CN101981182A - 经遗传修饰减毒的疱疹性口炎病毒、其组合物和使用方法 - Google Patents

经遗传修饰减毒的疱疹性口炎病毒、其组合物和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于产生用于制备免疫原性组合物的经遗传修饰并减毒的疱疹性口炎病毒(VSV)毒株的方法。更具体地，本发明涉及鉴定减毒的VSV的具体遗传修饰，所述修饰导致提高的病毒产量和用于制备免疫原性组合物的减毒毒株稳定性的提高。本发明还公开了用于细胞培养物繁殖的方法和在VSV大规模生产中的用途。

Description

经遗传修饰减毒的疱疹性口炎病毒、其组合物和使用方法
政府支持条款
产生本发明的研究至少部分由国家卫生研究所(National Institutes ofHealth)合同号N01-A1-25458支持。因此，政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本发明一般涉及负链RNA病毒。具体地，本发明涉及用于使疱疹性口炎病毒(VSV)颗粒适合在用于生产的细胞培养物中生长的方法和组合物。
发明背景
疱疹性口炎病毒(VSV)是属于单分子负链RNA病毒目(orderMononegavirales)弹状病毒科(Rhabdoviridae family)的原型病毒，其包括具有保守的基因顺序的单链、非区段的、负-有义RNA病毒。11-kbVSV基因组含有编码五种病毒蛋白质的五种基因：核壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、附着糖蛋白(G)和RNA-依赖性RNA聚合酶(L)。基因组中的基因顺序是3’-N-P-M-G-L-5’，并且大量研究证明基因表达是从单个3’启动子专性顺序的(Rose和Whitt，Rhabdoviridae：The Viruses and Their Replication.In“Fields Virology”，4th Edition，Vol.1.Lippincott和Williams和Wilkins，1221-1244，2001)。
N基因编码负责基因组壳体化的核壳体蛋白，而P(磷蛋白)和L(大)编码序列指定RNA-依赖性RNA聚合酶的亚基。基质蛋白(M)促进病毒体成熟并且排列病毒颗粒的内表面。VSV编码单个被膜糖蛋白(G)，所述被膜糖蛋白发挥细胞附着蛋白的作用，介导膜融合，并且是中和抗体的靶标。
两种在西半球最常见的VSV血清型被命名为印地安那(VSVin)和新泽西(VSVnj)。在自然中，VSV感染家畜，引起自限性疾病。尽管天然存在的VSV人感染是罕见的，但是已报导直接暴露于受感染家畜的或实验室环境中的个体被VSV感染的病例。人的VSV感染典型地是无症状的，或导致温和的流感样病态(Fields，B.N.，和K.Hawkins，N.Engl.J.Med.277：989-94，1967)。在小哺乳动物中，小鼠可容易地通过多种接种途径被实验感染，因此可作为极佳的小动物模型用于免疫原性、致病性和神经毒力研究(Bruno-Lobo，等An.Microbiol.(Rio J.)15：53-68，1968；Bruno-Lobo，等，An.Microbiol.(Rio J.)15：69-80，1968；Flanagan，E.B.等J.Virol.77：5740-8，2003；Wagner，R.R.Infect.Immun.10：309-315，1974；Huneycutt，等J.Virol.67：6698-706，1993)。
在过去的数年间，作为用于含有大量人病原体的免疫原性组合物的载体，VSV证明是有前途的，所述病原体包括HIV、乳头状瘤病毒、RSV、丙型肝炎病毒和流感病毒。大量特性使得VSV成为有吸引力的人用候选载体(Bukreyev，等J.Virol.80：10293-306，2006；Clarke，等Springer SeminImmunopathol.28：239-253，2006)。这些特性包括：1)VSV不是人病原体；2)几乎没有可能妨碍其用于人的预先存在的免疫性；3)VSV容易感染许多细胞类型；4)其在适用于制造免疫原性组合物的细胞系中有效繁殖；5)其是遗传稳定的；6)存在生产重组病毒的方法；7)VSV能够接受一个或多个外来基因插入物，并在感染后指导高水平的表达；和8)VSV感染是细胞免疫性和体液免疫性二者的有效诱导物。允许从基因组cDNA中容易地回收rVSV的反向遗传学技术的出现大幅促进这类研究(Lawson，等Proc Natl Acad Sci USA 92：4477-81，1995；Schnell，等EMBO J13：4195-203，1994)。另外，VSV相对小和简单的基因组构成已证明顺应外来基因插入，得到的病毒生产高水平的外来蛋白质。第一载体被设计为在G和L之间插入带有必需的基因间转录控制元件的外来编码序列。发现这些原型载体引发针对外来抗原的有效的免疫应答，并且在测试它们的动物模型中被良好耐受(Grigera，等Virus Res 69：3-15，2000；Kahn等J Virol75：11079-87，2001；Roberts，等J Virol 73：3723-32，1999；Roberts，等J Virol72：4704-11，1998，Rose，等Cell 106：539-49，2001；Rose，等J Virol 74：10903-10，2000；Schlereth，等J Virol 74：4652-7，2000)。显著地，Rose等发现两种载体(一种编码HIV-1env，另一种编码SIV gag)的共同施用在针对病原性SHIV攻击受保护的经免疫的猕猴中产生免疫应答(Rose，等Cell106：539-49，2001)。大部分这些研究用下述原型VSV载体进行，所述原型VSV载体来自于野生型(wt)VSV主链，并且与wt VSV相比显示被显著减毒(Roberts，等J.Virol.72：4704-11，1998)。更近期的研究显示在针对神经毒力的非人灵长动物模型中评价时，原型VSV载体引起了对神经组织的显著水平的损伤，尽管与野生型病毒相比处于降低的水平(Johnson，等Virol.360，36-49，2007)。这些观察结果导致以下结论：原型rVSV载体对于在人中使用而言可能未被充分减毒。
开发下述可大规模进行的繁殖方法仍然是在能够证实临床评价之前必须解决的障碍，所述方法符合管理用于对人施用的免疫原性组合物制造的规则。设计用于对人施用的载体时，导致病毒减毒的突变必须是稳定的，并且病毒的产量足以进行大规模生产。预期单一人剂量至少为1x107IU，因此只有在每ml培养基生产多于107IU时载体的制造才是可行的。
本领域对下述方法存在需要，所述方法使减毒的VSV颗粒适合在细胞培养物中有提高的生产，其中回收的所述减毒VSV颗粒的产量足以在大规模制造中使用。期望这类方法应使用有资格用于商业生产的细胞。另外，这类方法应当保留下述原始突变，所述突变导致病毒减毒，同时将产量提高至足以进行大规模生产的水平。
本文任何参考文献的引用不应当被视为承认这类参考文献可作为本发明的现有技术获得。
发明内容
根据本发明，提供了通过在Vero细胞或任何易感的细胞底物中以低感染复数(MOI)连续传代，使高度减毒的VSV重组体适应组织培养的工艺或方法。多次连续传代过程导致基因型改变，所述基因型改变的特征是病毒基因组各处大量核苷酸(NT)取代的逐步增长。大部分这些核苷酸取代导致VSV蛋白质中的氨基酸(AA)取代。该过程导致病毒的表型适应，伴随着病毒产量的大幅提高。在Vero细胞中继续传代，直至达到基因型和表型的稳定性，通常在10到15次连续传代(P10-P15)中达到。P15之后病毒的进一步传代显示很少或没有额外的取代，并且不导致病毒产量的进一步增强。该过程导致制造产量的大幅提高以及增强的制造一致性。在高度灵敏的小鼠颅内NV动物模型中测试时，适应性突变未大幅影响被传代的病毒的神经毒力(NV)。
因此，本发明的一个方面提供了经分离的、经遗传修饰的疱疹性口炎病毒(VSV)，其在对应于至少一种以下位置的区域中具有至少一个氨基酸突变：
-M蛋白的第119或142位的氨基酸；
-G蛋白的第109、224、438、477或481位的氨基酸；和
-L蛋白的第205、220或1450位的氨基酸。
在本发明的一个实施方案中，编码经遗传修饰的VSV的核酸还包含编码至少一种异源抗原或其片段的核酸。推测所述一种异源抗原或其片段来自致病微生物。获得编码异源抗原的核酸的致病微生物可选自由病毒、细菌、原生动物和真菌组成的组。在一个实施方案中，异源抗原可选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、Epstein-Barr病毒抗原、Varicella-Zoster病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、鼻病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、Norwalk病毒抗原、披膜病毒抗原、甲型病毒抗原、风疹病毒抗原、狂犬病病毒抗原、Marburg病毒抗原、Ebola病毒抗原、乳头状瘤病毒抗原、多瘤病毒抗原、偏肺病毒抗原、冠状病毒抗原、Vibrio cholerae抗原、Plasmodium falciparum抗原、Plasmodium vivax抗原、Plasmodium ovale抗原、Plasmodium malariae抗原、Plasmodiumknowlesi抗原、Streptococcus pneumoniae抗原、Streptococcus pyogenes抗原、Helicobacter pylori抗原、Streptococcus agalactiae抗原、Neisseriameningitidis抗原、Neisseria gonorrhoeae抗原、Corynebacteriumdiphtheriae抗原、Clostridium tetani抗原、Bordetella pertussis抗原、Haemophilus抗原、Chlamydia抗原和Escherichia coli抗原。
在本发明的一个实施方案中，编码经遗传修饰的VSV的核酸还包含编码异源抗原的核酸，所述异源抗原是人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白。在一个实施方案中，HIV蛋白由选自下组的基因编码，所述组由gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev和vpu组成。在一个实施方案中，HIV蛋白是HIV gag蛋白。在一个实施方案中，HIV gag蛋白在第165、270、329或348位上具有至少一个突变。
在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV具有包含保守性或非保守性氨基酸改变的突变。
在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV具有M蛋白第119或142位任一或M蛋白第119位和142位二者上的突变。在一个实施方案中，M蛋白第119位的氨基酸突变是T→N突变，并且M蛋白第142位的氨基酸突变是P→T突变或P→Q突变。
在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV在G蛋白的第109、224、438、477或481位上具有分别为K→N、N→T、S→I、A→V/G→L或V→I的氨基酸突变。
在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV在L蛋白的第205、220或1450位上具有分别为P→L、K→E或L→I的氨基酸突变。
在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV还包含编码HIV gag蛋白的核酸分子，其中所述HIV gag蛋白在至少第165、270、329或348位氨基酸之一中具有突变，其中所述突变分别为S→G、L→S、D→N或T→K。
在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV中的上述突变导致病毒基因型和/或表型的稳定性提高。在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV中的上述突变导致感染了经遗传修饰的VSV的细胞生产病毒的产量提高。
在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV在其基因组中还包含至少两种其它突变。在一个实施方案中，所述突变可选自由以下组成的组：温度敏感性突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。
本发明的第二方面提供了生产本文所述的经遗传修饰的VSV的方法，所述方法包括在易感的哺乳动物细胞系中以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/ml的低感染复数(MOI)将VSV连续传代至少5-15代，其中所述病毒具有至少1x106PFU/ml的效价和至少一个或多个本文所述的突变。
在一个实施方案中，上述方法得到经遗传修饰和减毒的病毒，所述病毒具有至少1x107PFU/ml的效价。
在一个实施方案中，上述方法利用易感的细胞系，即能够被本文所述经遗传修饰的VSV感染的任何细胞系。例如，易感的细胞系可包括但不限于Vero细胞系、幼仓鼠肾(BHK)细胞、或人胚肾细胞系如293细胞系。
在一个实施方案中，上述方法得到的病毒产量是用下述病毒毒株得到的5到100倍，所述病毒毒株未以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/ml的低MOI传代约5-15代。
在一个实施方案中，上述方法导致病毒基因型和/或表型稳定性提高。
本发明的第三方面提供了免疫原性组合物，其包含任一种或多种上述经遗传修饰的VSV和可药用载剂。
在一个实施方案中，免疫原性组合物还包含佐剂。
本发明的第四方面提供了用于保护哺乳动物不被致病微生物感染的方法，所述方法包括施用免疫有效量的任一种或多种本文所述经遗传修饰的VSV。
本发明的第五方面提供了使病毒适应在细胞培养物中生长的方法，所述方法包括：
a.以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/细胞的低感染复数(MOI)用病毒感染细胞培养物；
b.收获含有所述病毒的细胞培养基；
c.澄清所述细胞培养基；
d.冷冻所述细胞培养基；和
e.将步骤a)到d)重复约5到15次，
其中所述方法导致病毒生产/产量提高至5到100倍，和病毒基因型和表型稳定性的提高。
在一个实施方案中，本文所述方法利用属于减毒病毒的病毒。在一个实施方案中，使所述方法适应病毒免疫原性组合物的大规模生产。在一个实施方案中，所述方法导致与未以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/细胞的低感染复数传代约5-15代的病毒毒株获得的病毒产量相比5到100倍的病毒产量。在一个实施方案中，上述方法允许保持与病毒减毒相关的任何预先存在的突变。与病毒减毒相关的预先存在的突变可选自由以下组成的组：温度敏感性突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。在一个实施方案中，所述方法允许保持与病毒减毒相关的低神经毒力谱。在一个实施方案中，上述方法中使用的减毒病毒是疱疹性口炎病毒(VSV)的毒株。在一个实施方案中，上述方法利用经遗传修饰的VSV，所述VSV在对应于至少一个以下位置的区域中具有至少一个氨基酸突变：
-M蛋白第119或142位的氨基酸；
-G蛋白第109、224、438、477或481位的氨基酸；和
-L蛋白第205、220或1450位的氨基酸。
在一个实施方案中，本文所述方法利用下述疱疹性口炎病毒，所述病毒具有包含保守性或非保守性氨基酸改变的突变。在一个实施方案中，突变可以是VSV M蛋白第119或142位任一或M蛋白第119位和142位二者上的突变。在一个实施方案中，M蛋白第119位的氨基酸突变是T→N突变，并且M蛋白第142位的氨基酸突变是P→T突变或P→Q突变。
在一个实施方案中，突变可以位于VSV G蛋白的第109、224、438、477或481位，并可分别为K→N、N→T、S→I、A→V/G→L或V→I突变。
在一个实施方案中，突变可以位于VSV Lp的第205、220或1450位。
在本发明的一个实施方案中，本文所述方法利用可选自以下的VSV毒株：印地安那血清型(ATCC，VR-1238)、新泽西血清型(ATCC，VR-1239)、伊斯法罕血清型(PMID：192094)、金迪普拉血清型(ATCC，VR-476)或其它水泡性病毒。
