TW200932259A - Genetically modified attenuated vesicular stomatitis virus, compositions and methods of use thereof - Google Patents

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Roger Michael Hendry
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200932259 九、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明一般而言係關於負鏈RNA病毒。詳言之，本發明 係關於使水皰性口炎病毒（VSV)粒子適應在適用於製造之 細胞培養物中生長之方法及組合物。 政府支持款項 產生本發明之研究至少部分地藉由美國衛生研究院 (National Institutes of Health)合同號 N01-A1-25458 支持。 φ 因此，政府在本發明中可具有某些權利。 【先前技術】 水皰性口炎病毒（VSV)為棒狀病毒科（Rhabdoviridae family)之原型病毒，屬於單股反鏈病毒目 (Mononegavirales)，其包括具有高度保守基因順序之單 鏈、非分段、負義RNA病毒。11-kb VSV基因組含有5種編 碼以下5種病毒蛋白質之基因：核殼蛋白質（N)、磷蛋白 (P)、 基質蛋白質（M)、 連接膽蛋白（attachment 〇 glycoprotein)(G)及RNA依賴性RNA聚合酶（L)。基因組中 之基因順序為S’-N-P-M-G-L-S'且大量研究已證明基因表現 係專性地自單一 3'啟動子依序（Rose及Whitt, Rhabdoviridae: The Viruses and Their Replication. In "Fields Virology”，第 4版，第 1卷。Lippincott及 Williams 及 Wilkins，1221-1244, 2001)。 N基因編碼負責殼體化基因組之核殼蛋白質，而P(磷蛋 白）及L(大）編碼序列指定RNA依賴性RNA聚合酶之子單 136326.doc 200932259 元。基質蛋白質（Μ)促進病毒粒子成熟且覆蓋病毒粒子之 内表面。VSV編碼單一包膜醣蛋白，該醣蛋白用作細 胞連接蛋白質’介導膜融合且為中和抗體之標靶。 西半球中之VSV之2種最普通血清型命名為印第安納 (Indiana)(VSVin)及新澤西（New Jersey)(VSVnj)。本質上， VSV感染家畜’引起自限疾病（self_nmiting disease)。儘管 天然存在之人類感染VSV為不常見的，但是已報導直接暴 露於受感染家畜或處於實驗室環境内之個體的VSV感染之 ❿ 病例。人類之vsv感染通常為無症狀的或產生類似輕度流 感之疾病（Fields，Β· N.及K. Hawkins，N. Engl. J. Med. 277:989-94，1967)。在小哺乳動物之中，小鼠可容易在實 驗上經由多種接種路線感染且因此用作免疫原性、病原性 及神經毒性研究之極好小動物模型（Bruno-Lobo等人An.
Microbiol· (Rio J.) 15:53-68，1968 ; Bruno-Lobo 等人 An. Microbiol· (Rio J.) 15:69-80, 1968 ; Flanagan，E. B.等人 J·
Virol. 77:5740-8, 2003 , Wagner, R. R. Infect. Immun. ® l〇:309_315’ I974 ; Huneycutt 等人 j. Virol. 67:6698-706, 1993) 〇 在過去幾年中，已證明vsv有作為用於免疫原性組合物 之載體之前途’該等免疫原性組合物含有大量人類病原 體，包括HIV、乳頭狀瘤病毒、RSv、C型肝炎病毒及流感 病毒。許多性質使VSV成為用於人類用途之吸引人之候選 載體（Bukreyev 等人 J. Virol. 80:10293-306, 2006; Clarke 等 人 Springer Semin Immunopathol. 28: 239-253, 2006) ° 該等 136326.doc 200932259 性質包括：i)vsv不為人類病原體；2)存在可阻止其在人 類中使用之極少量的先前存在免疫性；3)vsv容易感染許 多細胞類型，4)其在適於製造免疫原性組合物之細胞株中 有效繁殖，5)其在基因上為穩定的；6)存在可藉以產生重 組病毒之方法；7) VSV可接收一或多種外來基因插入物且 在感染後引導高表現量；且8)VSV感染為細胞及體液免疫 性之有效誘導物。該等研究已由允許rVSV自基因組cDNA 之容易回收之逆轉遺傳技術的出現而大大促進（Laws〇n等 ® 人Proc Natl Acad Sci USA 92:4477-81，1995 ; Schnell 等人 EMBO J 13:4195-203，1994)。另外，已證明VSV之相對小 及簡單的基因組組織適合於外來基因插入，所得病毒產生 高含量之外來蛋白質。用插入G與L基因之間的外來編碼 序列連同必需之基因間轉錄控制元件來設計第一載體。發 現該等原型載體引起抵抗外來抗原之有效免疫反應且在其 中測試其之動物模型中良好耐受（Grigera等人Virus Res 69:3-15, 2000 ; Kahn 等人 J Virol 75:1 1079-87, 2001 ; Roberts 等人 J Virol 73:3723-32，1999 ; Roberts 等人 J Virol 72:4704-1 1，1998 ; Rose等人Cell 106:539-49, 2001 ; R0se 等人 J Virol 74:10903-10，2000 ; Schlereth 等人 J Virol 74:4652-7，2000)。特別地，Rose等人發現兩種載體（一種 編碼HIV-1 env且另一者編碼SIV gag)之共同投藥在經免疫 獼猴中產生免疫反應，其進行保護以抵抗用病原性SHIV 之攻毒（Rose等人Cell 106:539-49, 2001)。大多數該等研究 係用原型VSV載體來進行，該等載體得自野生型（wt)vsv 136326.doc 200932259 骨架且與wt vsv相比’展示為顯著減毒的(一等人】 ⑽1·72:4704-1 1，1998)。更近期之研究展示，當在用於 神經毒性之非人類靈長類動物模型中評估時，原型彻載 體引起對神經組織之顯著量的損傷，即使與野生型病毒相 比含量減少亦如此（Johnson等人Vir〇1 36〇, 36 49, 2〇〇7)。 該等觀察得出結論，對用於人類而言，原型載體可 不為充分減毒的。 符合控制用於向人類投藥之免疫原性組合物之製造的法 © S之大規模化繁殖方法之發展仍為在可驗證臨床評估之前 必須考慮之障礙。當設計用於向人類投藥之載體時，必要 的為產生病毒減毒之突變為穩定的且病毒產率足夠用於按 比例放大之製造。希望單一人類劑量為至少〗χΐ〇7 ，因 此，僅當每ml培養基產生大於107⑴時，載體之製造才為 實際的。 在此項技術中存在對於使減毒VSV粒子適應在細胞培養 _ 物中增加生長的方法之需要，其中所回收減毒vsv粒子之 產率足以適用於大規模製造。理想地，該等方法將使用有 資格用於商業生產之細胞。另外，該等方法應保留產生病 毒減毒之原始突變，而同時改良產率達到用於按比例放大 生產之足夠水準。 本文中任何參考文獻之引用不應視為承認該參考文獻可 用作本發明之先前技術。 【發明内容】 根據本發明，提供藉由在低病毒感染倍率（multiplicity 136326.doc 200932259 of infection)(MOI)下，在Vero細胞或在任何敏感細胞基質 中連續傳代使高度減毒之VSV重組體適應組織培養條件的 方法。多次連續傳代方法產生特徵為遍及病毒基因組之大 量核苷酸（NT)取代之進行性增加的基因型改變。大多數該 等核苷酸取代產生VSV蛋白質中之胺基酸（AA)取代。該方 法產生病毒之表型適應’伴隨病毒產率之實質改良。持續
Vero細胞中之傳代直至達到基因型及表型穩定性，通常在 10至丨5次連續傳代（Ρ1〇_Ρ15)中達到。超過P15之病毒之進 © 一步傳代展示很少的額外取代或不展示額外取代且不產生 病毒產率之進一步提高。該方法產生製造產率之實質改良 以及增強之製造一致性。當在高度敏感小鼠顱内NV動物 模型中測試時’適應性突變大體上不影響所傳代病毒之神 經毒性（NV)。 因此’本發明之一態樣提供經分離、基因修飾之水皰性 口炎病毒（VSV)，其在對應於以了位置之至少一者之區域 中具有至少一種胺基酸突變： 黎 Μ蛋白質之位置119或142處之胺基酸； G蛋白質之位置1〇9、224、438、477或481處之胺基 酸；及 L蛋白質之位置2〇5、220或U50處之胺基酸。 在本發明之一實施例中，編碼基因修飾之vsv之核酸另 外匕含編碼至少一種異源抗原或其片段之核酸。設想一種 異源抗原或其片段係來自一種病原微生物。編碼異源抗原 之核酸自其獲得之病原微生物可選自由病毒、細菌、原生 136326.doc 200932259 動物及真菌組成之群。在一實施例中，異源抗原可選自由 以下抗原組成之群：人類免疫缺陷性病毒（HI V)抗原、 HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、 CMV抗原、埃-巴二氏病毒抗原（Epstein-Barr virus antigen)、水痘-帶狀疮療病毒抗原、肥腺炎病毒抗原、麻 疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰質炎病毒抗原、鼻病 毒抗原、A型肝炎病毒抗原、B型肝炎病毒抗原、C型肝炎 病毒抗原、諾沃克病毒（Norwalk virus)抗原、彼衣病毒抗 原、阿爾發病毒抗原、風疹病毒抗原、狂犬病病毒抗原、 馬堡病毒（Marburg virus)抗原、伊波拉病毒（Ebola virus)抗 原、乳頭狀瘤病毒抗原、多形瘤病毒抗原、間質肺炎病毒 抗原、冠狀病毒抗原、霍亂弧菌（厂c/io/erae)抗原、 惡性瘧原蟲（尸/a/c/porrww)抗原、間日癔原蟲 (P/aswio山’wm νζ·ναχ)抗原、卵形癌原蟲（P/aswzo山ova/e) 抗原、三曰癌原蟲（户/似所odiww ma/arke)抗原、諾氏癌原 蟲（P/aswoiZ/wm Awow/es/)抗原、肺炎鍵球菌（《SVrepiococcws ❹ pwewmom’ae)抗原、釀膿鏈球菌（iSirepiococcw·? 抗 原、幽門螺桿菌（//e/icoZ)acier ;?少/orz·)抗原、無乳鏈球菌 (•SVrepiococcws aga/aci/ae)抗原、腦膜炎奈瑟球菌 {Neisseria meningitidis) H 滑、、淋病奈瑟球菌 gonorrhoeae)机揖、、白喉棒狀桿菌（CoryweZjacierz'wm <^'/?/2i/zeWae)抗原、破傷風梭菌（CVosir/c^ww ieiam·)抗原、 百曰咳博德特氏菌（5〇厂<^/^//<3/^以1^5^15)抗原、嗜血桿菌 (i/aewop/n’/ws)抗原、衣原體抗原及大腸桿菌（£^c/zeric?/^<3 136326.doc 200932259 £?σ/ί)抗原 β 在本發明之一實施例中’編碼基因修飾之vSV之核酸另 外包含編碼為人類免疫缺陷性病毒（mv)蛋白質之異源抗 原之核酸。在一實施例中，HIV蛋白質藉由選自由…尽、 MV …/、^^/、^、^^”⑼及^^組成之群之基因 編碼。在一實施例中，HIV蛋白質為HIVgag蛋白質。在一 實施例中，HIV gag蛋白質在位置165、27〇、329或348處 具有至少一種突變。 在一實施例中，基因修飾之vsv具有包含保守或非保守 胺基酸改變之突變。 在一實施例中’基因修飾之vsv具有在μ蛋白質之位置 119或142處或在Μ蛋白質之位置119及142處之突變。在一 實施例中，在Μ蛋白質之位置u 9處之胺基酸突變為 突變’且在Μ蛋白質之位置142處之胺基酸突變為ρ—τ突 變或P —Q突變。 在一實施例中，基因修飾之VSV具有在G蛋白質之位置 109、224、43 8、477或481處之胺基酸突變，亦即，分別 為 Κ-^Ν、Ν—Τ、S—I、A->V/G—L 或 V->I 突變。 在一實施例中，基因修飾之VSV具有在L蛋白質之位置 2〇5、22〇或1450處之胺基酸突變，亦即，分別為p—L、 K—>E 或 L —>1 ° 在一實施例中，基因修飾之VSV另外包含編碼hiV gag 蛋白質之核酸分子，其中HIV gag蛋白質具有在位置165、 270、329或348處之胺基酸之至少一者中的突變，其中突 136326.doc 12 200932259 變刀別為 S—»G、L—>S、D~-»N或 Τ—>Κ。 在-實施例中，基因修飾之vsv中之上述突變產生病毒 基因型及/或表型之增加的穩定性。在一實施例中，基因 修飾之VSV中之上述突變另外產生自經基因修飾之vsv感 染的細胞之病毒產生之增加產率。 在一實施例中，基因修飾之vsv在其基因組中另外包含 至少2種其他突變。在一實施例中，突變可選自由以下突 變組成之群：溫度敏感突變、點突變、基因洗牌 © (shuffling)突變、G-柄突變（G-stem mutation)、非細胞病變 Μ基因突變、雙義 RNA突變（ambisense RNA mutation)、截 斷G基因突變、G基因插入突變及基因缺失突變。 本發明之第二態樣提供產生如本文中所述之基因修飾之 VSV的方法’該方法包含在約o.ooi至約〇.1個空斑形成單 位（PFU)/ml之範圍變化之低病毒感染倍率（MC)I)下，將 VSV在敏感哺乳動物細胞株中連續傳代至少5-丨5次傳代， 其中病毒具有至少1χ1〇6 PFU/ml之效價及至少一種或多種 ® 如本文所述之突變。 在一實施例中’上述方法產生具有至少1 X 1 〇7 PFU/ml之 效價之基因修飾及減毒病毒。 在一實施例中’上述方法利用敏感細胞株，亦即，能夠 經如本文中所述之基因修飾之VSV感染的任何細胞株。舉 例而言，敏感細胞株可包括（但不限於）Vero細胞株、幼倉 鼠腎（BHK)細胞或人類胚腎細胞株（諸如293細胞株）。 在一實施例中，與未在約0.001至約〇.1個空斑形成單位 136326.doc 13 200932259 (PFU)/ml之範圍變化之低厘〇1下傳代約5至15次的病毒株獲 得之產率相比’上述方法產生高5至1 〇〇倍之病毒產率。 在一實施例中，上述方法產生病毒基因型及/或表型之 穩定性之增加。 本發明之第三態樣提供免疫原性組合物，其包含上述基 因修飾之VSV之任一者或多者及醫藥學上可接受之載劑。 在一實施例中’免疫原性組合物另外包含佐劑。 本發明之第四態樣提供保護哺乳動物抵抗經病原微生物 〇 之感染之方法，該方法包含投與免疫有效量之如本文中所 述之基因修飾的VSV之任一者或多者。 本發明之第五態樣提供使病毒適應在細胞培養物中生長 之方法，其包含 a.在每個細胞約o.ool至約〇丨個空斑形成單位（pFu)之 範圍變化之低病毒感染倍率(M〇I)下，用病毒感染細 胞培養物； b ·收穫含有病毒之細胞培養基； ® c.澄清細胞培養基； d. 冷凍細胞培養基；及 e. 重複步驟a)至d)約5至約15次， 其中該方法產生病毒產生/產率之5至1〇〇倍增加及病毒 基因型及表型之穩定性之增加。 在-實施例中，本文中所述之方法利用為減毒病毒之病 毒。在-實施例中，該方法適宜於病毒免疫原性組合物之 大規模生產。在一實施例中，與未在每個細胞約〇 〇()1至 136326.doc 200932259 ==形成單位之範圍變化之低病毒感染倍率下傳 ⑽倍之/Γ病毒株獲得之產率相比’該方法產生高5至 病。在—實施射，上述方法允許維持與 卜七 仕仃先前存在的突變。與病毒減毒相關的 先别存在之突變可選自 目由以下犬變組成之群：溫度敏感突 Ο ❹ 二點突變、基因洗牌突變、G柄突變、非細胞病變職 因犬變、雙義RNA突變、戴斷G基因突變、G基因插入突 :及基因缺失突變。在一實施例中，該方法允許維持與病 咸毋相關之低神經毒性概況。在_實施例中，用於上述 方法之減骨病毒為水皰性σ炎病毒（VSV)株。在-實施例 中’上述方法利用基因修_之VSV，其在對應於以下位置 之至/者之區域中具有至少一種胺基酸突變： Μ蛋白質之位置119或142處之胺基酸； G蛋白質之位置1〇9、224、438、477或481處之胺基酸；及 L蛋白質之位置2〇5、220或丨450處之胺基酸。 在一實施例中，本文中所述之方法利用具有包含保守或 非保守胺基酸改變之突變的水皰性口炎病毒。在一實施例 中，突變可在VSV Μ蛋白質之位置119或142處或在Μ蛋白 質之位置119及142處。在一實施例中，在μ蛋白質之位置 119處之胺基酸突變為τ—Ν突變，且在Μ蛋白質之位置142 處之胺基酸突變為Ρ->Τ或P—Q突變。 在一實施例中，突變可在VSV G蛋白質之位置1 09、 224、438、477或 481 處，且可分別為 Κ4Ν、Ν—Τ、S—I、 A—V/G —L 或 V—I 突變。 136326.doc 15 200932259 在一實施例中，突變可在vsv L蛋白質之位置2〇5、22〇 或1450處。 在本發明之一實施例中，本文中所述之方法利用vsv 株，其可選自印第安納血清型（ATCC，VR_1238)、新澤西 血清型（ATCC，VR-1239)、伊斯法罕（Isfahan)血清型 (PMID: 192094)、金迪普拉（chandipura)血清型（ATCC，VR_ 476)或其他水皰病毒。 在本發明之一實施例中，本文中所述之方法利用含有編 〇 碼至少一種異源抗原之核酸之VSV株。異源抗原係自選自 由病毒、細菌、原生動物及真菌組成之群之病原微生物獲 得。異源抗原可選自由以下抗原組成之群：人類免疫缺陷 性病毒（HIV)抗原、HTLV抗原、SIV抗原、RSV抗原、PIV 抗原、HSV抗原、CMV抗原、埃巴二氏病毒抗原、水痘_ 帶狀范疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗原、流 感病毒抗原、脊髓灰質炎病毒抗原、鼻病毒抗原、A型肝 炎病毒抗原、B型肝炎病毒抗原、c型肝炎病毒抗原、諾 沃克病毋抗原、披衣病毒抗原、阿爾發病毒抗原、風療病 毋抗原、狂犬病病毒抗原、馬堡病毒抗原、伊波拉病毒抗 原、乳頭狀瘤病毒抗原、多形瘤病毒抗原、間質肺炎病毒 抗原、冠狀病毒抗原、霍亂弧菌抗原、惡性瘧原蟲抗原、 間曰瘧原蟲抗原、卵形瘧原蟲抗原、三日瘧原蟲抗原、諾 氏瘧原蟲抗原、肺炎鏈球菌抗原、釀膿鏈球菌抗原、幽門 螺桿菌抗原、無乳鏈球菌抗原、腦膜炎奈瑟球菌抗原、淋 病奈瑟球菌抗原、白喉棒狀桿菌抗原、破傷風梭菌抗原、 136326.doc -16- 200932259 百曰咳博德特氏菌抗原、嗜血桿菌抗原、衣原體抗原及大 腸桿菌抗原。 在一實施例中，異源抗原包含HIV蛋白質。在一實施例 t，HIV蛋白質藉由選自由纠ge、 tat、vpr、rev及vpw組成之群之基因編碼。在一實施例 中’ HIV蛋白質為HIV gag蛋白質。在一實施例中，mv gag蛋白質在位置165、270、329或348處具有至少一種突 變。 在一實施例中，在HIV gag蛋白質之位置165、270、329 或348處之胺基酸突變分別為s —g、L—S、D—N或T—K。 【實施方式】 在把述本方法及治療方法之前，應瞭解本發明不限於所 述特定方法及實驗條件’因為該等方法及條件可變化。亦 應瞭解本文中使用之術語係僅出於描述特定實施例之目的 且並非意欲限制。 除非上下文另外明確指定，否則如本說明書及附加申請 專利範圍中所使用之單數形式”一”及"該"包括複數個提及 物。因此，舉例而言，對"該方法”之提及包括一或多種方 法’及/或本文中所述及/或將對熟習此項技術者而言在閱 讀本揭示案之後變得明顯之類型的步驟等等。 因此，在本申請案中，可使用此項技術中之習知分子生 物學、微生物學及技術。該等技術完全說明於文 獻中。參見（例如），Sambrook，Fritsch & Maniatis， M〇/㈣/ar C/_U 猶⑽少施⑽α/，第2版（1989) 136326.doc 17 200932259
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York(本文中"Sambrook等人，1989”）； DAU d iVaciz’ca/ Jpproac/7，第 I 及 II 卷（D.N. Glover 編 1985); iSywi/zeWMM.J. Gait編 1984); iVMc/eic Jc/iZ Hybridization(B.O. Hames & S.J. Higgins 編（1985)); Transcription And Translation^.Ώ. Hames & S.J. Higgins 編（1984)) ; CW/ CM/iwre(R.I. Freshney編（1986));
Immobilized Cells And Enzymes(lKL Press, (1986)) ； B. Pcrbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984) F.M. Ausubel 等人（編），Cwrrewi /Voioco/j ζ·« Mo/eew/ar
John Wiley & Sons, Inc. (1994)。 儘管與本文中所述之彼等方法及材料相似或相等之任何 方法及材料可用於實踐或測試本發明，但是現描述較佳方 法及材料。本文中提及之所有公開案均以引用之方式全部 併入0 定義 本文中使用之術語具有熟習此項技術者認識及已知之含 義，然而，為方便及完全起見，下文陳述特定術語及其含 義。 術語"約"意謂在20%之内、較佳在1〇%之内且更佳在5% 之内。 術浯”佐劑’’係指增強對抗原之免疫反應之化合物或混合 物。佐劑可用作緩慢釋放抗原之組織儲存物且亦用作非特 異性增強免疫反應之淋巴系統活化劑（Hood等人， 136326.doc -18- 200932259
Immunology，第 2版，1984, Benjamin/Cummings: Menlo Park，California，第384頁）。視環境而定，在佐劑不存在 時單獨用抗原之初級攻毒可未能引起足夠的體液或細胞免 疫反應。已展示大量細胞激素或淋巴介質具有免疫調節活 性，且因此適用作佐劑，該等細胞激素或淋巴介質包括 (但不限於）介白素卜α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、 12(參見（例如）美國專利第5,723，127號）、13、14、15、 16、17及18(及其突變體形式）；干擾素-α、β及γ ;粒細胞-〇 巨噬細胞群落刺激因子（GM-CSF)(參見（例如）美國專利第 5,078,996號及ATCC寄存編號39900);巨噬細胞群落刺激 因子（M-CSF);粒細胞群落刺激因子（G-CSF);及腫瘤壞死 因子α及β。適於與本文中所述之免疫原性組合物一起使用 之其他佐劑包括趨化因子，其包括（而不限於）MCP-1、 ΜΙΡ-1α、MIP-Ιβ及RANTES ;黏著分子，諸如選擇素，例 如L-選擇素、Ρ-選擇素及Ε-選擇素；類黏液素分子，例如 CD34、GlyCAM-Ι及MadCAM-Ι ;整合素家族之成員，諸 ® 如LFA-1、VLA-1、Mac-Ι及ρ150·95 ;免疫球蛋白總科之 成員，諸如 PECAM、ICAM(例如 ICAM-1、ICAM-2 及 ICAM-3)、CD2及LFA-3 ;協同刺激分子，諸如CD40及 CD40L ;生長因子，包括血管生長因子、神經生長因子、 纖維母細胞生長因子、表皮生長因子、Β7.2、PDGF、BL-1及血管内皮生長因子；受體分子，包括Fas、TNF受體、 Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、 AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、 136326.doc -19· 200932259 TRICK2及DR6 ;及卡斯蛋白酶（ICE)。 用於增強免疫反應之適合佐劑另外包括（而不限 於）MPL™(3-0-去醯基化單磷醯基脂質A，Corixa，Hamilton， MT) ’其描述於美國專利第4,912,094號中。亦適於用作佐 劑的為合成脂質A類似物或胺基烷基葡糖胺磷酸酯化合物 (AGP)或其衍生物或類似物，其可購自c〇rixa(Hamilton， MT)且描述於美國專利第6，113,918號中。一種該AGP為2-[(R)-3-十四醯基氧基十四醯基胺基]乙基2-脫氧-4-0-膦酸 〇 基- 3-0-[(R)-3 -十四醯基氧基十四醢基]-2-[(R)-3 -十四醯基 氧基十四醯基-胺基]-b-D-葡萄旅喃糖苦，其亦稱為529(以 前稱為RC529)。該529佐劑係調配為水溶液形式（AF)或調 配為穩定乳液（SE)。 其他佐劑包括胞壁醯基肽，諸如N-乙醯基-胞壁醯基-L-蘇胺醯基-D-異麩醯胺酸（thr-MDP)、N-乙醯基-降胞壁醯 基-L-丙胺酸-2-(Γ-2·二軟脂醯基-sn-丙三氧基-3-羥基磷酿 基氧基）-乙胺（MTP-PE);水包油乳液，諸如MF59(國際 ® PCT公開案第WO 90/14837號）（含有5%角鯊烯、0.5% Tween 80及0.5% Span 85(視需要含有各種量之MTP-PE)， 其使用諸如110Y型微流化器（Microfluidics，Newton，MA) 之微流化器調配成次微米級粒子），及SAF(含有1 0%角鯊 烯、0.4°/。Tween 80、5%普流尼克（pluronic)嵌段共聚物 L121及thr-MDP，其微流化成次微米級乳液或渦旋以產生 較大粒徑乳液）；佛氏不完全佐劑（incomplete Freund's adjuvant ’ IFA);鋁鹽（礬），諸如氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸 136326.doc -20» 200932259 銘；愛菲金（Amphigen);阿夫立定（Avridine) ; L121/角鯊 烯；D-交酯-聚交酯/苷；普流尼克多元醇；殺死之博德氏 桿菌；皂苷，諸如美國專利第5,057,540號中所述之 StimulonTM QS-21(Antigenics, Framingham, MA.)、美國專 利第 5,254,339 號中所述之 ISCOMATRIX(CSL Limited, Parkville, Australia)及免疫刺激複合物（ISCOMS);結核分 枝桿菌;細菌脂多聽；合成 聚核_酸，諸如含有CpG基元之寡核苷酸（例如美國專利第 〇 6,207,646號）；歐洲專利第1，296,713及1，326,634號中所述 之 1C-3 1 (Intercell AG、Vienna、Austria);百日咳毒素（PT) 或其突變體、霍亂毒素或其突變體（例如國際PCT公開案第 WO 00/18434、WO 02/098368 及 WO 02/098369號）；或大 腸桿菌熱不穩定毒素（LT)，尤其為LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129;參見（例如）國際PCT公開案第WO 93/13302及 WO 92/19265號。 術語”抗原"係指可在動物中刺激抗體或T細胞反應或兩 〇 者之生產之化合物、組合物或免疫原性物質，包括注射或 吸收至動物中之組合物。可對整個分子或對分子之部分 (例如抗原決定基或半抗原）產生免疫反應。術語可用於指 個別巨分子或抗原巨分子之同源或異源群體。抗原與具有 特異體液及/或細胞免疫性之產物反應。術語"抗原"廣泛涵 蓋包括蛋白質、多肽、抗原蛋白質片段、核酸、募醣、多 醣、有機或無機化學物質或組合物及其類似物之部分。術 語"抗原”包括所有相關之抗原性抗原決定基。給定抗原之 136326.doc -21 - 200932259 抗原決定基可使用此項技術熟知之許多抗原決定基定位技 術來識別。參見（例如），Epitope Mapping Protocols in
Methods in Molecular Biology，第 66 卷（Glenn E. Morris 編，1996)Humana Press，Totowa，N. J。舉例而言，直鏈抗 原決定基可藉由（例如）同時於固體支樓物上合成大量肽、 對應於蛋白質分子之部分之肽且肽仍與支撐物連接的同時 使該等肽與抗體反應來測定*該等技術在此項技術中已知 且描述於（例如）美國專利第4,708,871號；Geysen等人 o ❹ (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002 ； Geysen 等人（19 86) Molec· Immunol. 23:709-715 中，其全部以引用 之方式全部併入本文。同樣地，構形抗原決定基容易藉由 測定胺基酸之空間構形來識別，諸如藉由（例如）χ_射線結 晶學及2維核磁共振來識別。參見（例如）， MaPPingProtoc〇is，同上。此外，出於本發明之目的，”抗 原"亦可用以指包括對原生序列之諸如缺失、添加及取代 (通常本質上為保守的’但其可為非保守的)之修飾的蛋白 質，只要§亥蛋白質維持引起免疫反應之能力即可。該等修 飾可為故意的，如經由定位突變或經由特定合成程序，或 經由基因工程化方法’或可為偶然的，諸如經由產生抗原 之宿主之突變。此外’抗原可自任何病毒、細菌、寄生 2原^動物或真菌衍生或獲得’且可為完整有機體。同 ’（諸如)在核酸免疫應用中表現抗原之 核苷酸亦將包括在兮定甘暇或聚 原決定Λ = 亦包括合成抗原，例如多抗 疋基、側接抗原決定基及其他重組或合成衍生之抗原 136326.doc -22- 200932259 (Bergmann 等人（1993) Eur. J. Immunol. 23:2777 2781 ;
Bergmann 等人（1996) J. Immunol. 157:3242 3249 ;
Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75:402 408 · Gardner 等人（1998)第 12 屆世界 AIDS 會議，Geneva， Switzerland, 1998年 6 月 28 曰 7 月 3 曰）。 術語"減毒"係指病原體株，其病原性已降低以便其將引 發免疫反應而不產生特定疾病。病毒之減毒株比該株自其 衍生之親本株毒性更低。使用習知方式以引入減毒突變來 〇 產生修飾病毒，諸如使用於細胞培養物中之病毒生長期間 之化學突變（已向該等細胞培養物添加化學突變劑）。引入 減毒突變之替代方式包含使用定位突變製造預定突變。可 引入一或多種突變。隨後就其在細胞培養物及/或在動物 模型中之生物活性之減毒而言來筛選該等病毒。若存在所 援救病毒之減毒表型，則可用適當動物模型進行攻毒實 驗。非人類靈長類動物可用作人類疾病之發病機制之適當 動物模型。首先用減毒、重組產生之病毒將該等靈長類動 ❹ 物免疫，然後用病毒之野生型形式來攻毒。 如本文使用之術語"細胞”、”宿主細胞"、”細胞培養物” 及其類似物意欲包括任何個別細胞或細胞培養物，其可為 或已成為病毒、载體或併入外源核酸分子、聚核苷酸及/ 或蛋白質之受體。亦意欲包括單一細胞之後代。然而，由 於天然、偶然或故意之突變，後代可不必與原始母細胞完 全一致（在形態學或在基因組或總DNA互補序列上）。細胞 較佳為真核的’但可為原核的且包括（但不限於）細菌細 136326.doc •23- 200932259 胞、酵母細胞、動物細胞及哺乳動物細胞（例如鼠類、大 鼠、猴或人類）。 ❹ ❹ 如本文使用之術語"澄清"係指病毒純化之早期步驟，藉 以在用本發明之病毒感染細胞或細胞培養物後移除細胞及 細胞碎片。舉例而言，病毒純化之早期步驟包括使用諸如 低速離心（S10,000 RPM)或過濾之方法"澄清”細胞培養基以 移除細胞碎片。隨後使用熟習此項技術者已知之方法分離 及純化存在於上清液中之病毒，該等方法諸如經由薦糖塾 之高速離心（例如100,oooxg)或經由離子交換管柱之分離 (諸如美國專利公開案200702490丨9中所述之彼分離卜刀 在本揭示案中應注意，諸如”包含”、，，含有,,及其類似術 §吾之術語可具有在美國專利法中歸屬於其之含義；例如， 其可意謂”包括”及其類似術語。諸如”本質上由·.組成”之 術語具有在美國專利法中歸屬於其之含義，例如，其允許 包括不減損本發明之新㈣基本特徵之額外成份或步驟， Π成=咸損本發明之新穎或基本特徵之額外未經敍 述的成m步驟，且其㈣ 此項技術中之文件或不文中引用之 獻）之成份或步驟，尤1本太二式併入本文中之參考文 _ 尤其當本文件之目標為定義相對於去 ^支術（例如相對於本文中用或以引用本 件)可獲專利(例如為新穎、不明顯、發 施例的時候更是如此。且，術語”由·..組成"： 利法中歸屬於其之令 、有在美國專 ended) 〇 3義’即，該等術語為封閉式的⑷。sed 136326.doc -24· 200932259 "保守胺基酸取代’'係指蛋白質之胺基酸殘基之一或多者 經具有相似物理及/或化學性質之其他胺基酸殘基的取 代。用於序列内之胺基酸之取代物可選自胺基酸所屬種類 之其他成員。舉例而言，非極性（疏水性）胺基酸包括丙胺 酸、白胺酸、異白胺酸、纈胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、色 胺酸及曱硫胺酸。含有芳族環結構之胺基酸為苯丙胺酸、 色胺酸及胳胺酸。極性中性胺基酸包括甘胺酸、絲胺酸、 蘇胺酸、半胱胺酸、酪胺酸、天冬醯胺酸及麩醯胺酸。帶 Ο 正電（鹼性）胺基酸包括精胺酸、離胺酸及組胺酸。帶負電 (酸性）胺基酸包括天冬胺酸及麵胺酸。不希望該等改變影 響如藉由聚丙烯醯胺凝膠電泳或等電點所測定之表觀分子 量。尤其較佳取代為：Lys取代Arg及反之亦然以便可維持 正電荷；Glu取代Asp及反之亦然以便可維持負電荷；Ser 取代Thr以便可維持游離__〇H ;且取代Asn以便可維持 游離NH2。 ❹ 術語”培養液”、"細胞培養物液體"、"細胞培養基"、，，培 養基及/或生物反應器液體”可交替使用，且係指細胞培 養物於其中生長之培養基或溶液。 "藉由…編碼"或”編碼”係指編碼多肽序列之核酸序列， 八中多肽序列含有具有至少3至5個胺基酸、更佳至少8至 個胺基且甚至更佳1少15至2〇個胺基酸之胺基酸序 歹J，多肽藉由核酸序列編碼。亦涵蓋多肽序列，其可用藉 由該序列編喝之多肽免疫識別。因此，抗原"多肽"、"蛋 白質或"胺基酸”序列可且古访 斤夕』Ί八有與抗原之多肽或胺基酸序列 136326.doc -25- 200932259 至少70%相似性、較佳至少約80%相似性、更佳約90-95% 相似性且最佳約99%相似性。 "片段"係指包含具有母體蛋白質或多肽之胺基酸序列之 至少4個胺基酸殘基（較佳至少1〇個胺基酸殘基、至少15個 胺基酸殘基、至少20個胺基酸殘基、至少25個胺基酸殘 基、至少40個胺基酸殘基、至少50個胺基酸殘基、至少60 個胺基殘基、至少70個胺基酸殘基、至少80個胺基酸殘 基、至少90個胺基酸殘基、至少100個胺基酸殘基、至少 〇 125個胺基酸殘基或至少150個胺基酸殘基）的胺基酸序列 之蛋白質或多肽，或包含具有母體核酸之核苷酸序列之至 少10個鹼基對（較佳至少20個鹼基對、至少30個鹼基對、 至少40個鹼基對、至少50個鹼基對、至少50個鹼基對、至 少100個鹼基對、至少200個鹼基對）的核苷酸序列之核 酸。任何給定片段可或可不擁有母體核酸或蛋白質或多肽 之功能活性。 ❹ 如本發明之上下文中所用之"基因，，為基因功能與其相關 之核酸分子（染色體、質體等）中的核苷酸之序列。基因為 (例如）有機體之遺傳單位，其包含佔據有機體之基因組内 之特疋物理位置（"基因座（gene 1〇(：118或genetic 1〇eus)")的聚 核苦酸序列（例如哺乳動物之dna序歹)。《因可編碼諸如 多肽或聚核苷酸（例如tRNA)之所表現之產物。或者，基因 可界定用於諸如蛋白質及/或核酸之結合之特定事件/功能 的基因組位置（例如嗤菌體連接位點），其中基因不編碼所 表見之產物。通常，基因包括諸如多肽編碼序列之編石馬序 136326.doc -26- 200932259 列，及諸如啟動子序列、聚腺皆酸化序列、轉錄調節序列 (例如強化子序列)之非編碼序列。許多真核基因具有藉由 ，，内含子（非編碼序列）”中斷之"外顯子"（編碼序列）。在^些 狀況下，基因可與另一基因（例如重疊基因）共用序列1 語"基因”可或可不包括諸如啟動子序列之調節黯序列， 其決疋（例如）基因在其下表現之條件。不為結構基因之一 些基因可自DNA轉錄至RNA，但不轉譯至胺基酸序列中。 其他基因可起結構基因之調節劑的作用或起DNA轉錄之調 ❹ 節劑的作用。 如本文中所定義，術語，，基因洗牌（shuffUng)"、"經洗牌 基因，，、”經洗牌，，、，，洗牌”、，，基因重排"及，，基因易位"可交 替使用且係指野生型vsv基因組之順序之改變（突變）。如 本文中所定義，野生型VSV基因組具有以下基因順序：3,_ NPMGL-5'。 術語"基因修飾的"通常係指藉由熟習此項技術者已知之 © 任何方式將一或多種突變引入病毒基因組中。然而，雖然 =些”基因修飾”可藉由特定缺失、插人或取代或藉由使用 標準遺傳工程化技術將遺傳物質轉移至病毒基因組中來進 订’本發明之VSV基因組之某些遺傳修飾藉由減毒vsv在 低病毒感染倍率下之連續傳代來發生。在低MOI下之該連 續傳代產生遍及病毒基因組之大量核苦酸取代之進行性增 力且亦產生vsv蛋白質中之胺基酸取代^該等"基因修飾” 之VSV粒子展示為適宜於在細胞中增加生長，但在神經毒 性之J動物模型中無增加的神經病變。在本發明中，"低 136326.doc •27- 200932259 傳代病毒|·、"傳代〇，，或”p〇 示用作太# nB 原始病毒可交替使用且表 不用作本發明之基因修 rvSVN4CTlgagl病主。/一飾之病毒的起始物質之 運作中，咳等者言：紅一些狀況下，尤其在生物反應器 病毒。”高傳代病毒”、”傳===經傳代1至3次之 ”適應組織培養之病毒"或!=胞J飾之， 又k應細胞之病I ”可交替使用且 表不已傳代5次以上，通常5至25次，較佳15次之病毒。 如本文使用之術語"生長"係指病毒在各種種類之細胞中 之活體外繁殖。在實驗室中’病毒在細胞中之生長涉及用 病毒接種、.田胞，接著培養以允許病毒產生，且隨後收獲含 有病毒之細胞培養基。經病毒感染之細胞通常在培養容器 (諸如用於黏著細胞之燒瓶或盤或用於呈懸#液之細胞之 不斷移動的瓶子或燒瓶）内之生長培養基中生長且以恆定
姐度、濕度及氣體組成在細胞恆溫箱中維持培養物。然 而培養條件可視細胞類型而變化且可經改變以誘導細胞 中之改變或支持或增強藉由細胞之病毒產生。 如本文使用之術語”收穫"係指在用本文中所述之任何病 毒株或血清型感染細胞或細胞株後’收集細胞或細胞培養 基以準備分離及純化病毒。 術語"異源"係指在病毒或細胞中不天然存在之元件之組 合。舉例而言’異源DNA係指不天然位於細胞中或細胞之 染色體位點中之DNA。異源DNA可包括對細胞而言外來之 基因。如本文使用之術語”異源抗原"為在核酸序列中編碼 之抗原，其中抗原不來自有機體或不在其正常位置中或以 136326.doc -28- 200932259 其原生形式來編碼。異源表現調節元件為與不同於其在自 然界中可操作締合之基因的基因可操作締合之元件。 術語"免疫原性組合物”涉及含有例如微生物之抗原之任 何醫藥組合物，該組合物可用於在哺乳動物中引起免疫反 應。免疫反應可包括丁細胞反應、B細胞反應或τ細胞及B 細胞反應。組合物可用於藉由在細胞表面呈現與MHC分子 締合之抗原將哺乳動物敏化。另外，可產生抗原特異丁_淋 巴細胞或抗體以允許經免疫宿主之未來保護。"免疫原性 © 組合物"可含有包含完整微生物或得自其之免疫原性部分 之活的、減毒或經殺死/失活調配物，該完整微生物或得 自其之免疫原性部分誘導細胞介導（T細胞）免疫反應或抗 體介導（B細胞）免疫反應或兩者，且可保護動物避免與藉 由微生物之感染相關之一或多種症狀，或可保護動物避免 由於用微生物感染之死亡。 如本文使用之”免疫有效量”或”免疫原性有效量”係指如 藉由熟習此項技術者已知之標準檢定所量測，足以引起免 ® 疫反應（細胞（T細胞）或體液（B細胞或抗體）反應）之抗原或 調配物之量。舉例而言’關於本發明，"免疫有效量”為 乏5.0至7.0 Logl0pfu/mL之最小保護劑量（效價）。抗原作為 免疫原之有效性可藉由增殖檢定、藉由細胞溶解檢定（諸 如量測T細胞溶解其特定標靶細胞之能力之鉻釋放檢定）戈 藉由量測B細胞活性水準，藉由量測血清中對抗原特異之 循環抗體之含量來量測。此外，免疫反應之保護水準可藉 由用已注射之抗原將經免疫宿主攻毒來量測》舉例而t , 136326.doc -29- 200932259 右'需要對其 > &、虎c： rfc "、 、免疫反應之抗原為病毒或腫瘤細胞，則藉由 免疫有效量”之抗原誘導之保護水準係藉由在動物之病 菌原生動物或真菌攻毒後，债測存活百分比或死 亡百分比來量測。 ❹ ❹ 術經分離"或”經純化Η意謂將物質自其原始環境（例 如，若其天然存在，則為自然環境）移除。舉例而言，"經 2或k純化，，之肽或蛋白質大體上不含來自細胞或組 織來源（該蛋白質係自其得到）之細胞物質或其他污染蛋白 質，或當化學合成時大體上不含化學前驅物或其他化學物 質。在本發明中，病毒係自經感染細胞或自細胞碎片分離 或純化’以便其以適用於製造免疫原性組合物之形式來提 供。語言，’大體上不含細胞物質"包括病毒或多狀/蛋白質之 製劑’其中病毒或多肽/蛋白質與該病毒或該多肽/蛋白質 自其刀離或重組產生之細胞之細胞組分分離。因此，大體 上不含細胞物質之病毒或多肽/蛋白質包括具有小於約 3〇%、2〇%、10%、5%、2 5%或1%(以乾重計）之污染蛋白 質之病毒或多肽/蛋白質之製齊卜當重組產生病毒或多肽/ 蛋白質時，其亦較佳大體上不含培養基亦即，培 蛋白質製劑之體積之約2G%、1G%、5%、1%、Q5%或^% 以下。當藉由化學合成產生多肽/蛋白質時，其較佳大體 上不含化學前驅物或其他化學物質’亦即，其與涉及蛋白 質之合成之化學前驅物或其他化學物質分離。因此，多肽/ 蛋白質之該等製劑具㈣於約3G%、㈣、⑽、外（以乾 重計)之不同於所關注多肽/蛋白質片段之化學前驅物或： 136326.doc •30· 200932259 合物。"經分離”或”經純化，，核酸分子為與存在於核酸分子 之天然來源中之其他核酸分子分離的核酸分子。此外，諸 如cDNA分子或RNA分子之”經分離”核酸分子可在藉由重 組技術產生時大體上不含其他細胞物質或培養基，或在化 學合成時大體上不含化學前驅物或其他化學物質。 術語”感染倍率（multiplicity of infection)"或"MOI”係指 感染單一細胞之病毒粒子之平均數。"M0I"藉由將病毒空 斑形成單位（PFU)總數除以經感染之細胞總數來計算。 〇 如下文所定義，術語"突變種類，，或"突變之種類”可交替 地使用且在單獨使用時係指將VSV減毒之此項技術中已知 之突變。舉例而言，本發明之，，突變種類”包括（但不限 於）VSV溫度敏感N基因突變（下文為，'N⑻”）、溫度敏感L基 因突變（下文為"L⑻”）、點突變、G柄突變（下文為 ”G(stem>")、非細胞病變河基因突變（下文為"、基因 洗牌或重排突變、截斷〇基因突變（下文為，，G⑻"）、雙義 RNA突變、G基因插入突變、基因缺失突變及其類似突 變。如下文所定義，”突變"包括此項技術中已知之突變， 如插入、缺失、取代、基因重排或洗牌修飾。 "非保守胺基酸取代”係指使用上文所定義之特徵，蛋白 貝之胺基酸殘基之一或多者經具有不同物理及/或化學性 質之其他胺基酸殘基的取代。 如本文中所使用，短語，，核酸”或，，核酸分子„係指DNA、 RNA以及DNA及RNA之已知驗基類似物之任何類似物或自 其成形之嵌合體.因此，”核酸"或"核酸分子，，係指核苷（腺 136326.doc -31 · 200932259 砮、鳥苦、尿苦或胞喂咬核普；"RNA分子"）或去氧核糖核 苷（去氧腺苷、去氧烏苷、去氧胸苷或去氧胞喷咬核苷，· "DNA分子"）之磷酸酯聚合形式，其呈單鏈形式或雙鏈螺 旋體。雙鏈DNA-DNA、DNA_RNAmRNA螺旋為可能 的。術語核酸分子且尤其DNA或RNA分子僅係指分子之一 級及二級結構，且不將其限制於任何特定三級形式。因 此’該術語包括尤其見於直鏈或環狀魏分子（例如限制
片段）、f體及$色體中之雙鏈舰。纟討論特定雙鍵 DNA分子之結構中，本文中序列可根據僅在沿舰之未經 轉錄鍵（亦即，具有知囊同源之序列的鍵）之5N至抓方 向上給出序列的常識而描述。”重組職分子”為已經歷分 子生物學操作之DNA分子。 術語，•病原性的"係指諸如細菌或病毒之任何感染劑引起 疾病之能力。”非病原性"微生物係指缺乏微生物之"病原 性"株之引起疾病的特徵之微生物。 術6吾醫藥學上可接受之載査丨，，音$ #丄 〈戰劑思、谓精由聯邦管理機構、 州政府或其他管理機構批准 t * 乂幻於美國樂典中或適用於動 物（包括人類以及非人類喵多 由认m _動物）之其他—般公認之藥典 中的載劑。術語”載劑”係指 θ兴诸樂組合物一起投與之稀釋 劑、佐劑、職形劑或媒 ^ , . R 醫樂載劑可為無菌液體， 諸如水及油，包括石油、 等者，諸如花生％ * 或合成來源之彼 物允油、礦物油、芝麻油及其類似 物。當靜脈内投與醫藥組合 ^ ^ X* . 吁水為較佳载劑。鹽水溶 液及右％糖水溶液及甘油 π 了用作液體載剤，尤其用 136326.doc -32. 200932259 於可注射溶液。適合醫藥賦形劑包括澱粉、葡萄糖、乳 糖、蔗糖、明膠、麥芽糖、稻米、麵粉、白堊、矽膠、硬 脂酸納、單硬脂酸甘油酯、滑石、氣化鈉、脫脂奶粉、甘 油、丙二醇、水、乙醇及其類似物。需要時，組合物亦可 含有少量濕潤劑或乳化劑或pH值緩衝液。該等組合物可採 取溶液、懸浮液、乳液、錠劑、丸劑、膠囊、粉末、持續 釋放調配物及其類似物之形式。可將組合物與傳統黏合劑 及載劑（諸如甘油三酯）一起調配為栓劑。口服調配物可包 括標準載劑，諸如醫藥級甘露糖醇、乳糖、澱粉、硬脂酸 鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。適合醫藥載劑之實例描 述於E. W_ Martin之"Remington's Pharmaceutical Sciences" 中。調配物應適合投藥模式。
術語”空斑”或”病毒空斑"係指細胞培養物之不透明層中 溶解細胞之透明、通常圓形斑片。”空斑形成單位，，或 "PFU”係指每單位體積感染性病毒粒子之平均數1例而 言，若病毒溶液具有100 PFU/ml，則其意謂每毫升該病毒 溶液具有100個可各形成空斑之病毒粒子。pFu/mi為表示 空斑形成病毒製劑之濃度之習知方式。然而，咖通常可 與”感染單位"或|·ΐυ"交替使用，曰志_广主制 甘风用且表不病毒製劑中之感染 性病毒之單位。 ’' 術語"保護’’係指藉由誘導對特W之免疫反應來防 護（例如）哺乳動物避免感染或疾病。該保護通常在用免疫 :性組合物處理哺乳動物後達到。所提供之保護無需為絕 對的，亦即，若舆哺乳動物之對照群體(例如未投愈免疫 136326.doc -33· 200932259 原性組合物之感染動物）相比在統計上顯著改良，則無需 完全預防或根除感染。保護可藉由減輕感染症狀之嚴重性 或發作速度來達到。 術語"蛋白質"、"多肽"及"肽，，係指胺基酸殘基之聚合 物’且不限於產物之最小長度。因此’肽、募狀、_ 體、多聚體及其類似物包括在定義内。全長蛋白質及其片 #又為該定義所涵蓋。該術語亦包括對原序列之修飾，諸如 缺失、添加及取代（通常本質上為保守的，但可為非保守 © 的），較佳使蛋白質維持在投與蛋白質之動物體内引發免 疫反應之能力。亦包括表現後修飾，例如糖基化、乙酿 化、磷酸化及其類似作用。術語"胺基酸"係指天然及/或非 天然或合成胺基酸（包括D或L光學異構體）及胺基酸類似 物。熟習此項技術者已知用於各天然胺基酸之一字母及三 字母編碼。 產生重組RN A病毒之方法在此項技術稱為"援救”或"逆 〇 轉遺傳，，方法。用於VSV之示範性援救方法描述於美國專 利M33,886、美國專利 6,596,529 及 WO 2004/1 13517 中，
其各自以引用之方式併入本文。負義、單鏈、非分段RNA 病毒基因組之轉錄及複製經由對核糖核蛋白核心（核殼）作 用之多聚蛋白質複合物之酶促活性達到。裸基因組RN A不 可用作模板。取而代之，該等基因組序列僅當其藉由^^蛋 白質完全殼體化至核殼結構中時得以識別。僅在彼情況下 識别基因組及反基因組未端啟動子序列以啓始轉錄或複製 路徑。 136326.doc -34- 200932259 如下文所疋義，術語”協同”減毒係指大於相加之vsv減 毒水準。舉例而·τ，根據本發明之vsv之協同減毒包含在 同一 VSV基因組中組合至少兩種類型之突變，進而產生比 對各V S V突變種類單獨觀察到之相加減毒水準大更多之 VSV病原性降低。因此，在某些實施例中，vsv之協同減 毒疋義為至少大於對各突變種類單獨觀察到之相加減毒水 準（亦即，兩種突變種類之總和）其中減毒水準（亦 即，LD5〇)係在小動物神經毒性模型中測定。vsv之協同 © 減毒之實例描述於WO 2005/098009(其以引用之方式併入 本文）中。 如下文所定義之vsv ”溫度敏感"突變為限制在非 許可溫度下之vsv生長之vsv基因組的突變。舉例而言， 本發明之VSV ts突變體通常在許可溫度（例如3rc)下生長 且達到间效價，但其在非許可溫度（例如371或39。0下之 生長或繁殖受限制。 “術語"免疫原性組合物"係指在動物中誘導免疫反應之醫 藥組合物。免疫原性組合物可保護動物避免由於感染之疾 病或可能的死亡，且可或可不包括增強活性組分之免疫活 性之一或多種額外組分。免疫原性組合物可另外包含對免 疫原性組合物而言典型之其他組分，包括（例如）佐劑或免 疫調節劑。免疫原性組合物之免疫原性活性組分可包含呈 其原始形式或呈減毒有機體之完整活有機體，或在經殺死 或失活免疫原性組合物，或包含病毒之一或多種免疫原性 組分之子單元免疫原性組合物，或藉由熟習此項技術者已 136326.doc -35- 200932259 方法製備之基因工程化、經突變或選殖免疫原性組合 物中藉由適當方法失活之有機體。免疫原性組合物可包含 上述元件之一或（同時）一種以上者。 一般描述 根據本發明，提供藉由在低病毒感染倍率（MOI)下，在 V e r 〇細胞或在任何敏感細胞基質中連續傳代使高度減毒之 重、·且V S V適應組織培養條件的方法。多次連續傳代方法產 生特徵為遍及病毒基因組之大量核苷酸取代之進行性增加 ® 的基因型改變。大多數該等核苷酸取代產生VSV蛋白質中 之胺基酸（AA)取代。該方法產生病毒之表型適應，伴隨病 毋產率之實質改良。持續Vero細胞中之傳代直至達到基因 型及表型穩定性，通常在1〇至15次連續傳代（Ρΐ〇_ρι5)中達 到超過P15之病毒之進一步傳代展示很少的額外取代或 不展不額外取代且不產生病毒產率之進一步提高。該方法 產生製造產率之實質改良以及增強之製造一致性。當在高 度敏感小鼠顧内NV動物模型中測試時，適應性突變大體 上不影響所傳代病毒之神經毒性（NV)。 根據美國專利公開案第2〇〇7/〇218〇78A1號，產生表現 HIV-1 gag基因之高度減毒之vSv載體，即rVSVN4CTl_ gagl ’其藉由將3種病毒減毒方法組合來製得：將HIV_ i gag基因插入基因組之第一位置（gagl)中進而使所有vsv 基因自3’-啟動子移位—個位置，使vsv \基因易位至第四 位置（N4)且使用其細胞質尾部截斷至1個胺基酸（CT1)i VSV G(Schnell 等人 The emBO Journal 17:1289-1296, 136326.doc •36- 200932259 1998)。與原型rVsv相比，該載體顯示如藉由更小空斑表 型、在細胞培養物中之延遲之生長動力學及大大降低之峰 效價所表徵之活體外減毒之顯著增加。當在高度敏感鼠類 顱内（1C)動物模型中測試時，顯示相似之減毒模式，其展 示原型vsv與減毒vsv之間的許多個數量級之ld5〇差異 (Cooper等人，j· vir〇1〇gy，82:207-229，2008)。另外，與 原型VSV相比，減毒病毒在非人類靈長類動物十顯示最小 限度至不可偵測之神經病變。儘管該載體在小鼠及獼猴中 © 誘導可與用原型載體獲得之彼等反應相當之有效免疫反 應，但是其在細胞培養物中複製不良，使其對按比例放大 及製造而言次最佳。 基於促進臨床前安全性及免疫原性概況，該載體將製得 用於在人類中測試之有前途候選載體。對在人類中測試該 載體為關鍵之2個因素為上述3種減毒突變之穩定性及增加 的製造產率。在當前研究中，進行由在Ver。細胞中連續傳
符續適應。P1 5後，未見病毒產率之進 代病毒之生長動力學之結果指示， F固定。另外，傳代病 病毒產率直至P15之進 t示病毒對Vero細胞之 二進一步提高。來自傳 對P15病毒而言之病毒 136326.doc -37- 200932259 產率比用PO獲得之彼產率高5至loo倍（參見圖3_6)。 因此’本發明證明P1 5病毒顯示基因型及表型穩定性且 生長至適於臨床試驗物質之大規模製造之水準，該臨床試 驗物質適於毒物學及臨床評估。 用於VSV之生長/繁殖之適合細胞 用於在本發明中使用之適合宿主細胞能夠支持基因修飾 之減毒VSV之生產性感染，且將允許必需載體及其對支持 病毒產生所必需之編碼產物之表現。適用於本發明之方法 © 之宿主細胞的實例包括（但不限於）Vero細胞、幼倉鼠腎細 胞（BHK)及人類胚腎（HEK)細胞（諸如293細胞）。對用本文 中所述之基因修飾之減毒VSV株或血清型的感染敏感之任 何其他細胞可用於本發明之方法。
在哺乳動物細胞培養物中產生v s V 在哺乳動物細胞培養物中產生VSV為熟習此項技術者熟 知，且通常包括用VSV感染細胞培養物（宿主細胞），使 VSV在細胞培養物中生長且在適當時間收穫細胞培養物。 因為VSV自宿主細胞分泌至培養基中，所以自細胞培養物 液體收集VSV產物。 自哺乳動物細胞培養物產生VSV使用此項技術中已知之 用於繁瘦（或生長）VSV之適合哺乳動物細胞培養物。該等 細胞培養物包括（但不限於）人類胚腎（HEK)細胞（諸如HEK 293細胞）、非洲綠猴腎（AGMK)細胞（諸如Vero細胞）、中國 倉鼠印巢（CHO)細胞及幼倉鼠腎(Bhk)細胞。 另外’細胞培養物物質、方法及技術為熟習此項技術者 136326.doc -38- 200932259 熟知。舉例而言’重組VS V種子儲料係用以在生物反應器 中’在給定病毒感染倍率下感染長滿宿主細胞群體或在特 定密度下之宿主細胞群體（例如Vero細胞培養物）；使VSV 在細胞培養物中生長給定時間及溫度；且在細胞培養物液 體中收穫初生VSV後代。如下文所定義，術語"培養液”、 "細胞培養物液體”、"細胞培養基"、"培養基"及/或"生物 反應器液體"可交替使用，且係指細胞培養物於其中生長 之培養基或溶液。
Ο 自哺乳動物細胞培養物純化VSV 用於自經VSV感染之哺乳動物細胞培養物之細胞培養物 液體純化VSV的方法通常為熟習此項技術者已知。舉例而 言’如Miller 等人（Protein Expression and Purification，第 33卷，第1期，2004年1月，第92-103頁）中所述’可收集含 有病毒之培養物上清液且使其經受低速離心（例如l〇〇〇Xg) 以移除細胞及碎片，接著在2〇%蔗糖墊上高速離心（例如 100,000xg)以移除病毒。 用於自細胞培養物純化VSV之另一方法描述於美國專利 公開案2007/02490 19中。簡言之，該程序包括以下步驟： (a)初級澄清、（b)二級澄清、（e)陰離子交換膜吸附、（d)切 向流過濾及（e)過濾。更特定言之，該等步驟包含（a)藉由 低速離心澄清細胞培養物液體，（b)藉由經由〇2至〇45微 米過濾、器之過滤進-步澄清上清液，⑷在陰離子交換膜吸 附劑上純化vsv所過遽之溶液，（d)藉由切向流過滤（TFF) 緩衝交換及濃縮vsv及（e)vsv保留物經由〇.2至〇·22微米過 136326.doc •39· 200932259 濾器之最終過濾》在室溫下執行上文之純化方法步驟（&)至 (e)。 澄清程序 初級澄清 美國專利公開案2007/0249019中亦描述用於細胞培養物 液體之初級澄清以分離及純化病毒之方法。舉例而言，經 VSV感染之哺乳動物細胞培養物之細胞培養物液體可藉由 低速離心（或者藉由深度過濾）來澄清且回收上清液中之 © VSV，其亦在本文中稱為細胞培養物液體之"初級澄清，，。 在某些實施例中，細胞培養物液體之初級澄清係在室溫下 進行。 用於細胞培養物液體之初級澄清之離心方法及設備為熟 習此項技術者熟知。如下文所定義，"低速"離心為在 10,000 rpm下或1〇,〇〇〇 rprn以下之離心速度。 如上所述，經VSV感染之哺乳動物細胞培養物之細胞培 養物液體可替代地藉由深度過濾（亦即，替代低速離心）來 澄清。當自步驟之初級澄清省略低速離心時，可使用深 度過濾。深度過濾（與表面過濾對比）通常係指在其結構中 俘獲污染物之"厚”過濾器。深度過濾材料及方法為熟習此 項技術者熟知/舉例而言，過濾材料通常包含厚及纖維狀 纖維結構，諸如矽藻土粒子之無機助濾劑嵌入纖維之開口 中。該過壚材料具有Λ的内表面帛，其對粒子俘獲及過滤 能力為關鍵的。該等深度過濾模組含有1.0微米至4.5微米 之孔不範性深度過濾模組包括（但不限於）Whatman® 136326.doc 200932259
Polycap™. HD模組（Whatman Inc·; Florham Park, N.J·)、 Sartorius SartoclearTM P模組（Sartorius Corp.; Edgewood, N.Y·)及]Vlillipore® Millistak+.® HC 模組（Millipore; Billerica，Mass.)。細胞培養物液體可經由深度過濾（在室 溫下執行）來澄清且回收濾液中之VSV。 二級澄清 美國專利公開案2007/0249019中亦描述用於細胞培養物 液體之一級澄清以分離及純化病毒之方法。在經由離心 〇 (或深度過濾）之初級澄清後，藉由經由0.2至0.25微米過濾 器之過濾或微過濾進一步澄清VSV上清液（或濾液）且回收 所過滤溶液中之VSV。如上文所定義，可在室溫下執行微 過濾。過濾/微過濾介質可用於熟習此項技術者已知之多 種材料及製造方法。示範性微過濾過濾單元包括（但不限 於）Millipore Millex.®.-GV過渡單元（Millipore; Billerica， Mass·)、Millipore MillexIGP過濾單元、Pall Supor®過 濾單元（Pal1 corP.; East Hills，N.Y.)、Sartorius
Sartobran™過濾單元（Sart〇rius c〇rp ; Edgewood, N.Y.)及 Sartorius Sartopore™ 2過濾單元。在某些實施例中，該等 過濾單元擁有尺寸在〇_2至0_45微米之間的過濾器。回收所 過濾溶液中之經過濾VSV。 陰離子交換膜吸附 旦已在澄清後回收vsV，VSV即可在陰離子交換膜吸 附劑上進-步純化。膜吸附劑材料為熟習此項技術者熟知 且可購自諸如 Sartorius C〇rp (Edgew〇〇d，Ν γ )、Pall 136326.doc •41 - 200932259
Corp. (East Hills，Ν.Υ·)及 Sigma-Aldrich Corp. (St. Lou. u 1 s，
Mo·)之供應商。示範性陰離子交換膜吸附劑包括（但不限 於）SartobindTM Q膜吸附劑（sart〇rius Corp·)及 MustangTM q 膜吸附劑（Pall Corp.)。在一特定實施例中，陰離子交換膜 吸附劑為Pall MustangTM q膜吸附劑。一般而言，自習知 離子交換層析已知之方法及緩衝液可直接應用於熟習此項 技術者已知之膜吸附劑層析。在某些實施例中，如上文所 定義，在室溫下執行陰離子交換膜吸附劑層析。 因此，VSV可經由陰離子交換膜吸附劑純化，其中將來 自二級澄清之vsv過濾溶液加載於經第一 pH緩衝鹽溶液 (亦稱為”平衡緩衝液，，或vsv"結合緩衝液"）平衡之陰離子 父換膜吸附劑上。用第：pH緩衝鹽溶液（"溶離緩衝液將 vsv自陰離子交換膜吸附劑溶離，且回收所溶離的vsv溶 離份（例如，參見美國專利公開案2〇〇7/〇249〇19)。 第一 pH緩衝鹽溶液或平衡緩衝液可為NaCi或kCl鹽溶 液。NaC1或KC1可以在約至少Q」M至狀4 M之間的離子 強度（包括其之間的分數離子強度）存在於溶液中。緩衝溶 液可為鱗酸鹽緩衝液、N_2_輕基乙基旅嗓界2_乙烧績酸 (HEPES)緩衝液或參（羥基甲基）胺基甲烷（tris)緩衝液。 該等緩衝液可具有在約6.0至約8.0之間的pH。
，平衡緩衝液可另外包含約1%嚴糖至約5%薦糠。第二pH 緩衝鹽溶液(”溶離緩衝液")亦可包含與第一(平衡)緩衝液 相同之緩衝組分。溶離緩衝液可另外包含約1 %蔗糖至約 5%蔗糖。 136326.doc -42_ 200932259 為自膜溶離VSV，溶離緩衝液之鹽（NaCl或KC1)濃度（離 子強度）可以線性梯度增加或在單一步驟溶離方法中增加 (亦描述於美國專利公開案2007/0249019中）。2種步驟在自 陰離子交換膜吸附劑溶離VSV下同樣有效。NaCl於第二pH 緩衝鹽溶液中之離子強度應在0.5 Μ至0.75 Μ之間。
