compararon (figura 16C) con las tasas de incidencia de diarrea en otros refugios simultáneos (~1.000 animales de control) controlados en 2015. Las flechas de color negro indican el momento de la vacunación de refuerzo.
El análisis intermedio a los 6 meses después de la vacunación primaria no demostró casos de diarrea asociada a C. coli o C. jejuni en el grupo vacunado frente a 76 casos de diarrea asociada a Campylobacter entre los animales no vacunados, lo que representa un efecto protector estadísticamente significativo contra la enfermedad diarreica con cultivo positivo para Campylobacter (P = 0,035) después de una sola vacunación.
Dado que casi todas las vacunas humanas requieren al menos dos dosis para una eficacia protectora óptima y la durabilidad de la memoria inmunológica a menudo mejora después de la vacunación de refuerzo, se siguió un enfoque conservador mediante la administración de una vacunación de refuerzo en el punto temporal de 6 meses seguido de un seguimiento continuo de la incidencia de la enfermedad diarreica entre los PNH. A los 250 días después de la vacunación primaria, continuaron acumulándose más casos de enfermedad entérica asociada a Campylobacter entre la población no vacunada (alcanzando el 8,7 % o un total de 92 animales), mientras que ninguno de los animales (0/59) de la cohorte vacunada mostró signos de la enfermedad y la significación estadística entre los dos grupos aumentó a P = 0,020.
EJEMPLO 12
(La metisazona mejoró la tasa de inactivación de virus basada en oxidación simple y doble)
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, los Solicitantes determinaron que la metisazona mejoró la tasa de inactivación de virus basada en oxidación simple y doble. Como se muestra en las figuras 17A-C, la adición de metisazona pudo aumentar sustancialmente la tasa de inactivación basada en la oxidación dual para el virus vaccinia (VV, genoma de ADN), así como el serotipo 4 del virus del dengue (DENV4, genoma de ARN) y el virus chikungunya (CHIKV, genoma de ARN).
Además, mientras que la metisazona sola tuvo un impacto mínimo en la inactivación del virus (figuras 17B y 17C), la metisazona y el H2O2 juntos (incluso en ausencia de cobre) demostraron una mejora sinérgica para la inactivación del virus.
Específicamente, las figuras 17A, 17B y 17C muestran, según aspectos particulares, que la metisazona mejoró la tasa de inactivación de virus basada tanto oxidación simple como dual. (A) Cada uno del virus vaccinia (PBS, pH = 7,5), (B) serotipo 4 del virus del dengue (DENV4, en NaCI 110 mM, NaPÜ4150 mM [pH = 7,5], D-sorbitol al 2 %) y (C) virus Chikungunya (CHIKV, en PBS complementado con NaPÜ4 150 mM [pH = 7,5]) se trató con reactivos de inactivación como se indica en la figura. Las concentraciones de los diferentes componentes fueron las siguientes: H2O2 = 0,004 % (CHIKV) o 0,002 % (DENV4 y VV); CuCl2 = 1 pM (todos los virus), metisazona (MZ) = 10 pM (todos los virus). La línea discontinua indica el límite de detección (LOD).
EJEMPLO 13
(La metisazona mejoró la tasa de inactivación bacteriana basada en oxidación dual)
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, los Solicitantes determinaron que la metisazona mejoró la tasa de inactivación bacteriana basada en oxidación dual.
Los resultados del Ejemplo de trabajo 12 se extendieron a las bacterias (figuras 18A-C), en donde de nuevo la adición de metisazona al enfoque de oxidación dual (por ejemplo, H2O2/CuCb) mejoró sustancialmente las tasas de inactivación de Campylobacter coli (una bacteria gramnegativa de ejemplo), Listeria monocytogenes (una bacteria grampositiva de ejemplo) y Shigella dysenteriae (una bacteria gramnegativa de ejemplo).