在本发明的一个实施方案中，本文所述方法利用下述VSV毒株，其含有编码至少一种异源抗原的核酸。异源抗原得自选自下组的致病微生物，所述组由病毒、细菌、原生动物和真菌组成。异源抗原可选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、Epstein-Barr病毒抗原、Varicella-Zoster病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、鼻病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、Norwalk病毒抗原、披膜病毒抗原、甲型病毒抗原、风疹病毒抗原、狂犬病病毒抗原、Marburg病毒抗原、Ebola病毒抗原、乳头状瘤病毒抗原、多瘤病毒抗原、偏肺病毒抗原、冠状病毒抗原、Vibriocholerae抗原、Plasmodium falciparum抗原、Plasmodium vivax抗原、Plasmodium ovale抗原、Plasmodium malariae抗原、Plasmodium knowlesi抗原、Streptococcus pneumoniae抗原、Streptococcus pyogenes抗原、Helicobacter pylori抗原、Streptococcus agalactiae抗原、Neisseriameningitidis抗原、Neisseria gonorrhoeae抗原、Corynebacteriumdiphtheriae抗原、Clostridium tetani抗原、Bordetella pertussis抗原、Haemophilus抗原、Chlamydia抗原和Escherichia coli抗原。
在一个实施方案中，异源抗原包含HIV蛋白。在一个实施方案中，所述HIV蛋白由选自下组的基因编码，所述组由gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev和vpu组成。在一个实施方案中，HIV蛋白是HIV gag蛋白。在一个实施方案中，HIV gag蛋白在第165、270、329或348位上具有至少一个突变。
在一个实施方案中，HIV gag蛋白第165、270、329或348位上的氨基酸突变分别为S→G、L→S、D→N或T→K。
附图概述
图1：wtVSV and attn VSVN4CT1-gag1(IN和NJ血清型)的示意性基因组构成。
图2：用于在Vero细胞中连续传代病毒的实验方案概览。每5代通过所示实验分析病毒。
图3：Vero细胞中连续传代后减毒的IN血清型VSV(rVSVinN4CT1-gag1)病毒中增加的适应性氨基酸取代。
图4：Vero细胞中连续传代后减毒的NJ血清型VSV(rVSVnjN4CT1-gag1)病毒中增加的适应性氨基酸取代。
图5：IN血清型减毒的rVSVinN4CT1-gag1病毒的生长动力学。连续传代导致产量的显著提高，所述产量超出≥107PFU/ml的制造目标。第15代后没有生长的显著改变。
图6：传代水泡对NJ血清型的减毒rVSVnjN4CT1-gag1病毒生长动力学的影响。
图7：在如Cooper等，J Virology，82，207-29，2008中所述的小鼠颅内(IC)LD50动物模型中测试rVSVinN4CT1-gag1传代病毒P0到P25的神经毒力(NV)结果。
图8A-8L：原始(第0代或P0)病毒和第25代VSV印地安那血清型的核苷酸(NT)和氨基酸(AA)序列比较。传代病毒中NT和AA取代用粗体表示。
图9A-9M：原始(第0代或P0)病毒和第25代VSV新泽西血清型的核苷酸(NT)和氨基酸(AA)序列比较。传代病毒中NT和AA取代用粗体表示。
图10：使用低传代病毒和高传代病毒的VSVinN4CT1-gag1生物反应器运行的生长动力学。
图11：使用低传代病毒和高传代病毒的VSVnjN4CT1-gag1生物反应器运行的生长动力学。
发明详述
在描述本发明方法和治疗方法论之前，应当理解本发明不限于具体的方法和所述实验条件，因为这类方法和条件可以变化。还应当理解本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，不意图限制。
在说明书和附带的权利要求书中使用时，除非上下文另有明确说明，单数形式“一个”(″a″、″an″)和“这个”(″the″)包括复数。因此，例如“这个方法”包括本文所述类型的一种或多种方法和/或步骤，和/或本领域技术人员在阅读该公开内容后会明白的方法和/或步骤等等。
因此，在本申请中可能使用常规分子生物学、微生物学和本领域中的重组DNA技术。这类技术在文献中全面解释。参阅例如Sambrook，Fritsch&Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(herein″Sambrook等，1989″)；DNA Cloning：A Practical Approach，Volumes I and II(D.N.Glover ed.1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait ed.1984)；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins eds.(1985))；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higgins，eds.(1984))；Animal Cell Culture(R.I.Freshney，ed.(1986))；Immobilized Cells AndEnzymes(IRL Press，(1986))；B.Perbal，A Practical Guide To MolecularCloning(1984)；F.M.Ausubel等(eds.)，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，Inc.(1994)。
尽管在本发明的实践或检验中可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料，但是本文中描述了优选的方法和材料。本文提到的所有公开通过引用整体并入。
定义
本文使用的术语具有本领域技术人员公认和已知的含义，然而为了便利和全面，在下文公开具体的术语及其含义。
术语“约”表示在20％以内，优选地10％以内，更优选地5％以内。
术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫应答的化合物或混合物。佐剂可以发挥缓慢释放抗原的组织储藏所的作用，也可以发挥非特异性增强免疫应答的淋巴系统活化剂的作用(Hood等，Immunology，Second Ed.，1984，Benjamin/Cummings：Menlo Park，California，p.384)。根据情况，不存在佐剂时，单独使用抗原的首次攻击可能不能引发足够的体液或细胞免疫应答。大量细胞因子或淋巴因子已显示具有免疫调节火星，并因此可用作佐剂，包括但不限于白介素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参阅例如美国专利No.5,723,127)、13、14、15、16、17和18(及其突变体形式)；干扰素-α、β和γ；粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(参阅例如美国专利No.5,078,996和ATCC登记号39900)；巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；和肿瘤坏死因子α和β。可用于本文所述免疫原性组合物的其它佐剂包括：趋化因子，包括但不限于MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES；粘附分子如选择蛋白，例如L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白；粘蛋白样分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1；整联蛋白家族成员，如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95；免疫球蛋白超家族成员如PECAM，ICAMs例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3，CD2和LFA-3；共同刺激分子如CD40和CD40L；生长因此，包括血管生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6；和胱天蛋白酶(ICE)。
用于增强免疫应答的合适的佐剂还包括但不限于美国专利No.4,912,094中描述的MPLTM(3-O-脱酰基单磷酰基脂质A，Corixa，Hamilton，MT)。还适合用作佐剂的是合成的脂质A类似物或氨基烷基葡糖胺磷酸酯化合物(aminoalkyl glucosamine phosphate compound，AGP)或其衍生物或类似物，其可得自Corixa(Hamilton，MT)并描述于美国专利No.6,113,918中。一种这类AGP是2-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰氨基]乙基2-脱氧-4-O-磷酰-3-O-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰基]-2-[(R)-3-十四烷酰氧十四烷酰-氨基]-b-D-吡喃葡萄糖苷，其也已知为529(先前已知为RC529)。该529佐剂被配制为水性形式(AF)或稳定的乳液(SE)。
其它佐剂包括胞壁酰肽，如N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-normuramyl-L-丙氨酸-2-(1’-2’二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙胺(MTP-PE)；水包油乳液，如MF59(国际PCT公开No.WO 90/14837)(含有5％角鲨烯、0.5％Tween 80和0.5％Span 85(任选地含有多种量的MTP-PE)，使用微观流化剂如Model 110Y微观流化剂(Microfluidics，Newton，MA)配制成亚微米颗粒)，和SAF(含有10％角鲨烯、0.4％Tween 80、5％聚氧丙烯-嵌段聚合物L121和thr-MDP，被微观流化成亚微米乳液或振荡产生更大颗粒尺寸的乳液)；不完全弗氏佐剂(IFA)；铝盐(明矾)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝；Amphigen；Avridine；L121/角鲨烯；D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷；聚氧丙烯多元醇；杀死的Bordetella；皂苷，如美国专利No.5,057,540中描述的StimulonTMQS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，美国专利No.5,254,339中描述的ISCOMATRIX(CSL Limited，Parkville，澳大利亚)和免疫刺激性复合物(ISCOMS)；Mycobacterium tuberculosis；细菌脂多糖；合成的多核苷酸，如含有CpG基序的寡核苷酸(例如美国专利No.6,207,646)；欧洲专利No.1,296,713和No.1,326,634中描述的IC-31(Intercell AG，Vienna，澳大利亚)；百日咳毒素(PT)或其突变体，霍乱毒素或其突变体(例如国际PCT公开Nos.WO00/18434、WO02/098368和WO02/098369)；或E.coli热-不稳定毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参阅例如国际PCT公开Nos.WO 93/13302和WO 92/19265。
术语“抗原”是指化合物、组合物或免疫原性物质，其能够在动物中刺激抗体的生产或T-细胞应答或二者兼有，其包括被注射或吸收进动物中的组合物。免疫应答可以针对整个分子产生，或者针对分子的部分(例如表位或半抗原)产生。该术语可被用于表示个体大分子或同质或异质的抗原性大分子群。抗原与具有特定体液和/或细胞免疫力的产物反应。术语“抗原”广义地包括下述部件，包括蛋白质、多肽、抗原性蛋白质片段、核酸、寡糖、多糖、有机或无机化学品或组合物等等。术语“抗原”包括所有相关的抗原性表位。给定抗原的表位可以使用本领域公知的任何数量的表位作图技术鉴定。参阅例如Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，Vol.66(Glenn E.Morris，Ed.，1996)Humana Press，Totowa，N.J。例如，可以如下测定线性表位：例如在固体支持物上同时合成大量肽，并使所述肽与抗体反应同时所述肽仍然与支持物结合，其中所述肽对应于蛋白质分子的部分。这类技术是本领域已知的，并且描述于例如美国专利No.4,708,871；Geysen等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：3998-4002；Geysen等(1986)Molec.Immunol.23：709-715中，所述文献均通过引用整体并入本文。类似地，通过检测氨基酸的空间构来容易地鉴定构象表位，例如通过x-射线晶体学和2-维核磁共振来鉴定。参阅例如Epitope Mapping Protocols，上文。另外，就本发明的目的而言，“抗原”也可以被用于表示蛋白质，所述蛋白质包含对天然序列的修饰，例如缺失、添加和替换(通常天然是保守的，但是它们可以是非保守的)，使得蛋白质维持引发免疫应答的能力。这些修饰可以是故意的，如通过定向诱变或通过具体的合成步骤或通过遗传工程途径，也可以是偶然的，例如通过产生抗原的宿主的突变。另外，抗原可以衍生自或得自任何病毒、细菌、寄生虫、原生动物或真菌，并且可以是整个生物。类似地，例如在核酸免疫应用中表达抗原的寡核苷酸或多核苷酸也包括在该定义中。合成的抗原也包括在内，例如多肽、侧翼表位和其它重组或合成衍生的抗原(Bergmann等(1993)Eur.J.Immunol.23：27772781；Bergmann等(1996)J.Immunol.157：32423249；Suhrbier，A.(1997)Immunol.and Cell Biol.75：402408；Gardner等(1998)12th World AIDS Conference，Geneva，Switzerland，Jun.28 Jul.3，1998)。
术语“减毒的”是指下述病原体株系，其致病性被降低，使其会启始免疫应答而不产生特定疾病。减毒的病毒毒株比衍生它的亲本毒株毒性更弱。病毒在已添加化学诱变剂的细胞培养物中生长期间，使用常规手段如化学诱变引入减毒突变，产生经修饰的病毒剂。引入减毒突变的一种替代性手段包括使用定点诱变制造预定的突变。可以引入一个或多个突变。然后在细胞培养物和/或动物模型中针对其生物活性的减弱来筛选这些病毒。如果存在复苏病毒的减毒表型，则可以用适当的动物模型进行攻击实验。非人灵长动物可以用作人疾病发病机制的适当动物模型。首先用减毒的、重组生产的病毒免疫这些灵长动物，然后用病毒的野生型形式攻击。
在本文中使用术语“细胞”、“宿主细胞”、“细胞培养物”等等旨在包括下述任何个体细胞或细胞培养物，其可以成为或已成为病毒、载体或外源核酸分子、多核苷酸和/或蛋白质并入的接受者。其还旨在包括单个细胞的后代。然而，所述后代归因于自然、偶然或故意的突变而不必须与原始亲本细胞(在形态学或基因组或总DNA互补序列方面)完全相同。细胞优选地是真核细胞，但是也可以是原核细胞，并且包括但不限于细菌细胞、酵母细胞、动物细胞和哺乳动物细胞(例如小鼠、大鼠、猿或人)。
在本文中使用术语“澄清”是指病毒纯化的早期步骤，其中在用本发明的细胞或细胞培养物感染后去除细胞和细胞碎片。例如，病毒纯化的早期步骤涉及使用如低速离心(≤10,000RPM)或过滤的方法“澄清”细胞培养基以去除细胞碎片。然后使用本领域技术人员公知的方法，如美国专利公开20070249019中所述的通过蔗糖缓冲(sucrose cushion)的高速离心(例如100,000x g)或通过离子交换柱的分离，分离和纯化上清液中存在的病毒。
注意在本公开中，术语如“包含”(″comprises″，″comprised″，″comprising″)、“含有”(″contains″，″containing″)等等可具有在美国专利法中属于它们的含义；例如它们可以表示“包括”(″includes″，″included″，″including″)等等。术语如“基本由……组成”(″consistingessentially of″和″consists essentially of″)具有美国专利法中属于它们的含义，例如它们允许包括不损失本发明新颖特征或基本特征的额外成分或步骤，即它们排除损伤本发明新颖特征或基本特征的额外的未描述成分或步骤，并且排除现有技术的成分或步骤，如本文引用的或通过引用并入本文的本领域文件，特别是当该文件的目的是定义可授予专利权的(例如相对于现有技术，例如相对于本文引用或通过引用并入的文件而言新颖、非显而易见、有创造性的)实施方案时。术语“由……组成”(″consists of″和″consisting of″)具有美国专利法中属于它们的含义；即，这些术语是封闭式的。
“保守性氨基酸取代”是指用具有相似物理和/或化学特性的其它氨基酸残基取代蛋白质的一个或多个氨基酸残基。序列中氨基酸的取代可选自所述氨基酸所属种类的其它成员。例如(非极性疏水)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。含有芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。不会期望这类改变影响如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量或等电点。尤其优选的取代是：Lys取代为Arg且反之亦然，使得可以保留正电荷；Glu取代为Asp且反之亦然，使得可以保留负电荷；Ser取代为Thr，使得可以保留游离--OH；和Gln取代为Asn且反之亦然，使得可以保留游离NH2。