NaCl於第二pH緩衝鹽溶液中之離子強度應在約10 CV/分 鐘至30 CV/分鐘之溶離流動速率下自0.001 Μ線性增加至 0.75 Μ。 〇 切向流過濾（TFF) 在藉由陰離子交換膜吸附劑層析之VSV純化後，VSV可 進一步藉由切向流過遽（TFF)純化。一般而言’ TFF為使用 膜以分離液體溶液（或懸浮液）中之組分之壓力驅動方法， 其中沿膜之表面將液體（進料流）切向泵送且所施加壓力用 於迫使液體之"部分”穿過膜達到濾液側（膜之濾液側）。 TFF可在室溫下執行。在該方法中，交換緩衝液且濃縮 VSV。TFF步驟可包含濃縮自陰離子交換膜吸附步驟回收 ® 之VS V至少5次，接著至少一次緩衝液交換。 TFF材料（例如，中空纖維、螺旋形纏繞物、平板）及方 法（例如超濾（UF)、滲析（DF)、微過濾）為熟習此項技術者 熟知。TFF膜可具有300至750 kDa分子量截斷。 用於TFF之緩衝液交換之緩衝液可為如上所述之磷酸鹽 緩衝液、HEPES緩衝液或TRIS缓衝液。然而，缓衝液可具 有約5 mM至15 mM之濃度（包括其之間的mM濃度）。緩衝 液交換緩衝液可另外包含〇·1〇 Μ至0.20 M NaCl及3.5%至 136326.doc -43 - 200932259 4.5 %蔗糖。 可彙集來自陰離子交換膜吸附劑純化之VS V溶離份，且 將所彙集溶液濃縮’且藉由TFF，使用具有約750 kDa之分 子量截斷之中空纖維TFF Sciences Corp.; Piscataway，N.J.)交換緩衝液。 過渡 ❹ ❹ 在美國專利公開案2007/0249019中所述之方法中，病毒 純化中之最後的方法步驟為VSV保留物自TFF之最終微過 濾，其中如上文對經由微過濾之二級澄清所述，經由0.2 至0.25微米過濾器過濾保留物。 重組或基因修飾之水皰性口炎病毒（VSv) 如本文中所述，可獲得VSV且藉由使用任何上述純化方 法自哺乳動物細胞培養物純化。”改良之純度"意謂純化 VSV至少90.0%不含細胞培養物蛋白質及核酸污染物且較 佳99.0。/。至99‘8%不含細胞培養物蛋白質及核酸污染物。 在特疋實施例中’藉由任何上述方法自哺乳動物細胞培 養物之細胞培養㈣體純化之彻為重組或基因修飾及/或 減毒之⑽。產生諸如VSV之重組RNA病毒之方法為熟知 的且在此項技術中稱為"援救”或"逆轉遺傳”方法。用於 谓之示範性援救方法包括（但不限於）美國專利第 6,033,886號及美國專未丨笛& ®寻和苐6，168,943號（各自以引用之方式 併入本文）中所述之方法。用於進行諸如VSV之病毒之援 救…技術描述於美國專利第m 2〇〇4/113517(其在此Μ丨狀方切入）中。 136326.doc -44 - 200932259 VSV可為指定血清型之VS V。在某些實施例中，純化 VSV為印第安納血清型、新澤西血清型、伊斯法罕血清 型、金迪普拉血清型或其他水皰病毒。在某些實施例中， VSV可含有來自超過一種該血清型之序列。 VSV載體（及其免疫原性組合物）常常包含VSV基因組内 之一或多種減毒突變。在某些實施例中，純化VSV具有包 含至少一種突變之基因組序列，該突變減毒VSV之病原 性。在其他實施例中，純化VSV具有包含至少2種突變之 〇 基因組序列，該等突變減毒vsv之病原性。舉例而言，減 毒VSV可包含兩種或兩種以上已知減毒突變，諸如國際申 請案第PCT/US2005/01 1499號（國際公開案第WO 2005/098009號）及美國專利公開案第2007/02 18078A1號（其 以引用之方式併入本文）中陳述之減毒突變。舉例而言， 已知VSV減毒突變包括（但不限於）基因洗牌突變（包括形成 VSV基因組且命名為N、P、M、G及L之VSV基因之基因洗 牌）、G蛋白質插入突變、G蛋白質截斷突變、溫度敏感（ts) ® 突變（及其他點突變）、非細胞病變Μ基因突變、G柄突變、 雙義RNA突變及基因缺失突變，其各自詳細陳述於國際公 開案第WO 2005/098009號。因此，在某些實施例中，純化 VSV包含一或多種減毒突變，該或該等突變包括（而不限 於）溫度敏感（ts)突變、點突變、基因洗牌突變、G柄突 變、非細胞病變Μ基因突變、雙義RNA突變、截斷G基因 突變、G基因插入突變及基因缺失突變。 在某些實施例中，藉由任何上述純化方法純化之VSV具 136326.doc -45- 200932259 冑-或多種產生病毒減毒之突變，及—或多種產生增加之 生長及增加之自哺乳動物細胞或細胞株之病毒產率7的突 變。舉例而言，本發明提供藉由在低病毒感染倍率（m〇i) 下，在Vero細胞或在任何敏感細胞基質中連續傳代使高度 減毒之VSV重組體適應組織培養條件的方法。多次連續傳 代方法產生特徵為遍及病毒基因組之大量核苷酸（nt)取代 之進行性增加的基因型改變。大多數該等核苦酸取代產生 VSV蛋白質中之胺基酸(ΑΑ)取代。本文中所述之方法產生 〇 病毒之表型適應，伴隨病毒產率之實質改良。持續Vero細 胞中之傳代直至達到基因型及表型穩定性，通常在1〇至15 次連續傳代（P10-P15)中達到。超過Pl5之病毒之進一步傳 代展示很少的額外取代或不展示額外取代且不產生病毒產 率之進一步提高。該方法產生製造產率之實質改良以及增 強之製造一致性。當在高度敏感小鼠顱内Nv動物模型中 測試時，適應性突變大體上不影響所傳代病毒之神經毒性 (NV) 〇 ◎ 本發明之一實施例提供經分離、基因修飾之水皰性口炎 病毒（VSV)，其在對應於以下位置之至少一者之區域中具 有至少一種胺基酸突變： Μ蛋白質之位置119或142處之胺基酸； G蛋白質之位置109、224、438、477或481處之胺基 酸；及 L蛋白質之位置2〇5、22〇或ΐ45〇處之胺基酸。 在某些實施例中，突變可在Μ蛋白質之位置119或142處 136326.doc -46- 200932259 或在M蛋白質之位置119及142處。在其他某些實施例中， 在Μ蛋白質之位置119處之胺基酸突變為T—N突變，且在 Μ蛋白質之位置142處之胺基酸突變為ρ—τ突變或p —〇突 變。 在一實施例中，G蛋白質之位置1〇9、224、438、477或 481處之胺基酸突變分別為κ—ν、Ν—τ、s — j、 A—V/G-^L 或 V—>1突變。 在一實施例中’ L蛋白質之位置205、22〇或1450處之胺 © 基酸突變分別為P —L、K—E或L —卜 在某些實施例中，如本文中所述之基因修飾及減毒之 VSV具有包含一或多個外來或異源（或外來）聚核苷酸序列 (諸如外來RNA開放閱讀框架（ORF))之基因組序列。異源 聚核苷酸序列可按需要變化且包括（但不限於）編碼細胞激 素（諸如介白素）之基因、編碼τ_辅助抗原決定基之基因、 編碼CTL抗原決定基之基因、編碼佐劑之基因及編碼輔因 Ο 子之基因、編碼限制標記之基因、編碼治療性蛋白質或不 同微生物病原體（例如病毒、細菌、寄生蟲或真菌）之蛋白 質，尤其能夠引起理想免疫反應之蛋白質之基因。舉例而 言，編碼不同微生物病原體之蛋白質之異源聚核苷酸序列 可為以下一或多者：HIV基因、HTLV基因、SIV基因、 RSV基因、PIV基因、HSV基因、CMV基因、埃-巴二氏病 毒基因、水痘-帶狀疱疹病毒基因、腮腺炎病毒基因、麻 疹病毒基因、流感病毒基因、脊髓灰質炎病毒基因、鼻病 毒基因、Α型肝炎病毒基因、Β型肝炎病毒基因、匚型肝炎 136326.doc -47- 200932259 病毒基因、諾沃克病毒基因、披衣病毒基因、阿爾發病毒 基因、風疹病毒基因、狂犬病病毒基因、馬堡病毒基因、 伊波拉病毒基因、乳頭狀瘤病毒基因、多形瘤病毒基因、 間質肺炎病毒基因、冠狀病毒基因、霍亂弧菌基因、肺炎 鏈球菌基因、釀膿鏈球菌基因、幽門螺桿菌基因、無乳鏈 球菌基因、腦膜炎奈瑟球菌基因、淋病奈瑟球菌基因、白 喉棒狀桿菌基因、破傷風梭菌基因、百日咳博德特氏菌基 因、嗜血桿菌基因、衣原體基因及大腸桿菌基因。在某些 ® 實施例中，純化VSV包含HIV基因序列，其中該HIV序列 選自由 gag、env、pol、vif、nef、tat、vpr、rev或 vpu組成 之群。在一特定實施例中，HIV基因為gag或env。 在某些其他實施例中，純化VS V含有至少一種減毒突變 及至少一種如上所述之異源蛋白質。在其他某些實施例 中，VSV免疫原性組合物為包含2種減毒突變及編碼HIV-1 gag蛋白質之orf之基因修飾VSV。在一實施例中，基因修 飾之VSV另外包含編碼HIV gag蛋白質之核酸分子，其中 ❹ HIV gag蛋白質具有在位置165、270、329或348處之胺基 酸之至少一者中的突變，其中突變分別為S —G、L —S、 D—N或T—K。 在其他實施例中，本文中所述之基因修飾之VSV編碼 HIV gag基因，其中在以下位置處將gag基因插入VSV基因 組中：位置lP'-gagrNPMGL-S’）、位置 2(3，-N-gag2-PMGL-5，）、位置 3(3，-NP-gag3-MGL-5')、位置 4(3’-NPM-gag4-GL-5')、位置 5(3’-NPMG-gags-L_5')或位置 6(3’-NPMGL-gag6- 136326.doc -48- 200932259 5 )。在其他實施例中，本文中所述之vs v編碼hiv ο”基 因，其中在以下位置處將env基因插入VSV基因組中：位 置 1(3 envi-NPMGL-5')、位置2(3’_N_enV2 pMGL_5，）、位置 3(3 -NP-env3-MGL-5’）、位置 4(3’_NpM_enV4_GL_5,)、位置 5(3’-NPMG-env5-L-5，）或位置 6(3._NPMGL_enV6_5·)。 熟習此項技術者將自上文之描述瞭解，vsv基因組中之 各種基因修飾係在病毒以低M〇I於細胞培養物中之連續傳 代期間發生。該等基因修飾產生來自感染細胞之病毒產率 © 之增加。此外，不存在對病毒之其他基因型或表型改變且 不存在病毒減毒之改變。就將病毒產率增加至適用於病毒 載體產生之按比例放大之水準而言，該等基因修飾經證明 為顯著有益的。 下文描述之本發明滿足此項技術中對在哺乳動物中具有 顯著減毒病原性，尤其在動物神經毒性模型中具有減毒神 經病原性之水皰性口炎病毒（vsv)的需要。如上文所述， 泛 VSV具有許多使其為用於免疫原性組合物之適合载體之特 徵。舉例而言，人類之vsv感染為罕有的且為無症狀的或 特徵為類似輕度流感之症狀，該等症狀在3至8天内消除而 無併發症，且同樣地，vsv不視為人類病原體。使vsv為 吸引人之载體之VSV的其他特徵包括··（勾在細胞培養物中 強烈複製之能力；（b)不能整合至宿主細胞DNA中或經歷 基因重組；（C)存在多種血清型，允許預致敏-加強免疫策 略之可能性；（d)所關注外來基因可插入vsv基因組中且藉 由病毒轉錄酶大量地表現；（e)發展用於自病毒基因組之 136326.doc -49- 200932259 cDNA複本援救感染性病毒之高度特殊化系統（美國專利 6,033,886 ;美國專利6,168,943)及（f)在人類群體中對vsv 之先前存在免疫性不常見。 減毒水皰性口炎病毒 在某些實施例中，適用於本發明之減毒VSV包含一或多 種來自下文所列之突變種類之突變。此外，該等減毒病毒 另外使用本發明之方法，例如使用低MOI歷時約5至15次 之連續傳代來基因修飾。該方法產生減毒基因型及表型之 © 保留’仍提供如本文中所述之其他基因修飾，該等修御產 生更好適宜於在細胞培養物中生長之VSV。藉由使用該等 病毒達到之高病毒產率使其為用於載體產生之極好候選 者。 A.水皰性口炎病毒突變種類 在一實施例中’本發明之基因修飾之VSV載體在其基因 組中包含至少2種不同種類之突變。如先前所註明，術語 '’突變種類"或"突變之種類”可交替地使用且在單獨使用時 v 係指將vsV減毒之此項技術中已知之突變。舉例而言，本 發明之"突變種類"包括（但不限於）VSV溫度敏感Ν基因突變 (下文為"N(ts)n)、溫度敏感L基因突變（下文為"L⑽”）、點突 變、G柄突變（下文為”G(stem)")、非細胞病變Μ基因突變（下 文為”Mw〆’）、基因洗牌或重排突變、截斷g基因突變（下 文為"G(ct>")、雙義RNA突變、G基因插入突變、基因缺失 突變及其類似突變。如下文所定義，"突變"包括此項技術 中已知之突變，如插入、缺失、取代、基因重排或洗牌修 136326.d〇c •50- 200932259 飾。 此外，如先前所註明，術語"協 VSV減毒水準。㈣“▲ 係指大於相加之 vsv基因组中組… 之協同減母包含在同一 VSV突變種^ 兩義型之突變’⑼產生比對各 繼低Γ獨觀察到之相加減毒水準大更多之vsv病 :至降：。因此’在某些實施例中，vsv之協同減毒定義 為至>、大於對各突變種類單獨所觀察到之相加減毒水準 ❹ (亦即，兩種突變種類之總和)之LD5。，其中減毒水準(亦 即’ LD5。)係、在小動物神經毒性模型中測定。 經由非限制性實例，若方程式⑴描述VSV之，，相加減毒”： () ^aLD5〇+AbLD50=xLD5〇 ； 其中AaLDw為在其基因組中具有第一突變種類之vsV之 LDm ’ ΔΙ^^ο為在其基因組中具有第二突變種類之vsv之 LD5〇且xLD5〇為AaLDM及總和；則藉由方程式（2) 描述本發明之VSV"協同減毒，，，其具有至少大於對各突變 〇 種類單獨觀察到之相加減毒水準之ld50 : () ^a,bLD5〇>(AaLD5〇+AbLD50); 其中△a’bLDso為在其基因組中具有2種突變種類之組合的 VSV之LD50 , AaLDso為在其基因組中具有第一突變種類之 VSV之LDw ’且Δ1^〇5〇為在其基因組中具有第二突變種類 之VSV之LDS0。因此，在某些實施例中，相對於2種vsv 構築體（各VSV構築體在其基因組中具有單一突變種類）之 LD5〇來描述VSV減毒之協同作用（亦即，同一vsv基因組中 136326.doc -51 - 200932259 之2種突變種類），其中在其基因組中具有2種突變種類之 vsv之協同減毒定義為至少大於2種在其基因組中具有單 一突變種類之VSV構築體之相加LD5Q的ld5〇。 在某些其他實施例中，相騎野生型VSV2LD5〇來描述 VSV減毋之協同作用。因此，在—實施例中，之協同 減毒定義為至少大於野生型VSV2LD5G2LD5G，其中L〇5〇 係在動物神經毒性模型中測定。在一實施例中，谓之協 同減毒定義為大於野生型vs 乂之至少丨〇倍之LD5。，其 © tLD5Q係在動物神經毒性模型中測定。在另―實施例中， VSV之協同減毒定義為大於野生型vsV2LD5j少⑽倍 之LE>50 ’其中LD5〇係在動物神經毒性模型中測定。在另一 實施例中VS V之協同減毒定義為大於野生型乂之 至:>、1,000倍之LD5〇 ’其中le>5〇係在動物神經毒性模型中 測定。在其他實施例中，vsv之協同減毒定義為大於野生 型VSV之LD50至少10,000倍之Ld5〇，其中LD5〇係在動物神 經毒性模型中測定。在某些其他實施例中，谓之協同減 毒定義為大於野生型vsv之ld50至少100，_倍之LD5〇，其 中LE>5°係在動物神經毒性模型中料。特定VSV載體之 50。/。致死劑量（LD5。）之測定容易藉由熟習此項技術者使用 已知測試方法及動物模型來測定。 基因洗牌突變 在某些實施例中’本發明之基因修飾之vsv在其基因組 中包含基因洗牌突變。如本文中所定義，術語"基因洗牌，，、 ”經洗牌基因”、”經洗牌"、"洗牌"、"基ϋ重排"及"基因易 136326.doc -52- 200932259 位可父替使用且係指在野生型vsv基因組之順序中之改 變（突變如本文中所定義’野生型㈣基因組具有以下 基因順序：3，-NPMGy。 ，項技術中已知VSV基因相對於3,啟動子之位置決定表 現量及病毒減毒（美國專利6,596,529及Wertz等人，1998， 各自以引用之方式特定併入本文）。存在表現梯度，最接 近3’啟動子之基因比3,啟動子遠端之基因更大量地表現。 編碼VSV G、Μ、N、蛋白質之核苷酸序列在此項技 © 術中已知（Rose&GalIione，1981 ; Galli〇ne等人，1981)。 舉例而σ美國專利6,5 96,529描述基因洗牌突變，其中ν 蛋白質之基因自其最接近野生型啟動子之第一位置依次易 位（洗牌）至基因組上之更遠端位置以依次降低Ν蛋白質表 現（例如，3'-PNMGL-5'、3，-P_GL-5·、3LPMGNL-5,，分 別稱為N2、N3及N4)。因此，在某些實施例中，基因修飾 之VSV在其基因組中包含基因洗牌突變。在一種突變種類 ③中，在一特定實施例中’基因修飾之vsv包含包括N基因 之易位之基因洗牌突變（例如，3，_pnmgl_5，或3，_PMngl· 5，）。 本文中應注意，外來核酸序列（例如Hiv gag)於相對ν、 P、M、G或L基因之任何者而言3,之vsv基因組甲的插入 有效產生如上文所定義之"基因洗牌突變，I。舉例而言，當 HIV g叹基因在位置1處插入VSV基因組中時（例如3,_料^_ NPMGL-5’），1^、？、]^、〇及乙基因各自自其野生型位置移 動至基因組上之更遠端位置。因此，在本發明之某些實施 136326.doc -53- 200932259 例中，基因洗牌突變包括外來核酸序列於相對N、P、Μ、 G或L基因之任何基因而言Υ之VSV基因組中的插入（例 如，S'-gag^NPMGL-S'、3，-N-gag2-PMGL-5'、3'-NP-gag3-MGL-5,等）。 G蛋白質插入及截斷突變體 在某些其他實施例中，本發明之基因修飾之VSV包含突 變G基因，其中經編碼G蛋白質在其細胞質域（羧基末 端 >(亦稱為G蛋白質之''細胞質尾區”）處截斷。此項技術中 〇 已知截斷細胞質域之羧基末端之G基因突變影響VSV出芽 及減毒病毒產生（Schnell等人The EMBO Journal 17(5):1289-1296, 1998 ; Roberts 等人 J Virol，73:3723-3732, 1999)。野生型VSV G蛋白質之細胞質域包含29個胺基酸 (RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK-COOH; SEQ ID ΝΟ:1)。 在某些實施例中，本發明之截斷VSV G基因編碼G蛋白 質，其中細胞質域之後28個羧基未端胺基酸殘基缺失（僅 ® 保留來自SEQ ID ΝΟ:1之29胺基酸野生型細胞質域之精胺 酸）。在某些其他實施例中，本發明之截斷VSV G基因編碼 G蛋白質，其中細胞質域之後20個羧基未端胺基酸殘基缺 失（相對於SEQ ID ΝΟ:1之29胺基酸野生型細胞質域而 言）。 在某些其他實施例中，本發明之戴斷VSV G基因編碼在 其細胞質域（細胞質尾區）中包含單一胺基酸之G蛋白質， 其中單一胺基酸為任何天然存在之胺基酸。在其他實施例 136326.doc -54- 200932259 中，本發明之截斷VSVG基因編碼在其細胞質域（細胞質尾 區）中包含9個胺基酸之G蛋白質，其中9個胺基酸為任何天 然存在之胺基酸。在某些其他實施例中，本發明之突變 VSV基因編碼含有表示外來抗原決定基之插入之g蛋白 質。該等突變體在此項技術中已知（例如，參見咖—⑹ 及 Rose, 2003)。 如本文中所定義，編碼其中細胞質域之後28個羧基未端 胺基酸殘基相對於SEQ ID N〇:1之野生型序列而言缺失之 © G蛋白質的G基因突變體命名為” 或簡單命名為 "cti"，其中之細胞質域具有為（R_c〇〇H)之胺基酸 序列如本文中所定義，編碼其中細胞質域之後2〇個缓基 未端胺基酸殘基相對於SEq ID N〇:丨之野生型序列而言缺 失之G蛋白質的G基因突變體命名為"G(ctV或簡單命名為 "CT9" ’其中G(ct_9)之細胞質域具有為（rvgihlcik_ COOH, SEQ ID NO:2)之胺基酸序列。因此，在本發明之 某些實施例中，本發明之基因修飾之VSV包含突變G基 因，其中經編碼G蛋白質為 溫度敏感及其他點突變 如下文所定義，VSV "溫度敏感"（"ts")突變為限制在非 許可溫度下之VSV生長之VSV基因組的突變。舉例而言， 本發明之VSV ts突變體通常在許可溫度（例如31〇c)下生長 且達到高效價，但其在非許可溫度（例如37它或39。0下之 生長或繁殖受限制。藉由化學及定位突變產生18突變體在 此項技術中熟知（例如’參見pringle，1970 ; Li等人， 136326.doc -55- 200932259 1988);且已表徵及描述許多ts突變體（例如，參見 及 Pringle，1971 ; Flamand 及 Bish〇p，1973 ;及
Wagner，1971 ; Gopalakrishna及 Lenard，1985 ; pringl4 人，1981 ; Morita 等人，1987 ; u 等人，i988 ; Rabinowitz 等人，1977 ; Lundh 等人，1988 ;以！ 等 人’ 1976 ’· Rabinowiu等人，1976)。在某些實施例中本 發明之基因修飾之vsv在其基因組中包含ts突變，其中。 突變為編碼G、Μ、N、P或L蛋白質之核酸序列之一或多 © 種突變。 如本文中所定義，任一VSV G、Μ、Ν、？或[基因之ts 突變為本發明之獨立，，突變種類"。舉例而言，在本發明之 某些實施例中，基因修飾之vsv在其基因組中包含至少2 種不同種類之突變（其中2種突變協同地減毒vsv病原性）， 該等突變包含一或多種ts N基因突變（下文為"N⑻"）作為第 一種類之突變及一或多種ts L基因突變（下文為"L…〇作為 第二種類之突《。作為非限制性實例，包含諸如h N^PMGL⑻-5’之基因組之基因修飾vsv包含2個種類之突 變（亦即，（l)N(ts}基因突變及（2)L⑻基因突變）且包含諸2 3_-gagl-N⑽PMGL(ts)-5’之基因組之基因修飾vsv包含^固 種類之突變（亦即，⑴N⑽基因突變、⑺L(ts)基因突變= (3)經由gag!插入’基因洗牌突變）。 在某些其他實施例中，本發明之基因修飾之vsv在其 因組中包含點突變，其中點突變為編碼 蛋白質之核酸序列之一或多種突變，其中該突變職予諸 136326.doc -56- 200932259 寒冷適應性、減少之融合或致細胞病變效率之減毒表型 (例如，參見Fredericksen及Whitt，1998 ; Ahmed and Lyles， 1997)。舉例而言，Fredericksen 及 Whitt(1998)描述 G基因 之3種減毒點突變（例如，D137-L、E139-L或DE-SS)，該等 點突變具有用於融合活性之移位pH臨限值。Ahmed及 Lyles(1997)描述Μ基因（N163D)之減毒點突變，該Μ基因在 宿主基因表現之抑制中為高缺陷性的且比野生型Μ蛋白質 更快速轉換。因此，在某些實施例中，本發明之基因修飾 〇 之vsv在其基因組中包含一或多種點突變。 非細胞病變Μ基因突變 在某些其他實施例中，本發明之基因修飾之VSV在Μ基 因中包含非細胞病變突變。VSV(印第安納血清型）Μ基因 編碼229胺基酸Μ(基質）蛋白質，其中ΝΗ2末端之前30個胺 基酸包含ΡΡΡΥ基元。藉由Jayakar等人（J. Virology, 74:9818-27，（2000))證明，PPPY基元中之突變（例如， APPY、AAPY、PPAY、APPA、AAPA及PPPA)藉由阻斷病 〇 毒出芽之晚期而降低病毒產率。因此，在某些實施例中， 本發明之基因修飾之VSV在Μ基因中包含非細胞病變突 變，其中突變係在經編碼Μ蛋白質之ΡΡΡΥ基元中。 近期已報導M mRNA另外編碼2種稱為M2及M3之額外蛋 白質（Jayakar及 Whitt, J. Virology，76:8011:18，2002)。M2 及M3蛋白質係自編碼229胺基酸Μ蛋白質（稱為Ml)且缺乏 Ml蛋白質之前32個（M2蛋白質）或50個（M3蛋白質）胺基酸 之相同閱讀框架中的下游甲硫胺酸合成。已觀察到，經表 136326.doc -57· 200932259 現Μ蛋白質而非M2及M3之重組VSV感染之細胞顯示細胞 病變效應之延遲發作（在某些細胞類型中），仍產生正常病 毒產率。因此，在某些實施例中，本發明之基因修飾之 VSV在Μ基因中包含非細胞病變突變，其中Μ基因突變產 生不表現M2或M3蛋白質之病毒（例如，參見Jayakar及 Whitt，2002)。 G柄突變 在某些實施例中，本發明之基因修飾之VSV在G基因中 © 包含突變，其中經編碼G蛋白質在G蛋白質胞外域之最接 近膜之柄區（stem region)(稱為G柄蛋白質）中具有突變。G 柄區包含G蛋白質之胺基酸殘基421至462。近期研究已證 明VSV經由G蛋白質之G柄中之插入及/或缺失（例如截斷） 突變的減毒（Robinson 及 Whitt, J· Virol·，74，2239-46, 2000 ; Jeetendra等人，J. Virol，76，12300-311，2002 ; Jeetendra等人，J. Virol, 77, 12807-18, 2003)。因此，在某 些實施例中，基因修飾之VS V包含G柄插入、缺失、取代 ® 或其組合。在一特定實施例中，包含G柄突變之本發明之 基因修飾VSV載體（及其免疫原性組合物）包含基因組3·-gagi-NPMG(stem)L-5’。 雙義RNA突變 在某些實施例中，本發明之基因修飾之VSV包含雙義RNA 突變，其中5’反基因組啟動子（AGP)經3’基因組啟動子（GP) 之複本置換。VSV以及其他非分段、負鏈RNA病毒之5’ AGP擔當強複製啟動子，而3’ GP擔當轉錄啟動子及弱複製 136326.doc •58- 200932259 啟動子。在VS V感染之正常過程中，基因組複本存在超過 反基因組複本之3至4倍優勢；該比率對狂犬病病毒（棒狀 病毒科之另一成員）而言甚至更高（Finke &Conzelmann，J. Virology，73(5):3818-25, 1999)。用狂犬病病毒之先前研究 證明，用GP之複本置換VAGP(稱為雙義RNA突變）在經感 染細胞中產生相等含量之基因組及反基因組RNA複本。另 外，外來基因係自位於基因組之5'末端處之GP的複本表 現。當在培養細胞中連續傳代時，含有雙義RNA突變之狂 〇 犬病病毒不斷地複製至比重組野生型狂犬病病毒低10至15 倍之效價（Finke及 Conzelmann，J. Virology, 73(5):381 8-25, 1999)。該突變用於VSV載體中以減毒病毒複製且表現外 來基因。因此，在某些實施例中，基因修飾之VSV包含雙 義RNA突變。 基因缺失 在某些其他實施例中，本發明之基因修飾之VSV包含其 中VSV基因（諸如G或M)自基因組缺失之病毒。舉例而言， 〇 Roberts 等人（J. Virol.，73，3723-32，1999)描述 VSV 載體， 其中編碼G蛋白質之整個基因缺失（AG)且經流感血球凝集 素（HA)蛋白質取代，其中VSV載體（AG-HA)證明減毒發病 機制。 B.用於產生減毒VSV之其他基因修飾之方法 在某些實施例中，本發明針對包含下文陳述之至少2種 不同種類之突變的基因修飾之VSV。任何基因修飾及減毒 之VSV可另外藉由本發明中所述之方法基因修飾。亦即， 136326.doc -59- 200932259 任何該等減毒VS V可在每個細胞約0.001至約0.1 PFU之範 圍變化之低病毒感染倍率下，在敏感細胞或細胞株中連續 傳代約5至15次，且分析其基因組之本文中所述之突變的 至少一者之存在。 因此’在本發明之一態樣中，提供使病毒適應在細胞培 養物中之生長之方法，其包含以下步驟： a) 在每個細胞約〇.001至約〇丨空斑形成單位（pFU)之範 圍變化之低病毒感染倍率（MOI)下，用病毒感染細胞培 © 養物； b) 收穫含有病毒之細胞培養基； e)澄清細胞培養基； d) 冷凍細胞培養基；及 e) 重複步驟a)至d)約5至約15次。 與使用未在每個細胞約0.001至約O.i PFU之低MOI下以 低MOI傳代約5至15次之vSV的病毒產生或產率相比，該 方法之使用產生病毒產生/產率之5至1〇〇倍增加及病毒基 ® 因型及表型特徵之穩定性之增加。 該方法之使用產生基因修飾之水皰性口炎病毒（VSV)， 其在對應於以下位置之至少一者之區域中具有至少一種胺 基酸突變： Μ蛋白質之位置119或142處之胺基酸； G蛋白質之位置1〇9、224、438、477或481處之胺基 酸；及 L蛋白質之位置205、220或145〇處之胺基酸。 136326.doc 60· 200932259 在實施例中，藉由本發明之方法產生之基因修飾vsv 具有包含保守或非保守胺基酸改變之突變。 在實施例中，藉由本發明之方法產生之基因修飾vsv 、有在Μ蛋白貝之位置U9或142處或在μ蛋白質之位置119 及142處之突變。在—實施例中，在Μ蛋白質之位置119處 之胺基馱犬變為T_^N突變，且在Μ蛋白質之位置M2處之 胺基酸突變為ρ—τ突變或p—Q突變。
實施例中，藉由本發明之方法產生之基因修部VSV ©具2在G蛋白質之位置109、224、438、477或481處之胺基 夂大變亦即’分別為Κ-»Ν、Ν—»·Τ、S->I、A—>V/G—>1^或 V—»>1突變。 在實施例中，藉由本發明之方法產生之基因修飾vsv 具有在L蛋白質之位置205、220或1450處之胺基酸突變， 亦即，分別為P—L、K—卜 在實施例中，藉由本發明之方法產生之基因修飾vsv 驗另外包含編碼HIV gag蛋白質之核酸分子，其中mv gag蛋 白質具有在位置165、27G、329或348處之胺基酸之至少一 者中的突變，其中突變分別為S — G、L — s、d—n T->K。 一 在實施例中，在藉由本發明之方法產生之基因修飾 VSV中的上述突變產生病毒基因型及/或表型之穩定性的増 加且另外產生自經基因修飾之vsv感染之細胞的病毒產2 中之增加產率。 在—實施例中，藉由本發明之方法產生之基因修飾vsv 136326.doc -61， 200932259 另外在其基因組中包含至少2種選自彼等上述突變之任何 者之其他突變。在一實施例中，突變可選自由以下突變組 成之群：溫度敏感突變、點突變、基因洗牌突變、g柄突 變、非細胞病變Μ基因突變、雙義RNA突變、截斷^基因 犬變、G基因插入突變及基因缺失突變。 ❹ ❹ 在-實施例中，本文中所述之方法利用為減毒病毒之病 毒。在-實施例中，用於產生基因修飾之病毒之方法適宜 於病毒载體或免疫原性組合物之大規模生產。在一實施例 中：與未在每個細胞約0.001至約〇1個空斑形成單位之範 圍變化之低病毒感染倍率下傳代約5至15次的病毒株獲得 之產率相比，該方法產生高5至1〇〇倍之病毒產率。在一實 施例^ ’上述方法允許維持與病毒減毒相關之任何先前存 在的犬冑與病毒減毒相關的先前存在之突變可選自、、田产 敏感突變、點突變、基因洗牌突變、G柄突變、非細= 變Μ基因大變、雙義RNA突變、截斷g基因突變、〇 基因缺失突變。在一實施例中，該方法允；維持 與病毋減毒相關之低神經毒性概況。在一實施例中，用於 上述方法之減偏毒為水皰性口炎病毒（vsv)株。 、 C.重組水皰性口炎病毒載體 含種貧不施 1中’本發明提供重組⑽載趙，該載趙包 d種不同種類之突變於其基因組中及 RNA序列作為分離 個外來 個對複製非必需之換vsv基因組中-开乂笫之&域。該重組vsv載 飾以含有至少一種上i戟體了另外經基因修 種上迷修御，造成該病毒適應在細胞培養 136326.doc •62· 200932259 物中生長，因此增加每個細胞之病毒產率。 產生重組RNA病毒之方法在此項技術稱為"援救”或”逆 轉遺傳"方法。用於VSV之示範性援救方法描述於美國專 利 6,033,886、美國專利 6,596,529及\\^〇 2004/1 13517 中， 各以引用之方式併入本文。負義（negative-sense)、單鏈、 非分段RNA病毒基因組之轉錄及複製係經由一種多聚蛋白 質複合物之酶活性作用於核糖核蛋白核心（核殼）而達到。 裸基因組RNA不可用作模板。該等基因組序列僅在藉由N 〇 蛋白質完全殼體化至核殼結構中時得以識別。僅在該情況 下基因組及反基因組末端啟動子序列經識別而啓始轉錄或 複製路徑。
將VSV基因組之一種選殖DNA相等物置於一個適合之 DNA依賴性RNA聚合酶啟動子（例如T7 RNA聚合酶啟動子） 與一個自我分裂核糖酶序列（例如肝炎δ核糖酶）之間，將其 插入一種適合轉錄載體（例如可繁殖細菌質體）中。該轉錄 載體提供輕易可操作之DNA模板，RNA聚合酶（例如Τ7 ® RNA聚合酶）可自其確實地轉錄一個具有精確或幾乎精確 之5'及3'端的VSV反基因組（或基因組）之單鏈RNA複本。 VSV基因組DNA複本及側接啟動子及核糖酶序列之定向決 定是否轉錄反基因組或基因組RNA相等物。援救新VSV後 代亦需要將裸、單鏈VSV反基因組或基因組RNA轉錄物殼 體化至功能核殼模板中所需之VSV特異反作用支持蛋白 質：病毒核殼（N)蛋白質、締合聚合酶之磷蛋白（P)及聚合 酶（L)蛋白質。該等蛋白質包含活性病毒RNA依賴性RNA 136326.doc -63- 200932259 聚合酶’其必須嚙合該核殼模板以達到轉錄及複製。 因此’在其基因組中包含至少2種不同種類之突變的本 發明之基因修飾及減毒之VSV(例如，參見部分A)係根據 此項技術中已知之援救方法來產生。舉例而言，在其基因 組中包含至少2種不同種類之突變之基因修飾vsv載體係 使用（1)包含經分離核酸分子之轉錄載體，該經分離核酸分 子包含編碼VSV之基因組或反基因組之聚核苷酸序列；及 (2)至少一種包含至少一種編碼殼體化、轉錄及複製所需之 〇 反作用N、P及L蛋白質之經分離核酸分子的表現載體；在 宿主細胞中，在足以允許該等載體之共同表現及重組vsv 之產生的條件下產生。可根據本發明使用任何適合vsv株 或血清型’包括（但不限於）VSV印第安納、vsv新澤西、 VSV金迪普拉、vsv格拉斯哥（Glasg〇w)及其類似物。 除編碼VSV之減毒形式之聚核苷酸序列外，聚核苷酸序 列亦可編碼一或多個異源（或外來）聚核苷酸序列或開放閱 讀框架（ORF)。異源聚核苷酸序列可按需要變化且包括（但 不限於）辅因子、細胞激素（諸如介白素）、τ輔助抗原決定 基、CTL抗原決定基、限制標記、佐劑或不同微生物病原 體（例如病毒、細菌、寄生蟲或真菌）之蛋白質，尤其為能 夠引起理想免疫反應之蛋白質。在某些實施例中，異源 ORF含有HIV基因（例如，抑发、_、_、吨、_、如， vpr、rev或vpw)。在一特定實施例中，mv基因為gag，其 中在以下位置處將gag基因插入vsv基因組中：位置1(3，_ gagl-NPMGL-5’）或位置 5(3，_NPMG_gag5_L 5i)。在另一實 136326.doc -64 - 200932259 異源聚核转序列另外編碼諸如介白素·^之 其經選擇以# & 谇乂改良重組VSV之預防性或治療性特 在某些實施例中’本發明之基因修飾及減毒之VSV藉由 諸如化學突變之^ ^ °式突變。舉例而言，在於細胞培養 物中之病毒;ψ | IB „ t t 5 ，月間，添加化學突變劑，接著：（a)選擇已 在最佳溫度下姆A彳* 和 X卜‘又傳代以選擇溫度敏感及/或適應寒冷
之突變之病毒’（b)識別在細胞培養物中產生小空斑之突^ 體病毒及⑷經由異源宿主傳代以選用宿主範圍突變。在其 他實施例中’減毋突變包含使位突變製造預定突變且 隨後援救含㈣等突變之病毒。如先前所述，本發明之基 因修飾之VSV在其基因組中包含至少2種不同種類之突