Específicamente, las figuras 18A, 18B y 18C muestran, según aspectos particulares, que la metisazona mejoró la tasa de inactivación bacteriana basada en oxidación dual. (A) Campylobacter coli (B) Listeria monocytogenes y (C) Shigella dysenteriae se intercambiaron con tampón en NaCl 10 mM, NaPO4150 mM [pH = 7,5] y D-sorbitol al 2 % y se trataron con componentes de inactivación como se indica en cada panel. Se hizo un seguimiento en el tiempo de la viabilidad posterior a la inactivación, determinada a través de las unidades formadoras de colonias por ml (UFC/ml). Las concentraciones de los componentes de inactivación se optimizaron para cada tipo de bacteria de la siguiente manera: C. coli: H2O2 = 0,01 %, CuCl2 = 2 pM, metisazona (MZ) = 20 pM; L. monocytogenes: H2O2 = 0,10 %, CuCb = 10 pM, metisazona (MZ) = 100 pM; S. dysenteriae: H2O2 = 0,10 %, CuCb = 10 pM, Mz = 100 pM; los símbolos de color blanco representan condiciones sin MZ, mientras que los símbolos de color negro indican la adición de MZ. El límite de detección fue de 10 UFC/ml.
EJEMPLO 14
(La metisazona mejoró las tasas de inactivación mientras mantenía la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual)
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, los Solicitantes determinaron que la metisazona mejoraba las tasas de inactivación mientras mantenía la antigenicidad durante la inactivación de virus basada en oxidación dual. Para evaluar el impacto de la metisazona en la antigenicidad durante la inactivación, los virus modelo de ejemplo CHIKV y DENV4 se trataron con múltiples enfoques de inactivación: alta concentración de H2O2 (sistema de oxidación simple), oxidación dual (como se describe en esta invención) u oxidación dual con metisazona. Como muestran los datos de ELISA en las figuras 19A (virus Chikungunya (CHIKV)) y 19B (serotipo 4 del virus del dengue (DENV4)), la adición de metisazona al enfoque de oxidación dual mantuvo o mejoró significativamente la antigenicidad al reducir el daño a los epítopos neutralizantes, al tiempo que aumentó la tasa de inactivación en aproximadamente 10 a 20 veces.
Específicamente, las figuras 19A y 19B muestran, según aspectos particulares, que la metisazona mejoró las tasas de inactivación manteniendo al mismo tiempo la antigenicidad durante la inactivación de virus basada en oxidación dual. Cada uno del virus chikungunya (CHIKv , en PBS complementado con NaPO4 150 mM [pH = 7,5]) y serotipo 4 del virus del dengue (DENV4, en NaCl 110 mM, NaPO4150 mM [pH = 7,5], D-sorbitol al 2 %) se trató durante 20 horas a temperatura ambiente con los componentes de inactivación indicados en la figura. Después del tratamiento del virus, la retención de antígenos se ensayó con (A) un ELISA tipo sándwich específico para CHIKV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para las proteínas estructurales E1 y E2 o (B) un ELISA tipo sándwich específico para DENV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para la proteína estructural de la envoltura. Los valores de ELISA indican epítopos neutralizantes retenidos y se expresan como porcentaje de controles de virus vivos. Ambos virus también se trataron con H2O2 al 3 % para mostrar la pérdida de epítopos neutralizantes mediante un enfoque de inactivación dañino. Se muestran las semividas de inactivación para cada condición.
EJEMPLO 15
(Análogos químicos de metisazona, o grupos/subestructuras funcionales de metisazona o combinaciones de los mismos que mejoran la inactivación y el mantenimiento de la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual)
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, los Solicitantes determinaron que los análogos químicos de metisazona, o grupos/subestructuras funcionales de metisazona o combinaciones de los mismos, mejoraron la inactivación y el mantenimiento de la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual.