术语“培养液”、“细胞培养液”、“细胞培养基”、“培养基”和/或“生物反应器液体”可互换使用，并且表示细胞培养物在其中生长的培养基或溶液。
“由……编码”或“编码”是指编码多肽序列的核酸序列，其中所述多肽序列含有至少3到5个氨基酸、更优选地至少8到10个氨基酸、进一步更优选地至少15到20个氨基酸的氨基酸序列，由所述核酸序列编码的多肽。还包括在内的是多肽序列，其可以通过所述序列编码的多肽免疫鉴定。因此，抗原“多肽”、“蛋白质”或“氨基酸序列”可与抗原的多肽或氨基酸序列具有至少70％相似性、优选地至少约80％相似性、更优选地约90-95％相似性，最优选地约99％相似性。
“片段”是指包含亲本蛋白质或多肽氨基酸序列的至少4个氨基酸残基(优选地至少10个氨基酸残基、至少15个氨基酸残基、至少20个氨基酸残基、至少25个氨基酸残基、至少40个氨基酸残基、至少50个氨基酸残基、至少60个氨基酸残基、至少70个氨基酸残基、至少80个氨基酸残基、至少90个氨基酸残基、至少100个氨基酸残基、至少125个氨基酸残基或至少150个氨基酸残基)的蛋白质或多肽，或包含亲本核酸核苷酸序列的至少10个碱基对(优选地至少20个碱基对、至少30个碱基对、至少40个碱基对、至少50个碱基对、至少50个碱基对、至少100个碱基对、至少200个碱基对)。任何给定的片段可具有或不具有亲本核酸或蛋白质或多肽的功能性活性。
在本发明上下文中使用时，“基因”是核酸分子(染色体、质粒等)中与遗传功能相关的核苷酸序列。基因是例如生物的遗传单位，其包含在所述生物基因组内占据特定物理位置(“基因组”或“遗传基因座”)的多核苷酸序列(对哺乳动物而言是DNA序列)。基因可以编码表达产物，如多肽或多核苷酸(例如tRNA)。或者，基因可定义具有具体事件/功能的基因组位置(例如噬菌体附着位点)，其中所述基因不编码表达产物。典型地，基因包括编码序列如多肽编码序列，和非编码序列如启动子序列、多聚腺苷酸化序列、转录调节序列(例如增强子序列)。许多真核基因具有被“内含子”(非编码序列)打断的“外显子”(编码序列)。在某些情况下，基因可与另一基因(例如重叠基因)分享序列。术语“基因”可包括或不包括调节性DNA序列如启动子序列，其确定例如基因在何种条件下表达。一些并非结构基因的基因可以从DNA转录成RNA，但是不翻译为氨基酸序列。其它基因可发挥结构基因调节物或DNA转录调节物的功能。
如本文所定义的，术语“基因改组”、“改组的基因”、“改组的”、“改组”、“基因重排”和“基因易位”可互换使用，并且表示野生型VSV基因组中顺序的改变(突变)。如本文所定义的，野生型VSv基因组具有以下基因顺序：3′-NPMGL-5′。
术语“经遗传修饰的”通常是指通过本领域技术人员已知的任何手段向病毒基因组中引入一个或多个突变。然而，尽管某些“遗传修饰”可以通过特定的缺失、插入或取代制造，或者通过使用标准遗传工程技术将遗传材料转移进病毒基因组中来制造，但是本发明中VSV基因组的某些遗传修饰通过以低感染复数将减毒的VSV连续传代来实现。低MOI下的所述连续传代导致大量核苷酸取代在病毒基因组中各处逐渐增加，还导致VSV蛋白质中的氨基酸取代。这些“经遗传修饰的”VSV颗粒显示适应细胞中提高的生长，但是在针对神经毒力的小动物模型中没有提高的神经病理学。在本发明中，“低传代病毒”、“第0代”或“P0”和“原始病毒”可互换使用，并且表示作为本发明经遗传修饰的病毒起始材料的rVSVN4CT1gag1病毒。在一些情况下，尤其是在生物反应器运行中，低传代病毒还包括低1到3代病毒。“高传代病毒”、“传代的病毒”、“经遗传修饰的病毒”、“组织培养适应的”或“细胞适应的病毒”可互换使用，并且代表已传代超过5次、通常5到25次、优选地15次的病毒。
在本文中使用时，术语“生长”(“growing”或“growth”)是指多种细胞中病毒的体外繁殖。实验室中病毒在细胞中的生长涉及用所述病毒接种所述细胞，然后孵育使得病毒生产，之后收获含有病毒的细胞培养基。被病毒感染的细胞通常在培养管(例如烧瓶，或对附着的细胞而言为培养皿，或对悬浮液中的细胞而言为持续移动的瓶子或烧瓶)内的培养基中生长，并且将培养物保持在具有恒定温度、湿度和气体组成的细胞培养箱中。然而，培养条件可根据细胞类型而变化，并且可以被改变来诱导细胞中的改变，或者支持或增强细胞对病毒的生产。
在本文中使用时，术语“收获”是指用本文所述任何病毒毒株或血清型感染细胞或细胞系后，收集制备的细胞或细胞培养基，用于分离和纯化病毒。
术语“异源的”是指不天然存在于病毒或细胞中的元素的组合。例如，异源DNA是指不天然位于细胞中或细胞染色体位点中的DNA。异源DNA可包括对细胞而言外来的基因。在本文中使用时，术语“异源抗原”是在核酸序列中编码的抗原，其中所述抗原不来自于所述生物，或者不以其正常位置或天然形式编码。异源表达调节元件是和下述基因可操作地连接的元件，所述基因不同于与所述元件天然可操作地连接的基因。
术语“免疫原性组合物”是指含有抗原(例如微生物)的任何药物组合物，所述组合物可用于在哺乳动物中引发免疫应答。免疫应答可包括T细胞应答、B细胞应答、或T细胞以及B细胞两种应答。组合物可通过呈递与细胞表面MHC分子相关的抗原，发挥对哺乳动物致敏的作用。另外，可以产生抗原特异性T-淋巴细胞或抗体，来允许将来保护被免疫的宿主。“免疫原性组合物”可含有活的、减毒的或杀死/灭活的下述配制物，并可保护动物免于出现一种或多种与所述微生物感染相关的症状，或可保护动物免于因所述微生物感染而死亡，所述配制物包含引起细胞介导的(T细胞)免疫应答或抗体介导的(B细胞)免疫应答或二者的完整微生物或从中衍生的免疫原性部分。
在本文中使用时，“免疫有效量”或“免疫原性有效量”是指如通过本领域技术人员已知的标准测定法所测量的，抗原或配制物的量足以引发免疫应答，所述免疫应答为细胞(T细胞)应答或体液(B细胞或抗体)应答。例如，就本发明而言，“免疫有效量”是≥5.0到7.0Log10pfu/mL的最小保护剂量(效价)。可以通过增殖测定法、测量T细胞溶解其特异性靶细胞的能力的细胞溶解测定法(如铬释放测定法)任一，或者通过测量B细胞活性水平、通过测量血清中抗原特异性循环抗体的水平，来测量抗原作为免疫原的有效性。另外，可以通过用已注射的抗原攻击免疫的宿主来测量免疫应答的保护水平。例如，如果期望产生免疫应答的抗原是病毒或肿瘤细胞，则通过检测用病毒、细菌、原生动物或真菌攻击细胞后的存活百分比或死亡百分比来测量“免疫有效量”抗原诱导的保护水平。
术语“经分离的”或“经纯化的”表示材料从其原始环境(例如在天然存在时为天然环境)中取出。例如，“经分离的”或“经纯化的”肽或蛋白质基本不含来自于得到所述蛋白质的细胞或组织来源的细胞材料或其它污染性蛋白质，或者在化学合成时基本不含化学前体或其它化学品。在本发明中，从被感染的细胞或细胞碎片分离或纯化病毒，使其以可用于制造免疫原性组合物的形式提供。表述“基本不含细胞材料”包括病毒或多肽/蛋白质的制剂，其中病毒或多肽/蛋白质与分离或重组产生它们的细胞的细胞组分分开。因此，基本不含细胞材料的病毒或多肽/蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％、2.5％或1％(以干重计)污染性蛋白质的病毒或多肽/蛋白质制剂。重组生产病毒或多肽/蛋白质时，其还优选地基本不含培养基，即培养基构成蛋白质制剂体积的少于约20％、10％、5％、1％、0.5％或0.2％。通过化学合成生产多肽/蛋白质时，其优选地不含化学前体或其它化学品，即其与涉及蛋白质合成的化学前体或其它化学品分开。因此，这类多肽/蛋白质制剂在除感兴趣的多肽/蛋白质片段之外具有少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化学品。“经分离的”或“经纯化的”核酸分子是与核酸分子天然来源中存在的其它核酸分子分开的核酸分子。另外，“经分离的”核酸分子，如cDNA分子或RNA分子，通过重组技术生产时可以基本不含其它细胞材料或培养基，或者化学合成时可以基本不含化学前体或其它化学品。
术语“感染复数(multiplicity of infection)”或“MOI”是指感染单个细胞的病毒颗粒的平均数量。通过用病毒斑形成单位(PFU)总量除以被感染的细胞的总量来计算“MOI”。
如下文定义的，术语“突变种类”(“mutation class”，“mutationclasses”)或“突变类型”(“classes of mutation”)可互换使用，并且表示单独使用时使VSV减毒的本领域已知的突变。例如，本发明的“突变种类”包括但不限于VSV稳定敏感性N基因突变(下文称作“N(ts)”)、温度敏感性L基因突变(下文称作“L(ts)”)、点突变、G-茎突变(下文称作“G(茎)”)、非细胞病变M基因突变(下文称作“M(ncp)”)、基因改组或重排突变、截短的G基因突变(下文称作“G(ct)”)、双义RNA突变、G基因插入突变、基因缺失突变等等。如下文所定义的，“突变”包括本领域已知为插入、缺失、取代、基因重排或改组修饰的突变。
“非保守性氨基酸取代”是指使用上文定义的特征，用具有不相似物理和/或化学特性的其它氨基酸残基取代蛋白质的一个或多个氨基酸残基。
在本文中使用时，短语“核酸”或“核酸分子”是指DNA、RNA以及DNA和RNA的任何已知碱基类似物或由其形成的嵌合体。因此，“核酸”或“核酸分子”是指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合物形式，其为单链形式或双链螺旋。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，尤其是DNA或RNA分子仅表示分子的一级和二级结构，并且不将其限于任何具体的三级形式。因此，该术语包括发现的双链DNA，尤其是线性或环形DNA分子(例如限制性片段)、质粒和染色体。在讨论具体双链DNA分子的结构时，序列在本文中可根据一般习惯描述，仅沿非转录的DNA链(即具有与mRNA同源序列的链)以5N到3N的方向给出序列。“重组DNA分子”是经历分离生物学操作的DNA分子。
术语“致病性”是指任何感染剂(例如细菌或病毒)引起疾病的能力。“非致病性”微生物是指缺乏微生物“致病性”株系引起疾病的特征的微生物。
术语“可药用载剂”表示由联邦监管机构、州政府或其它监管机构批准的，或列于美国药典或其它公认药典中的，用于动物(包括人以及非人哺乳动物)的载剂。术语“载剂”是指与药物组合物一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或运载体。这类药用载剂可以是无菌液体如水和油，所述油包括石油，动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。静脉内施用药物组合物时水是优选的载剂。也可以使用盐水溶液和水性葡萄糖和甘油溶液作为液体载剂，尤其是用于可注射的溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干燥的脱脂奶、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。需要时组合物也可含有小量湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可采取溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持久释放配制物等等的形式。组合物可以用传统粘合剂和载剂(如甘油三酯)配制成栓剂。口服配制物可包含标准载剂，如药物级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。合适的药物载剂的例子描述于E.W.Martin的″Remington′sPharmaceutical Sciences″中。配制物应当适合施用模式。
术语“噬斑”或“病毒噬斑”是指其它地方不透明的细胞培养物层中透明、通常为圆形的溶解的细胞斑块。“噬斑形成单位”或“PFU”是指每单位体积的感染性病毒颗粒的平均数量。例如，如果病毒溶液具有100PFU/ml，这表示每毫升该病毒溶液具有100个病毒颗粒，每个所述病毒颗粒都可以形成噬斑。PFU/ml是表示形成噬斑的病毒制剂浓度的常规手段。然而，PFU通常与“感染性单位”或“IU”可交换使用，并且代表病毒制剂中感染性病毒的单位。
术语“保护性”是指通过诱导对具体病原体的免疫应答，保护例如哺乳动物免受感染或疾病。这类保护通常在用免疫原性组合物处理哺乳动物后实现。如果与对照哺乳动物种群(例如未施用免疫原性组合物的被感染动物)相比存在统计学显著的改善，则提供的保护不必须是绝对的，即感染不必须被完全预防或根除。可以通过减轻感染症状发生的严重性或迅速程度来实现保护。
术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”是指氨基酸残基聚合物，并且不限于产物的最小长度。因此，肽、寡肽、二聚体、多聚体等等包括在该定义内。全长蛋白质及其片段均被该定义包括。该术语还包括对天然序列的修饰，例如缺失、添加和取代(通常天然是保守的，但是也可以是非保守性的)，优选地使得蛋白质保持在施用所述蛋白质的动物中引发免疫应答的能力。还包括在内的是表达后修饰(例如糖基化)、乙酰化、磷酸化等等。术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成的氨基酸任一，包括D或L光学异构体，和氨基酸类似物。天然氨基酸的单字母和三字母代码是本领域技术人员已知的。
用于生产重组RNA病毒的方法在本领域中被称作“复苏”或“反向遗传学”方法。VSV的示范性复苏方法描述于美国专利6,033,886、美国专利6,596,529和WO 2004/113517中，每份专利通过引用并入本文。通过作用于核糖核蛋白核心(核壳)的多聚体蛋白质复合物的酶活性，实现负-有义、单链、非分段的RNA病毒基因组的转录和复制。裸基因组RNA不能发挥模板作用。相反，这些基因组序列只有在被进入核壳结构中的N蛋白完全壳体化的时候才能被识别。只有在所述语境中，基因组和反基因组末端启动子序列才被认为启始转录或复制通路。
如下文所定义的，术语“协同”减毒是指VSV减毒水平大于相加之和。例如，根据本发明的VSV协同减毒包括组合相同VSV基因组中至少两类突变，从而得到比针对每个单独的VSV突变种类观察到的总和减毒水平大得多的VSV致病性降低。因此，在某些实施方案中，VSV的协同减毒被定义为至少比针对每个单独的突变种类观察到的总和减毒水平(即两个突变种类的总和)更大的LD50，其中所述减毒水平(即LD50)在小动物神经毒力模型中测定。VSV协同减毒的例子描述于WO 2005/098009中，其通过引用并入本文。
下文定义的VSV“温度敏感性”(“ts”)突变是VSV基因组中限制VSV在非允许性温度下生长的突变。例如，本发明的VSV ts突变体通常在允许性温度(例如31℃)下生长并达到高效价，但是在非允许性温度(例如37℃或39℃)下它们的生长和繁殖受到限制。
术语“免疫原性组合物”是指在动物中诱导免疫应答的药物组合物。免疫原性组合物可以保护动物免受感染引起的疾病或可能的死亡，并可包括或不包括增强活性成分免疫活性的一种或多种额外的组分。免疫原性组合物可额外包含免疫原性组合物典型的其它成分，包括例如佐剂或免疫调节剂。免疫原性组合物的免疫活性组分可包含完整的活生物(其原始形式或者作为减毒生物)，或者杀死或灭活免疫原性组合物中通过适当方法灭活的生物，或者包含一种或多种病毒免疫原性组分的亚单位免疫原性组合物，或通过本领域技术人员已知的方法制备的经遗传改造、突变或克隆的免疫原性组合物。免疫原性组合物可包含一种或同时包含多于一种上述元素之一。
一般描述
根据本发明，提供了通过在Vero细胞或任何易感细胞底物中以低感染复数(MOI)连续传代，使高度减毒的重组VSV适应组织培养条件的工艺或方法。多次连续传代工艺导致基因型改变，其特征是病毒基因组各处大量核苷酸取代的逐渐增加。大部分这些核苷酸取代导致VSV蛋白质的氨基酸(AA)取代。该工艺导致病毒的表型适应，伴随着病毒产量的大幅提高。在Vero细胞中继续传代，直至到达基因型和表型稳定性，通常在10到15代(P10-P15)中达到。超过P15的病毒的进一步传代显示很少或没有额外的取代，并且不导致病毒产量的进一步增加。该工艺导致制造产量的大幅提高以及增强的制造一致性。在高灵敏度小鼠颅内NV动物模型中测试时，适应性突变不显著影响传代病毒的神经毒力(NV)。
根据美国专利公开No.2007/0218078A1，产生了表达HIV-1gag基因的高度减毒的VSV载体rVSVN4CT1-gag1，其通过合并三种病毒减毒途径而制造：在基因组的第一位中插入HIV-1gag基因(gag1)从而将所有VSV基因从3’-启动子移动一个位置，将VSV N基因易位至第四位(N4)，和使用其细胞质尾被截短至1个氨基酸(CT1)的VSV G(Schnell，等The EMBO Journal 17：1289-1296，1998)。与原型rVSV相比，该载体展示了可观的体外减毒提高，其特征是细胞培养物中更小的噬斑表型、延迟的生长动力学和大幅降低的峰效价。在高度灵敏的小鼠颅内(IC)动物模型中测试时，展示相似的减毒模式，其显示在原型和减毒VSV之间许多个数量级的LD50差异(Cooper等，J.Virology，82：207-229，2008)。另外，与原型VSV相比，减毒病毒在非人灵长动物中展示最小到不可检出的神经病理学。尽管该载体在小鼠和猕猴中诱导可与使用原型载体获得的相比较的有效免疫应答，但是其在细胞培养物中复制较差，使其对于按比例扩大和制造而言低于最优。