施例中 胞激素 徵。 5。在某些實施例中，—或多種種類之突變另外包含多次 突變’諸如具有雙重突變（例如’缺失、插入、取代等广 三重突變及其類似突變之G柄突變種類。隨後就其在動物 模型中之病毒性之減毒而言來篩選該等減毒VSV載體。 用於援救之典型（儘管未必唯一）環境包括適當哺乳動物 細胞環境，其中存在了7聚合酶以驅動反基因組（或基因組） 單鏈RNA自含病毒基因組cDNA之轉錄載體之轉錄。在轉 錄同時或其後不久，藉由核殼蛋白質將該病毒反基因組 (或基因組）RNA轉錄物殼體化至功能模板中，且藉由同時 自編碼所需病毒特異反作用蛋白質之經共同轉染之表現質 體產生的所需聚合酶組分來D齒合。該等事件及方法產生病 毒mRNA之先決轉錄、新基因組之複製及擴增，進而新 136326.doc •65- 200932259 VSV後代之產生（亦即，援救）。 轉錄載體及表現載體為通常經設計用於在宿主細胞中表 現之質體載體。包含至少一種編碼殼體化、轉錄及複製所 需之反作用蛋白質之經分離核酸分子的表現載體自同一表 現載體或至少2種不同載體表現該等蛋白質。該等載體通 常自基本援救方法已知’且其無需經改變以適用於本發明 之改良方法。 用於進行諸如VSV之病毒之援救的額外技術描述於美國 Ο 專利6,673,572及美國公開專利申請案US20060153870C其在 此以引用之方式併入）中。 用於援救VSV之宿主細胞為允許自具有產生重組vsv所 需之必需組分之載體表現之彼等宿主細胞。該等宿主細胞 可選自原核細胞或真核細胞，且較佳為脊椎動物細胞。一 般而言，宿主細胞係得自人類細胞，諸如人類胚腎細胞 (例如293)。Vero細胞以及許多其他類型之細胞亦用作宿主 細胞。以下為適合宿主細胞之非限制性實例：（1)人類二倍 〇 體初級細胞株（例如WI-38及MRC5細胞）；（2)猴二倍體細胞 株（例如FRhL-胎兒恆河猴肺細胞）；（3)準初級持續細胞株 (例如AGMK-非洲綠猴腎細胞）；（4)人類293細胞及（5)其他 可能的細胞株’諸如CHO、MDCK(Madin-Darby犬腎）、初 級雞胚纖維母細胞。在某些實施例中，添加促轉染試劑以 增加藉由細胞之DNA吸收。許多該等試劑在此項技術中已 知（例如磷酸鈣）。Lipofectaee(Life Technologies, Gaithersburg，MD)及 Effectene(Qiagen，Valencia，CA)為普 136326.doc -66- 200932259 通實例。Lipofectace及Effectene均為陽離子脂質。其均包 覆DNA且增強藉由細胞之DNA吸收。Lipofectace形成圍繞 DNA之脂質體，而Effectene包覆DNA但不形成脂質體。或 者’質體DNA吸收亦可藉由細胞之電穿孔來增強，藉以越 過含有細胞及DNA之光析管施加高壓電流歷時數毫秒。 ο 隨後，首先藉由活體外方式測試援救減毒vsv之所要表 型（溫度敏感性、寒冷適應性、空斑形態學及轉錄及複製 減毋）。亦使用微複製子（minireplic〇n)系統測試突變，其 中藉由野生型或經修飾輔助病毒，或藉由表現N、p及藏有 基因特異減毒突變之不同L基因之質體提供所需反作用殼 體化及聚合酶活性。亦在動物神經毒性模型中活體内測試 減毒VSV之協同減毒。舉例而言，建立小鼠及/或雪紹模型 用於债測神經毒性。簡言之，用跨越預期LD5〇劑量（對5〇% 之動物致命之劑量）之一系列病毒濃度中之每一者顱骨内 (ic)注射具有10隻小鼠之群組。舉例而言，使用處於1〇2、 …、—。、下之病毒找接種…病毒之預期 心在U)M〇4pfu之範圍中。藉由在m中連續稀釋純化 病毒儲料來製備病毒調配物。隨t經由顧㈣，用於5〇 爾MPBS中之必需劑量注射小鼠。每日監視動物之重 量損失、發病率及社。自在所職濃度範圍内之小鼠之 累積死亡來計算病毒載體之LD5Q。 異源核酸序列及抗原 在某些實施例中’本發明提供協 货協冋減毒及基因修飾之 VSV(使用在低MOI下之本發明之連 %躓傅代方法），其另外 136326.doc •67· 200932259 包含作為分離轉錄單元插入對複製而言非必需之基因組之 位點中或置換該位點的外來RNA序列，其中外來缝序列 (其呈負義形式）引導能夠在藉由vsv感染之宿主細胞中表 的蛋白質之產生。5亥重組基因組最初藉由將編碼蛋白質 之外來DNA插入VSV cDNA中來產生。在某些實施例中， 將編碼在單獨或與藉由相同或不同VSV表現之其他抗原一 起組合表現為本發明之重組協同減毒vsv中的融合或非融 合蛋白質時，產生抵抗疾病或病症之預防性或治療性免疫 © 性之免疫原性抗原的任何DNA序列分離且併入適用於本發 明之免疫原性組合物之VSV載體中。 在某些實施例中，藉由協同減毒及另外基因修飾（使用 本發明之方法）之重組VSV表現抗原誘導抵抗病原微生物 之免疫反應《舉例而言，抗原可顯示見於為疾病或病症之 病原體之細菌、寄生蟲、病毒或真菌上的抗原之免疫原性 或抗原性。在一實施例中’使用顯示人類病原體之抗原或 所關注之其他抗原之抗原性或免疫原性的抗原。 為藉由偵測與抗體之結合來測定免疫原性或抗原性，使 用此項技術中已知之各種免疫檢定，包括（但不限於）使用 以下技術之競爭性及非競爭性檢定系統：諸如放射免疫檢 定、ELISA(酶聯免疫吸附檢定）、"夾層"免疫檢定、免疫 放射量檢定、凝膠擴散沈澱素反應、免疫擴散檢定、就地 免疫檢定（例如使用膠態金、酶或放射性同位素標記）、西 方墨點法、免疫沈澱反應、凝集檢定（例如凝膠凝集檢 定、血細胞凝集檢定）、補體結合檢定、免疫螢光檢定、 136326.doc -68- 200932259 蛋白質A檢定及免疫電泳檢定、中和檢定等。在一實施例 中’抗體結合藉由偵測初級抗體上之標記來量測。在另一 實施例中，初級抗體藉由量測二級抗體或試劑與初級抗體 之結合來偵測。在另一實施例中，將二級抗體標記。在免 疫檢定中偵測結合之許多方式在此項技術中已知。在偵測 免疫原性之一實施例中，Τ細胞介導反應係藉由標準方 法’例如活體外或活體内細胞毒性檢定、四聚體檢定、酶 聯免疫斑點檢定（elispot assay)或活體内延遲型過敏性檢定 〇 來檢定。 表現藉由協同減毒VSV表現之抗原決定基（抗原決定子） 之寄生蟲及細菌（其中外來RNA引導含有其抗原決定基之 寄生蟲或細菌或其衍生物之抗原的產生）包括（但不限於）表 1中所列之彼等寄生蟲及細菌。 在另一實施例中，抗原包含線蟲之抗原之抗原決定基以 保護抵抗藉由該等罐蟲引起之病症。在另一實施例中，編 ❹ 碼瘧原蟲抗原決定基（在藉由重組VSV表現時在脊椎動物 宿主中為免疫原性的）之任何DNA序列根據本發明經分離 以插入至VSV(-)DNA中。用作DNA來源之癔原蟲物種包括 (但不限於）人類瘧疾寄生蟲惡性瘧原蟲、三日瘧原蟲、印 形瘧原蟲、間曰瘧原蟲，且動物瘧疾寄生蟲柏氏癔原蟲 (P. 、約氏瘧原蟲（八少、諾氏瘧原蟲（尸 hiow/eh)及食蟹猴瘧原蟲（p. c>；„owo/gz·)。在另—實施例 中，抗原包含具有霍亂毒素之β子單元之肽。 表現藉由協同減毒VSV表現之抗原決定基之病毒（其中 136326.doc -69- 200932259 外來RNA引導包含其抗原決定基之病毒或其衍生物之抗原 的產生）包括（但不限於）表2中所列之彼等病毒，該表出於 方便及非限制之目的藉由科來列出該等病毒。 在特定實施例中，藉由外來序列編碼之在藉由減毒VSV 感染宿主後表現之抗原顯示流感病毒血球凝集素；人類呼 吸道融合性病毒G醣蛋白（G);麻疹病毒血球凝集素或疱疹 單純型病毒2型醣蛋白gD之抗原性或免疫原性。 表1 ❹ 表現可藉由V S V表現之抗原決定基之寄生蟲及細菌 寄生蟲 細菌 癌原蟲屬 霍亂弧菌 艾美爾球蟲屬(Eimeria spp) 肺炎鏈球菌 線蟲 無乳鏈球菌 住血吸蟲屬(Schistosoma) 釀膿鏈球菌 利什曼原蟲(Leishmania) 腦膜炎奈瑟球菌 淋病奈瑟球菌 白喉棒狀桿菌 金黃素葡萄球菌 表皮葡萄球菌 破傷風梭菌 百曰咳博德特氏菌 嗜血桿菌屬(例如流感) 衣原體屬 腸毒性大腸桿菌 幽門螺桿菌 分枝桿菌屬 表2 表現可藉由VSV表現之抗原決定基之病毒 I.小核酷核酸病毒屬(Picomaviridae) 腸病毒 脊髓灰質炎病毒 柯薩奇病毒 136326.doc -70- 200932259
136326.doc 埃可病毒_ 鼻病毒_ A型肝炎病毒 II. 杯狀病毒科_ 諾沃克病毒群 III. 披衣病毒科(Togaviridae)及黃病毒科(Flaviviridae) 彼衣病毒(例如登革熱病毒(Dengue virus))_ 阿爾發病毒_ 黃病毒(例如C型肝炎病毒)_ 風療病毒_ IV. 冠狀病毒科(Coronaviridae) 冠狀病毒_ V. 彈狀病毒科 狂犬病病毒_ VI. 絲狀病毒科(Filoviridae) 馬堡病毒_ 伊波拉病毒_ VII. 畐!J 黏液病毒科(Paramyxoviridae)__ 副流感病毒 勝腺炎病毒_ 麻療病毒_ 呼吸道融合性病毒_ 間質肺炎病毒 VIII. 正黏液病毒科(Orthomyxoviridae) 正黏液病毒(例如流感病毒)_ IX. 布尼亞病毒科(Bunyaviridae) 布尼亞科病毒(Bunyavirus)_ X. 沙狀病毒科(Arenaviridae)_ 沙狀病毒_ XI. 呼腸孤病毒科(Reoviridae)_ 呼腸孤病毒_ 輪狀病毒_ 環狀病毒_ XII. 逆轉錄病毒科 人類T細胞白血病病毒I型_ 人類T細胞白血病病毒II型_ 人類免疫缺陷性病毒(例如I型及π型） 猴免疫缺陷性病毒 慢病毒_ XIII. 乳多空病毒科(Papovaviridae)_ 多瘤病毒_ 乳頭瘤病毒_ XIV. 細小病毒科(Parvoviridae) 細小病毒 -71 - 200932259 XV. 瘤療病毒科(Herpesviridae) 疮療單純型病毒_ 埃-巴二氏病毒_ 細胞巨大病毒_ 水痘-帶狀范殄病毒_ 人類范療病毒-6_ 人類范療病毒-7_ 猴范療病毒1 (B病毒)_ XVI. 痘病毒科(Poxviridae) 痘病毒_ XVIII. 肝炎病毒科(Hepadnaviridae) B型肝炎病毒 XIX. 腺病毒科 藉由減毒VSV表現之其他抗原包括（但不限於）顯示以下 〇 抗原之抗原性或免疫原性之彼等抗原：脊髓灰質炎病毒I VP1 ; HIV I之包膜醣蛋白；B型肝炎表面抗原；白喉毒 素；鏈球菌24M抗原決定基、SpeA、SpeB、SpeC或C5a肽 酶；及淋病球菌菌毛素。 在其他實施例中，藉由減毒及另外基因修飾之VSV表現 之抗原顯示以下者之抗原性或免疫原性：假性狂犬病病毒 g5 0 (gpD)、假性狂犬病病毒II (gpB)、假性狂犬病病毒gill (gpC)、假性狂犬病病毒醣蛋白Η、假性狂犬病病毒醋蛋白 〇 Ε、感染性胃腸炎醣蛋白195、感染性胃腸炎基質蛋白質、 豬輪狀病毒屬醣蛋白38、豬細小病毒屬衣殼蛋白質、豬赤 痢病原（Serpulina hydodysenteriae)保護性抗原、牛病毒腹 瀉醣蛋白55、新城疫病毒血球凝集素-神經胺酸酶、豬流 感血球凝集素或豬流感神經胺酸酶。 在某些實施例中，藉由減毒及另外基因修飾之VSV表現 之抗原顯示得自犬或貓病原體之抗原之抗原性或免疫原 性，該犬或貓病原體包括（但不限於）貓白血病病毒、犬瘟 136326.doc -72- 200932259 熱病毒、犬腺病毒、犬細小病毒屬及其類似病毒。 在某些其他實施例中，藉由減毒及另外基因修飾之vsv 表現之抗原顯示得自以下病毒之抗原之抗原性或免疫原 ^ 赤痢螺旋體（Serpulina hyodysenteriae)、口蹄疫病毒、 ^扃毒豬肌行性感冒病毒、非洲豬瘟病毒、豬肺炎黴 漿菌（Mycopiasma hy〇pneum〇niae)、牛感染性鼻氣管炎病 毒:例々如牛《性鼻氣管炎病毒聽蛋白£或糖蛋白G)或感染 f侯氣管炎病毒（例如感染性喉氣管炎病毒醣蛋白◦或醣蛋 ❹ 白I)。 在另一實施例中，抗原顯示拉克羅斯病毒（La Cr〇sse Virus)冑生小牛腹渴病毒、委内瑞拉馬腦脊趙炎病毒、 龐塔耗洛病毒（Punta T〇r。Virus)、鼠白血病病毒或小鼠乳 腺瘤病毒之醣蛋白之抗原性或免疫原性。 在其他實施财’ &原顯#人類病原體之抗原之抗原性 或免疫原性，該人類病原體包括（但不限於）人類疱疹病 毒、癌療單純型病毒」、㈣單純型病毒_2、人細胞巨大 =毒、埃_巴二氏病毒、水癌_帶狀癌療病毒、人類范療病 毒：、人類疱疹病毒_7、人類流感病毒、人類免疫缺陷性 病母（1里及/或2型）、狂犬病病毒、麻疹病毒、b型肝炎病 毒C型肝炎病毒、惡性癔原蟲及百日咳博德特氏菌。 用作藉由減毒VSV表現之抗原之可能適用的抗原或其衍 生物係藉由各種標準識別’抗原涉及病原體感染性之中 和31或群特異性、藉由患者抗血清或免疫細胞之識別， 及/或對抗原特異之抗血清或免疫細胞之保護效應的顯 I36326.doc •73· 200932259 示。 在另一實施例中’減毒VS V之外來RNA引導包含抗原決 定基之抗原之產生，該抗原決定基在減毒vsv引入所要宿 主中時’誘導保護以抵抗藉由含有抗原決定基之實體引起 之病狀或病症的免疫反應。舉例而言，抗原可為用於誘導 抵抗腫瘤（例如惡性腫瘤）之保護免疫反應之腫瘤特異抗原 或腫瘤締合抗原。該等腫瘤特異或腫瘤締合抗原包括（但 不限於）KS 1/4 pan-癌瘤抗原；卵巢癌抗原（CA125);前列 © 腺酸式磷酸鹽（Prostatic acid phosphate);前列腺特異抗 原；黑素瘤締合抗原P97 ;黑素瘤抗原gp75 ;高分子量黑 素瘤抗原及前列腺特異膜抗原。 插入減毒VSV DNA之非必需位點中之編碼抗原的外來 DNA視需要另外包含編碼細胞激素之外來DNA序列，該細 胞激素能夠在藉由減毒VSV感染之宿主中表現及刺激免疫 反應。舉例而言，該等細胞激素包括（但不限於）介白素 ❹ 1α、1β、2、4、 5、 6、 7、 8、 10、 12、 13、 14、 15、 16、 17及1 8、干擾素_α、干擾素_ β、干擾素、粒細胞群落刺 激因子、粒細胞巨噬細胞群落刺激因子及腫瘤壞死因子α 及β。 免疫原性及醫藥組合物 在某些實施例中，本發明針對包含免疫原性劑量之基因 6飾之v s v載體的免疫原性組合物，該基因修飾之ν sv載 體在其基因組中包含至少2種不同種類之突變及至少一個 插入對複製而言非必需之VSV基因組之區域中或置換該區 136326.doc -74- 200932259 域的外來RNA，其中2種突變協同地減毒vs V病原性。基 因修飾之VSV可另外如本文中所述藉由在低MOI下將病毒 傳代約5至15代來適應在細胞培養物中之生長，且該進— 步基因修飾及減毒之VSV可用於製備免疫原性組合物。 本發明之協同減毒及基因修飾之VSV載體經調配用於向 哺乳動物受檢者（例如人類）投藥。該等組合物通常包含 VSV載體及醫藥學上可接受之載劑。如下文所使用，語言 醫藥學上可接受之載劑"欲包括任何及所有可與醫藥投藥 〇 相容之溶劑、分散介質、塗層、抗細菌及抗真菌劑、等張 及吸收延遲劑及其類似物。該等介質及藥劑用於醫藥學上 /舌性物質之用途在此項技術中熟知。除非任何習知介質戍 藥劑不可與VSV載體相容，否則該等介質適用於本發明之 免疫原性組合物。補充活性化合物亦可併入組合物中。 因此，本發明之VSV免疫原性組合物係調配成可與其所 欲之投藥路線相容。投藥路線之實例包括非經腸（例如靜 脈内、皮内、皮下、肌肉内、腹膜内）及黏膜（例如，經 口、經直腸、鼻A、經頰、經陰道、經呼吸道）。用於非 經腸、皮内或皮下應用之溶液或懸浮液包括以下組分：無 菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發性油、聚^ 二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶劑；抗菌劑，諸如节醇 或對經基苯甲酸甲醋；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸 t鈉；螯合劑’諸如乙二胺四乙酸；緩衝劑，諸如乙酸 酯、摔檬酸醋或磷酸酉旨；及用於調節張力之藥劑，諸如氣 化鈉或右旋糖。PH係用諸如鹽酸或氫氧化鈉之酸或驗來調 136326.doc •75· 200932259 整。非經腸製劑可封裝於由玻璃或塑膠製成之安瓶、拋棄 式注射器或多劑量小瓶中。 適於可注射用途之醫藥組合物包括無菌水溶液（水溶性 情況下）或分散液及用於臨時製備無菌可注射溶液或分散 液之無菌粉末。就靜脈内投藥而言’適合載劑包括生理鹽 水、抑菌水、十六醇聚氧乙烯醚ELtm (Basf，Parsippany N.J)或磷酸鹽緩衝鹽水（PBS)e所有狀況中，組合物必須無 菌且應達到易於注射之流動程度。其在製造及儲存條件下 〇 必須穩定，且必須經保存以抵抗微生物（諸如細菌及真菌） 之污染作用。載劑為含有（例如）水、乙醇、多元醇（例如甘 油、丙二醇及液體聚乙二醇及其類似物）及其適合混合物 之溶劑或分散介質。舉例而言，可藉由使用包膜（諸如卵 磷脂）、藉由維持所需粒徑（在分散液之狀況下）及藉由使用 界面活性劑來維持適當之流動性。預防微生物之作用係藉 由各種抗菌劑及抗真菌劑（例如對經基苯甲酸、氣丁醇 苯酚、抗壞血酸及其類似物）來達到。在許多狀況中，較 〇 佳在組合物令包括等張劑，例如糖、諸如甘露糖醇、山梨 糖醇之多元醇、氣化鈉。藉由在組合物中包括延遲吸收2 藥劑（例如單硬脂酸鋁及明膠）來產生可注射組合物延長 吸收。 藉由將所需量（或劑量）之於適當溶劑中的vsv栽體與以 上列舉之成份之-或組合合併，按需要接著過據減菌來= 備無菌可注射溶液。一般而言，藉由將活性化合物併入 有鹼性分散介質及來自以上列舉之彼等成份的所需其 136326.doc •76· 200932259 來製備分散液。在用於製備無菌可注射溶 燥，：產兄下，較佳製備方法為真空乾燥及冷凌乾 何額外所要成份的粉末。其先則無菌過滤之溶液的任 劑St由=之投藥而言，化合物係以來自含有適合推進 一氧化碳之氣體或喷霧器）之加壓容器或分 =溶膠噴霧形式來傳遞。全身性投藥亦可藉由黏膜 ❹ 黏膜或經皮投藥而言，在調配物中使用適 ;v t障壁之滲透劑°該等滲透劑通常在此項技術中 口 ’且對黏膜投藥而言，包括（例如）清潔劑、膽汁鹽及 孢酸何生物。黏膜投藥經由使用鼻喷霧或栓劑來實 ^ δ物亦以用於直腸傳遞之栓劑（例如，具有諸如可 =旨及其他甘油s旨之習知栓劑基質）或保留灌腸劑形 製備。 W在某些實施例中’將σ服或非經腸組合物調配成易於投 樂及劑量$ Q = 性之劑量單位形式為有利的。如下文所使 ^ 里單位形式係指適合作為單一劑量用於欲治療之受 檢者的物理離散單元；各單元含有經計算以產生所要治療 效應之預宏县· & & ^ 曰 置的與所要藥用載劑締合之活性化合物。本發 明之劑量單位形式的規格受規定於且直接取決於活性化合 特徵及欲達到之特定治療效應’及出於治療個體 之目的混配該活性化合物之技術中固有的限制。 文中弓丨用之所有專利及公開案在此以引用之方式併 入0 136326.doc -77- 200932259 加載VSV的免疫原性組合物之產生通常包括用重組vs V 感染適合細胞培養物（宿主），在細胞培養物中生長VSV， 在適當時間收穫細胞培養物液體且自細胞培養物液體純化 VSV。VSV載體及其免疫原性組合物在臨床應用中之用途 將需要具有適當純度之VSV樣本（或劑量）以遵守全世界各 種藥物安全性機關（例如，食品及藥物管理局（FDA)、歐洲 醫學機構（EMEA)、加拿大保健品及食物分部（HPFB)等）之 安全規則。 〇 然而，使用現用vsv純化方法（例如，經由蔗糖梯度離 心之純化），通常難以自細胞培養物污染物（例如，細胞培 養物雜質蛋白質及DNA)分離VSV且獲得具有適當純度及 產率之VS V。舉例而言，使用現用純化方法，通常在VSV 樣本之純度與回收率（產率百分比）之間存在相反關係，進 而使其難以製造足夠量之純化VSV。另外，在當今基於生 物反應器之方法中，增加之細胞濃度及更長之培養時間產 生更高vsv效價，伴隨生物反應器液體中之細胞碎片及:有 ® 機成分濃度之增加，進一步使vsV純化方法複雜化。 自1964年起，蔗糖梯度超離心已成為病毒純化（包括 VSV純化）之標準方法（Yamada等人，2003 BioTechniques， 34(5):1074-1078, 1080 ; Brown 等人，1967 J. Immun.， 99(1):171-7 ; Robinson等人，1965 Proc. Natl. Acad. Sci·， USA，54(1):137-44 ; Nishimura#A，1964 Japan.J.Med. Sci. Biol.，17(6):295-305)。然而，隨著病毒濃度增加，亦 發生細胞碎片、宿主DNA及蛋白質雜質之伴隨增加，該等 136326.doc -78- 200932259 細胞碎片、宿主DNA及蛋白質雜質極難在較高濃度下經由 蔗糖梯度超離心來移除。另外，蔗糖梯度超離心對按比例 放大而言極其昂貴。藉由聚乙二醇（PEG)沈澱濃縮及純化 VSV(McSharry等人，1970 Virol.，40(3):745-6)具有相似的 高雜質含量問題。 已經由尺寸排阻層析法獲得相對高品質的病毒 (Transfiguracion 等人 ， 2003 Human Gene Ther., 14(12):1 139-1 153 ; Vellekamp 等人，2001 Human Gene ❹ Ther., 12(15):1923-36 ; Rabotti 等人，1971 Comptes Rendus des Seances de l'Academie des Sciences, Serie D: Sciences Naturelles，272(2):343-6 ; Jacoli 等人，1968 Biochim. Biophys. Acta, Genl Subj.，165(2):99-302)。然 而，由於方法成本及操作困難，其通常對大規模病毒產生 而言不可行。親和性層析法，諸如肝素（Zolotukhin等人， 1999 Gene Ther.，6(6):973-985)、凝集素（Kaarsnaes等人， 1983 J. Chromatog.，266:643-9 ; Kristiansen 等人，1976 ® Prot. Biol. Fluids, 23:663-5)及 MatrexTM CelluHne™硫酸醋 (Downing等人，1992 J. Virol. Meth·，38(2):215-228)已在 病毒純化中發現一些應用。肝素及凝集素通常由於可能的 浸濾問題對cGMP病毒產生不為較佳的（或適用），其需要在 產品發布之前的額外測試。 由於病毒純化之效率、病毒品質及管柱再生，使用 Matrex™ CelluHneTM4酸醋之病毒之親和力純化為尚未解 決的問題。對VSV純化而言，需要極大的親和力管柱（例 136326.doc -79- 200932259 如每公升細胞培養物0.2 L Matrex™ Cellufine.以硫酸酯樹 脂；Wyeth Vaccine未經公開之結果）。當經由離子交換層 析純化（單獨或與用於病毒純化之其他類型傳統層析技術 組合）時，觀察到低病毒產率（國際專利公開案第WO 2006/01 1580 號；Specht 等人，2004 Biotech. Bioeng.， 88(4):465-173 ; Yamada 等人，2003，引用於上文；
Vellekamp等人，2001引用於上文；Zolotukhin等人’ 1999，引用於上文；（國際專利公開案第WO 1997/06243 〇 號；Kaarsnaes等人，1983’引用於上文）。 實例 以下實例演示本發明之某些態樣。然而，應瞭解’該等 實例係僅用於說明且不表明完全限定本發明之條件及範 疇。應瞭解，當已給定典型反應條件（例如溫度、反應時 間等）時，亦可使用高於或低於特定範圍之條件’儘管通 常較不便利。除非另有指定’否則本文中提及之所有份數 及百分比均係以重量計且所有溫度以攝氏度來表達。 〇 實例1 :用VSV印第安納（IN)及VSV新澤西（NJ)血清型之病 毒傳代研究 圖1說明VSV及αίΜ VSVN4CTl-gagl之基因組組織。 圖2為用於在Vero細胞中連續傳代病毒之實驗協定的概 述。藉由所指示檢定分析處於每個第5傳代之病毒。圖8a 8L展示VSV印第安納血清型之原始（傳代〇或p〇)病毒及第 25次傳代之核苷酸（NT)及胺基酸（AA)序列的比較。傳代病 毒中之NT及AA取代以粗體展示。圖9A-9M展示VSV新、'舉 136326.doc -80 - 200932259 西血清型之原始（傳代0或P0)病毒及第25次傳代之核苷酸 (NT)及胺基酸（AA)序列的比較。傳代病毒中之NT及AA取 代以粗體展示。該等序列概述於表5及序列表中。 減毒rVSVINN4CTlGagl係用作在Vero靜止培養物中傳代 之起始物質。在於DMEM(不含血清、不含抗生素）中之 0.01之病毒感染倍率下，用減毒病毒接種T25燒瓶中之 Vero細胞。在3 2 °C下將燒瓶培養2至3天，此時病毒細胞病 變效應（CPE)在90-100%之細胞單層中明顯。收穫培養基， © 藉由低速離心（1500 rpm，10 min)澄清。添加1 X蔗糖磷酸 鹽（SP)緩衝液（最終濃度）後，在乾冰乙醇浴中將澄清病毒 急驟冷凍且在S-60°C下儲存。該病毒標記為 rrVSVINN4CTlGag之第1傳代或P1。該病毒同樣用於在 0.01之moi下接種具有Vero細胞之新鮮T25燒瓶以產生P2。 重複該方法（稱為連續傳代）25次以製得P1至P25病毒。在 各次傳代時，藉由對於Vero單層執行之感染性檢定將病毒 定效價。 〇 在使用VSVin血清型之連續傳代後，胺基酸取代之增加 展示於圖3中。在0.01之MOI下，在Vero細胞中傳代之 VSVin病毒的生長動力學展示於圖5中。 在使用VSVnj血清型之連續傳代後，胺基酸取代之增加 展示於圖4中。在0.01之MOI下，在Vero細胞中傳代之 VSVnj病毒的生長動力學展示於圖6中。 實例2:重組VSVN4CT1GAG1之產生 VSV印地安血清型（VSVin)之適應組織培養之聖胡安 136326.doc -81 - 200932259 (San Juan)株及其相應基因組cDNA藉由Yale University， New Haven, CT 之 Dr. John K. Rose 提供，且用於衍生 rVSVN4CTlgagl 重組體。 早先已描述用於製備rVSVinN4CTlgagl質體DNA之詳細 程序（Clarke等人，J Virology，81，2056-64, 2007及 Cooper 等人，J Virology，82:207-29, 2008)。類似NJ血清型醣蛋白 載體rVSVnjN4CTlgagl係藉由用Gnj基因之截斷形式置換 Gin基因來產生且已描述於Cooper等人，2008中。圖1示意 〇 性描繪得自wt VSV之減毒VSV重組體之基因組内的病毒基 因之順序。 自基因組cDNA回收感染性病毒，接著用含有全長基因 組之病毒基因組質體及5種個別地編碼VS V N、P、L、Μ 及G蛋白質之表現質體轉染Vero細胞。自該等質體之表現 係處於T7 RNA聚合酶啟動子之控制下。藉由在人細胞巨 大病毒即刻早期啟動子/強化子區之控制下，編碼T7 RNA 聚合酶之質體之電穿孔來提供聚合酶。藉由無性分離3至4 ® 次純化所援救之rVSV且藉由在Vero細胞中傳代3次來擴 增。病毒援救及所有隨後純化及擴增係在Vero細胞中執 行。用於病毒援救之胎牛血清（FBS)具有新西蘭起源。援 救後之所有步驟在不含血清培養基（DMEM)中執行。無性 純化後之所有步驟在不含血清、不含抗生素培養基 (DMEM)中執行。 簡言之，將來自T150燒瓶之大致2.0x1 07個Vero細胞置 放於含有10 pg rVSVINN4CTlGagl全長病毒cDNA質體及5 136326.doc -82· 200932259 種在T7啟動子控制下編碼VSV N、P、L、Μ及G蛋白質之 支持質體（分別為10、4、1、1、2 pg)的管中。添加50 pg 之第七質體以提供T7 RNA聚合酶；該質體藉由細胞RNA 聚合酶II控制。使懸浮液經受電穿孔，且使細胞再懸浮且 轉移至T150燒瓶中。在37°C下將燒瓶培養3小時；在43°C 下熱震盪5小時且隨後在37°C下培養隔夜。第二天置換培 養基且在次曰，在32°C下培養燒瓶。各工作日檢查燒瓶之 CPE徵象。密切觀測展示CPE徵象之燒瓶直至其達到80-〇 1 〇〇% CPE。在該點，收穫含有援救病毒之培養基（援救上 清液），用IX SP1作為病毒穩定劑來補充，急驟冷凍且在 <-60°C下儲存。就Gag表現而言，藉由西方墨點分析，使 用Gag特異單株抗體篩選所有援救上清液；使展示Gag表 現之援救病毒經受病毒基因組定序。選擇具有正確序列之 各血清型之一或多個病毒純系用於進一步空斑純化及擴 增。 在具有建它黴素（Gentamicin)且無血清之DMEM中，在 ® 具有瓊脂覆層之6孔板中，對於Vero細胞執行病毒空斑 化。在DMEM中稀釋含有感染性病毒之援救上清液以便達 到每孔<5個空斑。拾取大量良好分離之空斑，將其懸浮於 DMEM中且額外經受2至3輪空斑純化。拾取來自第四次選 殖_之領導空斑（lead plaque)且使其懸浮於DMEM中且隨後 用於分別在6孔板、T25燒瓶及T150燒瓶中，在Vero細胞上 之3次連續病毒擴增。使用無血清且無抗生素之DMEM執 行擴增。藉由該方法獲得之重組病毒稱為低傳代病毒且如 136326.doc -83 · 200932259 下文所述進一步用於在Vero細胞中傳代以用於細胞適應。 實例3:用於連續傳代之實驗協定 如圖2中所示，在τ-25燒瓶中，於vero細胞單層上將各 血凊型之低傳代vsv重組體（p〇)連續傳代25次。在約〇 之病毒感染倍率（M〇I)下，用病毒感染在不含血清培養基 中生長之Vero細胞且在32°c/5% c〇2恆溫箱中培養直至可 見廣泛CPE，通常在感染後48至72小時内可見。各次擴增 後’藉由低速離心澄清病毒培養物且用1X sp蔗糖磷酸鹽 © 緩衝液來穩定。10X SP每公升含有磷酸二氫鉀12 2 gm ; 鱗酸一氫鉀5.17 gm ;蔗糖746.2 gm。如早先所述，藉由空 斑檢定將來自第1至25傳代之病毒培養物定效價（Ciarke等 人，J. Virol.，81: 2056-64, 2007)。對每個第五傳代執行核 苷酸定序。 實例4 :小鼠IC LD50研究結果 小鼠IC LD50研究 年幼小鼠對顱内接種（1C)後經VSV之感染高度敏感，引 起快速發病及死亡。已展示小鼠IC LD50神經毒性動物模 型為高度敏感的且能夠辨別VSV重組體之病毒性改變 (Clarke等人，J. Virol.，81，2056-64, 2007)。因此，接受 wt VSVin之小鼠顯著地損失體重且在接種後2至4天死亡， LD50為1至2 pfu。另一方面，含有CT截斷或基因洗牌之病 毒展示比wt VSV減毒更多，LD50為12至21 pfu(Clarke等 人，J· Virol” 81，2056-64，2007)。然而，當CT1突變與基 因洗牌（N4及或gagl)突變組合時，可見病毒性之顯著降 136326.doc 84 - 200932259 低。舉例而言’低傳代rVSVinN4CTlgagi顯示極低水準之 病毒性’ LD50為>107 pfu ’該動物模型中測試之最高劑 量。經該病毒接種之小鼠最初在接種後損失其體重之1 〇至 20%，但在約2至3週内恢復至正常體重。對於病毒之犯血 清型見到相似結果（Cooper等人，J Virology，82 207-29 2008)。 在鼠科IC LD50動物模型中測試處於各血清型（in&nj) 之第I5至25傳代之本發明的適應Vero之VSVN4CTlgagl ; 〇 如圖7中所示，未見病毒性之增加，對所有傳代病毒而言 LD50為>1〇7 pfu«該等結果展示在細胞培養物中傳代之病 毒中增加的適應性突變不影響病毒之病毒性。低病毒性連 同其達到兩效價之增強複製使傳代病毒適於在人類臨床試 驗中測試。 方法 小鼠IC LD5 0研究之實驗細節由人給出（Clarke 等人，J· Vir〇1·，81，2056·64, 2007)及 Cooper 等人（c〇〇per 〇 等人，J Viro10 訂，82, 207-29, 2008)。將 5週大雌性8“
Webster小鼠麻醉且用呈30 μ丨體積之病毒之1〇倍稀釋液來 1C注射（每次稀釋10隻動物，所製得稀釋液在預期[仍〇周 圍之範圍内變化）。每天記錄體重及健康狀態歷時2週。將 變為雙侧麻痹或展示病痛或嚴重疾病之顯著徵象之小鼠處 死且記錄為死於VSV疾病。藉由Reed& Muench(Am J.