Como se ha mencionado anteriormente, la metisazona es un compuesto desarrollado originalmente como un agente antiviral in vivo. Se ensayaron varios compuestos relacionados para determinar si proporcionaban mejoras similares a la inactivación de patógenos para el desarrollo de vacunas (figuras 20A-C). Como se muestra con el virus modelo de ejemplo DENV4, varios de estos compuestos, tales como isatin p-tiosemicarbazona y N-propilisatin ptiosemicarbazona, demostraron resultados similares a los de la metisazona, incluidas tasas mejoradas de inactivación, mientras mantienen una antigenicidad superior en el sistema de oxidación dual. Curiosamente, cuando se usa solo el resto de tiosemicarbazida, aún se observa una mejora de la inactivación y una antigenicidad superior, mientras que la isatina o la semicarbazida no parecen aumentar la tasa de inactivación, pero aún demuestran protección de los antígenos de proteína contra el daño oxidativo durante la inactivación. Para explorar si los componentes principales separados (grupos/subestructuras funcionales) de los compuestos relacionados con la metisazona podrían combinarse para recapitular la inactivación óptima, se ensayaron mezclas de isatina tiosemicarbazida o isatina semicarbazida. Si bien la isatina semicarbazida aún demostraron protección antigénica, no hubo mejora de la inactivación del virus. Por el contrario, isatina tiosemicarbazida dieron como resultado tanto una rápida inactivación (más rápida que cualquiera de los componentes solos), así como en un gran aumento de la antigenicidad.
Específicamente, las figuras 20A, 20B y 20C muestran, según aspectos particulares, que los análogos químicos de metisazona, o grupos/subestructuras funcionales de metisazona o combinaciones de los mismos, mejoran la inactivación y el mantenimiento de la antigenicidad durante la inactivación viral basada en oxidación dual. (A) Se muestran compuestos químicos relacionados de la clase de isatin p-tiosemicarbazona. (B) El serotipo 4 del virus del dengue (DENV4, en NaCl 110 mM, NaPO4150 mM [pH = 7,5], D-sorbitol al 2 %) se trató con componentes de oxidación dual como se indica en cada panel (H2O2 = 0,01 %, CuCl2 = 1 pM) en ausencia o presencia de diferentes compuestos de tipo MZ, usándose cada compuesto a una concentración de 10 pM. (B) Para evaluar la inactivación, se ensayó el virus viable mediante un ensayo de placas 1 hora después de la inactivación. La línea discontinua indica el límite de detección. (C) Para cuantificar la antigenicidad, se realizó un ELISA tipo sándwich específico de DENV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para la proteína estructural de la envoltura 20 horas después de la inactivación. Los valores de ELISA indican epítopos neutralizantes retenidos y se expresan como porcentaje de controles de virus vivos.
EJEMPLO 16
(Niveles crecientes de metisazona con respecto al componente de metal de transición del sistema de oxidación dual mejoraron la antigenicidad y el perfil de inactivación del sistema de oxidación dual)
Como se muestra en este ejemplo de trabajo, los Solicitantes determinaron que los niveles crecientes de metisazona con respecto al componente de metal de transición del sistema de oxidación dual mejoraron la antigenicidad y el perfil de inactivación del sistema de oxidación dual.
Se examinó el impacto de las concentraciones relativas de metisazona y el metal de transición en el sistema de oxidación dual (figura 21). Se descubrió que el aumento de las concentraciones de metisazona en relación con el metal de transición demostró mejoras concomitantes tanto en la antigenicidad conservada como en el aumento de las tasas de inactivación del virus, con una relación molar preferida de 10:1 (metisazona:metal de transición).
Específicamente, la figura 21 muestra, según aspectos particulares, que los niveles crecientes de metisazona con respecto al componente de metal de transición del sistema de oxidación dual mejoraron la antigenicidad y el perfil de inactivación del sistema de oxidación dual. El virus chikungunya (CHIKV, en PBS complementado con NaPO4150 mM [pH = 7,5]) se trató con H2O2 (0,02 %) y CuCl2 (1 pM) a temperatura ambiente en presencia de concentraciones decrecientes de metisazona. Después del tratamiento, el virus se ensayó mediante un ensayo de placas en 1 hora para evaluar la inactivación y se ensayó la antigenicidad conservada en 20 horas usando un ELISA tipo sándwich específico para CHIKV compuesto por dos anticuerpos monoclonales neutralizantes específicos para las proteínas estructurales E1 y E2. El límite de detección para el ensayo de placas se indica mediante la línea discontinua.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un procedimiento para producir una composición de vacuna inmunógena que comprende un patógeno inactivado, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto un patógeno que tiene un genoma de ARN o ADN con un reactivo de Fenton,
que comprende peróxido de hidrógeno en combinación con al menos un ion metálico seleccionado del grupo que consiste en Cu y Fe, en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para que el agente haga que el patógeno no sea infeccioso, conservando al mismo tiempo la inmunogenicidad del patógeno, preferentemente en donde el patógeno está aislado o purificado antes de ponerse en contacto con el reactivo de Fenton.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además verificar la inmunogenicidad del patógeno no infeccioso utilizando un anticuerpo específico del patógeno, inmunoensayos de linfocitos B o T, ensayos de aglutinación u otros ensayos adecuados, en donde se proporciona una composición de vacuna inmunógena que comprende un patógeno inactivado.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en donde el patógeno es un virus o una bacteria.