根据鼓舞人心的临床前安全性和免疫原性模式，所述载体可以制造在人中测试的有前景的载体候选者。对于在人中测试该载体而言关键性的两个因素是上文所述三种减毒突变的稳定性，和提高的制造产量。在本研究中进行遗传稳定性研究，所述研究由Vero细胞中rVSV的连续传代组成。以低感染复数(MOI，0.01)将病毒在Vero细胞中传代。从传代了25次的病毒获得的数据揭示，尽管保留了所有三种载体减毒的突变，但是额外的氨基酸(AA)取代还是早在第5(P5)代就出现了。因为病毒被进一步传代，所以突变通过第15代(P15)被固定。另外，Vero细胞中传代病毒的生长动力学显示病毒产量的逐步改进直至P15，提示AA取代的增加代表了病毒对Vero细胞的持续适应。在P15后未观察到病毒产量的进一步增强。来自传代病毒生长动力学的结果指出，用P15病毒得到的病毒产量是用P0得到的病毒产量的5-到100-倍(见图3-6)。
因此，本发明证明P15病毒显示基因型和表型稳定性，并生长至适用于大规模制造适用于毒理学和临床评价的临床试验材料的水平。
适合VSV生长/繁殖的细胞
本发明中使用的合适的宿主细胞能够支持经遗传修饰的减毒VSV的生产性感染，并且会允许表达必需的载体和它们编码的为支持病毒生产而言必需的产物。用于本发明方法的宿主细胞的例子包括但不限于Vero细胞、幼仓鼠肾细胞(BHK)和人胚肾(HEK)细胞如293细胞。对本文所述经遗传修饰减毒的VSV毒株或血清型的感染易感的任何其它细胞可用于本发明的方法中。
在哺乳动物细胞培养物中生产VSV
在哺乳动物细胞培养物中生产VSV是本领域技术人员公知的，并且通常包括用VSV感染细胞培养物(宿主细胞)，在细胞培养物中培养VSV，并在适当的实践收获细胞培养物。因为VSV由宿主细胞分泌进培养基中，所以VSV产物从细胞培养液中收集。
从哺乳动物细胞培养物生产VSV使用合适的哺乳动物细胞培养物繁殖(或培养)VSV，这是本领域已知的。这类细胞培养物包括但不限于人胚肾(HEK)细胞如HEK 293细胞、非洲绿猴肾(AGMK)细胞如Vero细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和幼仓鼠肾(BHK)细胞。
另外，细胞培养材料、方法和技术是本领域技术人员公知的。例如，重组VSV接种储备被用于以给定的感染辅助感染生物反应器中某一密度的汇合宿主细胞种群或宿主细胞种群(例如Vero细胞培养物)；将VSV在细胞培养物中培养给定的时间和温度；并收获细胞培养液中新生的VSV后代。如下文所定义的，术语“培养液”、“细胞培养液”、“细胞培养基”、“培养基”和/或“生物反应器液体”可互换使用，并且表示培养细胞培养物的培养基或溶液。
从哺乳动物细胞培养物中纯化VSV
用于从用VSV感染的哺乳动物细胞培养物的细胞培养液中纯化VSV的工艺是本领域技术人员普遍已知的。例如，如Miller等(ProteinExpression and Purification，Vol.33，Issue 1，January 2004，pp.92-103)中所述，可以收集含有病毒的培养物上清液并进行低速离心(例如1000x g)以去除细胞和碎片，然后在20％蔗糖垫上进行高速离心(例如100,000xg)以取出病毒。
用于从细胞培养物中纯化VSV的另一方法描述于美国专利公开2007/0249019中。简言之，该操作包括步骤：(a)初步澄清，(b)再次澄清，(c)阴离子交换膜吸附，(d)切向流过滤和(e)过滤。更具体地，这类步骤包括(a)通过低速离心澄清细胞培养液，(b)通过经过0.2到0.45微米滤器过滤澄清上清液，(c)在阴离子交换膜吸附器上纯化经VSV过滤的溶液，(d)通过切向流过滤(TFF)对VSV进行缓冲液交换和浓缩，和(e)最终将VSV渗余物经过0.2到0.22微米滤器过滤。上述纯化工艺步骤(a)到(e)在室温下进行。
纯化操作
初步澄清
还描述于美国专利公开2007/0249019中的是对细胞培养液进行初步澄清以分离和纯化病毒的方法。例如，可以通过低速离心(或者通过深度过滤)澄清被VSV感染的哺乳动物细胞培养物的细胞培养液，并在上清液中回收VSV，在本文中也称作细胞培养液的“初步澄清”。在某些实施方案中，细胞培养液的初步澄清在室温下进行。
细胞培养液的初步澄清中使用的离心方法和设备是本领域技术人员公知的。如下文所定义的，“低速”离心是在低于10,000rpm的速度下的离心。
如上文所述，被VSV感染的哺乳动物细胞培养物的细胞培养液可以替代性地通过深度过滤(即替换低速离心)来澄清。从步骤(a)的初步澄清中省略低速离心时可使用深度过滤。深度过滤(与表面过滤相反)通常是指将污染物捕获在其结构内的“厚”滤器。深度过滤材料和方法是本领域技术人员公知的。例如，滤器材料典型地由厚和纤维状的纤维质结构组成，带有无机滤器助剂，如包埋在滤器开口中的硅藻土颗粒。该滤器材料具有大的内表面积，这对于颗粒捕获和滤器能力是关键性的。这类深度过滤模块含有从1.0微米到4.5微米的孔。示范性的深度过滤模块包括但不限于
Figure BPA00001206698400251
PolycapTM.HD模块(Whatman Inc.；Florham Park，N.J.)、Sartorius SartoclearTM P模块(Sartorius Corp.；Edgewood，N.Y.)和
Figure BPA00001206698400252
HC模块(Millipore；Billerica，Mass.)。可以通过深度过滤(在室温下进行)澄清细胞培养液，并在滤液中回收VSV。
再次澄清
还描述于美国专利公开2007/0249019中的是用于二次澄清细胞培养液来分离和纯化病毒的方法。在通过离心(或深度过滤)进行初步澄清后，通过过滤或经过0.2到0.25微米滤器的微量过滤将VSV上清液(或滤液)进一步澄清，并在经过过滤的溶液中回收VSV。如上文所定义的，微量过滤可以在室温下进行。过滤/微量过滤介质可得自大量多种材料和制造方法，它们是本领域技术人员已知的。示范性的微量过滤滤器包括但不限于Millipore-GV滤器单元(Millipore；Billerica，Mass.)、Millipore
Figure BPA00001206698400262
-GP滤器单元、Pall滤器单元(Pall Corp.；East Hills，N.Y.)、Sartorius SartobranTM滤器单元(Sartorius Corp.；Edgewood，N.Y.)和Sartorius SartoporeTM 2滤器单元。在某些实施方案中，这些过滤单元具有尺寸在0.2到0.45微米之间的滤器。在经过滤的溶液中回收经过滤的VSV。
阴离子交换膜吸附
一旦在澄清后回收了VSV，则可以在阴离子交换膜吸附器上进一步纯化VSV。膜吸附器材料是本领域技术人员公知的，并可得自供应商如Sartorius Corp.(Edgewood，N.Y.)、Pall Corp.(East Hills，N.Y.)和Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，Mo.)。示范性的阴离子交换膜吸附器包括但不限于SartobindTM Q膜吸附器(Sartorius Corp.)和MustangTM Q膜吸附器(PallCorp.)。在一个具体的实施方案中，阴离子交换膜吸附器是Pall MustangTMQ膜吸附器。通常，通过常规离子交换已知的方法和缓冲液可以直接用于本领域技术人员已知的膜交换器色谱。在某些实施方案中，阴离子交换膜吸附器色谱如上文所述在室温下进行。
因此，可以通过阴离子交换膜吸附器纯化VSV，其中来自再次澄清的经VSV过滤的溶液被上样在用第一pH缓冲的盐溶液(也称作“平衡缓冲液”或VSV“结合缓冲液”)平衡的阴离子交换膜吸附器上。用第二pH缓冲的盐溶液(“洗脱缓冲液”)从阴离子交换膜吸附器上洗脱VSV并回收洗脱的VSV积分(例如见美国专利公开2007/0249019)。
第一pH缓冲的盐溶液或平衡缓冲液可以是NaCl或KCl盐溶液。NaCl或KCl可以约至少0.1M到约0.4M之间的离子强度(包括其间的级分离子强度)存在于溶液中。缓冲溶液可以是磷酸缓冲液，N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-甲磺酸(HEPES)缓冲液或Tris(羟甲基)氨基甲烷(TRIS)缓冲液。这些缓冲液可具有约6.0到约8.0之间的pH。
平衡缓冲液可还包含约1％的蔗糖到约5％的蔗糖。第二pH缓冲的盐溶液(“洗脱缓冲液”)也可包含与第一(平衡)缓冲液相同的缓冲性组分。洗脱缓冲液可还包含约1％的蔗糖到约5％的蔗糖。
为了从膜上洗脱VSV，可以通过线性梯度或者在单一步骤洗脱工艺中提高洗脱缓冲液的盐(NaCl或KCl)浓度(离子强度)(也描述于美国专利公开2007/0249019中)。两种步骤均有效地从阴离子交换膜吸附器上洗脱VSV。第二pH缓冲的盐溶液中NaCl的离子强度应当在0.5M到0.75M之间。
第二pH缓冲的盐溶液中NaCl的离子强度应当以约10CV/分钟到30CV/分钟的洗脱流速从0.001M线性提高至0.75M。
切向流过滤(TFF)
通过阴离子交换膜吸附器色谱纯化VSV后，可以通过切向流过滤(TFF)进一步纯化VSV。通常，TFF是使用膜分离液体溶液(或悬浮液)中组分的压力驱动的工艺，其中流体(进料流)沿着膜表面且向泵入，并且应用的压力发挥强迫“部分”流体经过膜达到(膜的)滤液侧的作用。TFF可以在室温下进行。在所述工艺中，交换缓冲液并浓缩VSV。TFF步骤可包括将从阴离子交换膜吸附步骤回收的VSV浓缩至少5倍，然后至少进行一次缓冲液交换。
TFF材料(例如中空纤维、螺旋缠绕(spiral-wound)、扁平板)和方法(例如超滤(FU)、膜渗滤(DF)、微量过滤)是本领域技术人员公知的。TFF膜可具有300到750kDa的分子量截断。
TFF缓冲液交换中使用的缓冲液可以是上文所述的磷酸缓冲液、HEPES缓冲液或TRIS缓冲液。然而，缓冲液可具有约5mM到15mM的浓度，包括其间的nM浓度。缓冲液交换缓冲液可还包含0.10M到0.20MNaCl和3.5％到4.5％蔗糖。
可以合并来自阴离子交换膜吸附器纯化的VSV级分，浓缩合并的铜业，并使用分子量截断约750kDa的中空纤维TFF膜药筒(GE HealthcareBio-Sciences Corp.；Piscataway，N.J.)通过TFF交换缓冲液。
过滤
在美国专利公开2007/0249019中所述方法中，病毒纯化的最后加工步骤是来自TFF的VSV渗余物的最终微量过滤，其中将所述渗余物滤过0.2到0.24微米的滤器，如上文针对通过微量过滤进行再次澄清所述。
重组的或经遗传修饰的疱疹性口炎病毒(VSV)
可以通过使用上述任何纯化方法，从哺乳动物细胞培养物中获得和纯化如本文所述的VSV。“提高的纯度”表示经纯化的VSV至少90.0％不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物，并优选地99.0％到99.8％不含细胞培养物蛋白质和核酸污染物。
在一些具体的实施方案中，通过上述任何工艺从哺乳动物细胞培养物的细胞培养物中纯化的VSV是重组的或经遗传修饰的和/或减毒的VSV。生产重组RNA病毒如VSV的方法是公知的，并且在本领域中被称作“复苏”或“反向遗传学”方法。用于VSV的示范性复苏方法包括但不限于美国专利6,033,886和美国专利6,168,943中描述的方法，每份专利通过引用并入本文。用于构建病毒(如VSV)复苏的其它技术描述于美国专利No.6,673,572和WO 2004/113517中，所述文件通过引用并入本文。
VSV可以是特定血清型的VSV。在某些实施方案中，经纯化的VSV是印地安那血清型、新泽西血清型、伊斯法罕血清型、金迪普拉血清型或其它水泡性病毒。在某些实施方案中，VSV可含有来自多于一种这类血清型的序列。
VSV载体(及其免疫原性组合物)通常在VSV基因组中包含一个或多个减毒突变。在某些实施方案中，经纯化的VSV具有包含至少一个突变的基因组序列，所述突变减轻VSV的致病性。在其它实施方案中，经纯化的VSV具有包含至少两个突变的基因组序列，所述突变减轻VSV的致病性。例如，减毒的VSV可包含两个或更多已知的减毒性突变，例如国际申请No.PCT/US2005/011499(国际公开No.WO 2005/098009)和美国专利公开号2007/0218078A1中公开的减毒性突变，所述文件通过引用并入本文。例如，已知的VSV减毒性突变包括但不限于基因改组突变(包括形成VSV基因组并被命名为N、P、M、G和L的VSV基因的基因改组)、G蛋白插入突变、G蛋白截断突变、温度敏感性(ts)突变(及其它点突变)、非细胞病变M基因突变、G-茎突变、双义RNA突变和基因缺失突变，所述每种突变详细公开于国际公开No.WO 2005/098009中。因此，在某些实施方案中，经纯化的VSV包含一个或多个减毒性突变，包括但不限于温度敏感性(ts)突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。
在某些实施方案中，通过上述任何纯化工艺纯化的VSV具有导致病毒减毒的一个或多个突变，和导致哺乳动物细胞或细胞系对病毒的生产提高和产量提高的一个或多个突变。例如，本发明提供了通过在Vero细胞或任何易感细胞底物中以低感染复数(MOI)连续传代，使高度减毒的VSV重组体适应组织培养条件的工艺或方法。多次连续传代工艺导致基因型改变，其特征是病毒基因组各处大量核苷酸(NT)取代的逐渐增加。大部分这些核苷酸取代导致VSV蛋白质的氨基酸(AA)取代。本文所述工艺导致病毒的表型适应，伴随着病毒产量的大幅提高。在Vero细胞中继续传代，直至到达基因型和表型稳定性，通常在10到15代(P10-P15)中达到。超过P15的病毒的进一步传代显示很少或没有额外的取代，并且不导致病毒产量的进一步增加。该工艺导致制造产量的大幅提高以及增强的制造一致性。在高灵敏度小鼠颅内NV动物模型中测试时，适应性突变不显著影响传代病毒的神经毒力(NV)。
本发明的一个实施方案提供了经分离的、经遗传修饰的疱疹性口炎病毒(VSV)，其在对应于至少一个以下位置的区域中具有至少一个氨基酸突变：
-M蛋白的第119或142位的氨基酸；
-G蛋白的第109、224、438、477或481位的氨基酸；和
-L蛋白的第205、220或1450位的氨基酸。
在某些实施方案中，所述突变在M蛋白第119或142位任一或M蛋白第119位和142位二者上。在其它某些实施方案中，M蛋白第119位的氨基酸突变是T→N突变，并且M蛋白第142位的氨基酸突变是P→T突变或P→Q突变。
在一个实施方案中，G蛋白的第109、224、438、477或481位上的氨基酸突变分别为K→N、N→T、S→I、A→V/G→L或V→I。
在一个实施方案中，L蛋白的第205、220或1450位上的氨基酸突变分别为P→L、K→E或L→I。
在某些实施方案中，本文所述经遗传修饰和减毒的VSV具有下述基因组序列，所述基因组序列包含一个或多个外来或异源(或外来)的多核苷酸序列，如外来RNA开放读码框(ORF)。异源多核苷酸序列可以根据需要变化，并且包括但不限于编码细胞因子(如白介素)的基因、编码T-辅助细胞表位的基因、编码CLT表位的基因、编码佐剂的基因和编码辅因子的基因、编码限制性标记物的基因、编码治疗性蛋白质或不同微生物病原体(例如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的蛋白质(特别是能够引发期望的免疫应答)的基因。例如，编码不同微生物病原体的蛋白质的异源多核苷酸序列可以是一个或多个HIV基因、HTLV基因、SIV基因、RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、Epstein-Barr病毒基因、Varicella-Zoster病毒基因、腮腺炎病毒基因、麻疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰质炎病毒基因、鼻病毒基因、甲型肝炎病毒基因、乙型肝炎病毒基因、丙型肝炎病毒基因、Norwalk病毒基因、披膜病毒基因、甲型病毒基因、风疹病毒基因、狂犬病病毒基因、Marburg病毒基因、Ebola病毒基因、乳头状瘤病毒基因、多瘤病毒基因、偏肺病毒基因、冠状病毒基因、Vibriocholerae基因、Streptococcus pneumoniae基因、Streptococcus pyogenes基因、Helicobacter pylori基因、Streptococcus agalactiae基因、Neisseriameningitidis基因、Neisseria gonorrhoeae基因、Corynebacteriumdiphtheriae基因、Clostridium tetani基因、Bordetella pertussis基因、Haemophilus抗原、Chlamydia基因和Escherichia coli基因。在某些实施方案中，经纯化的VSV包含HIV基因序列，其中所述HIV序列选自由gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu组成的组。在一个特定的实施方案中，HIV基因是gag或env。
在某些实施方案中，经纯化的VSV含有上述至少一个减毒性突变以及至少一个异源蛋白质。在其它某些实施方案中，VSV免疫原性组合物是经遗传修饰的VSV，其包含两个减毒性突变和编码HIV-1gag蛋白的orf。在一个实施方案中，经遗传修饰的VSV还包含编码HIV gag蛋白的核酸分子，其中所述HIV gag蛋白至少在第165、270、329或348位氨基酸之一中具有突变，其中所述突变分别为S→G、L→S、D→N或T→K。