Hyg. 27, 493-97, 1938)之方法測定LD5〇。 概述 136326.doc -85- 200932259 與早期傳代rVSVN4CTl-gagl病毒（P〇)相比，連續傳代 之P1 5病毒生長至更高效價。其促進臨床試驗材料 之大規模製造。另外，在CTM產生期間，達到pi5時之適 應性突變之穩定性提供病毒製造批量與批量間之—致性。 此外’如藉由鼠科IC LD50動物模型所測試，傳代病毒之 安全概況仍未改變，進而維持臨床評估之適合性。 實例5 :經加載HIV之按比例放大 用Vero細胞，以大致5xl〇5個細胞/mL接種含有7.5公克/L © 之Cytodex I微載劑之10 L生物反應器（8 L工作體積）。在 37°C下’用每天0.5培養體積之Gibco VP-SFM培養基（有或 無紛紅）灌注生物反應器。70-90小時後或當細胞密度為 22><106個細胞/1^時’在32。(：下，在0.001之]^〇1下用低傳 代（SP5)或咼傳代（P15)VSV N4CTl-gagl病毒感染培養物。 每天將培養物取樣2-3次且最終在感染後48-60小時收穫。 將印第安納血清型按比例放大至1〇公升生物反應器，測 試低傳代（SP5)及高傳代（P15)病毒。使用低傳代病毒材料 ® (實線）完成生物反應器運作X-BRN10-VSV-14、17及28以 感染培養物。使用高傳代研究病毒種子（虛線）完成生物反 應器運作X-BRN10-VSV-3 1、33及34。各次運作之生長動 力學展示於圖10中。病毒之傳代編號指示於圖之圖例中之 括號中。 對高及低傳代運作而言，各組運作彼此一致。高傳代生 物反應器運作比低傳代運作產生高至多2個對數之效價。 基於尚傳代材料之生長動力學，收穫時間確定為感染後大 136326.doc • 86 · 200932259 致48小時。 將新澤西血清型按比例放大至1 0公升生物反應器’再次 測試低傳代（SP5)及高傳代（P15)病毒。使用低傳代病毒材 料（實線）完成生物反應器運作X-BRN10-VSV-15、18、 19、20、22及23以感染培養物。使用高傳代研究病毒種子 (虛線）完成生物反應器運作X-BRN10-VSV-36及37。各次 運作之生長動力學展示於圖11中。
對新澤西構築體而言，低傳代與高傳代運作之間存在比 對印第安納構築體所觀察到更少之差異。基於高傳代材料 之生長動力學，與對VSVinN4CTl-gagl之狀況一樣’ VSVnjN4CTl-gagl之收穫時間確定為感染後大致48小時。 總之，對印第安納而言，P15 N4CTl-gagl產生生物反應器 效價之約35倍增加及每個細胞所產生之病毒粒子數量的45 倍增加，且對新澤西而言，產生生物反應器效價之約5倍 增加及每個細胞所產生之病毒粒子數量的7倍增加。（參見 表3及4)
表3 : vSVinN4CTl-gagl生物反應器運作之比較
136326.doc -87- 200932259 表4 : VSVnjN4CTl-gagl生物反應器運作之比較 運作ID 傳代數 培養物 體積(L) 感染時之細胞密 度(細胞/mL) 收穫時 間(hpi) 峰效價 每個細胞之 病毒粒子 BR-15 P1 8.0 3.52 X 10b 72 5.28 χ 1〇ύ 1.5 BR-18 P3 8.0 3Λ)6 χ 106 72 1.72 χ 1〇7 5.6 BR-19 P3 7.0 136 χ 106 66 1.46 χ 10' 4.3 BR-20 P3 7.0 3.65 χ 10G 66 7.26 χ 1〇ύ 2.0 BR-22 P4 7.0 4^27 χ 106 50.5 3.41 χ 10^ 8.0 BR-23 P4 7.0 2.78 χ ΙΟ6 47 1.07x10' 3.9 BR-36 P16 8.0 2.42 χ ΙΟ6 72 5.57x10, 23.0 BR-37 P16 8.0 2.31 χ ΙΟ6 50.3 8.36 χ1〇Ί 36.2 表5 不同傳代後之VSV印第安納及新澤西株之序列描述(參見圖8及9) SEQ ID NO 描述 1 VSV印第安納(gagl)DNA :傳代編號25 2 VSV印第安納(gagl)蛋白質：傳代〇 3 VSV印第安納(gagl)蛋白質：傳代編號25 4 VSV新澤西(gagl)DNA :傳代編號25 5 VSV新澤西(gagl)蛋白質：傳兩 6 VSV新澤西(gagl)蛋白質：傳代編號25 【圖式簡單說明】 圖 1 : wt VSV 及 attn VSVmCTl-gagl(IN 及 NJ 血清型）之 示意基因組組織。 圖2 :用於在Vero細胞中連續傳代病毒之實驗協定的概 〇 述。藉由所指示檢定分析處於每個第5傳代之病毒。 圖3 :在Vero細胞中連續傳代後，減毒vsv (rVSVinN4CTl-gagl)病毒之IN血清型中增加之適應性胺基 酸取代。 圖4 :在Vero細胞中連續傳代後，減毒vsv (rVSVnjN4CTl-gagl)病毒之NJ血清型中增加之適應性胺基 酸取代。 圖5 :傳代水準對減毒1'VSVinN4CTl -gagl病毒之in血清 136326.doc • 88 - 200932259 型之生長動力學的效應。連續傳代產生產率之顯著增加， 其超過2107 PFU/ml之製造目標。第15次傳代後，不存在 生長之顯著改變。 圖6 :傳代水準對減毒rVSVnjN4CTl-gagl病毒之NJ血清 型之生長動力學的效應。 圖 7 :在如 Cooper等人，J Virology, 82，207-29, 2008 中 所述之小鼠顱内（IC)LD50動物模型中，rVSVinN4CTl-gagl 傳代病毒P〇至P25之神經毒性（NV)測試之結果。 〇 圖8A-8L : VSV印第安納血清型之原始（傳代0或P0)病毒 及第25次傳代之核苷酸（NT)及胺基酸（AA)序列的比較。傳 代病毒中之NT及AA取代以粗體展示。 圖9A-9M : VSV新澤西血清型之原始（傳代0或P0)病毒及 第25次傳代之核苷酸（NT)及胺基酸（AA)序列的比較。傳代 病毒中之NT及AA取代以粗體展示。 圖10 :使用低及高傳代病毒，VSVinN4CTl-gagl生物反 應器運作之生長動力學。 〇 圖11 :使用低及高傳代病毒，VSVnjN4CTl-gagl生物反 應器運作之生長動力學。 136326.doc 89-
Ο 200932259 序列表 <11〇>美商惠氏 <120>基因修飾之減毒水皰性口炎病毒，組合物及其使用方法 <130> ΑΜ102885 <140> 097149975 <141> 2008-12-19 <150> 61/015,868 <151> 2007-12-21 <160〉 6 <170> Patcntln version 3.3
<2I0> I <211> 15732 <2I2> DNA <2]3>水皰性口炎病毒 <400> 1 acgaagacaa acaaaccatt attatcatta aaaggctcag gagaaacttt aacagtaatc aaactcgagg gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg gggagaatta gatcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaataiaa attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttca£ac aggatcagaa gaacttagat caitatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagaaa aaagcacagc aagcagcagc tgacacagga cacagcaatc aggtcagcca aaattaccct atagtgcaga acatccaggg gcaaatggta catcaggcca tatcacctag aactttaaat gcatgggtaa aagtagtaga agagaaggct ttcagcccag aagtgatacc catgttttca gcattatcag aaggagccac cccacaagat ttaaacacca tgctaaacac agtgggggga catcaagcag ccatgcaaat gttaaaagag accatcaatg aggaagctgc agaatgggat agagtgcatc cagtgcatgc agggcctatt gcaccaggcc agatgagaga accaagggga agtgacatag caggaactac tagtaccctt caggaacaaa taggatggat gacaaataat ccacctatcc cagtaggaga aatttataaa agatggataa tccigggatt aaataaaata giaagaatgt alagccctac cagcattctg gacauagac aaggaccaaa agaacccttt agagactatg tagaccggtt ctataaaact ctaagagccg agcaagcttc acaggaggta aaaaattgga tgacagaaac cttgttggtc caaaatgcga acccaaattg taagactatl ttaaaagcat tgggaccagc ggctacacta gaagaaatga tgacagcatg icagggagta ggaggacccg gccataaggc aagagttttg gctgaagcaa tgagccaagt aacaaattca -gctaccataa tgatgcagag aggcaatttt aggaaccaaa gaaagattgt taagtgtttc aattgtggca aagaagggca cacagccaga aattgcaggg cccctaggaa aaagggctgt tggaaatgtg gaaaggaagg acaccaaatg aaagattgta ctgagagaca ggctaattti ttagggaaga tctggcctlc ctacaaggga aggccaggga attttcttca gagcagacca gagccaacag ccccaccaga agagagcttc aggtctgggg lagagacaac aactccccct cagaagcagg agccgataga caaggaactg tatcctltaa cttccctcag atcactcttt ggcaacgacc cctcgtcaca ataatcgcta gcatattatg ctacatatga aaaaaaclaa cagatatcat 136326·序列表.doc 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 200932259
ggaiaatctc aggagagata agaggatgga cacagaaict tgagcaagtt tgttgtaut ctiacggtig gattaaagca atcgggagaa tccagtgatg aaagacatcc ggatgaattg tcataaagag caaatat tct aatccat tea tctaagaaat ccgagcgctc aatcaat taa ccgttcagaa ggaatggcag aaggccactc ggcagggctt cact tcagaa atetaegatg aaattttctg tctggagcgt ttctgaacaa tcctgtcttt agagaatcat aatacccggc aaagtttgtc tcatacatgt aagattggtc accttgtatc gaaccagcgc gaacacaaat tgatcaatga acaaaagt tc gatgagateg giggaagage gaaccagaaa gaaggcttta acttcggact acatcgccag gtcgtgcaaa ggggtcatta aacacacatc atgactttcc ttcicatcta gccatcctgc ctgtagacia tcatgagltc tagggatege caattgacaa gatatgagaa catactcaga ggaaacgtcc cagcggtatt atttgcaaca gaccattcaa atgagtcact atttcagaga gggtcctgga iccccggttt tctatcccta tgacaacaca agattaette agatetaaga caacagctac aagtttcgga ettgaaagee agatgacaaa gcctgaatac acagtttgaa gtgagtatet aagcacaacg atactaagcc itgaagacaa tacaggggcc ggaaacagcc agggtttaag gtgccaaata tgaaggagcg cgtcccaatc aacccaagaa gaggagagtt tcggcctgag tgaaaaaaag ettaaagaag accaccccct atcctatttt attettettt tgtggcagcc ct tctacaaa ggcagatcaa taggatgggg tataggtett ggaageaget gaaggeetta cictatcggc actcagtctc tgaaaaaaac gtcgtagttc agaaaatcaa ggatatgtct ttgtatggag ataaacatcg ctggacggcg tggttgcctt agaaaaaagc cctcttgtgc caagtcctat agctgaaaag ctcttatttt tcaaggcttg tttagatgac tgagcttgaa tggagagcag ctggaatctg ccagataact agaageagta agcaagtctt catctctgtc atacaaaaag taacagatat attctcggtc tatgaagagg ggagttgacg acagtgaaaa gctgtatccc atettggett ggtcaaccag aagacccctc lacaagggaa cctatgatct algittggcc cacttcaaat ccctaattcc taacagtaat caaaacttcc aggagattcc accaaggcct cattaaagga ggaaagcagg tacttccaga igtatctact tcatggatgg cagaaggtcg tctcglctgg tccaaitatg caggcagcag tatgcaccag tatgeagatg tetgaegage aaatcccagt gcagagtgca ccggaigtat tcagaigtt t cagcctctca ggaggtgacg ttgtacaatc cacgatctaa tgaaggggaa acactagcat agatggacac tgacggttag attgggatca ttttgggitc agtatcacgc ccatgctcaa egattgaget gggatcattt igattgtega gagetagtet agcctctcga caaaatgtct tgcaaatgag tctttacaic caaatccgga catccggggi ggatacaatc tggagtateg tgget tatac gctgacaaat tgacattttt atcaggcggt agttgttcca atgattctga atccagaagc aggaagtgga atggaaagac ggetuegae catttgaagc ataaggteae ggtcictctc ccatatcctt gacgaatgtc aggegagagt gtgttatccc aggtaagaaa ggagtatget ctatgatccg atetaategt catgtacatc ttetaateta tcactgcgaa tgtaccagag cacaatgacc caattcttcc gaaaaaggca aaettetage acaactaata gttacagtca gatccagtgg aatactacaa aatgiatcaa aagttggata ggaatatttg gatgcttcca agagtgggca caatgcaaaa gatgtgiggg 1680 1740 1800 I860 1920 1980 2040 2100 2] 60 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 -2· 136326·序列表.doc
Ο 200932259 gaaatgacag taattacaca aaaattgtcg ctgcagtgga catgttcttc cacatgttca aaaaacatga atgtgcctcg ttcagatacg gaactattgt ttccagattc aaagattgtg ctgcattggc aacatttgga cacctctgca aaataaccgg aatgtctaca gaagatgtaa cgacctggat cttgaaccga gaagttgcag atgaaatggt ccaaatgaig citccaggcc aagaaattga caaggccgai tcatacatgc cttatttgat cgactttgga ttgtcttcta agtctccata ttcttccgtc aaaaaccctg ccttccactt ctgggggcaa ttgacagctc ttctgctcag atccaccaga gcaaggaatg cccgacagcc tgatgacati gagtatacat ctcttactac agcaggtttg ttgtacgctt atgcagtagg atccictgcc gactiggcac aacagttttg tgttggagat aacaaataca ctccagatga tagtaccgga ggattgacga ctaatgcacc gccacaaggc agagatgtgg tcgaatggct cggatggttt gaagatcaaa acagaaaacc gactcctgat atgatgcagt atgcgaaaag agcagtcatg tcactgcaag gcctaagaga gaagacaatt ggcaagtatg ctaagtcaga atttgacaaa igaccctata attctcagat cacctattat atattatgcl acatatgaaa aaaactaaca gagatcgatc tgtttacgcg tcactatgaa gtgccitttg tacttagcct ttuattcat tggggtgaat tgcaagttca ccatagtttt iccacacaac caaaaaggaa actggaaaaa tgttcdtct aattaccatt attgcccgtc aagctcagat ttaaattggc ataatgactt aataggcaca gccttacaag tcaaaatgcc caagagtcac aaggctattc gagcagacgg ttggatgtgt catgcitcca aatgggtcac tacttgtgat ttccgttggt atggaccgaa gtatataaca cattccatcc gatccttcac tccatctgta gaacaatgca atgaaagcat tgaacaaacg aaacaaggaa cttggctgaa tccaggcttc cctcctcaaa gttgtggata tgcaactgtg acggatgccg aagcagtgat tgtccaggtg acicctcacc atgtgctggt tgatgaatac acaggagaat gggttgattc acagttcatc aacggaaaat gcagcaatta catatgcccc actgtccata actctacaac ctggcattct gactataagg tcaaagggct atgtgattct aacctcaitt ccatggacat caccttcnc tcagaggacg gagagctatc atccctggga aaggagggca cagggttcag aagtacctac tttgcttatg aaactggagg caaggcctgc aaaatgcaat actgcaagca ttggggagtc agactcccat caggtgtctg gttcgagaig gctgaiaagg atctctttgc tgcagccaga ttccctgaat gcccagaagg gtcaagtatc tctgctccat ctcagacctc agtggatgta agtctaattc aggacgtlga gaggatcttg gattattccc tctgccaaga aacctggagc aaaatcagag cgggtcttcc aatctctcca gtggatctca gctatcttgc tcctaaaaac ccaggaaccg gtcctgcttt caccataatc aatggtaccc taaaatactt tgagaccaga tacatcagag tcgatattgc tgctccaatc ctctcaagaa tggtcggaat gatcagtgga actaccacag aaagggaact gtgggatgac tgggcaccat atgaagacgt ggaaattgga cccaatggag ttctgaggac cagttcagga tataagtttc ctttatacat gatiggacat ggtatgttgg actccgatct tcatcttagc tcaaaggctc aggtgttcga acatcctcac attcaagacg ctgcttcgca acttcctgat galgagattt tattttttgg tgatactggg ctatccaaaa atccaatcga gcttgiagaa ggttggttca gtagttggaa aagctctau gcctctttu tcutatcai agggitaaic attgtactat tctiggttct ccgataagct agccgcctag ccagattctt catgtttgga 136326-序列表.doc 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 200932259 ❹
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G tatccgacaa cgtctaattg gtcttatcca tacaagccat tcattgctaa atattattgt aataaagaca cctgtttait aatcccctgc cggagtatat tccggaggga agtctgttag ctagaaact t ccatctgact gggcttcaaa aaaattgaga atctacaaga ggtcccatgt gaagtatata tct tccatca gccagagcaa cctgatcctt tctcatgcgg ttttatatgg ccgaaccccc ttttggclga cagcaatcat tggagtacta atcgggaact aatgagatct ttgcgaagaa tctatactga atgaggagac tttttatttt cgcggtccga cccccgcggg gcaataacta gcaaccgtga aaaagggaaa tagacttcat ttttatctgg gatcaggaga gtccagagga tgagctatcc atacgaccac tgtccggaat tacatggaal tgactgctgc aattatcagg taggaggaga tatgtgaccc ttgatttaat cgaatgttag ctiatggaac tcaagacggt tggtatgtaa atgaatcctg agaaggttag ttgtaaacat ctgcct taaa cgattatatc catcagatgg gtttgatgga tcccgattag gaggtgatgg ggatcagatc tgttcaatca acacaggaat tgttgaagag tccaaacttt tttatctggt cctgggcatc gctgctaaca gcataacccc tatgggggtg atacagatca tggaccattc gaaagataag ggggtgggaa aatcagacat cccttgggga cccttaccca caggttgggc gggaatccat attactacga gtcagtcatg taaatcgaga aaggacttgg tgtaatggat aaattatgtg atatatttgt cgacttagtt aggtttgaag gaaaaacctg tacatacttt tgagactatg alcaictgat gtattataac aattgcacaa gaaagacatt gtgggaggct gctcccaaaa tctggaattg gctatglcgt gattgaatgg tgacctacac aagtatgaaa tttgtggtct cgaaggagga aagcccgaaa ttggggcctc attgtcagaa cattattcac tctatttcca aatgagttga gacatacatg gcttgcaagt agggaatcca aagatgctag caattaccaa tacagggact gaaaatgtgc cgaggcgcct tgigtaaatg gactatttcc atggaagt tc caccggattt gagagcgaaa caaacagaat aaattaatcg tacgcat tcc accttgacag ctacaaatat agacctgcag atcaatcata aatgtgggga ccactatatc gtttcagtaa gatacccgaa gtccgaaacc acagtggata atcaatagac gaggaaaaci aaaactttga tcgtgggtcg cgtcgtccac ggaagctgag taaacgggtc attacttcaa aattatggti ccaccctctt gagagctggc tgaaattctt tcgggattgc gagggacaat agatgcctcc ctggcgctca tcttgagttg atagcagagg ctcctgagcc gtgaaacatg tccgactcaa gggattcttc iggatgagca agaatgcagi ttagtagttc atgaacccaa agtcatcaga glattccctc tcggagiacc atttattgac tcagagtagg tcgctataac aacagtgttt aaggaggata tttcagactc aagttcgtct atcatttgaa gaatttcaaa ctiggagaga tccttaagac gcatggcatc tcggatggct ttggctgctg ngaggggtt ataccaatgc attctcagat gcaaatccta aaatctttct caccaaggac taaggataat tacaacaatc aagaatccaa ttataaaatt tggagacggc aatattcaat ccccagtgcc ttgggaatat agcaggcttg tactagcctg aggagtttta aacaatcctt tcaaacgtct tcccgattgg acaggaattt ccaattcatt cacgggtgtg cattagcctt accgatacct tggtataagc agcaguarc caagcagaag cttggcccca aaatccaltc atggtcaaat agaagaccgg ttaaaaaatc cctcugtgg tccacctcct aagggagggg ccaccgctga ttttgctgaa 10680 10740 10800 10860 10920 10980 13040 11100 11160 11220 11280 11340 11400 11460 11520 11580 11640 11700 11760 Π820 11880 11940 12000 12060 12120 12180 12240 12300 12360 12420 12480 12540 12600 12660 12720 12780 12840 • 6- 136326-序列表.doc 200932259 ❹
aggaggaact tcccittagt tgaaattgtt gcctggggtg ttccagtcgg ggcggtttgc gttcggctgc tcaggggata aaaaaggccg aatcgacgct ccccctggaa tccgcctttc agttcggtgt gaccgctgcg tcgccactgg acagagttct tgcgctctgc caaaccaccg aaaggatctc aactcacgtt ttaaattaaa agttaccaat atagttgcct cccagtgctg aaccagccag cagtctatta aacgttgttg ttcagctccg gcggttagct ctcatggtta tctgtgactg tgctcttgcc ctcatcattg tccagttcga agcgtttctg acacggaaat ggttattgtc gttccgcgca atatccggat gagggttaat atccgctcac cctaatgagt gaaacctgtc gtattgggcg ggcgagcggt acgcaggaaa cgttgctggc caagtcagag gctccctcgt tcccttcggg aggtcgttcg ccttatccgg cagcagccac (gaagtggtg tgaagccagt ctggtagcgg aagaagatcc aagggatttt aatgaagttt gcttaatcag gactccccgt caatgatacc ccggaagggc attgtlgccg ccattgctac gttcccaacg ccttcggtcc tggcagcact gtgagtactc cggcgtcaat gaaaacgttc tgtaacccac ggtgagcaaa gttgaatact tcatgagcgg catttccccg cgagacctcg ttcgagcttg aattccacac gagctaactc gtgccagctg ctcttccgct atcagctcac gaacatgtga gtmtccat gtggcgaaac gcgcictcct aagcgtggcg ctccaagctg taactatcgt tggtaacagg gcctaactac taccttcgga tggttttttt tttgatcttt ggtcatgaga taaatcaatc tgaggcacct cgtgtagata gcgagaccca cgagcgcaga ggaagctaga aggcatcgtg atcaaggcga tccgalcgtt gcataattct aaccaagtca acgggataat ttcggggcga tcgtgcaccc aacaggaagg catactcttc atacatattt aaaagtgcca atactagtgc gcgtaatcat aacatacgag acattaattg cattaatgaa tcctcgctca tcaaaggcgg gcaaaaggcc aggctccgcc ccgacag^ac gttccgaccc ctt tctcata ggctgtgtgc cetgagtcca attagcagag ggctacacta aaaagagug gtitgcaagc tctacggggt itatcaaaaa taaagtatat atctcagcga actacgatac cgctcaccgg agtggtcctg gtaagtagtt gtgtcacgct gttacatgai gtcagaagta cttactgtca ttctgagaat accgcgccac aaactctcaa aactgatctt caaaatgccg ctttitcaat gaatgtattt cctaaattgt ggtggagctc ggtcatagct ccggaagcat cgttgcgctc tcggccaacg ctgactcgct taatacggtt agcaaaaggc cccctgacga tataaagata tgccgcttac gctcacgcig acgaaccccc acccggtaag cgaggtatgt gaaggacagt gtagctcttg agcagaitac ctgacgctca ggatcttcac atgagtaaac tctgtctatt gggagggctt ctccagattt caacttiatc cgccagttaa cglcgtttgg cccccatgti agttggccgc tgccatccgt agtgtatgcg atagcagaac ggatctiacc cagcatcttt caaaaaaggg attattgaag agaaaaataa aagcgttaat cagcttttgt gtttcctgtg aaagtgtaaa actgcccgct cgcggggaga gcgctcggtc atccacagaa caggaaccgt gcatcacaaa ccaggcgttt cggatacctg taggtatctc cgtlcagccc acacgactta aggcggtgct atttggtatc atccggcaaa gcgcagaaaa gtggaacgaa ctagatcctt ttggtctgac tcgttcatcc accatctggc atcagcaata cgcctccatc tagtitgcgc tatggcttca gtgcaaaaaa agtgttatca aagatgcitt gcgaccgagt tttaaaagtg gctgttgaga tactttcacc aataagggcg catttatcag acaaataggg attttgttaa 12900 2960 3020 3080 3140 3200 3260 3320 3380 3440 3500 3560 3620 3680 3740 3800 3860 3920 3980 4040 4100 4160 4220 4280 4340 4400 4460 4520 4580 4640 4700 4760 4820 4880 4940 5000 5060 5120 136326-序列表.doc 200932259 aattcgcgtt aaatttttgt taaatcagct cattttttaa ccaataggcc gaaatcggca aaatccctta taaatcaaaa gaatagaccg agatagggtt gagtgttgtt ccagtttgga acaagagtcc actattaaag aacgtggact ccaacgtcaa agggcgaaaa accgtctatc agggcgatgg cccactacgt gaaccatcac cctaatcaag ttttttgggg tcgaggtgcc gtaaagcact aaatcggaac cctaaaggga gcccccgatt tagagcttga cggggaaagc cggcgaacgt ggcgagaaag gaagggaaga aagcgaaagg agcgggcgct agggcgctgg caagtgtagc ggtcacgctg cgcgtaacca ccacacccgc cgcgcttaat gcgccgctac agggcgcglc ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggigcggg cctcttcgct attacgccag clggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gg
<2】0> 2 <211> 4007 <212> PRT
O 15180 15240 15300 15360 15420 15480 15540 15600 15660 15720 15732 <2丨3>水皰性口炎病毒 <400> 2
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15
Glu Lys lie Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30
His lie Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin lie Leu Gly Gin Leu 50 55 60
Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg lie Glu lie Lys Asp 85 90 95 o
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys lie Glu Glu Glu Gin Asn Lys Scr Lys 100 105 110
Lys Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gin Val 115 120 125
Scr Gin Asn Tyr Pro lie Val Gin Asn lie Gin Gly Gin Met Val His 130 135 140
Gin Ala lie Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu 145 150 155 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val lie Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser 165 170 175 136326*•序列表,d〇c 200932259
Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly 180 185 190
Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr He Asn Glu Glu 195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro lie Ala 210 215 220
Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp lie Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240
Ser Thr Leu Gin Glu Gin lie Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro He 245 250 255
Pro Val Gly Glu lie Tyr Lys Arg Trp lie He Leu Gly Leu Asn Lys 260 265 270
He Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser lie Leu Asp lie Arg Gin Gly 275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 290 295 300
Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr 305 310 315 320
Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr lie Leu Lys Ala 325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly 340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly Ηΐϋ Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser 355 360 365
Gin Val Thr Asn Ser Ala Thr He Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg 370 375 380
Asn Gin Arg Lys lie Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His 385 390 395 400
Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys 405 410 4】5
Gly Lys Giu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gin Ala Asn 420 425 430
Phe Leu Gly Lys lie Trp Pro Ser Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe 435 440 445
Leu Gin Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Scr Phe Arg 450 455 460
Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gin Lys Gin Glu Pro lie Asp 465 470 475 480 -9- 136326-序列表.doc 200932259
Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Asn Asp 485 490 495
Pro Ser Ser Gin Met Asp Asn Leu Thr Lys Val Arg Glu Tyr Leu Lys 500 505 510
Ser Tyr Ser Arg Leu Asp Gin Ala Val Gly Glu !lc Asp Glu lie Glu 515 520 525
Ala Gin Arg Ala Glu Lys Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Gin Glu Asp Gly 530 535 540
Val Glu Glu His Thr Lys Pro Ser Tyr Phe Gin Ala Ala Asp Asp Ser 545 550 555 560
Asp Thr Glu Ser Glu Pro Glu lie Glu Asp Asn Gin GJy Leu Tyr Ala 565 570 575
Pro Asp Pro Glu Ala Glu Gin Val Glu Gly Phe lie Gin Gly Pro Leu 580 585 590 Ο
Asp Asp Tyr Ala Asp Glu Glu Val Asp Val Val Phe Thr Ser Asp Trp 595 600 605
Lys Gin Pro Glu Leu Glu Ser Asp Glu His Gly Lys Thr Leu Arg Leu 610 615 620
Thr Ser Pro Glu Gly Leu Ser Giy Glu Gin Lys Ser Gin Trp Leu Ser 625 630 635 640
Thr lie Lys Ala Val Val Gin Ser Ala Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Glu 645 650 655
Cys Thr Phe Glu Ala Ser Gly G!u Giy Val lie Met Lys Glu Arg Gin 660 665 670 lie Thr Pro Asp Val Tyr Lys Val Thr Pro Val Met Asn Thr His Pro 675 680 685
Ser Gin Ser Glu Ala Val Ser Asp Val Trp Ser Leu Scr Lys Thr Ser 690 695 700
Met Thr Phe Gin Pro Lys Lys Ala Ser Leu Gin Pro Leu Thr He Ser 705 710 715 720
Leu Asp Glu Leu Phe Ser Ser Arg Gly G!u Phe Me Ser Val Gly Gly 725 730 735
Asp Gly Arg Met Scr His Lys Glu Ala lie Leu Leu Gly Leu Arg Tyr 740 745 750
Lys Lys Leu Tyr Asn Gin Ala Arg Val Lys Tyr Ser Leu Me〖Ser Ser 755 760 765
Leu Lys Lys He Leu Cly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys Ser Lys Lys 770 775 780 -10- 136326-序列表.doc 200932259
Leu Gly He Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser Met Glu Tyr 785 790 795 800
Ala Pro Ser Ala Pro He Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val Asp Glu Met 805 810 815
Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gin Leu Arg Tyr Glu Lys Phe Phe Phe Thr 820 825 830
Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr Tyr Ser Asp 835 840 845
Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr lie Gly Met Ala 850 855 860
Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys lie Leu Ala Phe Leu Gly Ser Ser Asn 865 870 875 880
Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gin Gly Gin Pro Glu Tyr 885 890 895
His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met Gly Lys 900 905 910
Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro Phe Asn 915 920 925
He Gly Leu Tyr Lys Gly Thr lie Glu Leu Thr Met Thr He Tyr Asp 930 935 940
Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met lie Trp Asp His Phe Asn Ser 945 950 955 960
Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly Leu lie 965 970 975
Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Scr lie Gly His 980 985 990
Phe Lys Met Ser Val Thr Val Lys Arg lie lie Asp Asn Thr Val Val 995 1000 1005
Val Pro Lys Leu Pro Ala Asn Glu Asp Pro Val Glu Tyr Pro Ala 1010 1015 1020
Asp Tyr Phe Arg Lys Ser Lys Glu lie Pro Leu Tyr lie Asn Thr 1025 1030 1035
Thr Lys Ser Leu Ser Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gin Gly Leu 1040 1045 1050
Lys Ser Gly Asn Val Ser lie lie His Val Asn Ser Tyr Leu Tyr 1055 1060 1065
Gly Ala Leu Lys Asp He krg Gly Lys Leu Asp Lys Asp Trp Ser -11 - 136326-序列表.doc 200932259 1070 1075 1080
Ser Phe Gly Me Asn He Gly Lys Ala Gly Asp Thr lie Gly lie 1085 1090 1095
Phe Asp Leu Val Ser Leu Lys Ala Leu Asp Gly Val Leu Pro Asp 1100 1105 1110
Gly Val Ser Asp Ala Ser Arg Thr Ser Ala Asp Asp Lys Trp Leu 1115 1120 1125
Pro Leu Tyr Leu Leu Gly Leu Tyr Arg Val Gly Arg Thr Gin Met 1130 1135 Π40
Pro Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Met Asp Gly Leu Thr Asn Gin Cys 1145 1150 1155
Lys Met lie Asn Glu Gin Phe Glu Pro Leu Val Pro Glu Gly Arg 1160 1165 1170
Asp lie Phe Asp Val Trp Gly Asn Asp Ser Asn Tyr Thr Lys lie 1175 1180 1185
Val Ala Ala Val Asp Met Phe Phe His Met Phe Lys Lys His Glu 1190 1195 1200
Cys Ala Ser Phe Arg Tyr Gly Thr lie Val Ser Arg Phe Lys Asp 1205 1210 1215
Cys Ala Ala Leu Ala Thr Phe Gly His Leu Cys Lys Ile Thr Gly 1220 1225 1230