4. El procedimiento de la reivindicación 3, en donde el patógeno es un virus, preferentemente en donde el patógeno es un virus de la familia Togaviridae, Flaviviridae, Poxviridae o Orthomyxoviridae, o en donde el patógeno es un virus de la familia Togaviridae (género: Alphavirus), la familia Flaviviridae (género: Flavivirus), la familia Poxviridae (género Orthopoxvirus) o la familia Orthomyxoviridae (género Influenzavirus), o en donde el virus es el virus chikungunya (CHIKV, familia: Togaviridae, género: Alphavirus), virus del dengue serotipos 1-4 y virus de la fiebre amarilla (DENV 1-4, YFV, familia: Flaviviridae, género: Flavivirus), virus vaccinia (VV, familia: Poxviridae, género: Orthopoxvirus) o virus influenza (familia: Orthomyxoviridae, género: Influenzavirus.
5. El procedimiento de la reivindicación 3,
en donde el patógeno es una bacteria, preferentemente
en donde la bacteria es Campylobacter, Shigella spp. o Listeria spp., o
en donde la bacteria es Campylobacter coli o Campylobacter jejuni.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde poner en contacto el patógeno comprende poner en contacto el patógeno con el reactivo de Fenton y un compuesto que tiene la fórmula T:
Figure imgf000040_0001
en donde R1 es independientemente H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH o por arilo; y en donde X es independientemente H o halógeno; y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, o
en donde X y R2 son H; y en donde R1 es H (isatin p-tiosemicarbazona), -CH3 (N-metil-isatin p-tiosemicarbazona (metisazona)), o propilo (N-propil-isatin p-tiosemicarbazona), o
en donde R1 es -CH3 (N-metil-isatin p-tiosemicarbazona (metisazona))
Figure imgf000041_0001
; o
en donde poner en contacto el patógeno comprende poner en contacto el patógeno con el reactivo de Fenton y uno o más compuestos, teniendo cada uno una de las fórmulas II-V:
Figure imgf000041_0002
en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; y en donde X es independientemente H o halógeno; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo;
Figure imgf000041_0003
en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; en donde X es independientemente H o halógeno; y en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH, o por arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo; y
Figure imgf000041_0004
en donde R2 y R3 son independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH, o por arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo; y combinaciones del mismo, o
en donde X de fórmula II es H, y R1 de fórmula (II) es H (isatina), -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatina); en donde X, R1 y R2 de fórmula (III) son H (indol, 2,3-diona, 3-hidrazona); en donde R2 y R3 de fórmula (IV) son H (tiosemicarbazida); y en donde R2 y R3 de fórmula (V) son H (semicarbazida), o
en donde poner en contacto el patógeno comprende poner en contacto el patógeno con el reactivo de Fenton, tiosemicarbazida y un compuesto que tiene la fórmula VI:
Figure imgf000042_0001
en donde Ri es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4), preferentemente
en donde R1 es H (isatina), -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatina).
7. Un procedimiento para producir una composición de vacuna inmunógena que comprende un patógeno inactivado, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto un patógeno que tiene un genoma de ARN o ADN con peróxido de hidrógeno en combinación con un reactivo de metisazona según la fórmula I de la reivindicación 6, la fórmula VII de la reivindicación 6, una de las fórmulas II-V de la reivindicación 6, la fórmula VI de la reivindicación 6, y combinaciones de las mismas, en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para que el agente haga que el patógeno no sea infeccioso, conservando al mismo tiempo la inmunogenicidad del patógeno.