在其它一些实施方案中，本文所述经遗传修饰的VSV编码HIV gag基因，其中所述gag基因被插入VSV基因组的第一位(3′-gag1-NPMGL-5′)、第二位(3′-N-gag2-PMGL-5′)、第三位(3′-NP-gag3-MGL-5′)、第四位(3′-NPM-gag4-GL-5′)、第五位(3′-NPMG-gag5-L-5′)或第六位(3′-NPMGL-gag6-5′)。在其它实施方案中，本文所述VSV编码HIV env基因，其中所述env基因被插入VSV基因组的第一位(3′-env1-NPMGL-5′)、第二位(3′-N-env2-PMGL-5′)、第三位(3′-NP-env3-MGL-5′)、第四位(3′-NPM-env4-GL-5′)、第五位(3′-NPMG-env5-L-5′)或第六位(3′-NPMGL-env6-5′)。
本领域技术人员根据上述说明书应当理解，VSV基因组中多种遗传修饰发生在以低MOI在细胞培养物中对病毒连续传代期间。这些遗传修饰导致被感染的细胞生产的病毒产量提高。另外，不存在对病毒的其它基因型或表型改变和病毒减毒的改变。这些遗传修饰证实对于将病毒产量提高至可用于在病毒载体生产中扩大规模的水平而言是显著有益的。
下文所述的本发明解决了本领域对下述疱疹性口炎病毒(VSV)载体的需要，所述载体在哺乳动物中具有显著减毒的致病性，尤其是在动物神经毒力模型中揭示的减毒的神经致病性。如上文所述，VSV具有许多特征，使其成为免疫原性组合物的合适载体。例如，VSV感染人是罕见的，并且是无症状的，或者特征是在三到八天内消退的无并发症的温和流感样症状，同样，VSV不被认为是人病原体。使VSV成为有吸引力的载体的其它特征包括：(a)在细胞培养物中有活力地复制的能力；(b)不能整合进宿主细胞DNA或者经历遗传重组；(c)多种血清型的存在允许最优加强(prime-boost)免疫策略的可能性；(d)感兴趣的外来基因可以被插入VSV基因组中，并通过病毒转录酶大量表达；(e)开发了用于从病毒基因组的cDNA拷贝复苏感染性病毒的高度专门化的系统(美国专利6,033,886；美国专利6,168,943)，和(f)人种群中对VSV的预先存在的免疫性是罕见的。
减毒的疱疹性口炎病毒
在某些实施方案中，用于本发明中的减毒VSV具有一个或多个来自下文所列突变种类的突变。另外，还使用本发明的方法(例如使用低MOI连续传代约5到15次)对这些减毒病毒进行遗传修饰。该方法导致减毒基因型和表型的保持，还提供了本文所述的其它遗传修饰，所述其它遗传修饰导致更好地适应在细胞培养物中生产的VSV。通过使用这些病毒实现的更高病毒产量使得它们成为载体生产的极佳候选者。
A.疱疹性口炎病毒突变种类
在一个实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV载体在其基因组中包含至少两个不同种类的突变。如前文所示，术语“突变种类”(“mutation class”，“mutation classes”)或“突变类型”(“classes ofmutation”)可互换使用，并且表示单独使用时使VSV减毒的本领域已知的突变。例如，本发明的“突变种类”包括但不限于VSV稳定敏感性N基因突变(下文称作“N(ts)”)、温度敏感性L基因突变(下文称作“L(ts)”)、点突变、G-茎突变(下文称作“G(茎)”)、非细胞病变M基因突变(下文称作“M(ncp)”)、基因改组或重排突变、截短的G基因突变(下文称作“G(ct)”)、双义RNA突变、G基因插入突变、基因缺失突变等等。如下文所定义的，“突变”包括本领域已知为插入、缺失、取代、基因重排或改组修饰的突变。
另外，如前文所述，术语“协同”减毒是指VSV减毒水平大于相加之和。例如，VSV协同减毒包括组合相同VSV基因组中至少两类突变，从而得到比针对每个单独的VSV突变种类观察到的总和减毒水平大得多的VSV致病性降低。因此，在某些实施方案中，VSV的协同减毒被定义为至少比针对每个单独的突变种类观察到的总和减毒水平(即两个突变种类的总和)更大的LD50，其中所述减毒水平(即LD50)在小动物神经毒力模型中测定。
通过非限制性例子，如果等式(1)描述了VSV的“总和减毒”：
(1)ΔaLD50+ΔbLD50＝xLD50；
其中ΔaLD50是其基因组中具有第一突变种类的VSV的LD50，ΔbLD50是其基因组中具有第二突变种类的VSV的LD50，并且xLD50是ΔaLD50和ΔbLD50的总和；那么具有至少大于针对每个单独的突变种类观察到的总和减毒水平的的LD50本发明VSV“协同减毒”通过等式(2)描述：
(2)Δa，bLD50＞(ΔaLD50+ΔbLD50)；
其中Δa，bLD50是其基因组中具有两个突变种类的VSV的LD50，ΔaLD50是其基因组中具有第一突变种类的VSV的LD50，且ΔbLD50是其基因组中具有第二突变种类的VSV的LD50。因此，在某些实施方案中，VSV减毒的协同作用(即相同VSV基因组中两个突变种类)相对于两种VSV构建体(每种VSV构建体在其基因组中具有单个突变种类)的LD50而描述，其中其基因组中具有两个突变种类的VSV的协同减毒被定义为下述LD50，所述LD50至少比基因组中具有单个突变种类的两种VSV构建体的总和LD50更大。
在某些其它实施方案中，VSV减毒的协同作用相对于野生型VSV的LD50描述。因此，在一个实施方案中，VSV的协同减毒被描述为下述LD50，所述LD50至少大于野生型VSV的LD50，其中所述LD50在动物神经毒力模型中测定。在一个实施方案中，VSV的协同减毒被定义为下述LD50，所述LD50至少是野生型VSV LD50的10倍，其中所述LD50在动物神经毒力模型中测定。在另一实施方案中，VSV的协同减毒被定义为下述LD50，所述LD50至少是野生型VSV LD50的100倍，其中所述LD50在动物神经毒力模型中测定。在另一实施方案中，VSV的协同减毒被定义为下述LD50，所述LD50至少是野生型VSV LD50的1,000倍，其中所述LD50在动物神经毒力模型中测定。还在其它实施方案中，VSV的协同减毒被定义为下述LD50，所述LD50至少是野生型VSV LD50的10,000倍，其中所述LD50在动物神经毒力模型中测定。在某些其它实施方案中，VSV的协同减毒被定义为下述LD50，所述LD50至少是野生型VSV LD50的100,000倍，其中所述LD50在动物神经毒力模型中测定。具体VSV载体的50％致死剂量(LD50)的测量由本领域技术人员使用已知的测试方法和动物模型容易地测定。
基因改组突变
在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在其基因组中包含基因改组突变。如本文所定义的，术语“基因改组”、“改组的基因”、“改组的”、“改组”、“基因重排”和“基因易位”可互换使用，并且表示野生型VSV基因组中顺序的改变(突变)。如本文所定义的，野生型VSv基因组具有以下基因顺序：3′-NPMGL-5′。
本领域已知VSV基因相对于3’启动子的位置决定了表达水平和病毒减毒(美国专利6,596,529和Wertz等，1998，各自通过引用明确并入本文)。存在表达梯度，接近3’启动子的基因比远离3’启动子的基因更大量表达。编码VSV G、M、N、P和L蛋白的核苷酸序列是本领域已知的(Rose和Gallione，1981；Gallione等，1981)。例如，美国专利6,596,529描述了基因改组突变，其中N蛋白的基因从其野生型启动子近端的第一位被易位(改组)至基因组中连续地更远的位置，从而连续地降低N蛋白表达(例如3′-PNMGL-5′、3′-PMNGL-5′、3′-PMGNL-5′，分别称作N2、N3或N4)。因此，在某些实施方案中，经遗传修饰的VSV在其基因组中包含基因改组突变。在一类突变中，在一个具体的实施方案中，经遗传修饰的VSV包含含有N基因易位(例如3′-PNMGL-5′或3′-PMNGL-5′)的基因改组突变。
在本文中应当注意，向VSV基因组N、P、M、G或L基因任何的3’插入外来核酸序列(例如HIV gag)有效地导致了如上文定义的“基因改组突变”。例如，HIV gag基因被插入VSV基因组中第一位(例如3′-gag1-NPMGL-5′)时，N、P、M、G和L基因各自从其野生型位置被移至基因组中更远端的位置。因此，在本发明的某些实施方案中，基因改组突变包括在VSV基因组中N、P、M、G或L基因任一的3’插入外来氨基酸序列(例如3′-gag1-NPMGL-5′、3′-N-gag2-PMGL-5′、3′-NP-gag3-MGL-5′等)。
G蛋白插入和截断突变
在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV包含突变的G基因，其中编码的G蛋白在其细胞质结构域(羧基端)、也称作G蛋白的“细胞质尾区域”被截短。本领域已知截短胞质结构域羧基端的G基因突变影响VSV芽殖并减少病毒生产(Schnell，等The EMBO Journal17(5)：1289-1296，1998；Roberts，等J Virol，73：3723-3732，1999)。野生型VSV G蛋白的胞质结构域包含二十九个氨基酸(RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK-COOH；SEQ ID NO：1)。
在某些实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码下述G蛋白，其中胞质结构域的最后二十八个羧基端氨基酸被缺失(仅剩余来自SEQID NO：1的二十九个氨基酸野生型胞质结构域的精氨酸)。在某些其它实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码下述G蛋白，其中胞质结构域的最后二十个羧基端氨基酸残基被缺失(相对于SEQ ID NO：1的二十九个氨基酸野生型胞质结构域)。
在某些其它实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码下述G蛋白，所述G蛋白在其胞质结构域(胞质尾区)中包含单个氨基酸，其中所述单个氨基酸是任何天然存在的氨基酸。还在其它实施方案中，本发明的截短的VSV G基因编码下述G蛋白，所述G蛋白在其胞质结构域(胞质尾区)中包含九个氨基酸，其中所述九个氨基酸是任何天然存在的氨基酸。在某些其它实施方案中，本发明的截短的VSV基因编码下述G蛋白，所述G蛋白含有代表外来表位的插入。这类突变体是本领域已知的(例如参阅Schlehuber and Rose，2003)。
如本文所定义的，编码相对于SEQ ID NO：1的野生型序列而言其中胞质结构域最后二十八个羧基端氨基酸残基被缺失的G蛋白的G基因突变体被命名为“G(ct-1)”，或简单地命名为“CT1”，其中G(ct-1)的胞质结构域具有(R-COOH)的氨基酸序列。如本文所定义的，编码相对于SEQ ID NO：1的野生型序列而言其中胞质结构域最后二十个羧基端氨基酸残基被缺失的G蛋白的G基因突变体被命名为“G(ct-9)”，其中G(ct-9)的胞质结构域，或简单地称作“CT9”具有(RVGIHLCIK-COOH；SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。因此，在本发明的某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV包含经突变的G基因，其中编码的G蛋白是G(ct-1)或G(ct-9)。
温度敏感性和其它点突变
如本文定义的VSV“温度敏感性”(“ts”)突变，是VSV基因组中限制非允许性温度下VSV生长的突变。例如，本发明的VSV ts突变体通常在允许性温度(例如31℃)下生长并达到高效价，但是在非允许性温度(例如37℃或39℃)下它们的生长和繁殖受到限制。通过化学诱变和定点诱变产生ts突变体是本领域公知的(例如参阅Pringle，1970；Li等，1988)；并且已表征和描述了大量ts突变体(参阅例如Flamand andPringle，1971；Flamand and Bishop，1973；Printz and Wagner，1971；Gopalakrishna and Lenard，1985；Pringle等，1981；Morita等，1987；Li等，1988；Rabinowitz等，1977；Lundh等，1988；Dal Canto等，1976；Rabinowitz等，1976)。在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在其基因组中包含ts突变，其中所述ts突变是编码G、M、N、P或L蛋白的核酸序列的一个或多个突变。
如本文所定义的，G、M、N、P或L基因任一的ts突变是本发明的单独的“突变种类”。例如，在本发明的某些实施方案中，其基因组中包含至少两个不同种类突变的经遗传修饰的VSV(其中所述两个突变协同减毒VSV致病性)包含一个或多个ts N基因突变(下文称作“N(ts)”)作为第一类突变，和一种或多种L基因突变(下文称作“L(ts)”)作为第二类突变。作为非限制性的例子，包含基因组如3′-N(ts)PMGL(ts)-5′的经遗传修饰的VSV包含两类突变(即(1)N(ts)基因突变和(2)L(ts)基因突变)，并且包含基因组如3′-gag1-N(ts)PMGL(ts)-5′的经遗传修饰的VSV包含三类突变(即(1)N(ts)基因突变，(2)L(ts)基因突变，和(3)通过gag1插入产生的基因改组突变)。
在某些其它实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在其基因组中包含点突变，其中所述点突变是编码G、M、N、P或L蛋白的核酸序列的一个或多个突变，其中所述突变赋予减毒性表型如冷适应、降低的融合或致细胞病变效率(参阅例如Fredericksen and Whitt，1998；Ahmed andLyles，1997)。例如，Fredericksen and Whitt(1998)描述了三种减毒性G基因点突变(例如D137-L、E139-L或DE-SS)，所述G基因具有移位的融合活动pH阈值。Ahmed and Lyles(1997)描述了M基因的减毒性点突变(N163D)，所述M基因在宿主基因表达的抑制方面高度缺陷，并且比野生型M蛋白更迅速地周转。因此，在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在其基因组中包含一个或多个点突变。
非细胞病变M基因突变
在某些其它实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在其M基因中包含非细胞病变突变。VSV(印地安那血清型)M基因编码229个氨基酸的M(基质)蛋白，其中NH2-端最初三十个氨基酸包含PPPY基序。Jayakar等(J.Virology，74：9818-27，(2000))证明PPPY基序中的突变(例如APPY、AAPY、PPAY、APPA、AAPA和PPPA)通过阻断病毒芽殖中的晚期截短而降低病毒产量。因此，在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在M基因中包含非细胞病变突变，其中所述突变处于编码的M蛋白的PPPY基序中。
最近已报道了M mRNA还编码两种额外的蛋白质，称作M2和M3(Jayakar and Whitt，J.Virology，76：8011-18，2002)。M2和M3蛋白从编码229的氨基酸的M蛋白质(称作M1)的相同读码框中的下游甲硫氨酸开始合成，并且缺乏M1蛋白的最初三十二(M2蛋白)或五十(M3蛋白)个氨基酸。观察到用表达M蛋白而不表达M2和M3蛋白的重组VSV感染的细胞显示(某些细胞类型中)细胞病变效应的延迟发生，但是产生正常的病毒产量。因此，在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在M基因中包含非细胞病变突变，其中所述M基因突变产生不表达M2或M3蛋白的病毒(例如参阅Jayakar and Whitt，2002)。
G-茎突变
在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV在G基因中包含突变，其中编码的G蛋白在G蛋白外结构域(ectodomain)的膜近端茎区(称作G-茎蛋白)中具有突变。G-茎蛋白区包含G蛋白的421到462位氨基酸残基。最近的研究证明通过在G蛋白的G-茎中插入和/或缺失(例如截短)突变使VSV减毒(Robinson and Whitt，J.Virol.，74，2239-46，2000；Jeetendra等，J.Virol，76，12300-311，2002；Jeetendra等，J.Virol，77，12807-18，2003)。因此，在某些实施方案中，经遗传修饰的VSV包含G-茎插入、缺失、取代或其组合。在一个具体的实施方案中，包含G-茎突变的本发明的经遗传修饰的VSV载体(及其免疫原性组合物)包含3′-gag1-NPMG(茎)L-5′的基因组。
双义RNA突变