Met Ser Thr Glu Asp Val Thr Thr Trp lie Leu Asn Arg Glu Val 1235 1240 1245
Ala Asp Glu Met Val Gin Met Met Leu Pro Gly Gin Glu lie Asp 1250 1255 1260
Lys Ala Asp Ser Tyr Met Pro Tyr Leu lie Asp Phe Gly Leu Ser 1265 1270 1275
Ser Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Val Lys Asn Pro Ala Phe His Phe 1280 1285 1290
Trp Gly Gin Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ser Thr Arg Ala Arg 1295 1300 1305
Asn Ala Arg Gin Pro Asp Asp lie Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Thr 1310 1315 1320
Ala Gly Leu Leu Tyr Ala Tyr Ala Val Gly Ser Ser Ala Asp Leu 1325 1330 1335
Ala Gin Gin Phe Cys Val Gly Asp Asn Lys Tyr Thr Pro Asp Asp 1340 1345 1350 -12- 136326-序列表.doc 200932259
Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Asn Ala Pro Pro Gin Gly Arg Asp 1355 1360 1365
Val Val Glu Trp Leu Gly Trp Phe Glu Asp Gin Asn Arg Lys Pro 1370 1375 1380
Thr Pro Asp Met Met Gin Tyr Ala Lys Arg Ala Val Met Ser Leu 1385 丨390 1395
Gin Gly Leu Arg Giu Lys Thr ile Giy Lys Tyr Ala Lys Ser Glu 1400 1405 1410
Phe Asp Lys Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe He Gly 1415 1420 1425
Val Asn Cys Lys Phe Thr lie Val Phe Pro His Asn Gin Lys Gly 1430 1435 1440
Asn Trp Lys Asn Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser 1445 1450 1455
Ser Asp Leu Asn Trp His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu Gin 1460 1465 丨470
Val Lys Met Pro Lys Ser His Lys Ala Ile Arg Ala Asp Gly Trp 1475 1480 1485
Met Cys His Ala Ser Lys Trp Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp 1490 1495 1500
Tyr Gly Pro Lys Tyr Jle Thr His Ser lie Arg Ser Phe Thr Pro 1505 1510 1515
Ser Val Glu Gin Cys Lys Glu Ser Ile Glu Gin Thr Lys Gin Gly 1520 1525 1530
Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gin Ser Cys Gly Tyr Ala 1535 1540 1545
Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gin Val Thr Pro His 1550 1555 1560
His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val Asp Ser Gin 1565 1570 1575
Phe lie Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr Val His 1580 1585 1590
Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu Cys 1595 1600 1605
Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Me Thr Phe Phe Ser Glu Asp 1610 1615 1620
Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser 1625 1630 1635 -】3- 136326-序列表.doc 200932259
Asn Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gin 1640 1645 1650
Tyr Cys Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe 1655 1660 1665
Glu Met Ala Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu 1670 1675 1680
Cys Pro Glu Gly Ser Ser lie Ser Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val 1685 1690 1695
Asp Val Ser Leu lie Gin Asp Val Glu Arg He Leu Asp Tyr Ser 1700 1705 1710
Leu Cys Gin Glu Thr Trp Ser Lys lie Arg Ala Gly Leu Pro lie 1715 1720 1725
Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr 1730 1735 1740
Gly Pro Ala Phe Thr lie He Asn Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu 1745 1750 1755
Thr Arg Tyr lie Arg Val Asp lie Ala Ala Pro lie Leu Ser Arg 1760 1765 1770
Met Val Gly Met Me Ser Gly Thr Thr Thr Glu Arg Glu Leu Trp 1775 1780 1785
Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu He Gly Pro Asn Gly 1790 1795 1800
Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu Tyr Met lie 1805 1810 1815
Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser Lys Ala 1820 1825 1830
Gin Val Phe Glu His Pro His lie Gin Asp Ala Ala Ser Gin Leu 1835 1840 1845
Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser lys 1850 1855 I860
Asn Pro lie Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser 1865 1870 1875
Ser lie Ala Ser Phe Phe Phe lie He Gly Leu I le lie Gly Leu 1880 1885 1890
Phe Leu Val Leu Arg Met Glu Val His Asp Phe Glu Thr Asp Glu 1895 1900 1905
Phe Asn Asp Phe Asn Glu Asp Asp Tyr Ala Thr Arg Glu Phe Leu 1930 1915 1920 -14- 136326-序列表,doc 200932259
Asn Pro Asp Glu Arg Met Thr Tyr Leu Asn His Ala Asp Tyr Asn 1925 1930 1935
Leu Asn Ser Pro Leu lie Ser Asp Asp lie Asp Asn Leu lie Arg 1940 1945 1950
Lys Phe Asn Ser Leu Pro lie Pro Ser Met Trp Asp Ser Lys Asn 1955 1960 1965
Trp Asp Gly Va] Leu Glu Met Leu Thr Ser Cys Gin Ala Asn Pro 1970 1975 1980 lie Pro Thr Ser Gin Met His Lys Trp Met Gly Ser Trp Leu Met 1985 1990 1995
Ser Asp Asn His Asp Ala Ser Gin Gly Tyr Ser Phe Leu His Glu 2000 2005 2010
Val Asp Lys Glu Ala Glu He Thr Phe Asp Val Val Glu Thr Phe 2015 2020 2025
ne Arg Gly Trp Gly Asn Lys Pro 丨 le Glu Tyr He Lys Lys Glu 2030 2035 2040
Arg Trp Thr Asp Ser Phe Lys lie Leu Ala Tyr Leu Cys Gin Lys 2045 2050 2055
Phe Leu Asp Leu His Lys Leu Thr Leu lie Leu Asn Ala Val Ser 2060 2065 2070
Glu Val Glu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Thr Phe Lys Gly Lys Val 2075 2080 2085
Arg Arg Ser Ser His Gly Thr Asn He Cys Arg lie Arg Val Pro 2090 2095 2100
Ser Leu Gly Pro Thr Phe lie Ser Glu Gly Trp Ala Tyr Phe Lys 2105 2110 2115
Lys Leu Asp He Leu Met Asp Arg Asn Phe Leu Leu Met Val Lys 2120 2125 2130
Asp Val I)e He Gly Arg Mel GJn Thr Val Leu Ser Met Val Cys 2135 2140 2145
Arg lie Asp Asn Leu Phe Ser Glu Gin Asp lie Phe Ser Leu Leu 2150 2155 2160
Asn lie Tyr Arg lie Gly Asp Lys lie Val Glu Arg Gin Gly Asn 2165 2170 2175
Phe Ser Tyr Asp Leu lie 乙ys Met Val Glu Pro Ik Cys Asn Leu 2180 2185 2190
Lys Leu Met Lys Leu Ala Arg Glu Ser Arg Pro Leu Val Pro Gin -15- 136326·序列表.doc 200932259 2195 2200 2205
Phe Pro His Phe Glu Asn His Ile Lys Thr Ser Va] Asp Glu Gly 2210 2215 2220
Ala Lys lie Asp Arg Gly Jle Arg Phe Leu His Asp Gin He Met 2225 2230 2235
Ser Val Lys Thr Val Asp Leu Thr Leu Val lie Tyr Gly Ser Phe 2240 2245 2250
Arg His Trp Gly His Pro Phe lie Asp Tyr Tyr Thr Gly Leu Glu 2255 2260 2265
Lys Leu His Ser Gin Val Thr Met Lys Lys Asp lie Asp Val Ser 2270 2275 2280
Tyr Ala Lys Ala Leu Ala Ser Asp Leu Ala Arg He Val Leu Phe 2285 2290 2295
Gin Gin Phe Asn Asp His Lys Lys Trp Phe Val Asn Gly Asp Leu 2300 2305 2310
Leu Pro His Asp His Pro Phe Lys Ser His Val Lys Glu Asn Thr 2315 2320 2325
Trp Pro Thr Ala Ala Gin Val Gin Asp Phe Gly Asp Lys Trp His 2330 2335 2340
Glu Leu Pro Leu lie Lys Cys Phe Glu lie Pro Asp Leu Leu Asp 2345 2350 2355
Pro Ser Ile 1le Tyr Ser Asp Lys Ser His Ser Met Asn Arg Ser 2360 2365 2370
Glu Val Leu Lys His Val Arg Met Asn Pro Asn Thr Pro He Pro 2375 2380 2385
Ser Lys Lys Val Leu Gin Thr Met Leu Asp Thr Lys Ala Thr Asn 2390 2395 2400
Trp Lys Glu Phe Leu Lys Glu lie Asp Glu Lys Gly Leu Asp Asp 2405 2410 2415
Asp Asp Leu Me He Gly Leu Lys Gly Lys Glu Arg Glu Leu Lys 2420 2425 2430
Leu Ala Gly Arg Phe Phe Scr Leu Met Ser Trp Lys Leu Arg Glu 2435 2440 2445
Tyr Phe Val lie Thr Glu Tyr Leu lie Lys Thr His Phe Val Pro 2450 2455 2460
Met Phe Lys Gly Leu Thr Met Ala Asp Asp Leu Thr Ala Val lie 2465 2470 2475 •16- 136326-序列表.doc 200932259
Lys Lys Met Leu Asp Ser Ser Ser Cly Gin Gly Leu Lys Ser Tyr 2480 2485 2490
Glu Ala lie Cys He Ala Asn His lie Asp Tyr Glu Lys Trp Asn 2495 2500 2505
Asn His Gin Arg Lys Leu Ser Asn Gly Pro Val Phe Arg Val Met 2510 2515 2520
Gly Gin Phe Leu Gly Tyr Pro Ser Leu lie Glu Arg Thr His Glu 2525 2530 2535
Phe Phe Glu Lys Ser Leu Me Tyr Tyr Asn Gly Arg Pro Asp Leu 2540 2545 2550
Met Arg Va) His Asn Asn Thr Leu lie Asn Ser Thr Ser Gin Arg 2555 2560 2565
Val Cys Trp Gin Gly Gin Glu Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gin 2570 2575 2580
Lys Gly Trp Ser lie Leu Asn Leu Leu Val lie Gin Arg Glu Ala 2585 2590 2595
Lys lie Arg Asn Thr Ala Val Lys Va) Leu Ala Gin Gly Asp Asn 2600 2605 2610
Gin Val Me Cys Thr Gin Tyr Lys Thr Lys Lys Ser Arg Asn Val 2615 2620 2625
Val Glu Leu Gin Gly Ala Leu Asn Gin Met Val Ser Asn Asn Glu 2630 2635 2640
Lys lie Met Thr Ala lie Lys lie Gly Thr Gly Lys Leu Gly Leu 2645 2650 2655
Leu lie Asn Asp Asp Glu Thr Met Gin Ser Ala Asp Tyr Leu Asn 2660 2665 2670
Tyr Gly Lys lie Pro lie Phe Arg Gly Val lie Arg Gly Leu Giu 2675 2680 2685
Thr Lys Arg Trp Ser Arg Val Thr Cys Val Thr Asn Asp Gin lie 2690 2695 2700
Pro Thr Cys Ala Asn lie Met Ser Ser Val Ser Thr Asn Ala Leu 2705 2710 2715
Thr Val Ala His Phe Ala Glu Asn Pro lie Asn Ala Met lie Gin 2720 2725 2730
Tyr Asn Tyr Phe Gly Thr Phe Ala Arg Leu Leu Leu Met Met His 2735 2740 2745
Asp Pro Ala Leu Arg Gin Ser Leu Tyr Glu Val Gin Asp Lys lie 2750 2755 2760 -17- 136326-序列表.doc 200932259
Pro Gly Leu His Ser Ser Thr Phe Lys Tyr Ala Met Leu Tyr Leu 2765 2770 2775
Asp Pro Ser lie Giy Gly Va丨 Ser Gly Met Ser Leu Ser Arg Phe 2780 2785 2790
Leu He Arg Ala Phe Pro Asp Pro Val Thr Glu Ser Leu Ser Phe 2795 2800 2805
Trp Arg Phe lie His Val His Ala Arg Ser Glu His Leu Lys Glu 2810 2815 2820
Met Ser Ala Val Phe Gly Asn Pro Glu lie Ala Lys Phe Arg lie 2825 2830 2835
Thr His lie Asp Lys Leu Val Glu Asp Pro Thr Ser Leu Asn lie 2840 2845 2850
Ala Met Gly Met Ser Pro Ala Asn Leu Leu Lys Thr Glu Val Lys 2855 2860 2865
Lys Cys Leu lie Glu Ser Arg Gin Thr He Arg Asn Gin Val lie 2870 2875 2880
Lys Asp Ala Thr lie Tyr Leu Tyr His Glu Glu Asp Arg Leu Arg 2885 2890 2895
Ser Phe Leu Trp Ser lie Asn Pro Leu Phe Pro Arg Phe Leu Ser 2900 2905 2910
Glu Phe Lys Ser Gly Thr Phe Leu Gly Val Ala Asp Gly Leu lie 2915 2920 2925
Ser Leu Phe Gin Asn Ser Arg Thr He Arg Asn Ser Phe Lys Lys 2930 2935 2940
Lys Tyr His Arg Glu Leu Asp Asp Leu lie Val Arg Ser Glu Val 2945 2950 2955
Ser Ser Leu Thr His Leu Gly Lys Leu His Leu Arg Arg Gly Ser 2960 2965 2970
Cys Lys Met Trp Thr Cys Ser Ala Thr His Ala Asp Thr Leu Arg 2975 2980 2985
Tyr Lys Ser Trp Gly Arg Thr Val lie Gly Thr Thr Val Pro His 2990 2995 3000
Pro Leu Glu Met Leu Gly Pro Gin His Arg Lys Glu Thr Pro Cys 3005 3010 3015
Ala Pro Cys Asn Thr Ser Gly Phe Asn Tyr Val Ser Val His Cys 3020 3025 3030
Pro Asp Gly lie His Asp Val Phe Ser Ser Arg Gly Pro Leu Pro 3035 3040 3045 -18- 136326-序列表.doc 200932259
Ala Tyr Leu Gly Ser Lys Thr Ser Glu Ser Thr Scr 3050 3055 3060
Pro Trp Glu Arg Glu Ser Lys Val Pro Leu lie Lys 3065 3070 3075
Arg Leu Arg Asp Ala He Ser Trp Phe Val Glu Pro 3080 3085 3090
Leu Ala Met Thr He Leu Ser Asn lie His Ser Leu 3095 3100 3105
Glu Trp Thr Lys Arg Gin His Gly Phe Lys Arg Thr 3110 3Π5 3120
Leu His Arg Phe Ser Thr Ser Arg Met Ser His Gly 3125 3130 3135
Ser Gin Ser Thr Ala Ala Leu Thr Arg Leu Met Ala 3140 3145 3150 ❹
Thr Met Arg Asp Leu Gly Asp Gin Asn Phe Asp Phe 3155 3160 3165
Ala Thr Leu Leu Tyr Ala Gin 丨le Thr Thr Thr Val 3170 3175 3180
Gly Trp lie Thr Ser Cys Thr Asp His Tyr His lie 3185 3190 3195
Ser Cys Leu Arg Pro lie Glu Glu lie Thr Leu Asp 3200 3205 3210
Asp Tyr Thr Pro Pro Asp Val Ser His Val Leu Lys 3215 3220 3225
Asn Gly Glu Giy Ser Trp Gly Gin Glu lie Lys Gin 3230 3235 3240
Leu Glu Gly Asn Trp Lys Asn Leu Ala Pro Ala Glu 3245 3250 3255
Gin Va! Gly Arg Cys lie Gly Phe Leu Tyr Gly Asp 3260 3265 3270
Arg Lys Scr Thr His Ala Glu Asp Scr Scr Leu Phe 3275 3280 32S5 lie Gin Gly Arg He Arg Gly Arg Gly Phe Leu Lys 3290 3295 3300
Asp Gly Leu Met Arg Ala Ser Cys Cys Gin Val lie 3305 3310 3315
Ser Leu Ala His Leu Lys Arg Pro Ala Asn Ala Val
Ite Leu Gin Arg Ala Thr Asp Ser Lys Thr Gly Glu Gly Ser Ala Gly Phe Ala Thr Thr Asp Leu Phe Gin Ala Arg Asp Ala Cys Lys Ser Ser Met Thr Trp Arg He Tyr Pro Gin Ser Tyr Leu Ala Tyr Pro Leu Ser Gly Leu Leu His Arg Arg Tyr Gly Gly 136326-序列表.doc -19- 200932259 3320 3325 3330
Leu lie Tyr Leu lie Asp Lys Leu Ser Va丨 Ser Pro Pro Phe Leu 3335 3340 3345
Ser Leu Thr Arg Ser Gly Pro He Arg Asp Glu Leu Glu Thr Me 3350 3355 3360
Pro His Lys He Pro Thr Ser Tyr Pro Thr Ser Asn Arg Asp Met 3365 3370 3375
Gly Val lie Vai Arg Asn Tyr Phe Lys 丁yr Gin Cys Arg Leu ile 3380 3385 3390
Glu Lys Gly Lys Tyr Arg Ser His Tyr Ser Gin Leu Trp Leu Phe 3395 3400 3405
Ser Asp Val Leu Ser lie Asp Phe lie Gly Pro Phe Ser He Ser 3410 3415 3420
Thr Thr Leu Leu Gin lie Leu Tyr Lys Pro Phe Leu Ser Gly Lys 3425 3430 3435
Asp Lys Asn Glu Leu Arg Glu Leu Ala Asn Leu Ser Ser Leu Leu 3440 3445 3450
Arg Ser Gly Glu Gly Trp Glu Asp lie His Val Lys Phe Phe Thr 3455 3460 3465
Lys Asp He Leu Leu Cys Pro Glu Glu lie Arg His Ala Cys Lys 3470 3475 3480
Phe Gly lie Ala Lys Asp Asn Asn Lys Asp Met Ser Tyr Pro Pro 3485 3490 3495
Trp Gly Arg G!u Ser Arg Gly Thr lie Thr Thr lie Pro Val Tyr 3500 3505 3510
Tyr Thr Thr Thr Pro Tyr Pro Lys Met Leu Glu Met Pro Pro Arg 3515 3520 3525 lie Gin Asn Pro Leu Leu Ser Gly lie Arg Leu Gly Gin Leu Pro 3530 3535 3540
Thr Gly Ala His Tyr Lys lie Arg Ser lie Leu His Gly Met Gly 3545 3550 3555 lie His Tyr Arg Asp Phe Leu Ser Cys Gly Asp Gly Ser Gly Gly 3560 3565 3570
Met Thr Ala Ala Leu Leu Arg Glu Asn Val His Ser Arg Gly lie 3575 3580 3585
Phe Asn Ser Leu Leu Glu Leu Ser Gly Ser Val Met Arg Gly Ala 3590 3595 3600 •20- 136326-序列表.doc 200932259
Ser Pro Glu Pro Pro Ser Ala Leu Glu Thr Leu Gly Gly Asp Lys 3605 3610 3615
Ser Arg Cys Val Asn Gly Glu Thr Cys Trp Glu Tyr Pro Ser Asp 3620 3625 3630
Leu Cys Asp Pro Arg Thr Trp Asp Tyr Phe Leu Arg Leu Lys Ala 3635 3640 3645
Gly Leu Gly Leu Gin lie Asp Leu lie Val Met Asp Met Glu Val 3650 3655 3660
Arg Asp Ser Ser Thr Ser Leu Lys lie Glu Thr Asn Val Arg Asn 3665 3670 3675
Tyr Val His Arg He Leu Asp Glu Gin Gly Val Leu lie Tyr Lys 3680 3685 3690
Thr Tyr Gly Thr Tyr lie Cys Glu Ser Glu Lys Asn Ala Val Thr 3695 3700 3705
He Leu Gly Pro Met Phe Lys Thr Val Asp Leu Val Gin Thr Glu 3710 3715 3720
Phe Ser Ser Ser Gin Thr Ser Glu Val Tyr Met Val Cys Lys Gly 3725 3730 3735
Leu Lys Lys Leu lie Asp Glu Pro Asn Pro Asp Trp Ser Ser He 3740 3745 3750
Asn Glu Ser Trp Lys Asn Leu Tyr Ala Phe Gin Ser Ser Glu Gin 3755 3760 3765
Glu Phe Ala Arg Ala Lys Lys Val Ser Thr Tyr Phe Thr Leu Thr 3770 3775 3780
Gly lie Pro Ser Gin Phe lie Pro Asp Pro Phe Val Asn lie Glu 3785 3790 3795
Thr Met Leu Gin He Phe Gly Val Pro Thr Gly Va! Ser His Ala 3800 3805 3810
Ala Ala Leu Lys Ser Ser Asp Arg Pro Ala Asp Leu Leu Thr lie 3815 3820 3825
Ser Leu Phe Tyr Met Ala He He Ser Tyr Tyr Asn [Ie Asn His 3830 3835 3840 lie Arg Vai Gly Pro lie Pro Pro Αϋη Pro Pro Ser Asp Gly lie 3845 3850 3855
Ala Gin Asn Val Gly lie Ala lie Thr Gly He Ser Phe Trp Leu 3860 3865 3870
Ser Leu Met Glu Lys Asp He Pro Leu Tyr Gin Gin Cys Leu Ala 3875 3880 3885 -21 - 136326-序列表.doc 200932259
Val lie Gin Gin Ser Phe Pro lie Arg Trp Glu Ala Val Ser Val 3890 3895 3900
Lys Gly Gly Tyr Lys Gin Lys Trp Ser Thr Arg Gly Asp Gly Leu 3905 3910 3915
Pro Lys Asp Thr Arg lie Ser Asp Ser Leu Ala Pro lie Gly Asn 3920 3925 3930
Trp lie Arg Ser Leu Glu Leu Val Arg Asn Gin Val Arg Leu Asn 3935 3940 3945
Pro Phe Asn Giu lie Leu Phe Asn Gin Leu Cys Arg Thr Val Asp 3950 3955 3960
Asn His Leu Lys Trp Ser Asn Leu Arg Arg Asn Thr Gly Met lie 3965 3970 3975
Glu Trp lie Asn Arg Arg lie Scr Lys Glu Asp Arg Scr lie Leu 3980 3985 3990 ❹
Met Leu Lys Ser Asp Leu His Glu Glu Asn Ser Trp Arg Asp 3995 4000 4005
<2丨0> 3 <21!> 4007 <212> PRT <213>水皰性口炎病毒 <400> 3
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 15 10 15
Glu Lys lie Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30
His lie Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin lie Leu Gly G!n Leu 50 55 60
Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg He Glu lie Lys Asp 85 90 95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys He Glu Glu Glu Gin Asn Lys Ser Lys 100 105 110
Lys Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gin Val 115 120 125
Ser Gin Asn Tyr Pro lie Val Gin Asn lie Gin Gly Gin Met Vai His 130 135 140 -22· 136326·序列表.doc 200932259
Gin Ala lie Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu 145 150 155 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val He Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser 165 170 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly 180 185 190
Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr 11c Asn Glu Glu 195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro lie Ala 210 215 220
Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp He Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240
Ser Thr Leu Gin Glu Gin lie Gly Trp Mel Thr Asn Asn Pro Pro ile 245 250 255 ❹
Pro Val Gly Glu lie Tyr Lys Arg Trp lie lie Leu Gly Leu Asn Lys 260 265 270 lie Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Scr lie Leu Asp lie Arg Gin Gly 275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 290 295 300
Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr 305 310 315 320
Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asn Cys Lys Thr lie Leu Lys Ala 325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly 340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser 355 360 365
Gin Val Thr Asn Ser Ala Thr He Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg 370 375 380
Asn Gin Arg Lys lie Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His 385 390 395 400
Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys 405 410 415
Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gin Ala Asn 420 425 430
Phe Leu Gly Lys lie Trp Pro Ser Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe 435 440 445 -23- 136326-序列表.doc 200932259
Leu Gin Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Ser Phe Arg 450 455 460
Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gin Lys Gin Glu Fro lie Asp 465 470 475 480
Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Asn Asp 485 490 495
Pro Ser Ser Gin Met Asp Asn Leu Thr Lys Val Arg Glu Tyr Leu Lys 500 505 510
Ser Tyr Ser Arg Leu Asp Gin Ala Val Gly Glu Me Asp Glu He Glu 515 520 525
Ala Gin Arg Ala Glu Lys Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Gin Glu Asp Gly 530 535 540
Val Glu Glu His Thr Lys Pro Ser Tyr Phe Gin Ala Ala Asp Asp Ser 545 550 555 560 〇
Asp Thr Glu Ser Glu Pro Glu He Glu Asp Asn Gin Gly Leu Tyr Ala 565 570 575
Pro Asp Pro Glu Ala Glu Gin Val Glu Gly Phe lie Gin Gly Pro Leu 580 585 590
Asp Asp Tyr Ala Asp Glu Glu Val Asp Val Val Phe Thr Ser Asp Trp 595 600 605
Lys Gin Pro Glu Leu Glu Ser Asp Glu His Gly Lys Thr Leu Arg Leu 610 615 620
Thr Ser Pro Glu Gly Leu Ser Gly Giu Gin Lys Ser Gin Trp Leu Ser 625 630 635 640
Thr lie Lys Ala Val Val Gin Ser A!a Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Glu 645 650 655
Cys Thr Phe Glu Ala Ser Gly Glu Gly Val He Met Lys Glu Arg Gin 660 665 670 lie Thr Pro Asp Val Tyr Lys Val Thr Pro Val Met Asn Thr His Pro 675 680 685
Ser Gin Ser Glu Ala Val Ser Asp Val Trp Ser Leu Ser Lys Thr Ser 690 695 700
Mel Thr Phe Gin Pro Lys Lys Ala Ser Leu Gin Pro Leu Thr He Ser 705 710 715 720
Leu Asp Glu Leu Phe Ser Ser Arg Gly Glu Phe lie Ser Va! Gly Gly 725 730 735
Asp Gly Arg Met Ser His Lys Glu Ala lie Leu Leu Gly Leu Arg Tyr -24- 136326-序列表.doc 200932259 740 745 750
Lys Lys Leu Tyr Asn Gin A,a Arg Val Lys Tyr Ser Leu Met Ser Ser
Leu Lys Lys He Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys Ser Lys Lys 770 775 780
Leu Gly lie Ala Pro Pro Pro Tyr GIu Glu Asp Thr Ser Met Glu Tyr 785 790 795 800
Ala Pro Ser Ala Pro He Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val Asp Glu Met 805 810 815
Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gin Leu Arg Tyr Glu Lys Phe Phe Phe Thr 820 825 830
Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg TTir Tyr Ser Asp 835 840 845 〇
Val Ala Ala Ala Va! Ser His Trp Asp His Met Tyr lie Gly Met Ala 850 855 860
Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys Jle Leu Ala Phe Leu Gly Ser Ser Asn 865 870 875 880
Leu Lys Ala Tlir Pro A)a Va) Leu Ala Asp Gin Gly On Pro Glu Tyr 885 890 895
His Ala His Cys C)u Gly Arg Ala Tyr Leu Gin His Arg Met Gly Lys 900 905 910
Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro Phe Asn 915 920 925 lie Gly Leu Tyr Lys Gly Thr lie Glu Leu Thr Met Thr Me Tyr Asp 930 935 940
Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met lie Trp Asp His Phe Asn Ser 945 950 955 960
Scr Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly Leu lie 965 970 975
Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser He Gly His 980 985 990
Phe Lys Met Ser Val Thr Val Lys Arg He lie Asp Asn Thr Val Val 995 丨 000 丨 005
Val Pro Lys Leu Pro Ala Asn Glu Asp Pro Val Glu Tyr Pro Ala 1010 1015 J020
Asp Tyr Phe Arg Lys Ser Lys Glu lie Pro Leu Tyr lie Asn Thr 1025 1030 1035 -25- 136326-序列表.doc 200932259
Thr Lys Ser Leu Ser Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gin Gly Leu 1040 1045 1050
Lys Ser Gly Asn Val Ser lie lie His Val Asn Ser Tyr Leu Tyr 1055 1060 丨065
Gly A】a Leu Lys Asp I]e Arg Gly Lys Leu Asp Lys Asp 丁rp Ser 1070 1075 1080
Ser Phe Gly lie Asn lie Gly Lys Ala Gly Asp Thr lie Gly lie 1085 1090 1095
Phe Asp Leu Val Ser Leu Lys Ala Leu Asp Gly Val Leu Pro Asp 1100 1105 1110
Gly Val Ser Asp Ala Ser Arg Thr Ser Ala Asp Asp Lys Trp Leu U15 li20 1125
Pro Leu Tyr Leu Leu Gly Leu Tyr Arg Val Gly Arg Thr Gin Met 1130 1135 1140
Pro Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Met Asp Gly Leu Thr Asn Gin Cys 1145 1150 1155
Lys Met lie Asn Glu Gin Phe Glu Pro Leu Va) Pro Glu Gly Arg 1160 1165 1170
Asp lie Phe Asp Val Trp Gly Asn Asp Ser Asn Tyr Thr Lys lie 1175 1180 1185
Val Ala Ala Val Asp Met Phe Phe His Met Phe Lys Lys His Glu 1190 1195 1200
Cys Ala Ser Phe Arg Tyr Gly Thr He Val Ser Arg Phe Lys Asp 1205 1210 1215
Cys Ala Ala Leu Ala Thr Phe Gly His Leu Cys Lys lie Thr Gly 1220 1225 丨230
Met Ser Thr Glu Asp Val Thr Thr Trp He Leu Asn Arg Glu Val 1235 1240 1245
Ala Asp Glu Met Val Gin Met Met Leu Pro Gly Gin Glu lie Asp 1250 1255 1260
Lys Ala Asp Ser Tyr Met Pro Tyr Leu lie Asp Phe Gly Leu Ser 1265 1270 1275
Ser Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Val Lys Asn Pro Ala Phe His Phe 1280 1285 1290
Trp Gly Gin Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ser Thr Arg Ala Arg 1295 1300 1305
Asn A!a Arg Gin Pro Asp Asp lie Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Thr 1310 1315 1320 •26- 136326-序列表.doc 200932259
Ala Gly Leu Leu Tyr Ala Tyr Ala Val Gly Ser Ser Ala Asp Leu 1325 1330 1335
Ala Gin Gin Phe Cys Val Gly Asp Asn Lys Tyr Thr Pro Asp Asp 1340 1345 1350
Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Asn Ala Pro Pro Gin Gly Arg Asp 1355 1360 1365
Vai Val Glu Trp Leu Gly Trp Phe Glu Asp Gin Asn Arg Lys Pro 1370 1375 1380
Thr Pro Asp Met Met Gin Tyr Ala Lys Arg Ala Val Met Ser Leu 1385 1390 1395
Gin Gly Leu Arg Glu Lys Thr lie Gly Lys Tyr Ala Lys Ser Glu 1400 1405 1410
Phe Asp Lys Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe lie Gly 1415 1420 1425
Val Asn Cys Lys Phe Thr lie Val Phe Pro His Asn Gin Lys Gly 1430 丨435 1440
Asn Trp Lys Asn Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser 1445 1450 1455
Ser Asp Leu Asn Trp His Asn Asp Leu lie Gly Thr Ala Leu Gin 1460 1465 1470
Val Lys Met Pro Lys Ser His Lys Ala He Arg Ala Asp Gly Trp 1475 1480 1485
Met Cys His Ala Ser Lys Trp Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp 1490 1495 1500
Tyr Gly Pro Lys Tyr lie Thr His Ser lie Arg Ser Phe Thr Pro 1505 1510 1515