8. El procedimiento de la reivindicación 7, que comprende además verificar la inmunogenicidad del patógeno no infeccioso utilizando un anticuerpo específico del patógeno, inmunoensayos de linfocitos B o T, ensayos de aglutinación u otros ensayos adecuados.
9. Un procedimiento para inactivar un patógeno, comprendiendo el procedimiento: poner en contacto un patógeno que tiene un genoma de ARN o ADN con peróxido de hidrógeno, o un reactivo de Fenton que contiene peróxido de hidrógeno en combinación con al menos un ion metálico seleccionado del grupo que consiste en Cu y Fe, y un reactivo de metisazona, en una cantidad y durante un período de tiempo suficiente para hacer que el patógeno no sea infeccioso, en donde la inactivación del patógeno se produce a una velocidad mayor en relación con la que se produce al poner en contacto el patógeno con peróxido de hidrógeno o con el reactivo de Fenton solo, y preferentemente, en donde el patógeno está aislado o purificado antes de ponerlo en contacto con el peróxido o el reactivo de Fenton.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en donde el patógeno es un virus o una bacteria, preferentemente
en donde el virus es de la familia Togaviridae, Flaviviridae, Poxviridae o Orthomyxoviridae, o
en donde el virus es de la familia Togaviridae (género: Alphavirus), la familia Flaviviridae (género: Flavivirus), la familia Poxviridae (género Orthopoxvirus) o la familia Orthomyxoviridae (género Influenzavirus), o
en donde el virus es el virus chikungunya (CHIKV, familia: Togaviridae, género: Alphavirus), virus del dengue serotipos 1-4 y virus de la fiebre amarilla (DENV 1-4, YFV, familia: Flaviviridae, género: Flavivirus), virus vaccinia (VV, familia: Poxviridae, género: Orthopoxvirus) o virus influenza (familia: Orthomyxoviridae, género: Influenzavirus; o
en donde la bacteria es Campylobacter, Shigella spp. o Listeria spp., o
en donde la bacteria es Campylobacter coli o Campylobacter jejuni.
11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 9-10, en donde el reactivo de metisazona comprende un compuesto que tiene la fórmula I:
Figure imgf000042_0002
en donde R1 es independientemente H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH o por arilo; y en donde X es independientemente H o halógeno; y sales farmacéuticamente aceptables del mismo, o
en donde X y R2 son H; y en donde R1 es H (isatin p-tiosemicarbazona), -CH3 (N-metil-isatin p-tiosemicarbazona (metisazona)), o propilo (N-propil-isatin p-tiosemicarbazona), o
en donde R1 es -CH3 (N-metil-isatin p-tiosemicarbazona (metisazona))
Figure imgf000043_0001
o
en donde poner en contacto el patógeno comprende poner en contacto el patógeno con el reactivo de Fenton y uno o más compuestos, teniendo cada uno una de las fórmulas II-V:
Figure imgf000043_0002
en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; y en donde X es independientemente H o halógeno; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo;
Figure imgf000043_0003
en donde R1 es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4) opcionalmente sustituido por -OH; en donde X es independientemente H o halógeno; y en donde R2 es independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH, o por arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo; y
Figure imgf000043_0004
en donde R2 y R3 son independientemente H, alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C2) opcionalmente sustituido por -OH, o por arilo; y sales, incluyendo sales farmacéuticamente aceptables del mismo; y combinaciones del mismo, o
en donde X de fórmula II es H, y R1 de fórmula (II) es H (isatina), -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatina); en donde X, R1 y R2 de fórmula (III) son H (indol, 2,3-diona, 3-hidrazona); en donde R2 y R3 de fórmula (IV) son H (tiosemicarbazida); y en donde R2 y R3 de fórmula (V) son H (semicarbazida), o
en donde poner en contacto el patógeno comprende poner en contacto el patógeno con el reactivo de Fenton, tiosemicarbazida y un compuesto que tiene la fórmula VI:
Figure imgf000044_0001
en donde Ri es H o alquilo inferior (por ejemplo, alquilo C1-C4), preferentemente en donde R1 es H (isatina), -CH3 (N-metil-isatina) o propilo (N-propil-isatina).
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