在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV包含双义RNA突变，其中用3’基因组启动子(GP)的拷贝代替5’反基因组启动子(AGP)。VSV的5′AGP以及其它非节段的、负链RNA病毒发挥强复制启动子的作用，而3’GP发挥转录启动子和弱复制启动子的作用。在VSV感染的正常过程中，存在基因组拷贝是反基因组拷贝3-倍到4-倍的优势；该比例对于弹状病毒科另一成员——狂犬病病毒而言甚至更高(Finke andConzelmann，J.Virology，73(5)：3818-25，1999)。使用狂犬病病毒的先前工作证明用一个GP拷贝代替5′AGP(已知为双义RNA突变)导致被感染的细胞中等水平的基因组和反基因组RNA拷贝。另外，外来基因由位于基因组5’端的GP拷贝表达。在培养的细胞中连续传代时，含有双义RNA突变的狂犬病病毒一致地复制至比重组野生型狂犬病病毒低10-到15-倍的效价(Finke and Conzelmann，J.Virology，73(5)：3818-25，1999)。在VSV载体中使用这类突变来减少病毒复制并表达外来基因。因此，在某些实施方案中，经遗传修饰的VSV包含双义RNA突变。
基因缺失
在某些其它实施方案中，本发明的经遗传修饰的VSV包含其基因组中缺失VSV基因(如G或M)的病毒。例如，Roberts等(J.Virol.，73，3723-32，1999)描述了一种VSV载体，其中编码G蛋白的整个基因被缺失(ΔG)并用流感血凝素(HA)蛋白取代，其中所述VSV载体(ΔG-HA)展示减毒的发病机制。
B.用于产生减毒VSV的进一步遗传修饰的方法
在某些实施方案中，本发明涉及包含至少两个下文公布的不同类突变的经遗传修饰的VSV。可以通过本发明中描述的方法，对任何这些经遗传修饰和减毒的VSV进行进一步的遗传修饰。也就是说，可以在易感细胞或细胞系中，以范围从约0.01到约0.1PFU/细胞的低感染复数，将任何这些减毒的VSV连续传代从约5次到15次，并针对本文所述至少一种突变的存在分析它们的基因组。
因此，在本发明的一个方面中，提供了使病毒适应在细胞培养物中生长的方法，所述方法包括以下步骤：
a)以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/细胞的低感染复数(MOI)用所述病毒感染所述细胞培养物；
b).收获含有所述病毒的所述细胞培养基；
c).澄清所述细胞培养基；
d).冷冻所述细胞培养基；和
e).将步骤a)到d)重复约5到约15次。
所述方法的使用导致与使用下述VSV的病毒生产或产量相比病毒生产/产量提高至5到100倍，和病毒基因型和表型特征稳定性的提高，所述VSV未以约0.001到约0.1PFU/细胞的MOI以低MOI传代5到15次。
这类方法的使用导致在对应于至少一个以下位置的区域中具有至少一个氨基酸突变：
-M蛋白的第119或142位的氨基酸；
-G蛋白的第109、224、438、477或481位的氨基酸；和
-L蛋白的第205、220或1450位的氨基酸。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的经遗传修饰的VSV具有包含保守性或非保守性氨基酸改变的突变。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的经遗传修饰的VSV具有M蛋白第119或142位任一或M蛋白第119位和142位二者上的突变。在一个实施方案中，M蛋白第119位的氨基酸突变是T→N突变，并且M蛋白第142位的氨基酸突变是P→T突变或P→Q突变。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的经遗传修饰的VSV在G蛋白的第109、224、438、477或481位上具有分别为K→N、N→T、S→I、A→V/G→L或V→I的氨基酸突变。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的经遗传修饰的VSV在L蛋白的第205、220或1450位上具有分别为P→L、K→E或L→I的氨基酸突变。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的经遗传修饰的VSV还包含编码HIV gag蛋白的核酸分子，其中所述HIV gag蛋白在至少第165、270、329或348位氨基酸之一中具有突变，其中所述突变分别为S→G、L→S、D→N或T→K。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的经遗传修饰的VSV中的上述突变导致病毒基因型和/或表型的稳定性提高，还导致感染了经遗传修饰的VSV的细胞生产病毒的产量提高。
在一个实施方案中，通过本发明方法生产的经遗传修饰的VSV在其基因组中还包含至少两种选自任何上述突变的其它突变。在一个实施方案中，所述突变可选自由以下组成的组：温度敏感性突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。
在一个实施方案中，本文所述方法利用属于减毒病毒的病毒。在一个实施方案中，使用于生产经遗传修饰的病毒的方法适应病毒载体或免疫原性组合物的大规模生产。在一个实施方案中，所述方法导致与未以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位/细胞的低感染复数传代约5到15代的病毒毒株获得的病毒产量相比5到100倍的病毒产量。在一个实施方案中，上述方法允许保持与病毒减毒相关的任何预先存在的突变。与病毒减毒相关的预先存在的突变可选自温度敏感性突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。在一个实施方案中，所述方法允许保持与病毒减毒相关的低神经毒力谱。在一个实施方案中，上述方法中使用的减毒病毒是疱疹性口炎病毒(VSV)的毒株。
C.重组的疱疹性口炎病毒载体
在某些实施方案中，本发明提供了下述重组的VSV载体，所述VSV载体在其基因组中包含至少两种不同类的突变，和作为独立的转录单元插入VSV基因组非复制关键性区域中或代替所述区域的至少一种RNA序列。所述重组VSV载体可以被进一步遗传修饰为含有至少一种上述修饰，这导致病毒适应在细胞培养物中生长，从而提高每个细胞的病毒产量。
生产重组RNA病毒的方法在本领域中被称作“复苏”或“反向遗传学”方法。针对VSV的示范性方法描述于美国专利6,033,886、美国专利6,596,529和WO 2004/113517中，每个专利通过引用并入本文。通过作用于核糖核蛋白核心(核壳)的多聚体蛋白质复合物的酶活性，实现负-有义、单链、非分段的RNA病毒基因组的转录和复制。裸基因组RNA不能发挥模板作用。相反，这些基因组序列只有在被进入核壳结构中的N蛋白完全壳体化的时候才能被识别。只有在所述语境中，基因组和反基因组末端启动子序列才被认为启始转录或复制通路。
VSV基因组经克隆的DNA等同物被置于合适的DNA-依赖性RNA聚合酶启动子(例如T7RNA聚合酶启动子)和自我切割的核酶序列(例如肝炎δ核酶)之间，其被插入合适的转录载体中(例如可繁殖的细菌质粒)。该转录载体提供了可容易操作的DNA模板，从中RNA聚合酶(例如T7RNA聚合酶)能够忠诚地转录VSV反基因组(或基因组)具有精确或接近精确的5’和3’端的单链RNA拷贝。VSV基因组DNA拷贝和侧翼启动子和核酶序列的方向决定了是反义基因或基因组RNA等同物被转录。复苏新VSV后代还需要的是将裸、单链VSV反基因组或基因组RNA转录本壳体化成为功能性核壳模板所需要的VSV-特异性反式作用支持蛋白：病毒核壳(N)蛋白、聚合酶相关磷蛋白(P)和聚合酶(L)蛋白。这些蛋白质包含活性病毒RNA-依赖性RNA聚合酶，所述聚合酶必须与该核壳模板连接以实现转录和复制。
因此，其基因组中包含至少两种不同类突变的本发明的经遗传修饰和减毒的VSV(见A部分)根据本领域已知的复苏方法生产。例如，其基因组中包含至少两类不同突变的经遗传修饰的VSV载体使用(1)和(2)在宿主细胞中于足以允许下述载体共表达并生产重组VSV的条件下产生，其中(1)为包含经分离的核酸分子的转录载体，所述核酸分子包含编码VSV基因组或反基因组的多核苷酸序列，(2)为至少一种表达载体，所述表达载体包含至少一种编码壳体化、转录和复制必需的反式作用N、P和L蛋白的经分离的核酸分子。任何合适的VSV毒株或血清型可根据本发明的方法使用，包括但不限于VSV印地安那、VSV新泽西、VSV金迪普拉、VSV格拉斯哥等等。
除了编码减毒形式VSV的多核苷酸序列以外，多核苷酸序列可还编码一种或多种异源(或外来)多核苷酸序列或开放读码框(ORF)。异源多核苷酸序列可根据需要变化，并且包括但不限于辅因子、细胞因子(如白介素)、T-辅助细胞、CLT表位、限制性标记物、佐剂、或不同微生物病原体(例如病毒、细菌、寄生虫或真菌)的蛋白质，特别是能够引发期望的免疫应答的蛋白质。在某些实施方案中，异源ORF含有HIV基因(例如gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或vpu)。在一个具体的实施方案中，HIV基因是gag，其中所述gag基因在第一位(3′-gag1-NPMGL-5′)或第五位(3′-NPMG-gag5-L-5′)被插入VSV基因组中。在另一实施方案中，异源多肽序列还编码细胞因子如白介素-12，所述细胞因子被选择来改进重组VSV的预防特征或治疗特征。
在某些实施方案中，本发明的经遗传修饰和减毒的VSV通过常规手段如化学诱变来突变。例如，在病毒于细胞培养物中生长期间，添加化学诱变剂，然后：(a)选择已在低于最优的温度下进行传代的病毒，从而选择温度敏感性和/或冷适应性突变，(b)鉴定在细胞培养物中产生小噬斑的突变体病毒，和(c)经过异源宿主传代，以选择宿主范围突变。在其它实施方案中，减毒性突变包括使用定点诱变制造预定的突变，然后复苏含有这些突变的病毒。如先前所公开的，本发明的经遗传修饰的VSV在其基因组中包含至少两类突变。在某些实施方案中，一类或多类突变还包含多种突变，如具有双突变(例如缺失、插入、取代等等)、三突变等等的G-茎突变种类。然后针对在动物模型中毒力的减轻筛选这些减毒VSV载体。
用于复苏的典型(尽管不必须是排他的)境况包括适当的哺乳动物细胞环境，其中存在驱动从自含病毒基因组cDNA的转录载体转录反基因组(或基因组)单链RNA的T7聚合酶。通过共同转录或在之后不久转录，所述病毒反基因组(或基因组)RNA转录本通过核壳蛋白被壳体化为功能性模板，并被由编码所需病毒特异性反式作用蛋白的共转染的表达质粒同时生产的所需聚合酶组分使用。这些事件和工艺导致病毒mRNA的必要转录，复制和新基因组的扩增，并因此产生新颖的VSV后代，即复苏。
转录载体和表达载体典型地是被设计用于在宿主细胞中表达的质粒载体。包含编码壳体化、转录和复制必需的反式作用蛋白的至少一种经分离的核酸分子的表达载体从相同的表达载体或至少两种不同的载体表达这些蛋白质。这些载体从基本的复苏方法普遍已知，并且它们不必须被改变来用于本发明的经改进的方法。
用于进行病毒如VSV复苏的额外技术描述于美国专利6,673,572和美国公开专利申请US20060153870，它们通过引用并入本文。
VSV复苏中使用的宿主细胞是下述宿主细胞，其允许从生产重组VSV所需的必要组分的载体中表达。这类宿主细胞可选自原核细胞或真核细胞，优选地为脊椎动物细胞。通常，宿主细胞衍生自人细胞，如人胚肾细胞(例如293)。Vero细胞以及许多其它类型的细胞也可以被用作宿主细胞。以下是合适的宿主细胞的非限制性例子：(1)人二倍体原代细胞系(例如WI-38和MRC5细胞)；(2)猴二倍体细胞系(例如FRhL-猕猴胎肺细胞)；(3)准原代连续细胞系(例如AGMK-非洲绿猴肾细胞)；(4)人293细胞和(5)其它可能的细胞系，如CHO、MDCK(Madin-Darby犬肾)、原代鸡胚成纤维细胞。在某些实施方案中，添加转染促进试剂来提高细胞的DNA摄取。许多这些试剂是本领域已知的(例如磷酸钙)。Lipofectace(Life Technologies，Gaithersburg，MD)和Effectene(Qiagen，Valencia，CA)是常见的例子。Lipofectace和Effectene均为阳离子脂质。它们均包裹DNA并增强细胞对DNA的摄取。Lipofectace形成环绕DNA的脂质体，而Effectene包裹DNA但不形成脂质体。或者，也可以通过细胞的电穿孔增强质粒DNA摄入，从而跨越含有细胞和DNA的小杯施加高电压电流数毫秒。
然后首先通过体外手段，测试复苏的减毒VSV期望的表型(温度敏感性、冷适应、噬斑形态学和转录与复制减少)。还使用袖珍复制子(minireplicon)系统测试突变，所述系统中由野生型或经修饰的助手病毒或由表达带有基因特异性减毒突变的N、P和不同L基因的质粒提供所需的反式作用壳体化和聚合酶活性。还在动物神经毒力模型中针对协同减毒体内测试减毒VSV。例如，建立用于检测神经毒力的小鼠和/或雪貂模型。简言之，对多个十只小鼠的组进行颅内注射(IC)，每组使用跨越预期的LD50剂量(对50％动物致死的剂量)的一个病毒浓度范围。例如，使用102、103、104和105pfu的病毒IC接种，其中预期的病毒LD50在103-104pfu的范围内。通过在PBS中连续稀释经纯化的病毒储液来制备病毒配制物。然后通过颅骨顶部以必要剂量在50-100μl PBS中注射小鼠。每天监测动物的体重减轻、发病率和死亡。然后根据测试的浓度范围内小鼠的累积死亡来计算病毒载体的LD50。
异源核酸序列和抗原
在某些实施方案中，本发明提供了协同减毒并经遗传修饰的VSV(使用本发明的低MOI传代方法)，其还包括作为单独的转录单元插入非复制必需的基因组位点中或者代替所述位点的外来RNA序列，其中所述外来RNA序列(负有义)指导能够在VSV感染的宿主细胞中表达的蛋白质的生产。所述重组基因组最初通过在VSV cDNA中插入编码蛋白质的外来DNA而产生。在某些实施方案中，编码免疫原性抗原、生产针对疾病或病症的预防性或治疗性免疫力的任何DNA序列，独自或与相同或不同VSV表达的其它抗原组合，在本发明的重组协同减毒VSV中作为融合蛋白或非融合蛋白表达时，被分离并掺入用于本发明免疫原性组合物中的VSV载体中。
在某些实施方案中，协同减毒并经进一步遗传修饰(使用本发明的方法)的重组VSV对抗原的表达诱导针对致病微生物的免疫应答。例如，抗原可展示存在于属于疾病或病症引发剂的细菌、寄生虫、病毒或真菌上的抗原的免疫原性或抗原性。在一个实施方案中使用下述抗原，其展示人病原体抗原或感兴趣的其它抗原的抗原性或免疫原性。
为了通过检测与抗体的结合来测定免疫原性或抗原性，使用本领域已知的多种免疫测定法，包括但不限于使用下述技术的竞争性和非竞争性测定系统：如放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定法)、“夹层”免疫测定法、免疫放射测定法、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定法、原位免疫测定法(例如使用胶体金、酶或放射性同位素标签)、western印迹、免疫沉淀反应、凝集测定法(例如凝胶凝胶测定法、血凝集测定法)、补体固定测定法、免疫荧光测定法、A蛋白测定法和免疫电泳测定法、中和测定法等等。在一个实施方案中，通过检测一级抗体上的标签来测量抗体结合。在另一实施方案中，通过测量二级抗体或试剂与一级抗体的结合来检测一级抗体。在又一个实施方案中，对二级抗体加上标签。本领域已知在免疫测定中检测结合的许多手段。在检测免疫原性的一个实施方案中，通过标准方法测定T细胞介导的应答，例如体外或体内细胞毒性测定法、四聚体测定法、elispot测定法或体内迟发型超敏感性测定法。
表达协同减毒的VSV(其中外来RNA指导寄生虫或细菌的抗原或含有其表位的衍生物的生产)所表达表位(抗原性决定簇)的寄生虫和细菌，包括但不限于表1中所列这些。
在另一实施方案中，抗原包含线虫抗原表位，来防护这类蠕虫引起的病症。在另一实施方案中，编码疟原虫(Plasmodium)表位的任何DNA序列(其由重组VSV表达时在脊椎动物宿主中是免疫原性的)被分离用于插入根据本发明的VSV(-)DNA中。作为DNA来源的疟原虫物种包括但不限于人疟疾寄生虫P.falciparum、P.malariae、P.ovale、P.vivax，和动物疟疾寄生虫P.berghei、P.yoelii、P.knowlesi和P.cynomolgi。在又一实施方案中，抗原包含霍乱毒素β-亚基的肽。
表达协同减毒的VSV(其中外来RNA指导病毒的抗原或包含其表位的衍生物的生产)所表达表位的病毒，包括但不限于表2中所列这些，所述表2为了便利而非限制的目的按科列出了这类病毒。
在特定的实施方案中，用减毒VSV感染宿主后表达的外来序列编码的抗原展示了流感病毒血凝素；人呼吸合胞体病毒G糖蛋白(G)；麻疹病毒血凝素或单纯疱疹病毒2型糖蛋白gD的抗原性或免疫原性。
表1
表达能够通过VSV表达的表位的寄生虫和细菌
  寄生虫   细菌
  plasmodium spp.   Vibrio cholerae
  Eimeria spp.   Streptococcus pneumoniae
  线虫   Streptococcus agalactiae
  血吸虫(Schistosoma)   Streptococcus pyogenes
  利什曼原虫(Leishmania)   Neisseria meningitidis
  Neisseria gonorrhoeae
  Corynebacterium diphtheriae
  Staphylococcus aureus
  Staphylococcus epiderm idis
  Clostridium tetani
  Bordetella pertussis
  Haemophilus spp.(例如influenzae)
  Chlamydia spp.