Ser Val Glu Gin Cys Asn Glu Scr He Glu Gin Thr Lys Gin Gly 1520 1525 1530
Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gin Ser Cys Gly Tyr Aia 1535 1540 1545
Thr Va] Thr Asp Ala Glu Ala Val lie Val Gin Val Thr Pro His 1550 1555 1560
His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val Asp Ser Gin 1565 1570 1575
Phe lie Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr lie Cys Pro Thr Val His 1580 1585 1590
Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu Cys 1595 1600 1605 -27- 136326-序列表.doc 200932259
Asp Ser Asn Leu lie Ser Met Asp lie Thr Phe Phe Ser Glu Asp 1610 1615 1620
Gly Glu Leu Ser Scr Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser 1625 1630 1635
Thr Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Giy Gly Lys Ala Cys Lys Met Gin 1640 1645 1650
Tyr Cys Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe 1655 1660 1665
Glu Met Ala Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu 1670 1675 1680
Cys Pro Glu Gly Ser Scr 1le Scr Ala Pro Ser Gin Thr Ser Val 1685 1690 1695
Asp Val Ser Leu lie Gin Asp Val Glu Arg lie Leu Asp Tyr Ser 1700 1705 1710 〇
Leu Cys Gin Glu Thr Trp Ser Lys He Arg Ala Gly Leu Pro 11c 1715 1720 1725
Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr 1730 1735 1740
Gly Pro Ala Phe Thr lie lie Asn Gly Thr Leu Lys Tyr Fhe Glu 1745 1750 丨755
Thr Arg Tyr lie Arg Val Asp lie Ala Ala Pro lie Leu Ser Arg 1760 1765 1770
Met Val Gly Met lie Ser Gly Thr Thr Thr Glu Arg Glu Leu Trp 1775 1780 1785
Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu lie Gly Pro Asn Gly 1790 1795 1800
Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu Tyr Met lie 1805 1810 1815
Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser Lys Ala 1820 1825 1830
Gin Val Phe Glu His Pro His lie Gin Asp Ala Ala Ser Gin Leu 1835 1840 1845
Pro Asp Asp Glu He Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys 1850 1855 I860
Asn Pro lie Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser 1865 1870 1875
Ser lie Ala Scr Phe Phe Phe lie lie Gly Leu lie lie Val Leu -28- 136326-序列表.doc 200932259 1880 1885 1890
Phe Leu lie Leu Arg Met GIu Val His Asp Phe Glu Thr Asp Glu 1895 1900 1905
Phe Asn Asp Phe Asn Glu Asp Asp Tyr Ala Thr Arg Glu Phe Leu 1910 1915 1920
Asn Pro Asp Glu Arg Met Thr Tyr Leu Asn His Ala Asp Tyr Asn 1925 1930 1935
Leu Asn Ser Pro Leu lie Ser Asp Asp lie Asp Asn Leu He Arg 1940 1945 丨950
Lys Phe Asn Ser Leu Pro lie Pro Ser Met Trp Asp Ser Lys Asn 1955 1960 1965
Trp Asp Gly Val Leu Glu Met Leu Thr Ser Cys Gin Ala Asn Pro 1970 1975 1980
lie Pro Thr Ser Gin Met His Lys Trp Mel Gly Ser Trp Leu Met 1985 1990 1995
Ser Asp Asn His Asp Ala Ser Gin Gly Tyr Ser Phe Leu His Glu 2000 2005 2010
Val Asp Lys Glu Ala Glu lie Thr Phe Asp Val Val Glu Thr Phe 2015 2020 2025 lie Arg Gly Trp Gly Asn Lys Pro Me Glu Tyr He Lys Lys Glu 2030 2035 2040
Arg Trp Thr Asp Ser Phe Lys lie Leu Ala Tyr Leu Cys Gin Lys 2045 2050 2055
Phe Leu Asp Leu His Lys Leu Thr Leu lie Leu Asn Ala Val Ser 2060 2065 2070
Glu Val Glu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Thr Phe Lys Gly Lys Val 2075 2080 2085
Arg Arg Ser Ser His Gly Thr Asn He Cys Arg lie Arg Val Leu 2090 2095 2100
Ser Leu Gly Pro Thr Phe lie Ser Glu Gly 丁rp Ala Tyr Phe Lys 2105 2110 2115
Lys Leu Asp lie Leu Met Asp Arg Asn Phe Leu Leu Met Val Lys 2120 2125 2130
Asp Val lie lie Gly Arg Met Gin Thr Val Leu Ser Met Val Cys 2135 2140 2145
Arg He Asp Asn Leu Phe Ser Glu Gin Asp lie Phe Ser Leu Leu 2150 2155 2160 -29- 136326-序列表.doc
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Asn He Tyr Arg 丨 le Gly Asp Lys lie Val Glu Arg 2165 2170 2175
Phe Ser Tyr Asp Leu lie Lys Met Val Glu Pro He 2180 2185 2190
Lys Leu Met Lys Leu Ala Arg Glu Ser Arg Pro Leu 2195 2200 2205
Phe Pro His Phe Glu Asn His lie Lys Thr Ser Val 2210 2215 2220
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Ser Val Lys Thr Val Asp Leu Thr Leu Va! lie Tyr 2240 2245 2250
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Lys Leu His Ser Gin Val Thr Met Lys Lys Asp lie 2270 2275 2280
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Gin Gin Phe Asn Asp His Lys Lys Trp Phe Val Asn 2300 2305 2310
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Asp Asp Leu lie lie Gly Leu Lys Gly Lys Glu Arg 2420 2425 2430
Leu Ala Gly Arg Phe Phe Ser Leu Met Ser Trp Lys 2435 2440 2445 136326-序列表.doc -30-
Gin Gly Asn Cys Asn Leu Val Pro Gin Asp Glu Gly Gin lie Met Gly Ser Phe Gly Leu Glu Asp Val Ser Val Leu Phe Gly Asp Leu Glu Asn Thr Lys Trp His Leu Leu Asp Asn Arg Ser Pro Ile Pro Ala Thr Asn Leu Asp Asp Glu Leu Lys Leu Arg Glu 200932259
Tyr Phe Val Me Thr Glu Tyr Leu lie Lys Thr His Phe Val Pro 2450 2455 2460
Met Phe Lys Gly Leu Thr Met Ala Asp Asp Leu Thr Ala Val lie 2465 2470 2475
Lys Lys Met Leu Asp Ser Ser Ser Gly Gin Gly Leu Lys Ser Tyr 2480 2485 2490
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Pro Thr Cys Ala Asn lie Met Ser Ser Val Ser Thr Asn Ala Leu 2705 2710 2715
Thr Val Ala His Phe Aia Glu Asn Pro lie Asn Ala Met lie Gin 2720 2725 2730 -31 · 136326-序列表.doc 200932259
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Ala Pro Cys Asn Thr Ser Gly Phe Asn Tyr Val Ser Val His Cys 3020 3025 3030
Pro Asp Gly lie His Asp Val Phe Ser Ser Arg Gly Pro Leu Pro 3035 3040 3045
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Glu Trp Thr Lys Arg Gin His Gly Phe Lys Arg Thr Gly Ser Ala 31J0 3115 3】20
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Ser Gin Ser Thr Ala Ala Leu Thr Arg Leu Met Ala Thr Thr Asp 3140 3145 3150
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Gin Val Gly Arg Cys lie Gly Phe Leu Tyr Gly Asp Leu Ala Tyr 3260 3265 3270
Arg Lys Ser Thr His Ala Glu Asp Ser Ser Leu Phe Pro Leu Ser 3275 3280 3285 •33· 136326-序列表.doc 200932259 lie Gin Gly Arg lie Arg Gly Arg Gly Phc Leu Lys Gly Leu Leu 3290 3295 3300
Asp Gly Leu Met Arg Ala Ser Cys Cys Gin Val lie His Arg Arg 3305 3310 3315
Ser Leu Ala His Leu Lys Arg Pro Ala Asn Ala Val Tyr Gly Gly 3320 3325 3330
Leu lie Tyr Leu lie Asp Lys Leu Ser Val Ser Pro Pro Phe Leu 3335 3340 3345
Ser Leu Thr Arg Ser Gly Pro He Arg Asp Glu Leu Glu Thr lie 3350 3355 3360
Pro His Lys lie Pro Thr Ser Tyr Pro Thr Ser Asn Arg Asp Met 3365 3370 3375
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Met Thr Ala Ala Leu Leu Arg Glu Asn Val His Ser Arg Gly He 3575 3580 3585
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Ala Ala Leu Lys Ser Ser Asp Arg Pro Ala Asp Leu Leu Thr lie 3815 3820 3825
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He Arg Val Gly Pro lie Pro Pro Asn Pro Pro Ser Asp Gly lie 3845 3850 3855 •35- 136326-序列表.doc 200932259
Ala Gin Asn Val Giy lie Ala Ile Thr Gly lie Ser Phe Trp Leu 3860 3865 3870
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<210> 4 <211> 15752 <212> DNA <213>水皰性口炎病毒 <400> 4
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aaaatgccgt atggacccag tcctcgtcca gaaaggatcc ccaattaclc ucaccatca gaaagtcctg ttgtgggatc acgaagcaag atcaaaatgg tttttaaaaa aatccagttg ctggttgtga gccagattct ttatatltga tttgagaccg aatcccgatg attagtgatg tgggatagta atcccaacat gccagtcaag gtggtggaga agatggactg aagttgacat ttcaaaggca agcttgggtc atggaccgaa ctatccatgg aatatctaca attaaaatgg cctttagtcc gcaaaaattg gatctcacac tacactggac tatgcaaaag cataaaaagt gttaaagaaa tttgcagaaa acctggataa taatcacacc tagactatgc cggtagatct ttaacggttc tcatacccag agtggtttcc ggtataaatt aaagggttgt aagatgacac aattagtcga ttataggatt tcatgtttgg gtttttaatt acgagttcaa agcgcatgac atattgacaa agaactggga ctcagatgca ggtatagut ccttcatccg actcattcaa taatcttaaa aagtcagaag ctacttttat actttctgtt tatgtagaat gaattggaga tggaaccgat cacaat tccc accgaggtat tggtgattta tagaaaaatt cacttgcaag ggttcgtgaa atacatggcc acaggggtac aacggttaga aggagaacat tcmgtcag cagctatctt cctgcattat aatggaagga t ttcggagaa cccactacac caagcactgg aggagaagtc gggatggttt tgtgatttta accaaatcaa tttatgaaaa tgatttcaat gtacttgaat tttaatcagg tggagttctt taaatggatg 11 tacatgaa cggctggggc aattctcgct tgctgtctct aagttctcat ttcagaagga aatggtcaaa agacaacctg taaaattgtg algcaacttg tcattttgaa aagaticctc tggatcgttc acattcccaa tgatttagct tggagact tg cacagctgct aagcttaaaa gaictccctc gctacagaca aatacatgga gggccaaaaa tt tacatcga aaagltgcag gttgagattg atcattggaa gaacaccccc ctttattatg agtggatgga atgtttttaa cttgtgatac aaactaacag gaagatgact catgctgatt aaattcaatt gagatgttaa ggaagttggt gtggacaaag aacaaaccaa tatttgtfitc gaggtggaat ggaacgaaca tgggcttact gatgtgatta ttctcagagc gagaggcagg aagctgatga aatcatatca catgatcaga agacatiggg gtaaccatga cggattgttc ctccctcatg caagttcaag atgacctctg atattaagga tctcactgat gtaaaat tga acccaggggt agtatctgcg gaactaggat gacccaatgg ctggagaagt atattgaggc gcgacaccgg ggagctccct ttcgataagc catgctcaaa caatcatgga atgccacaag acaaccigaa ctcttccaat cgtcatgtca taatgtctga aggcagaaat ttgaatacat aaaagttttt igctcaactt tatgcaggat tcgagaaact tagggaggat aagacatctt gaaatttttc aattagcaag agacttctgt taatgagtgt gtcatccttt agaaagatat tatticaaca aicatccctt attttggaga gticcagatc cigigacctc atcagatgtt atcgggagaa tgggccggtc agtcgaattd tgtacggcaa tgtgttgaaa agacagtgac cgctcagaca agtgtcgaaa catgggagtg tagccgccta gaggcctcaa agtccacgat agaattcctg ttctcctcta tccctcgatg agccaatccc taatcatgat aacatttgac caaaaaggaa ggacttacac ggcgaggact tagggttccc tgatattcta gcaaacggtg ctcccttcta ttatgacttg agaatcaagg tgatgaaggg gaaaacagtg tatagattat tgatgtgtca gttcaatgat laaaagtcat taaatggcat 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 •39- 136326-序列表.doc
❹ 200932259 gaacttccgc tgattaaatg itttgaaata cccgacttac tagacccatc gataatatac tctgacaaaa gtcattcaat gaalaggtca gaggtgttga aacatgtccg aatgaatccg aacactccta tccctagtaa aaaggtgttg cagactatgt tggacacaaa ggciaccaat tggaaagaat ttcttaaaga gattgatgag aagggcttag atgatgatga tctaattatt ggtcttaaag gaaaggagag ggaactgaag ttggcaggta gatttttctc cctaatgtct tggaaattgc gagaatactt tgtaattacc gaatatttga taaagactca ittcgtccct atgtttaaag gccigacaat ggcggacgat ctaactgcag tcattaaaaa gatgttagat tcctcatccg gccaaggatt gaagtcatat gaggcaattt gcatagccaa tcacattgat tacgaaaaat ggaataacca ccaaaggaag ttatcaaacg gcccagtgu ccgagttatg ggccaguct taggttatcc atccttaatc gagagaactc atgaattttt tgagaaaagt cttatatact acaatggaag accagacttg atgcgtgttc acaacaacac actgatcaat tcaacctccc aacgagtttg ttggcaagga caagagggig gactggaagg tciacggcaa aaaggatgga gtatcctcaa tctactggtt attcaaagag aggctaaaat cagaaacact gctgtcaaag tcttggcaca aggtgataat caagttattt gcacacagta taaaacgaag aaatcgagaa acgttgtaga attacagggt gctctcaatc aaatggtttc taataatgag aaaattatga ctgcaatcaa aatagggaca gggaagttag gacttttgat aaatgacgat gagactatgc aatctgcaga ttacttgaat tatggaaaaa taccgatttt ccgtggagtg attagagggt tagagaccaa gagatggtca cgagtgactt gtgtcaccaa tgaccaaata cccacttgtg ctaatataat gagctcagtt tccacaaatg ctctcaccgt agctcatttt gctgagaacc caatcaatgc catgatacag tacaattatt ttgggacatt tgctagactc ttgttgatga tgcaigatcc tgctcttcgt caatcatlgt atgaagtlca agataagala ccgggcttgc acagttctac tttcaaatac gccatgttgt atttggaccc ttccattgga ggagtgtcgg gcatgtcttt gtccaggttt ttgattagag ccttcccaga tcccgtaaca gaaastctct cattctggag attcatccat gtacatgctc gaagtgagca tctgaaggag atgagtgcag tatttggaaa ccccgagata gccaagtttc gaataactca catagacaag ccagtagaag atccaacctc tctgaacatc gctatgggaa tgagtccagc gaacttgtta aagactgagg ttaaaaaatg cttaatcgaa tcaagacaaa ccatcaggaa ccaggtgatt aaggatgcaa ccatatattt gtatcatgaa gaggatcggc tcagaagttt cttaiggtca ataaatcctc tgttccctag atuuaagt gaattcaaat caggcacttt tttgggagtc gcagacgggc tcatcagtct atttcaaaat tctcgtacia ttcggaactc ctttaagaaa aagtatcata gggaattgga tgatttgatt gtgaggagtg aggiatcctc titgacacat Itagggaaac ttcatttgag aaggggatca tgtaaaatgt ggacatgttc agctactcal gctgacacat taagatacaa atcctggggc cgtacagtta ugggacaac tgtaccccat ccattagaaa tgttgggtcc acaacaicga aaagagactc cttgtgcacc atgtaacaca tcagggtlca attalgtttc tgtgcattgt ccagacggga tccatgacgt ctttagttca cggggaccat tgcctgctta tciagggtct aaaacatctg aatctacatc tattltgcag cctigggaaa gggaaagcaa agtcccactg attaaaagag ctacacgtct tagagatgct atctcttggt ttgttgaacc cgactctaaa ctagcaatga ctatacutc taacatccac 136326·序列表.doc •40· 7620 7680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8J0D 8160 8220 8280 8340 8400 8460 8520 8580 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 Ο
200932259 tctttaacag gcgaagaatg gaccaaaagg cagcatgggt tcaaaagaac agggtctgcc cttcataggt tttcgacatc tcggatgagc catggtgggt tcgcatctca gagcactgca gcattgacca ggttgatggc aactacagac accatgaggg atctgggaga tcagaatttc gactttttat tccaagcaac gttgctctat gctcaaatta ccaccadgt tgcaagagac ggatggatca ccagttgtac agatcattat catattgcci gtaagtcctg tttgagaccc atagaagaga tcacccigga ctcaagtatg gaciacacgc ccccagatg丨 atcccatgig ctgaagacat ggaggaatgg ggaaggttcg tggggacaag agataaaaca gatctatcci ttagaaggga attggaagaa tttagcacct gctgagcaai cctatcaagt cggcagatgt ataggttttc tatatggaga cttggcgtat agaaaatcta ctcaigccga ggacagttct ctatttcctc tatctataca aggicgtatt agaggtcgag gtttcttaaa agggttgcta gacggattaa tgagagcaag ttgctgccaa gtaatacacc ggagaagtct ggctcatttg aagaggccgg ccaacgcagt gtacggaggt ttgatttact tgattgataa attgagtgta tcacclccat tcatttctct taciagatca ggacciaua gagacgaau agaaacgatt ccccacaaga tcccaacctc ctatccgaca agcaaccgtg atatgggggt gattgtcaga aattacttca aataccaatg ccgtctaatt gaaaagggaa aatacagatc acattattca caattatggt tattctcaga tgtcttatcc atagacttca ttggaccatt ctctatttcc accaccctct tgcaaatcct alacaagcca tttttatctg ggaaagataa gaatgagttg agagagctgg caaatctttc ttcattgcta agatcaggag aggggtggga agacatacat gtgaaattct tcaccaagga catattattg tgtccagagg aaatcagaca tgcttgcaag ttcgggattg ctaaggataa taataaagac at£agctatc ccccttgggg aagggaatcc agagggacaa ttacaacaat ccctgtttat tatacgacca ccccttaccc aaagatgcta gagatgcctc caagaatcca aaatcccctg ctgtccggaa tcaggttggg ccaattacca actggcgctcattataaaat tcggagtata ttacatggaa tgggaatcca uacagggac ttcttgagtt gtggagacgg ctccggaggg atgactgcig cattactacg agaaaatgtg catagcagag gaatattcaa tagtctgtta gaattatcag ggtcagtcat gcgaggcgcc tctcctgagc cccccagtgc cctagaaact ttaggaggag ataaatcgag atgtgtaaal ggtgaaacat gttgggaata tccatctgac ttatgtgacc caaggacttg ggactatttc ctccgactca aagcaggctt ggggcticaa atigatttaa ttgtaatgga tatggaagtt cgggattctt ctactagcct gaaaattgag acgaatgtta gaaattatgt gcaccggatt ttggatgagc aaggagtttt aatctacaag acttatggaa catatatttg tgagagcgaa aagaatgcag taacaatcct tggtcccatg ttcaagacgg tcgacttagt tcaaacagaa tttagtagtt ctcaaacgtc tgaagtatat atggiatgta aaggtttgaa gaaattaatc gatgaaccca atcccgattg gtcttccatc aatgaatcct ggaaaaacci gtacgcattc cagtcatcag aacaggaatt tgccagagca aagaaggtta gtacatactt taccttgaca ggtattccct cccaattcat tcctgatcct tttgtaaaca ttgagaciat gciacaaata ttcggagtac ccacgggtgt gtctcatgcg gcigccttaa aatcatctga tagacctgca gatttattga ccattagcct tttttatatg gcgattatat cgtauataa catcaatcai 136326-序列表.doc -41 - 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380 10440 10500 10560 10620 10680 10740 10800 10860 10920 10980 11040 11100 11160 Π220 11280 11340 11400 11460 11520 11580 11640 11700 11760 11820 11880 11940 12000 12060 200932259 Ο
atcagagiag atcgctataa caacagtgtt aaaggaggat atttcagact caagttcgtc aatcatttga cgaatttcaa tcttggagag atccttaaga gcatggcatc tcggatggct ttggctgctg ttgaggggtt ggtggagctc ggtcaiagct ccggaagcat cgttgcgctc tcggccaacg ctgactcgct taatacggtt agcaaaaggc cccctgacga tataaagata tgccgcttac gctcacgctg acgaaccccc acccggtaag cgaggtatgt gaaggacagt gtagctcttg agcagattac ctgacgctca ggatcttcac atgagtaaac tctgtctat t gggagggct t ctccagatt t gaccgatacc ctggtataag tagcagttat acaagcagaa ccttggcccc taaatccatt aatggtcaaa aagaagaccg attaaaaaat ccctcttgtg tccacctcct aagggagggg ccaccgctga tt ttictgaa cagcttttgt gtttcctgtg aaagtgtaaa actgcccgct cgcggggaga gcgctcggtc atccacagaa caggaaccgt gcatcacaaa ccaggcgttt cggatacctg taggtatctc cgttcagccc acacgacita aggcggtgct atttggtatc atccggcaaa gcgcagaaaa gtggaacgaa ctagatcctt ttggtctgac tcgttcatcc accatctggc atcagcaata tccgaacccc cttttggctg ccagcaatca gtggagtact aatcgggaac caatgagatc tttgcgaaga gtctatactg catgaggaga gtttttattt cgcggtccga cccccgcggg gcaataacta aggaggaact tccctttagt tgaaattgtt gcctggggtg itccagtcgg ggcggtttgc gttcggctgc tcaggggata aaaaaggccg aatcgacgct ccccctggaa tccgcct t tc agttcggtgt gaccgctgcg tcgccactgg acagagttct tgcgctctgc caaaccaccg aaaggatctc aactcacgtt t taaattaaa agttaccaat atagttgcct cccagtgctg aaccagccag ccatcagatg agtttgatgg ttcccgatta agaggtgatg tggatcagat ttgttcaatc aacacaggaa atgttgaaga ctccaaactt tttatctggt cctgggcatc gctgctaaca gcataacccc atatccggat gagggttaat atccgctcac cctaatgagt gaaacctgtc gtattgggcg ggcgagcggt acgcaggaaa cgttgctggc caagtcagag gctccctcgt tcccttcggg aggtcgttcg ccttatccgg cagcagccac tgaagtggtg tgaagccagt ctggtagcgg aagaagatcc aagggatt tt aalgaagt tt gcltaatcag gactccccgt caatgatacc ccggaagggc gaattgcaca agaaagacat ggtgggaggc ggctcccaaa ctctggaait agctatgtcg tgattgaatg gtgacctaca taagtatgaa tttgtggtct cgaaggagga aagcccgaaa ttggggcctc cgagacctcg ttcgagcttg aattccacac gagctaactc gtgccagctg ctcttccgct atcagctcac gaacatgtga gtttttccat gtggcgaaac gcgctctcct aagcgtggcg ctccaagctg taactatcgt tggtaacagg gcctaactac taccttcgga tggttttttt tttgatcttt ggtcatgaga taaatcaatc tgaggcacct cgtgtagata gcgagaccca cgagcgcaga aaatgtgggg tccactatat tgtttcagta agatacccga ggtccgaaac tacagtggat gatcaataga cgaggaaaac aaaaactttg tcgtgggtcg cgtcgtccac ggaagctgag taaacgggtc atactagtgc gcgtaatcat aacatacgag acattaattg cattaatgaa tcctcgctca tcaaaggcgg gcaaaaggcc aggctccgcc ccgacaggac gt tccgaccc ct nctcata ggctgtgtgc ct tgagtcca at tagcagag ggciacacta aaaagagttg gt ttgcaagc tctacggggt ttatcaaaaa taaagtatat atctcagcga actacgatac cgctcaccgg agtggtcctg 12120 12180 12240 )2300 12360 12420 12480 12540 12600 12660 12720 12780 12840 )2900 12960 13020 13080 13140 13200 13260 13320 13380 13440 13500 13560 13620 13680 13740 13800 13860 13920 13980 14040 14100 14160 14220 14280 14340 • 42· 13 63 26-序列表.doc 200932259
caactttatc cgccagttaa cgtcgtttgg cccccatgtt agttggccgc tgccatccgt agtgtatgcg alagcagaac ggatcttacc cagcatcttt caaaaaaggg attattgaag agaaaaataa aagcgttaat ccaataggcc gagtgttgtt agggcgaaaa uttttgggg tagagcttga agcgggcgci cgcgcttaat ggaagggcga tgcaaggcga ggccagtgaa cgcctccatc tagtttgcgc tatggctica gtgcaaaaaa agtgttatca aagatgcttt gcgaccgagt tttaaaagtg gctgttgaga tactttcacc aataagggcg catttatcag acaaataggg attttgttaa gaaatcggca ccagtttgga accgtctatc tcgaggigcc cggggaaagc agggcgctgg gcgccgctac tcggtgcggg ttaagttggg ttgtaatacg cagtctatta aacgitgttg ttcagctccg gcggttagct ctcatggtta tctgtgactg tgctcttgcc ctcatcattg tccagttcga agcgtttctg acacggaaat ggnattgtc gttccgcgca aattcgcgtt aaatccctta acaagagtcc agggcgatgg gtaaagcact cggcgaacgt caagtgtagc agggcgcgtc cctcttcgct taacgccagg actcactata attgttgccg ccattgciac gttcccaacg ccttcggicc tggcagcact gtgagtactc cggcgtcaat gaaaacgttc tgtaacccac ggtgagcaaa gttgaatact tcatgagcgg catttccccg aaatttttgt taaatcaaaa actattaaag cccactacgi aaatcggaac ggcgagaaag ggtcacgctg ccattcgcca at tacgccag gttttcccag gg ggaagctaga aggcatcgtg atcaaggcga tccgatcgtt gcataattct aaccaagtca acgggataat ttcggggcga tcgtgcaccc aacaggaagg catactcttc atacatattt aaaagtgcca taaatcagct gaatagaccg aacgtggact gaaccaicac cctaaaggga gaagggaaga cgcgtaacca ttcaggctgc ctggcgaaag tcacgacgtt gtaagtagtt gtgicacgct guacatgat gtcagaagta cttactgica ttctgagaat accgcgccac aaaclctcaa aactgatctt caaaatgccg ctttttcaat gaatgtattt cctaaattgt catttttiaa agatagggtt ccaacgicaa cctaatcaag gcccccgait aagcgaaagg ccacacccgc gcaactgttg ££S£atgtgc gtaaaacgac 14400 14460 14520 14580 14640 14700 14760 14820 14880 14940 15000 15060 15120 15180 15240 15300 15360 15420 15480 15540 15600 15660 15720 15752
O
<210> 5 <211> 4015 <212> PRT <213>水皰性口炎病毒 <400> 5
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly G!u Leu Asp Arg 丁rp 15 10 15
Glu Lys lie Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys 20 25 30
His lie Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Arg Gin lie Leu Gly Gin Leu 50 55 60
Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Scr Leu Tyr Asn 65 70 75 80 •43- 136326-序列表.doc 200932259
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg lie Glu lie Lys Asp 85 90 95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys lie Glu Glu Glu Gin Asn Lys Ser Lys 100 105 110
Lys Lys Ala Gin Gin Aia Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gin Val 115 120 125
Ser G!n Asn Tyr Pro Me Val Gin Asn ile Gin Gly Gin Met Val His 130 135 140
Gin Ala Jle Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Va] Glu 145 150 155 160
Glu Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser 165 170 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly 180 185 190
O
Gly His Gin Ala Ala Met Gin Met Leu Lys Glu Thr Ile Asn Glu Glu 195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala 210 215 220
Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240
Ser Thr Leu Gin Glu Gin lie Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro Ile 245 250 255
Pro Val Gly Glu lie Tyr Lys Arg Trp lie lie Leu Gly Leu Asn Lys 260 265 270 lie Val Arg Met Tyr Ser Pro Thr Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gin Gly 275 280 285 o
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 290 295 300
Arg Ala Glu Gin Ala Ser Gin Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Glu Thr 305 310 315 320
Leu Leu Val Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr 丨le Leu Lys Ala 325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Mei Thr Ala Cys Gin Gly 340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser 355 360 365
Gin Val Thr Asn Ser Ala Thr He Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg -44 - 136326-序列表.doc 200932259 370 375 380
Asn Gin Arg Lys lie Val Lys Cys Phe Asn Cys 385 390 395
Gly Lys Glu Gly His 400
Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys 405 410
Gly Cys Trp Lys Cys 415
Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr 420 425
Glu Arg Gin Ala Asn 430
Phe Leu Gly Lys lie Trp Pro Ser Tyr Lys Gly 435 440
Arg Pro Gly Asn Phe 445
Leu Gin Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Fro Pro 450 455
Glu Glu Ser Phe Arg 460
Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gin Lys 465 470 475
Gin Glu Pro lie Asp 480
Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser 485 490
Leu Phe Gly Asn Asp 495
Pro Ser Ser Gin Met Asp Asn Leu Thr Lys Val 500 505 Ser Tyr Ser Arg Leu Asp Gin Ala Val Gly Glu 515 520
Arg Glu Tyr Leu Lys 510
Ile Asp Glu lie Glu 525
Ala Gin Arg Ala Glu Lys Ser Asn Tyr Glu Leu 530 535
Phe Gin Glu Asp Gly 540
Val Glu G!u His Thr Lys Pro Ser Tyr Phe Gin 545 550 555
Ala Ala Asp Asp Ser 560
Asp Thr Glu Ser Glu Pro Glu lie Glu Asp Asn 565 570
Gin Gly Leu Tyr Ala 575
Pro Asp Pro Glu Ala Glu Gin Val Glu Gly Pbe 580 585 lie Gin Gly Pro Leu 590
Asp Asp Tyr Ala Asp Glu Glu Val Asp Va) Val 595 600
Phe Thr Ser Asp Trp 605
Lys Gin Pro Glu Leu Glu Ser Asp Glu His Gly 610 615
Lys Thr Leu Arg Leu 620