  产肠毒素的Escherichia coli
  Helicobacter pylori
  分支杆菌
表2
表达能够通过VSV表达的表位的病毒
  I.小核糖核酸病毒
  肠道病毒
  脊髓灰质炎病毒
  柯萨奇病毒
  艾柯病毒
  鼻病毒(Rhinoviruses)
  甲型肝炎病毒
  II.杆状病毒科(Caliciviridae)
  诺沃克类病毒(Norwalk group of viruses)
  III.披盖病毒科(Togaviridae)和黄病毒科(Flaviviridae)
  披膜病毒(Togaviruses)(例如登革热病毒)
  甲型病毒
  虫媒病毒(Flaviviruses)(例如丙型肝炎病毒)
  风疹病毒
  IV.冠状病毒科(Coronaviridae)
  冠状病毒
  V.弹状病毒科(Rhabdoviridae)
  狂犬病病毒
  VI.纤丝病毒科(Filoviridae)
  Marburg病毒
  Ebola病毒
  VII.副粘病毒科(Paramyxoviridae)
  副流感(Parainfluenza)病毒
  腮腺炎病毒
  麻疹病毒
  呼吸合胞体(Respiratory syncytial)病毒
  偏肺病毒(Metapneumovirus)
  VIII.正粘病毒科(Orthomyxoviridae)
  正粘病毒(Orthomyxoviruses)(例如流感病毒)
  IX.本扬病毒科(Bunyaviridae)
  布亚病毒(Bunyaviruses)
  X.沙粒病毒科(Arenaviridae)
  沙粒病毒(Arenaviruses)
  XI.呼肠孤病毒科(Reoviridae)
  呼肠孤病毒(Reoviruses)
  轮状病毒(Rotaviruses)
  环状病毒(Orbiviruses)
  XII.逆转录病毒科(Retroviridae)
  人T细胞白血病病毒I型
  人T细胞白血病病毒II型
  人免疫缺陷病毒(例如I型和II型)
  猿免疫缺陷病毒
  慢病毒(Lentiviruses)
  XIII.乳多空病毒科(Papovaviridae)
  多瘤病毒(Polyomaviruses)
  乳头瘤病毒(Papillomaviruses)
  XIV.微小病毒科(Parvoviridae)
  细小病毒(Parvoviruses)
  XV.疱疹病毒科(Herpesviridae)
  单纯疱疹病毒
  Epstein-Barr病毒
  巨细胞病毒(Cytomegalovirus)
  Varicella-Zoster病毒
  人疱疹病毒-6
  人疱疹病毒-7
  猕猴疱疹病毒(B病毒)
  XVI.痘病毒科(Poxviridae)
  痘病毒(Poxviruses)
  XVIII.嗜肝DNA病毒(Hepadnaviridae)
  乙型肝炎病毒
  XIX.腺病毒科(Adenoviridae)
由减毒VSV表达的其它抗原包括但不限于展示以下抗原的抗原性或免疫原性的抗原：脊髓灰质炎病毒I VP1；HIV I的被膜糖蛋白；乙型肝炎表面抗原；白喉毒素；链锁状球菌(streptococcus)24M表位、SpeA、SpeB、SpeC或C5a肽酶；和淋球菌菌毛蛋白(gonococcal pilin)。
在其它实施方案中，减毒和进一步遗传修饰的VSV表达的抗原展示了以下的抗原性或免疫原性：伪狂犬病病毒g50(gpD)、伪狂犬病病毒II(gpB)、伪狂犬病病毒gIII(gpC)、伪狂犬病病毒糖蛋白H、伪狂犬病病毒糖蛋白E、可传染的胃肠炎糖蛋白195、可传染的胃肠炎基质蛋白、猪轮状病毒糖蛋白38、猪细小病毒壳体蛋白、Serpulina hydodysenteriae保护性抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)血凝素-神经氨酸酶、猪流感血凝素或猪流感神经氨酸酶。
在某些实施方案中，减毒和进一步遗传修饰的VSV表达的抗原展示了衍生自犬或猫病原体的抗原的抗原性或免疫原性，所述病原体包括但不限于猫白血病病毒、犬瘟热病毒、犬腺病毒、犬细小病毒等等。
在某些其它实施方案中，减毒和经进一步遗传修饰的VSV表达的抗原展示了衍生自以下的抗原的抗原性或免疫原性：Serpulinahyodysenteriae、口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus)、猪瘟病毒(Hog Cholera Virus)、猪流感病毒、非洲猪霍乱病毒(African SwineFever Virus)、Mycoplasma hyopneumoniae、感染性牛鼻气管炎病毒(例如感染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G)、或感染性喉气管炎病毒(例如感染性喉气管炎病毒糖蛋白G或糖蛋白I)。
在另一实施方案中，抗原展示以下的抗原性或免疫原性：拉克罗斯病毒(La Crosse Virus)、新生牛腹泻病毒(Neonatal Calf Diarrhea Virus)、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒(Venezuelan Equine Encephalomyelitis Virus)、庞塔托鲁病毒(Punta Toro Virus)、小鼠白血病病毒或小鼠乳腺肿瘤病毒。
在其它一些实施方案中，抗原展示人病原体抗原的抗原性或免疫原性，所述人病原体包括但不限于人疱疹病毒、单纯疱疹病毒-1、单纯疱疹病毒-2、人巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、Varicella-Zoster病毒、人疱疹病毒-6、人疱疹病毒7、人流感病毒、人免疫缺陷病毒(1型和/或2型)、狂犬病病毒、麻疹病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、Plasmodium falciparum和Bordetella pertussis。
用过减毒VSV表达的抗原的可能有用的抗原或其衍生物通过多种标准鉴定，如抗原与病原体感染力中和的关系、类或组特异性、被患者抗血清或免疫细胞识别、和/或抗原特异性抗血清或免疫细胞保护性效应的证明。
在另一实施方案中，减毒VSV的外来RNA指导包含表位的抗原生产，所述表位在减毒的VSV被引入期望的宿主中时诱导免疫应答，所述免疫应答防护含有所述表位的实体引起的状况或病症。例如，抗原可以是肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原，永玉诱导针对肿瘤(例如恶性肿瘤)的保护性免疫应答。这类肿瘤特异性或肿瘤相关抗原包括但不限于KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸性磷酸(prostatic acidphosphate)；前列腺特异性抗原；黑色素瘤相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原和前列腺特异性膜抗原。
被插入减毒VSV DNA非关键性位点中的编码抗原的外来DNA任选地还包含编码下述细胞因子的外来DNA序列，所述细胞因子能够在被减毒VSV感染的宿主中被表达并刺激免疫应答。例如，这类细胞因子包括但不限于白介素1α、1β、2、4、5，6、7、8、10、12、13、14、15、16、17和18、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子和肿瘤坏死因子α和β。
免疫原性和药物组合物
在某些实施方案中，本发明涉及免疫原性组合物，其包含免疫原性剂量的经遗传修饰的VSV载体，所述VSV载体在其基因组中包含至少两种不同类的突变，和至少一种被插入VSV基因组中非复制关键性区域中或代替所述区域的外来RNA序列，其中所述两种突变协同减轻VSV致病性。可通过以本文所述低MOI将病毒传代约5到15代，使经遗传修饰的VSV进一步适应在细胞培养物中的生长，并可使用该进一步遗传修饰和减毒的VSV制备免疫原性组合物。
本发明的经协同减毒和遗传修饰的VSV载体被配制用于施用给哺乳动物受试者(例如人)。这类组合物典型地包含VSV载体和可药用载剂。在本文中使用时，“可药用载剂”旨在包括适合药物施用的任何和所当的溶剂中，所述溶剂根据需要具有一种上述成分或其组合，然后过滤灭菌。通常，通过将活性化合物掺入无菌运载体中制备分散液，所述无菌运载体含有基本分散介质和需要的来自上文所列的其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，由先前经无菌过滤的溶液得到了活性成分加任何额外的期望成分的粉末。
为了通过吸入施用，以来自加压容器或含有合适推进剂(例如气体如二氧化碳或喷雾器)的递送器的气溶胶喷雾的形式，递送化合物。也可以通过粘膜或经皮手段进行全身性施用。对粘膜或经皮施用而言，在配制物中使用对要穿越的屏障而言合适的渗透剂。这类渗透剂是本领域普遍已知的，并且包括，例如对粘膜施用而言去污剂、胆汁盐和夫西地酸衍生物。通过使用鼻喷雾或栓剂完成粘膜施用。还以栓剂形式(例如用常规栓剂基质如可可脂和其它甘油酯)或用于直肠递送的停留灌肠剂制备化合物。
在某些实施方案中，以易于施用和剂量均一性的剂量单位形式配制口或肠胃外组合物是有利的。下文使用剂量单位形式是指适合用作待治疗受试者的单一剂量的物理离散单位；每个单位含有被计算为产生期望治疗效果的预定量的活性化合物，与需要的药物载剂组合。本发明剂量单位形式的规格由活性化合物的特有特征和要实现的具体治疗效果以及用于治疗个体的这类活性化合物的配料领域固有的限制决定，并直接取决于这些因素。
本文引用的所有专利和公开物通过引用并入本文。
以VSV为载体的免疫原性组合物的生产通常包括用重组VSV感染合适的细胞培养物(宿主)，在细胞培养物中培养VSV，在合适时间收获细胞培养液，并从细胞培养液中纯化VSV。VSV载体及其免疫原性组合物在临床应用中的用途会需要适当纯度的VSV样品(或剂量)，从而顺应全世界多种药物安全性管理机构(例如食品与药物管理局(FDA)、欧洲医药局(EMEA)、加拿大健康产品和食品分局(HPFB)等等)的安全性规章。
然而，典型地难以将VSV与细胞培养物污染物(例如细胞培养物杂有溶剂、分散介质、途径、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸附延迟剂等等。针对药物活性物质使用这类介质和药剂是本领域公知的。除非任何常规介质或药剂与VSV载体不相容，否则在本发明的免疫原性组合物中使用这类介质。也可以向组合物中掺入补充性活性化合物。
因此，本发明的VSV免疫原性组合物被配制为与意图的施用途径相容。施用途径的例子包括肠胃外(例如静脉内、真皮内、皮下、肌内、腹膜内)和粘膜(例如口、直肠、鼻内、颊、阴道、呼吸道)。用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液包含以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或重亚硫酸钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲剂如乙酸盐、柠檬酸盐磷酸盐和用于调节张力的试剂如氯化钠或葡萄糖。用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节pH。可以将肠胃外制剂包封在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料职称的多剂量管中。
适用于注射用途的药物组合物包括无菌水性溶液(其中可溶于水时)或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内施用而言，合适的载剂包括生理盐水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲的盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的，并且应当流动至易于注射的程度。其在制造和储存条件下必须是稳定的，并且必须针对微生物如细菌和真菌的污染作用来防腐。载剂是含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液体聚乙二醇等等)及其合适的混合物的溶剂或分散介质。例如通过使用涂层如卵磷脂、在分散液的情况下通过维持所需颗粒尺寸和通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。通过多种抗菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸等等实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选组合物中包括等渗剂，例如糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶，造成可注射组合物的延长吸收。
如下制备无菌可注射溶液：以需要量(或剂量)将VSV载体掺入适质蛋白质和DNA)分开，并使用目前可获得的VSV纯化工艺(例如通过蔗糖梯度离心的纯化)获得具有适当纯度和产量的VSV。例如，使用目前可获得的纯化工艺，典型地在VSV样品的纯度和回收率(百分比产量)之间存在互逆关系，从而使得难以加工足量的经纯化的VSV。另外，在目前的基于生物反应器的工艺中，提高的细胞浓度和更长的培养时间导致更高的VSV效价，伴随着生物反应器流体中细胞碎片和有机组分浓度的增加，使VSV纯化工艺进一步复杂化。
蔗糖梯度超速离心是1964年以来用于病毒纯化(包括VSV纯化)的标准方法(Yamada等，2003 BioTechniques，34(5)：1074-1078，1080；Brown等，1967 J.Immun.，99(1)：171-7；Robinson等，1965 Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，54(1)：137-44；Nishimura等，1964Japan.J.Med.Sci.Biol.，17(6)：295-305)。然而，随着病毒浓度的提高，也发生了细胞碎片、宿主DNA和蛋白质杂质的伴随提高，它们在更高的浓度下非常难以通过蔗糖梯度超速离心去除。另外，蔗糖梯度超速离心要扩大规模极度昂贵。通过聚乙二醇(PEG)沉淀来浓缩和纯化VSV(McSharry等，1970 Virol.，40(3)：745-6)具有高杂质水平的相似问题。
通过尺寸排除色谱获得了相对高品质的病毒(Transfiguracion等，2003Human Gene Ther.，14(12)：1139-1153；Vellekamp，等，2001Human GeneTher.，12(15)：1923-36；Rabotti等，1971Comptes Rendus des Seances del′Academie des Sciences，Serie D：Sciences Naturelles，272(2)：343-6；Jacoli等，1968 Biochim.Biophys.Acta，Genl Subj.，165(2)：99-302)。然而，由于工艺成本和操作难度，对大规模病毒生产而言通常不可行。已发现亲和色谱如肝素(Zolotukhin等，1999Gene Ther.，6(6)：973-985)、凝集素(Kaarsnaes等，1983 J.Chromatog.，266：643-9；Kristiansen等，1976 Prot.Biol.Fluids，23：663-5)和MatrexTM CellufineTM硫酸盐(Downing等，1992 J.Virol.Meth.，38(2)：215-228)在病毒纯化中具有一些应用。因为可能的淋洗问题(leaching problems)，对cGMP病毒生产而言通常不优选(或使用)肝素和凝集素，所述淋洗问题会需要在产物释放之前进行额外的测试。
由于病毒生产效率、病毒品质和柱再生，使用MatrexTM CellufineTM硫酸盐进行病毒的亲和纯化是一个未解决的问题。对VSV纯化而言，需要非常大的亲和柱(例如每升细胞培养物0.2L MatrexTM Cellufine.TM硫酸盐树脂；Wyeth Vaccine未公开的结果)。通过独自或与病毒纯化中使用的其它类型传统色谱技术(国际专利公开No.WO2006/011580；Specht等，2004Biotech.Bioeng.，88(4)：465-173；Yamada等，2003，上文所述；Vellekamp等，2001，上文所述；Zolotukhin等，1999，上文所述)组合的离子交换层析纯化时，观察到低病毒产量(国际专利公开No.WO1997/06243；Kaarsnaes等，1983，上文所述)。
实施例
以下的实施例展示了本发明的某些方面。然而，应当理解这些实施例仅用于阐述，而非旨在全面定义本发明的条件和范围。应当理解给出典型的反应条件(例如温度、反应次数等)时，也可以使用高于以及低于所述范围的条件，尽管通常较不方便。除非另有说明，本文涉及的所有部分和百分比以重量为基础，并且所有温度以摄氏度表述。
实施例1
用vsv印地安那(IN)和VSV新泽西(NJ)血清型进行病毒传代研究
图1阐述了wtVSV和attn VSVN4CT1-gag1的基因组构成。图2是用于在Vero细胞中连续传代病毒的实验方案大纲。每5代通过所示实验分析病毒。图8A-8L展示了原始(第0代或P0)病毒和第25代VSV印地安那血清型的核苷酸(NT)和氨基酸(AA)序列比较。传代病毒中NT和AA取代用粗体表示。图9A-9M显示原始(第0代或P0)病毒和第25代VSV新泽西血清型的核苷酸(NT)和氨基酸(AA)序列比较。传代病毒中NT和AA取代用粗体表示。这些序列概括于表5和序列表中。
使用减毒的rVSVINN4CT1Gag1作为在Vero固定培养物中传代的起始材料。在DMEM(无血清、无抗生素)中，以0.01的感染复数用减毒病毒接种T25烧瓶中的Vero细胞。将烧瓶在32℃下培养2到3天，此时在90-100％的细胞单层中病毒的细胞病变作用(CPE)是明显的。收获培养基，通过低速离心(1500rpm，10分钟)澄清。添加1X蔗糖磷酸盐(SP)缓冲液(终浓度)后，在干冰乙醇浴中快速冷冻经澄清的病毒，并储存于≤-60℃。所述病毒被标记为rrVSVINN4CT1Gag的第1代或P1。类似地以0.01的moi用所述病毒接种Vero细胞的新鲜T25烧瓶，产生P2。将称作连续传代的所述过程重复25次，制造P1到P25病毒。在每一代中通过在Vero单层上进行的感染力测定来测定病毒效价。
图3中展示了使用VSVin血清型连续传代后氨基酸取代的增加。图5中展示了Vero细胞中以0.01MOI传代VSVin病毒的生长动力学。
图4展示了使用VSVnj血清型连续传代后氨基酸取代的增加。图6中展示了Vero细胞中以0.01的MIO传代的VSVnj病毒的生长动力学。
实施例2
生产rECOMBINANT VSVN4CT1gag1
VSV印地安那血清型(VSVin)的组织培养适应性San Juan毒株及其相应的基因组cDNA由Yale University，New Haven，CT的Dr.John K.Rose提供，并用于rVSVN4CT1gag1重组体的衍生。
制备rVSVinN4CT1gag1质粒DNA的详细步骤先前已经描述(Clarke等，J Virology，81，2056-64，2007和Cooper等，J Virology，82：207-29，2008)。类似的NJ血清型糖蛋白载体通过用截短形式的Gnj基因代替Gin基因来产生，并描述于Cooper et al，2008中。图1示意性展示了衍生自wtVSV的减毒VSV重组体病毒基因组内病毒基因的顺序。
用下述Vero细胞感染后，从基因组cDNA中回收感染性病毒，所述Vero细胞带有含有全长基因组的病毒基因组质粒和分别编码VSV N、P、L、M和G蛋白的五种表达质粒。来自这些质粒的表达处于T7RNA聚合酶启动子的控制下。通过下述质粒的电穿孔供应所述聚合酶，所述质粒编码位于人巨细胞病毒介导早期启动子/增强子区控制下的T7RNA聚合酶。通过克隆分离3到4次来纯化复苏的rVSV，并通过在Vero细胞中传代来扩增。病毒复苏和随后的纯化与扩增在Vero细胞中进行。在病毒复苏中使用的胎牛血清(PBS)是新西兰(New Zealand)来源的。所有步骤在无血清培养基(DMEM)中进行。克隆纯化后的所有步骤在无血清、无抗生素培养基(DMEM)中进行。
简言之，将来自T150烧瓶的约2.0×107个Vero细胞置于下述管中，所述管含有10μg rVSVINN4CT1Gag1全长病毒cDNA质粒和编码处于T7启动子控制下的VSV N、P、L、M和G蛋白的五种支持质粒(分别为10、4、1、1、2μg)。添加50μg第七质粒来供应T7RNA聚合酶；所述质粒由细胞RNA聚合酶II控制。对悬浮液进行电穿孔，将细胞重悬并转移至T150烧瓶。将所述烧瓶在37℃下孵育3小时；在43℃下热激5小时，然后在37℃下孵育过夜。接下来那天更换培养基，并在第二天将烧瓶在32℃下孵育。在每个工作日针对CPE征兆检查烧瓶。监测显示CPE的烧瓶，直至它们达到80-100％CPE。此时收获含有复苏病毒(复苏上清液)的培养基，补充1X SP1作为病毒稳定剂，快速冷冻并储存于≤-60℃。使用Gag-特异性单克隆抗体，通过Western印迹分析，针对Gag表达来筛选所有复苏上清液；对显示Gag表达的复苏病毒进行病毒基因组测序。选择具有正确序列的每种血清型的一个或多个病毒克隆进行进一步噬斑纯化和扩增。
在含庆大霉素不含血清的DMEM中，在含琼脂覆盖层的六孔平板中的Vero细胞上进行病毒纯化。将含有感染性病毒的复苏上清液稀释于DMEM中，达到每孔≤5个噬斑。挑取大量良好分离的噬斑，重悬于DMEM中并进行两轮或三轮额外的噬斑纯化。挑取来自第四次克隆的主噬斑并悬浮于DMEM中，然后分别在T25烧瓶和T150烧瓶的6-孔板中Vero细胞上进行三次相继的病毒扩增。使用不含血清并且不含抗生素的DMEM进行扩增。通过该过程获得的重组病毒被称作低传代病毒，并用于在Vero细胞中进一步传代，进行下述细胞适应(adaption)。
实施例3
用于连续传代的试验方案
如图2中所示，在T-25烧瓶中Vero细胞单层上，将每种血清型的低传代VSV重组体(P0)连续传代25次。以～0.01的感染复数(MOI)，用病毒感染无血清培养基中培养的Vero细胞，并在32℃/5％CO2培养箱中孵育，直至可以看到广泛的CPE(通常在感染后48到72小时)。每次扩增后，通过在低速下离心来澄清病毒培养物，并用1X SP蔗糖磷酸盐缓冲液稳定化。10X SP每升含有磷酸钾，二碱基，12.2gm；磷酸钾，单碱基，5.17gm；蔗糖，746.2gm。通过先前所述(Clarke等，J.Virol.，81：2056-64，2007)的噬斑测定法测定从第1代到第25代的病毒培养物的效价。每五代进行核苷酸测序。
实施例4
小鼠IC LD50研究结果
小鼠IC LD50研究
颅内接种(IC)后年幼小鼠对VSV感染高度敏感，引起快速发病率和死亡率。小鼠IC LD50神经毒力动物模型显示高度敏感，并且能够区分VSV重组体毒力的改变(Clarke et al，J.Virol.，81，2056-64，2007)。因此，接受wt VSVin的小鼠体重大幅降低，并且在用1到2pfu的LD50接种后2到4天死亡。另一方面，使用12到21pfu的LD50时，含有CT截短或基因改组的病毒显示比wt VSV更加减毒(Clarke et al，J.Virol.，81，2056-64，2007)。然而，将CT1突变与基因改组(N4和/或gag1)突变组合时，观察到毒力的显著降低。例如，使用在所述动物模型中测试的最高剂量——＞107pfu的LD50时，低传代rVSVinN4CT1gag1显示极低的毒力水平。用所述病毒接种的小鼠最初在接种后损失其体重的10％到20％，但是在～2到3周后恢复正常体重。用NJ血清型病毒观察到类似的结果(Cooper等，J Virology，82，207-29，2008)。
在小鼠IC LD50动物模型中于每种血清型(IN和NJ)第15到25代测试了本发明经Vero-适应的VSVN4CT1gag1；如图7中所示，对所有传代病毒而言，使用＞107pfu的LD50时未观察到毒力提高。这些结果显示在细胞培养物中传代的病毒中增加的适应性突变不影响病毒的毒力。低毒力与达到高效价的增强的复制一起，使传代的病毒适用于在人临床试验中测试。
方法
小鼠IC LD50研究的试验细节在Clarke等(Clarke et al，J.Virol.，81，2056-64，2007)和Cooper等(Cooper等，J Virology，82，207-29，2008)中给出。将五周龄的雌性Swiss Webster小鼠麻醉并IC注射体积为30μl的病毒10倍稀释液(每种稀释10只动物，制造范围在预期的LD50周围的稀释液)。每天记录体重和健康状态，持续两周。将变得两侧麻痹或者显示显著的不适或严重疾病症状的小鼠处死，并记录为屈从于(succumbing to)VSV疾病。通过Reed和Muench，(Am.J.Hyg.27，493-97，1938)的方法测定LD50。
总结
与较早代的rVSVN4CT1-gag1病毒(P0)相比，连续传代的P15病毒生长至高得多的效价。这有利于大规模制造临床试验材料(CTM)。另外，P15对适应性突变的稳定化提供了在CTM生产期间具有制造很多到很多(lot-to-lot)一致性的病毒。另外，如通过小鼠IC LD50动物模型所测试的，传代病毒的安全性谱保持不变，从而维持了用于临床评价的适应性。
实施例5
经载体化的HIV(VECTORED HIV)的扩大规模
以约5x105细胞/mL的Vero细胞接种以7.5克/L含有Cytodex I微载体的10-L生物反应器(8-L工作体积)。每天在37℃下对生物反应器灌注0.5倍培养物体积的Gibco VP-SFM培养基(含有或不含有苯酚红)。在70-90小时后，或细胞密度≥2x106细胞/mL时，在32℃下以0.001的MOI用低传代(≤P5)或高传代(P15)VSV N4CT1-gag1病毒感染培养物。每天将培养物取样2-3次，最后在感染后48-60小时时收获。
为了将印地安那血清型扩大规模至10升生物反应器，测试低传代(≤P5)和高传代(P15)病毒。使用低传代病毒材料(实线)完成生物反应器运行X-BRN10-VSV-14、17和28，来感染培养物。使用高传代研究病毒种(虚线)完成生物反应器运行X-BRN10-VSV-31、33和34。每种运行的生长曲线展示于图10中。病毒的传代数量在图例的括号中指出。
对高传代和低传代运行而言，各组运行彼此一致。高传代生物反应器运行生产高达低传代运行两倍logs的效价。以高传代材料的生长动力学为基础，将收获时间确定为感染后约48小时。
为了将新泽西血清型扩大规模至10升生物反应器，也测试低传代(≤P5)和高传代(P15)病毒。使用低传代病毒材料(实线)完成生物反应器运行X-BRN10-VSV-15、18、19、20、22和23，来感染培养物。使用高传代研究病毒种(虚线)完成生物反应器运行X-BRN10-VSV-36和37。每种运行的生长曲线展示于图11中。
对新泽西构建体而言，低传代运行和高传代运行之间的差异比用印地安那构建体观察到的差异更少。与VSVinN4CT1-gag1的情况一样，以高传代材料的生长动力学为基础，VSVnjN4CT1-gag1的收获时间被确定为感染后约48小时。总而言之，P15-N4CT1-ag1导致对印地安那型而言，生物反应器效价提高至～35倍，每个细胞生产的病毒颗粒数提高至45倍，对新泽西型而言，生物反应器效价提高至～5倍，每个细胞生产的病毒颗粒数提高至7倍(见表3和4)。
表3：VSVinN4CT1-gag1生物反应器运行的比较
  BR-14   P1   8.0   2.96x106   48   1.20x106   0.4
  BR-17   P2   8.0   3.07x106   50   2.55x106   0.8
  BR-28   P3   7.0   2.78x106   47   1.84x106   0.7
  BR-31   P16   8.0   2.25x106   88   8.51x107   37.8
  BR-33   P16   8.0   2.24x106   50   4.50x107   20.1
  BR-34   P16   8.0   1.99x106   51   7.10x107   35.7
表4：VSVnjN4CT1-gag1生物反应器运行的比较
  BR-15   P1   8.0   3.52x106   72   5.28x106   1.5
  BR-18   P3   8.0   3.06x106   72   1.72x107   5.6
  BR-19   P3   7.0   3.36x106   66   1.46x107   4.3
  BR-20   P3   7.0   3.65x106   66   7.26x106   2.0
  BR-22   P4   7.0   4.27x106   50.5   3.41x107   8.0
  BR-23   P4   7.0   2.78x106   47   1.07x107   3.9
  BR-36   P16   8.0   2.42x106   72   5.57x107   23.0
  BR-37   P16   8.0   2.31x106   50.3   8.36x107   36.2
表5：不同传代后VSV印地安那和新泽西毒株的序列说明(见图8和9)
 SEQ ID NO   说明
  1   VSV印地安那(gag1)DNA：传代数25
  2   VSV印地安那(gag1)蛋白：传代0
  3   VSV印地安那(gag1)蛋白：传代数25
  4   VSV新泽西(gag1)DNA：传代数25
  5   VSV新泽西(gag1)蛋白：传代0
  6   VSV新泽西(gag1)蛋白：传代数25
Figure IPA00001206697800021
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Claims (50)

1.经分离的、经遗传修饰的疱疹性口炎病毒(VSV)，其在对应于至少一个以下位置的区域中具有至少一个氨基酸突变：
-M蛋白的第119或142位的氨基酸；
-G蛋白的第109、224、438、477或481位的氨基酸；和
-L蛋白的第205、220或1450位的氨基酸。
2.权利要求1的经遗传修饰的VSV，其中编码经遗传修饰的VSV的所述核酸还包含编码至少一种异源抗原或其片段的核酸。
3.权利要求1的经遗传修饰的VSV，其中所述一种异源抗原或其片段来自致病微生物。
4.权利要求3的经遗传修饰的VSV，其中，从中获得编码所述异源抗原的核酸的所述致病微生物得自由病毒、细菌、原生动物和真菌组成的组。
5.权利要求4的经遗传修饰的VSV，其中所述异源抗原选自由以下组成的组：人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、Epstein-Barr病毒抗原、Varicella-Zoster病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、鼻病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、Norwalk病毒抗原、披膜病毒抗原、甲型病毒抗原、风疹病毒抗原、狂犬病病毒抗原、Marburg病毒抗原、Ebola病毒抗原、乳头状瘤病毒抗原、多瘤病毒抗原、偏肺病毒抗原、冠状病毒抗原、Vibrio cholerae抗原、Plasmodium falciparum抗原、Plasmodium vivax抗原、Plasmodiumovale抗原、Plasmodium malariae抗原、Plasmodium knowlesi抗原、Streptococcus pneumoniae抗原、Streptococcus pyogenes抗原、Helicobacterpylori抗原、Streptococcus agalactiae抗原、Neisseria meningitidis抗原、Neisseria gonorrhoeae抗原、Corynebacterium diphtheriae抗原、Clostridiumtetani抗原、Bordetella pertussis抗原、Haemophilus抗原、Chlamydia抗原和Escherichia coli抗原。
6.权利要求5的经遗传修饰的VSV，其中所述异源抗原包含HIV蛋白。
7.权利要求6的经遗传修饰的VSV，其中所述HIV蛋白由选自下组的基因编码，所述组由gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev和vpu组构成。
8.权利要求6的经遗传修饰的VSV，其中所述HIV蛋白是HIV gag蛋白。
9.权利要求8的经遗传修饰的VSV，其中所述HIV gag蛋白在第165、270、329或348位上具有至少一个突变。
10.权利要求1到9中任一项的经遗传修饰的VSV，其中所述突变包含保守性或非保守性氨基酸改变。
11.权利要求1的经遗传修饰的VSV，其中所述突变处于M蛋白的第119或142位中任一位置上或M蛋白的第119位和142位二者上。
12.权利要求1的经遗传修饰的VSV，其中M蛋白的第119位的所述氨基酸的突变是T→N突变，并且M蛋白的第142位的所述氨基酸的突变是P→T突变。
13.权利要求1的经遗传修饰的VSV，其中G蛋白的第109、224、438、477或481位上的所述氨基酸的突变分别为K→N、N→T、S→I、A→V/G→L或V→I突变。
14.权利要求1的经遗传修饰的VSV，其中L蛋白的第205、220或1450位上的所述氨基酸的突变分别为P→L、K→E或L→I。
15.权利要求9的经遗传修饰的VSV，其中HIV gag蛋白的第165、270、329或348位的所述氨基酸的突变分别为S→G、L→S、D→N或T→K。
16.权利要求1到15中任一项的经遗传修饰的VSV，其中所述氨基酸中任一个或多个的突变导致病毒基因型和/或表型的稳定性提高。
17.权利要求16的经遗传修饰的VSV，其中所述氨基酸中任一个或多个的突变还导致感染了所述病毒的细胞生产病毒的产量提高。
18.权利要求1到15中任一项的经遗传修饰的VSV，其基因组中还包含至少两种其它突变，所述突变可选自由以下组成的组：温度敏感性突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。
19.生产权利要求1到15中任一项的经遗传修饰的VSV的方法，所述方法包括在连续哺乳动物细胞系中以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/ml的低感染复数(MOI)将VSV连续传代至少5-15代，其中所述病毒具有至少1x106PFU/ml的效价和权利要求1到14中任一项所述的突变中的至少一种或多种。
20.权利要求19的方法，其中所述病毒具有至少1x107PFU/ml的效价。
21.权利要求19或20中任一项的方法，其中所述细胞系是Vero、BHK或293细胞系。
22.权利要求19到21中任一项的方法，其中所述方法得到的病毒产量是使用下述病毒毒株得到的病毒产量的5到100倍，所述病毒毒株未以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/细胞的低MOI传代约5-15代。
23.权利要求19到22中任一项的方法，其中所述经遗传修饰的VSV展示病毒基因型和/或表型稳定性的提高。
24.免疫原性组合物，其包含权利要求1到15中任一项的任一种或多种经遗传修饰的VSV和可药用载剂。
25.权利要求24的免疫原性组合物，还包含佐剂。
26.保护哺乳动物抵挡致病微生物感染的方法，所述方法包括施用免疫有效量的权利要求1到15中任一项的经遗传修饰的VSV。
27.保护哺乳动物抵挡致病微生物感染的方法，所述方法包括施用免疫有效量的权利要求24或25中任一项的免疫原性组合物。
28.使病毒适应在细胞培养物中生长的方法，所述方法包括：
a.以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位(PFU)/细胞的低感染复数(MOI)用所述病毒感染所述细胞培养物；
b.收获含有所述病毒的所述细胞培养基；
c.澄清所述细胞培养基；
d.冷冻所述细胞培养基；和
e.将步骤a)到d)重复约5到约15次，
其中所述方法导致病毒生产/产量提高至5到100倍，以及病毒基因型和表型特征稳定性的提高。
29.权利要求28的方法，其中所述病毒是减毒病毒。
30.权利要求29的方法，其中所述方法允许保留与病毒减毒相关的任何预先存在的突变。
31.权利要求29的方法，其中所述方法允许保持与病毒减毒相关的低神经毒力谱。
32.权利要求28的方法，其中所述方法被用于大规模生产免疫原性组合物。
33.权利要求32的方法，其中所述方法导致与未以范围从约0.001到约0.1个噬斑形成单位/细胞的低感染复数传代约5-15代的病毒毒株获得的病毒产量相比5到100倍的病毒产量。
34.权利要求30的方法，其中与病毒减毒相关的所述预先存在的突变选自由以下组成的组：温度敏感性突变、点突变、基因改组突变、G-茎突变、非细胞病变M基因突变、双义RNA突变、截短的G基因突变、G基因插入突变和基因缺失突变。
35.权利要求29的方法，其中所述减毒病毒是疱疹性口炎病毒(VSV)毒株。
36.权利要求30的方法，其中所述VSV在对应于至少一个以下位置的区域中具有至少一个氨基酸突变：
-M蛋白的第119或142位的氨基酸；
-G蛋白的第109、224、438、477或481位的氨基酸；和
-L蛋白的第205、220或1450位的氨基酸。
37.权利要求36的方法，其中所述突变包含保守性或非保守性氨基酸改变。
38.权利要求36的方法，其中所述突变处于M蛋白的第119或142位中的任一处或M蛋白的第119位和142位二者上。
39.权利要求38的方法，其中M蛋白的第119位的所述氨基酸突变是T→N突变，以及，M蛋白的第142位的所述氨基酸突变是P→T突变。
40.权利要求36的方法，其中G蛋白的第109、224、438、477或481位的所述氨基酸突变分别为K→N、N→T、S→I(A→V/G→L)或V→I突变。
41.权利要求36的方法，其中L蛋白第205、220或1450位的所述氨基酸突变分别为P→L、K→E或L→I。
42.权利要求35的方法，其中所述VSV毒株选自印地安那血清型、新泽西血清型或伊斯法罕血清型或其它水泡性病毒。
43.权利要求36或42中任一项的方法，其中所述VSV菌株含有编码至少一种异源抗原的核酸。
44.权利要求43的方法，其中所述异源抗原从选自病毒、细菌、原生动物和真菌构成的组的致病微生物获得。
45.权利要求43的方法，其中所述异源抗原选自由以下构成的组：人免疫缺陷病毒(HIV)抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、Epstein-Barr病毒抗原、Varicella-Zoster病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰质炎病毒抗原、鼻病毒抗原、甲型肝炎病毒抗原、乙型肝炎病毒抗原、丙型肝炎病毒抗原、Norwalk病毒抗原、披膜病毒抗原、甲型病毒抗原、风疹病毒抗原、狂犬病病毒抗原、Marburg病毒抗原、Ebola病毒抗原、乳头状瘤病毒抗原、多瘤病毒抗原、偏肺病毒抗原、冠状病毒抗原、Vibrio cholerae抗原、Plasmodium falciparum抗原、Plasmodium vivax抗原、Plasmodiumovale抗原、Plasmodium malariae抗原、Plasmodium knowlesi抗原、Streptococcus pneumoniae抗原、Streptococcus pyogenes抗原、Helicobacterpylori抗原、Streptococcus agalactiae抗原、Neisseria meningitidis抗原、Neisseria gonorrhoeae抗原、Corynebacterium diphtheriae抗原、Clostridiumtetani抗原、Bordetella pertussis抗原、Haemophilus抗原、Chlamydia抗原和Escherichia coli抗原。
46.权利要求43的方法，其中所述异源抗原包含HIV蛋白。
47.权利要求46的方法，其中所述HIV蛋白由选自下组的基因编码，所述组由gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev和vpu构成。
48.权利要求46的方法，其中所述HIV蛋白是HIV gag蛋白。
49.权利要求48的方法，其中所述HIV gag蛋白在第165、270、329或348位上具有至少一个突变。
50.权利要求49的方法，其中HIV gag蛋白第165、270、329或348位的所述氨基酸突变分别为S→G、L→S、D→N或T→K。
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PB01 Publication
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WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

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