Thr Ser Pro Glu Gly Leu Ser Gly Glu Gin Lys 625 630 635
Ser Gin 丁rp Leu Ser 640
Thr lie Lys Ala Val Val Gin Ser Ala Lys Tyr 645 650
Trp Asn Leu Ala Glu 655
Cys Thr Phe Glu Ala Ser Gly Glu Gly Val He 660 665
Met Lys Clu Arg Gin 670 136326-序列表.doc -45· 200932259 lie Thr Pro Asp Val Tyr Lys Val Thr Pro Val Met Asn Thr His Pro 675 680 685
Ser Gin Ser Glu Ala Val Ser Asp Val Trp Ser Leu Scr Lys Thr Ser 690 695 700
Met Thr Phe Gin Pro Lys Lys Ala Ser Leu Gin Pro Leu Thr lie Ser 705 710 715 720
Leu Asp Glu Leu Phe Ser Ser Arg Gly Glu Phe lie Ser Val Cly Gly 725 730 735
Asp Gly Arg Met Ser His Lys Glu Ala lie Leu Leu Gly Leu Arg Tyr 740 745 750
Lys Lys Leu Tyr Asn Gin Ala Arg Va丨 Lys Tyr Ser Leu Met Ser Ser 755 760 765
Leu Lys Lys lie Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys Ser Lys Lys 770 775 780 ❹
Leu Gly Me Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Glu Asp Thr Ser Met Glu Tyr 785 790 795 800
Ala Pro Ser Ala Pro lie Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val Asp Glu Met 805 8J0 815
Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gin Leu Arg Tyr Glu Lys Phe Phe Phe Thr 820 825 830
Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr Tyr Ser Asp 835 840 845
Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr lie Gly Mcl Ala 850 855 860
Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys He Leu Ala Phe Leu Gly Ser Ser Asn 865 870 875 880
Leu Lys Ala Thr Pro Ala Val Leu Ala Asp Gin Gly Gin Pro Glu Tyr 885 890 895
His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Pro His Arg Met GJy Lys 900 905 910
Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro Phe Asn 915 920 925 lie Gly Leu Tyr Lys Gly Thr lie Glu Leu Thr Met Thr lie Tyr Asp 930 935 940
Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met He Trp Asp His Phe Asn Ser 945 950 955 960
Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly Leu lie 965 970 975 -46- 136326-序列表.doc 200932259
Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser lie Giy His 980 985 990
Phe Lys Met Ser Va) Thr Val Lys Arg lie lie Asp Asn Thr Val Val 995 1000 丨 005
Val Pro Lys Leu Pro Ala Asn Glu Asp Pro Va! Glu Tyr Pro Ala 1010 1015 1020
Asp Tyr Phe Arg Lys Ser Lys Glu He Pro Leu Tyr I le Asn Thr 1025 1030 1035
Thr Lys Ser Leu Ser Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gin Gly Leu 1040 1045 1050
Lys Ser Gly Asn Val Ser lie He His Va! Asn Ser Tyr Leu Tyr 1055 1060 1065
Giy Ala Leu Lys Asp lie Arg Gly Lys Leu Asp Lys Asp Trp Ser 1070 1075 1080
Scr Phe Gly lie Asn lie Gly Lys Ala Gly Asp Thr lie Gly Ile 1085 1090 1095
Phe Asp Leu Val Ser Leu Lys Ala Leu Asp Gly Val Leu Pro Asp 1100 1105 1110
Gly Val Ser Asp Ala Ser Arg Thr Ser Ala Asp Asp Lys Trp Leu 1115 1120 1125
Pro Leu Tyr Leu Leu Gly Leu Tyr Arg Val Gly Arg Thr Gin Met 1130 1135 1140
Pro Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Met Asp Gly Leu Thr Asn Gin Cys 1145 1150 1155
Lys Met lie Asn Glu Gin Phe Glu Pro Leu Val Pro Glu Gly Arg 1160 1165 1170
Asp lie Phe Asp Val Trp Gly Asn Asp Ser Asn Tyr Thr Lys lie 1175 1180 1185
Val Ala Ala Val Asp Met Pbe Phe His Met Phe Lys Lys His Glu 1190 1)95 1200
Cys Ala Ser Phe Arg Tyr Gly Thr lie Val Ser Arg Phe Lys Asp 1205 】210 1215
Cys Ala Ala Leu Ala Thr Phe Gly His Leu Cys Lys He Thr Gly 1220 1225 1230
Met Ser Thr Glu Asp Val Thr Thr Trp He Leu Asn Arg Glu Val 1235 1240 1245
Ala Asp Glu Met Val Gin Met Met Leu Pro Gly Gin Glu lie Asp 1250 1255 1260 -47- 136326-序列表.doc 200932259
Lys Ala Asp Ser Tyr Met Pro Tyr Leu lie Asp Phe Gly Leu Ser 1265 】270 1275
Ser Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Val Lys Asn Pro Ala Phe His Phe 1280 1285 1290
Trp Gly Gin Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ser Thr Arg Ala Arg 1295 1300 1305
Asn Ala Arg Gin Pro Asp Asp Me Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Thr 1310 1315 1320
Ala Gly Leu Leu Tyr Ala Tyr Ala Val Gly Ser Ser Ala Asp Leu 1325 1330 1335 A】a Gin Gin Phe Cys Va】Gly Asp Asn Lys 丁yr Thr Pro Asp Asp 1340 1345 1350
Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Asn Ala Pro Pro Gin Gly Arg Asp 1355 1360 1365 o
Val Val Glu Trp Leu Gly Trp Phe Glu Asp Gin Asn Arg Lys Pro Ϊ370 1375 1380
Thr Pro Asp Met Met Gin Tyr Ala Lys Arg Ala Val Met Ser Leu 1385 1390 1395
Gin Gly Leu Arg Glu Lys Thr lie Gly Lys Tyr Ala Lys Ser Giu 1400 1405 1410
Phe Asp Lys Met Leu Ser Tyr Leu lie Phe Ala Leu Ala Val Ser 1415 1420 1425
Pro lie Leu Gly Lys lie Glu lie Val Phe Pro Gin His Thr Thr 1430 1435 1440
Gly Asp Trp Lys Arg Val Pro His Glu Tyr Asn Tyr Cys Pro Thr 1445 1450 1455
Ser Ala Asp Lys Asn Ser His Gly Thr Gin Thr Gly He Pro Val 1460 1465 1470
Glu Leu Thr Met Pro Lys Gly Leu Thr Thr His Gin Val Glu Gly 1475 1480 1485
Phe Met Cys His Ser Ala Leu Trp Met Thr Thr Cys Asp Phe Arg 1490 1495 1500
Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr lie Thr His Ser lie His Asn Glu Glu 1505 1510 1515
Pro Thr Asp Tyr Gin Cys Leu Glu Ala lie Lys Ser Tyr Lys Asp 1520 1525 1530
Gly Val Ser Phe Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gin Ser Cys Gly Tyr -48- 136326-序列表.doc 200932259 1535 1540 1545
Gly Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala His lie Val Thr Val Thr Pro 1550 1555 1560
His Ser Val Lys Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp lie Asp Pro 1565 1570 1575
His Phe He Gly Gly Arg Cys Lys Gly Gin He Cys Glu Thr Val 1580 1585 1590
His Asn Ser Thr Lys Trp Phe Thr Ser Ser Asp Gly Glu Ser Val 1595 1600 1605
Cys Ser Gin Leu Phe Thr Leu Val Gly Gly lie Phe Phe Ser Asp 3610 ]6】5 1620
Ser Glu Glu lie Thr Ser Met Gly Leu Pro Glu Thr Gly He Arg 1625 1630 1635 〇
Ser Asn Tyr Phe Pro Tyr He Ser Thr Glu Gly He Cys Lys Met 1640 1645 1650
Pro Phe Cys Arg Lys Gin Gly Tyr Lys Leu Lys Asn Asp Leu Trp 1655 1660 1665
Phe Gin lie Met Asp Pro Asp Leu Asp Lys Thr Val Arg Asp Leu 1670 1675 1680
Pro His He Lys Asp Cys Asp Leu Ser Ser Ser lie lie Thr Pro 1685 1690 1695
Gly Glu His Ala Thr Asp lie Ser Leu lie Ser Asp Val Glu Arg 1700 1705 Π10 lie Leu Asp Tyr Ala Leu Cys Gin Asn Thr Trp Ser Lys lie Glu 1715 1720 1725
Ser Gly Glu Pro lie Thr Pro Val Asp Leu Ser Tyr Leu Gly Pro 1730 1735 1740
Lys Asn Pro Gly Val Gly Pro Val Phe Thr lie lie Asn Gly Ser 1745 1750 1755
Leu His Tyr Phe Thr Ser Lys Tyr Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser 1760 1765 1770
Pro Val lie Pro Arg Met Glu Gly Lys Va! Ala Gly Thr Arg lie 1775 1780 1785
Val Arg Gin Leu Trp Asp Gin Trp Phe Pro Phe Gly Glu Val Glu 1790 1795 1800 lie Gly Pro Asn Gly Val Leu Lys Thr Lys Gin Gly Tyr Lys Phe 1805 1810 1815 -49- 13 6326·序列表.doc 200932259
Pro Leu His lie He Gly Thr Gly GIu Val Asp Ser Asp He Lys 1820 1825 1830
Met Glu Arg Val Val Lys His Trp Glu His Pro His lie Glu Ala 1835 1840 1845
Aia Gin Thr Phe Leu Lys Lys Asp Asp Thr Gly Glu Val Leu Tyr 1850 1855 1860
Tyr Gly Asp Thr Gly Val Ser Lys Asn Pro Val Glu Leu Val Glu 1865 1870 1875
Gly Trp Phe Ser Gly Trp Arg Ser Ser Leu Met Gly Val Leu Ala 1880 1885 1890
Val lie He Gly Phe Va] lie Leu Met Phe Leu lie Arg Met Glu 1895 1900 1905
Val His Asp Phe Glu Thr Asp Glu Phe Asn Asp Phe Asn Glu Asp 1910 1915 1920 〇
Asp Tyr Ala Thr Arg Glu Phe Leu Asn Pro Asp Glu Arg Met Thr 1925 】930 1935
Tyr Leu Asn His Ala Asp Tyr Asn Leu Asn Ser Pro Leu lie Ser 1940 1945 1950
Asp Asp Me Asp Asn Leu lie Arg Lys Phe Asn Ser Leu Pro lie 1955 )960 1965
Pro Ser Met Trp Asp Ser Lys Asn Trp Asp Gly Vai Leu Glu Mel 1970 1975 1980
Leu Thr Ser Cys Gin Ala Asn Pro lie Pro Thr Ser Gin Met His 1985 1990 1995
Lys Trp Met Gly Ser Trp Leu Met Ser Asp Asn His Asp Ala Ser 2000 2005 2010 G!n Giy Tyr Ser Phe Leu His Glu Val Asp Lys Glu Ala Glu lie 2015 2020 2025
Thr Phe Asp Val Val Glu Thr Pbe He Arg Gly Trp Gly Asn Lys 2030 2035 2040
Pro lie Glu Tyr He Lys Lys Glu Arg Trp Thr Asp Ser Phe Lys 2045 2050 2055
Me Leu Ala Tyr Leu Cys Gin Lys Phe Leu Asp Leu His Lys Leu 2060 2065 2070
Thr Leu lie Leu Asn Ala Val Ser Glu Val Glu Leu Leu Asn Leu 2075 2080 2085
Ala Arg Thr Phe Lys Gly Lys Val Arg Arg Ser Ser His Gly Thr 2090 2095 2100 -50- 136326-序列表.doc 200932259
Asn lie Cys Arg lie Arg Val Pro Ser Leu Gly Pro Thr Phe lie 2105 2110 2115
Ser Glu Gly Trp Ala Tyr Phe Lys Lys Leu Asp He Leu Met Asp 2120 2125 2130
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Gin Thr Val Leu Ser Met Vai Cys Arg lie Asp Asn Leu Phe Ser 2)50 2155 2160
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Lys He Val Glu Arg Gin Gly Asn Phe Ser Tyr Asp Leu lie Lys 2180 2185 2190
Met Val Glu Pro lie Cys Asn Leu Lys Leu Met Lys Leu Ala Arg 2195 2200 2205
Glu Ser Arg Pro Leu Val Pro Gin Phe Pro His Phe Glu Asn His 2210 2215 2220 lie Lys Thr Ser Val Asp Glu Gly Ala Lys He Asp Arg Gly lie 2225 2230 2235
Arg Phe Leu His Asp Gin lie Met Ser Val Lys Thr Val Asp Leu 2240 2245 2250
Thr Leu Val lie Tyr Giy Ser Phe Arg His Trp Gly His Pro Phe 2255 2260 2265 lie Asp Tyr Tyr Thr Gly Leu Glu Lys Leu His Ser Gin Val Thr 2270 2275 2280
Met Lys Lys Asp lie Asp Val Ser Tyr Ala Lys Ala Leu Ala Ser 2285 2290 2295
Asp Leu Ala Arg He Val Leu Phe Gin Gin Phe Asn Asp His Lys 2300 2305 2310
Lys Trp Phe Val Asn Gly Asp Leu Leu Pro His Asp His Pro Phe 2315 2320 2325
Lys Ser His Val Lys Glu Asn Thr Trp Pro Thr Ala Ala Gin Val 2330 2335 2340
Gin Asp Phe Gly Asp Lys Trp His Glu Leu Pro Leu lie Lys Cys 2345 2350 2355
Phe Glu lie Pro Asp Leu Leu Asp Pro Ser lie lie Tyr Ser Asp 2360 2365 2370
Lys Ser His Ser Met Asn Arg Ser Glu Val Leu Lys His Val Arg 2375 2380 2385 -51 - 136326-序列表.doc 200932259
Met Asn Pro Asn Thr Pro Ile Pro Ser Lys Lys Val Leu Gin Thr 2390 2395 2400
Met Leu Asp Thr Lys Ala Thr Asn Trp Lys Glu Phe Leu Lys Glu 2405 2410 2415 lie Asp Glu Lys Gly Leu Asp Asp Asp Asp Leu lie lie Gly Leu 2420 2425 2430
Lys Gly Lys Glu Arg Glu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Phe Phe Ser 2435 2440 2445
Leu Met Ser Trp Lys Leu Arg Glu Tyr Phe Val He Thr Glu Tyr 2450 2455 2460
Leu lie Lys Thr His Phe Val Pro Met Phe Lys Gly Leu Thr Met 2465 2470 2475
Ala Asp Asp Leu Thr Ala Val Me Lys Lys Met Leu Asp Ser Ser 2480 2485 2490
Ser Gly Gin Gly Leu Lys Ser Tyr Glu Ala lie Cys lie Ala Asn 2495 2500 2505
His lie Asp Tyr Glu Lys Trp Asn Asn His Gin Arg Lys Leu Ser 2510 2515 2520
Asn Gly Pro Val Phe Arg Val Met Gly Gin Phe Leu Gly Tyr Pro 2525 2530 2535
Ser Leu lie Glu Arg Thr His Glu Phe Phe Glu Lys Ser Leu lie 2540 2545 2550
Tyr Tyr Asn Gly Arg Pro Asp Leu Met Arg Val His Asn Asn Thr 2555 2560 2565
Leu lie Asn Ser Thr Ser Gin Arg Val Cys Trp Gin Gly Gin Glu 2570 2575 2580
Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gin Lys Gly Trp Ser Me Leu Asn 2585 2590 2595
Leu Leu Val lie Gin Arg Glu Ala Lys lie Arg Αϋη Thr Ala Val 2600 2605 2610
Lys Val Leu Ala Gin Gly Asp Asn Gin Val lie Cys Thr Gin Tyr 2615 2620 2625
Lys Thr Lys Lys Ser Arg Asn Val Va! Glu Leu Gin Gly Ala Leu 2630 2635 2640
Asn Gin Met Val Ser Asn Asn Glu Lys lie Met Thr Ala lie Lys 2645 2650 2655 lie Gly Thr Gly Lys Leu Gly Leu Leu lie Asn Asp Asp Glu Thr -52- 136326·序列表.doc 200932259 2660 2665 2670
Met Gin Ser Ala Asp Tyr Leu Asn Tyr Gly Lys IJe Pro lie Phe 2675 2680 2685
Arg Gly Val lie Arg Gly Leu Glu Thr Lys Arg Trp Ser Arg Val 2690 2695 2700
Thr Cys Val Thr Asn Asp Gin lie Pro Thr Cys Ala Asn lie Met 2705 2710 2715
Ser Ser Val Ser Thr Asn Ala Leu Thr Val Ala His Phe Ala Glu 2720 2725 2730
Asn Pro He Asn Ala Met lie Gin Tyr Asn Tyr Phe Gly Thr Phe 2735 2740 2745
Ala Arg Leu Leu Leu Met Met His Asp Pro Ala Leu Arg Gin Ser 2750 2755 2760
Leu Tyr Glu Val Gin Asp Lys lie Pro Gly Leu His Ser Ser Thr 2765 2770 2775
Phe Lys Tyr Ala Met Leu Tyr Leu Asp Pro Ser lie Gly Gly Val 2780 2785 2790
Ser Gly Met Ser Leu Ser Arg Phe Leu lie Arg Ala Phe Pro Asp 2795 2800 2805
Pro Val Thr Glu Ser Leu Ser Phe Trp Arg Phe lie His Val His 2810 2815 2820
Ala Arg Ser Glu His Leu Lys Glu Met Ser Ala Val Phe Gly Asn 2825 2830 2835
Pro Glu lie Ala Lys Phe Arg lie Thr His He Asp Lys Leu Va! 2840 2845 2850
Glu Asp Pro Thr Ser Leu Asn He Ala Met Gly Met Ser Pro Ala 2855 2860 2865
Asn Leu Leu Lys Thr Glu Va) Lys Lys Cys Leu lie Glu Ser Arg 2870 2S75 2880
Gin Thr lie Arg Asn Gin Val lie Lys Asp Ala Thr lie Tyr Leu 2885 2890 2895
Tyr His Glu Glu Asp Arg Leu Arg Ser Phe Leu 丁rp Ser ile Asn 2900 2905 2910
Pro Leu Phe Pro Arg Phe Leu Scr Glu Phe Lys Ser Gly Thr Phe 2915 2920 2925
Leu Gly Val Ala Asp Gly Leu lie Ser Leu Phe Gin Asn Ser Arg 2930 2935 2940 -53- 136326-序列表.doc 200932259
Thr lie Arg Asn Ser Phe Lys Lys Lys Tyr His Arg Glu Leu Asp 2945 2950 2955
Asp Leu lie Val Arg Ser Glu Val Ser Ser Leu Thr His Leu Gly 2960 2965 2970
Lys Leu His Leu Arg Arg Gly Ser Cys Lys Met Trp Thr Cys Ser 2975 2980 2985
Ala Thr His Ala Asp Thr Leu Arg Tyr Lys Ser Trp Gly Arg Thr 2990 2995 3000
Val lie Gly Thr Thr Val Pro His Pro Leu Giu Met Leu Gly Pro 3005 3010 3015
Gin His Arg Lys Glu Thr Pro Cys Ala Pro Cys Asn Thr Ser Gly 3020 3025 3030
Phe Asn Tyr Val Ser Val His Cys Pro Asp Gly lie His Asp Val 3035 3040 3045
Phe Ser Ser Arg Gly Pro Leu Pro Ala TyT Leu Gly Ser Lys Thr 3050 3055 3060
Ser Glu Ser Thr Ser He Leu Gin Pro Trp Glu Arg Glu Ser Lys 3065 3070 3075
Val Pro Leu He Lys Arg Ala Thr Arg Leu Arg Asp Ala lie Ser 3080 3085 3090
Trp Phe Val Glu Pro Asp Ser Lys Leu Ala Met Thr lie Leu Ser 3095 3100 3105
Asn lie His Ser Leu Thr Gly Glu Glu Trp Thr Lys Arg Gin His 3110 3115 3120
Gly Phe Lys Arg Thr Gly Ser Ala Leu His Arg Phe Ser Thr Ser 3125 3130 3135
Arg Met Ser His Gly Gly Phe Ala Ser Gin Ser Thr Ala Ala Leu 3140 3145 3150
Thr Arg Leu Met Ala Thr Thr Asp Thr Met Arg Asp Leu Gly Asp 3355 3160 3165
Gin Asn Phe Asp Phe Leu Phe Gin Ala Thr Leu Leu Tyr Ala Gin 3170 3175 3180
He Thr Thr Thr Val Ala Arg Asp Gly Trp He Thr Ser Cys Thr 3185 3190 3195
Asp His Tyr His Me Ala Cys Lys Ser Cys Leu Arg Pro lie Glu 3200 3205 3210
Glu lie Thr Leu Asp Ser Ser Met Asp Tyr Thr Pro Pro Asp Val 3215 3220 3225 -54- 136326-序列表.doc 200932259
Ser His Va) Leu Lys Thr Trp Arg Asn G】y Glu Gly Ser 丁rp GJy 3230 3235 3240
Gin GIu He Lys Gin lie Tyr Pro Leu GIu Giy Asn Trp Lys Asn 3245 3250 3255
Leu Ala Pro Ala GIu Gin Ser Tyr Gin Val Gly Arg Cys lie Gly 3260 3265 3270
Phe Leu Tyr Gly Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Ser Thr His Ala GIu 3275 3280 3285
Asp Ser Ser Leu Phe Pro Leu Ser lie Gin Gly Arg lie Arg Gly 3290 3295 3300
Arg Gly Phe Leu Lys Gly Leu Leu Asp Gly Leu Mel Arg Ala Ser 3305 3310 3315
Cys Cys Gin Val lie His Arg Arg Ser Leu Ala His Leu Lys Arg 3320 3325 3330
Pro Ala Asn Ala Val Tyr Giy Gly Leu lie Tyr Leu lie Asp Lys 3335 3340 3345
Leu Ser Val Ser Pro Pro Phe Leu Ser Leu Thr Arg Ser Gly Pro 3350 3355 3360
He Arg Asp GIu Leu GIu Thr He Pro His Lys lie Pro Thr Ser 3365 3370 3375
Tyr Pro Thr Ser Asn Arg Asp Met Gly Val lie Val Arg Asn Tyr 3380 3385 3390
Phe Lys Tyr Gin Cys Arg Leu lie GIu Lys Gly Lys Tyr Arg Ser 3395 3400 3405
His Tyr Ser Gin Leu 丁rp Leu Phe Ser Asp Val Leu Ser lie Asp 3410 3415 3420 ❹
Phe lie Gly Pro Phe Ser lie Ser Thr Thr Leu Leu Gin lie Leu 3425 3430 3435
Tyr Lys Pro Phe Leu Ser Gly Lys Asp Lys Asn GIu Leu Arg GIu 3440 3445 3450
Leu Ala Asn Leu Ser Ser Leu Leu Arg Ser Gly GIu Gly Trp GIu 3455 3460 3465
Asp He His Val Lys Phe Phe Thr Lys Asp lie Leu Leu Cys Pro 3470 3475 3480 GIu GIu lie Arg His Ala Cys Lys Phe Gly He Ala Lys Asp Asn 3485 3490 3495
Asn Lys Asp Met Ser Tyr Pro Pro Trp Gly Arg GIu Ser Arg Gly 3500 3505 3510 •55- 136326-序列表.doc 200932259
Thr lie Thr Thr 3 le Pro Val Tyr Tyr Thr Thr Thr Pro Tyr Pro 3515 3520 3525
Lys Met Leu GIu Met Pro Pro Arg lie Gin Asn Pro Leu Leu Ser 3530 3535 3540
Gly lie Arg Leu Gly Gin Leu Pro Thr Gly Ala His Tyr Lys lie 3545 3550 3555
Arg Ser lie Leu His Gly Met Gly He His Tyr Arg Asp Phe Leu 3560 3565 3570
Ser Cys Gly Asp Giy Ser Gly Gly Met Thr Ala Ala Leu Leu Arg 3575 3580 3585 GIu Asn Val His Ser Arg Gly lie Phe Asn Ser Leu Leu Glu Leu 3590 3595 3600
Ser Gly Ser Val Met Arg Gly Ala Ser Pro Glu Pro Pro Ser Ala 3605 3610 3615 ❹
Leu Glu Thr Leu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Cys Val Asn Gly Glu 3620 3625 3630
Thr Cys Trp Glu Tyr Pro Ser Asp Leu Cys Asp Pro Arg Thr Trp 3635 3640 3645
Asp Tyr Phe Leu Arg Leu Lys Ala Gly Leu Gly Leu Gin lie Asp 3650 3655 3660
Leu He Va! Met Asp Met Glu Val Arg Asp Ser Ser Thr Ser Leu 3665 3670 3675
Lys lie Glu Thr Asn Val Arg Asn Tyr Val His Arg lie Leu Asp 3680 3685 3690
Glu Gin Gly Val Leu He Tyr Lys Thr Tyr Gly Thr Tyr He Cys 3695 3700 3705
Glu Ser Glu Lys Asn Ala Val Thr lie Leu Gly Pro Met Phe Lys 3710 3715 3720
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Glu Val Tyr Met Val Cys Lys Gly Leu Lys Lys Leu lie Asp Glu 3740 3745 3750
Pro Asn Pro Asp Trp Ser Ser lie Asn Glu Ser Trp Lys Asn Leu 3755 3760 3765
Tyr Ala Phe Gin Ser Ser GIu Gin GIu Phe Ala Arg Ala Lys Lys 3770 3775 3780
Val Ser Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Gly lie Pro Ser Gin Phe He -56- 136326-序列表.doc 200932259 3785 3790 3795
Pro Asp Pro Phe Val Asn lie Glu Thr Met Leu Gin lie Phe Gly 3800 3805 3810
Val Pro Thr Gly Val Ser His Ala Ala Ala Leu Lys Ser Ser Asp 3815 3820 3825
Arg Pro Ala Asp Leu Leu Thr lie Ser Leu Phe Tyr Met Ala lie 3830 3835 3840 lie Ser Tyr Tyr Asn He Asn His He Arg Val Gly Pro lie Pro 3845 3850 3855
Pro Asn Pro Pro Ser Asp Gly lie Ala Gin Asn Val Gly He Ala 3860 3865 3870 lie Thr Gly lie Ser Phe Trp Leu Ser Leu Met Glu Lys Asp lie 3875 3880 3885
Pro Leu Tyr Gin Gin Cys Leu Ala Val lie Gin Gin Ser Phe Pro 3890 3895 3900 lie Arg Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Gly Gly Tyr Lys Gin Lys 3905 3910 3915
Trp Ser Thr Arg Gly Asp Gly Leu Pro Lys Asp Thr Arg lie Ser 3920 3925 3930
Asp Ser Leu Ala Pro lie Gly Asn Trp lie Arg Ser Leu Glu Leu 3935 3940 3945
Val Arg Asn Gin Val Arg Leu Asn Pro Phe Asn Glu lie Leu Phe 3950 3955 3960
Asn Gin Leu Cys Arg Thr Val Asp Asn His Leu Lys 丁rp Ser Asn 3965 3970 3975 ❹
Leu Arg Arg Asn Thr Gly Met He Glu Trp lie Asn Arg Arg lie 3980 3985 3990
Ser Lys Glu Asp Arg Ser lie Leu Met Leu Lys Ser Asp Leu Hi; 3995 4000 4005
Glu Glu Asn Ser Trp Arg Asp 4010 4015
<210> 6 <211> 4015 <212> PRT <213>水炮性口炎病毒 <400> 6
Met Gly Ala Arg Ala Ser Val Leu Ser Gly Gly Glu Leu Asp Arg Trp 1 5 10 15
Glu Lys lie Arg Leu Arg Pro Gly Giy Lys Lys Lys Tyr Lys Leu Lys -57- 136326-序列表.doc 200932259 20 25 30
His He Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Val Asn Pro 35 40 45
Gly Leu Leu Glu Thr Scr Glu Gly Cys Arg Gin lie Leu Gly Gin Leu
Gin Pro Ser Leu Gin Thr Gly Ser Glu Glu Leu Arg Ser Leu Tyr Asn 65 70 75 80
Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Gin Arg He Glu lie Lvs Asd 85 90 95
Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys 丨le Glu Glu Glu Gin Asn Lys Ser Lvs 300 】05 l!〇 y
Lys Lys Ala Gin Gin Ala Ala Ala Asp Thr Gly His Ser Asn Gin Val 115 120 125 〇
Ser Gin Asn Tyr Pro lie Val Gin Asn lie Gin Gly Gin Met Val His 130 135 140
Gin Ala lie Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Val Glu 145 150 155 160
Glu Lys Ala Phe Gly Pro Glu Val He Pro Met Phe Ser Ala Leu Ser 】65 170 175
Glu Gly Ala Thr Pro Gin Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly 180 185 190
Gly His Gin Ala Ala Mel Gin Met Leu Lys Glu Thr Me Asn Glu Glu 195 200 205
Ala Ala Glu Trp Asp Arg Val His Pro Val His Ala Gly Pro lie Ala 210 215 220
Pro Gly Gin Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp He Ala Gly Thr Thr 225 230 235 240
Ser Thr Leu Gin Glu Gin He Gly Trp Met Thr Asn Asn Pro Pro lie 245 250 255
ProVa. Gly Glu lie Tyr Lys Arg Trp He He Leu G.y Ser Asn Lys lie Val Arg Met Tyr Scr Pro Thr Ser He Leu Asp lie Arg Gin Gly 275 280 285
Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Thr Leu 290 295 300
Arf A,aG,uG,nA,a Ser Gin G,u Va, Lys Asn Trp Me, G.u Thr -58 - Π6326·序列表.doc 200932259
Leu Leu Va! Gin Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Me Leu Lys Ala 325 330 335
Leu Gly Pro Ala Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gin Gly 340 345 350
Val Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser 355 360 365
Gin Val Thr Asn Ser Ala Thr lie Met Met Gin Arg Gly Asn Phe Arg 370 375 380
Asn Gin Arg Lys lie Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His 385 390 395 400
Thr Ala Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys 405 410 415
Gly Lys Glu Gly His Gin Met Lys Asp Cys Thr Giu Arg Gin Ala Asn 420 425 430
Phe Leu GJy Lys lie 丁rp Pro Ser Tyr Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe 435 440 445
Leu Gin Ser Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Glu Glu Scr Phe Arg 450 455 460
Ser Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Pro Gin Lys Gin Glu Pro He Asp 465 470 475 480
Lys Glu Leu Tyr Pro Leu Thr Ser Leu Arg Ser Leu Phe Gly Asn Asp 485 490 495
Pro Ser Ser Gin Met Asp Asn Leu Thr Lys Val Arg Glu Tyr Leu Lys 500 505 510
Ser Tyr Ser Arg Leu Asp Gin Ala Val Gly Glu He Asp Glu lie Glu 515 520 525
Ala Gin Arg Ala Glu Lys Ser Asn Tyr Glu Leu Phe Gin Giu Asp Gly 530 535 540
Val Glu Glu His Thr Lys Pro Ser Tyr Phe Gin Ala Ala Asp Asp Ser 545 550 555 560
Asp Thr Glu Ser Glu Pro Glu He Glu Asp Asn Gin Gly Leu Tyr Ala 565 570 575
Pro Asp Pro Glu Ala Glu Gin Val Glu Gly Phe He Gin Gly Pro Leu 580 585 590
Asp Asp Tyr Ala Asp Glu Glu Val Asp Val Va) Phe Thr Ser Asp Trp 595 600 605
Lys Gin Pro Glu Leu Glu Ser Asp Glu His Gly Lys Thr Leu Arg Leu 610 615 620 -59- 13 63 26-序列表.doc 200932259
Thr Ser Pro Glu Gly Leu Ser Gly Glu Gin Lys Ser Gin Trp Leu Ser 625 630 635 640
Thr lie Lys Ala Val Val Gin Ser Ala Lys Tyr Trp Asn Leu Ala Glu 645 650 655
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He Thr Pro Asp Val Tyr Lys Val Thr Pro Va] Met Asn Thr His Pro 675 680 685
Ser Gin Ser Glu Ala Val Ser Asp Val Trp Ser Leu Ser Lys Thr Ser 690 695 700
Met Thr Phe Gin Pro Lys Lys Ala Ser Leu Gin Pro Leu Thr He Ser 705 710 715 720
Leu Asp Glu Leu Phe Ser Ser Arg Gly Glu Phe He Ser Val Gly Gly 725 730 735 〇
Asp Gly Arg Met Ser His Lys Glu Ala lie Leu Leu Gly Leu Arg Tyr 740 745 750
Lys Lys Leu Tyr Asn Gin Ala Arg Val Lys Tyr Ser Leu Met Ser Ser 755 760 765
Leu Lys Lys lie Leu Gly Leu Lys Gly Lys Gly Lys Lys Ser Lys Lys 770 775 780
Leu Gly He Ala Pro Pro Pro Tyr Glu Giu Asp Thr Ser Met Glu Tyr 785 790 795 800
Ala Pro Ser Ala Pro lie Asp Lys Ser Tyr Phe Gly Val Asp Glu Met 805 810 815
Asp Thr Tyr Asp Pro Asn Gin Leu Arg Tyr Glu Lys Phe Phe Phe Thr 820 825 830
Val Lys Met Thr Val Arg Ser Asn Arg Pro Phe Arg Thr Tyr Ser Asp 835 . 840 845
Val Ala Ala Ala Val Ser His Trp Asp His Met Tyr lie Gly Met Ala 850 855 860
Gly Lys Arg Pro Phe Tyr Lys He Leu Ala Phe Leu Gly Ser Ser Asn 865 870 875 880
Leu Lys Ala Asn Pro Ala Val Leu Ala Asp Gin Gly Gin Pro Glu Tyr 885 890 895
His Ala His Cys Glu Gly Arg Ala Tyr Leu Thr His Arg Met Gly Lys 900 905 910
Thr Pro Pro Met Leu Asn Val Pro Glu His Phe Arg Arg Pro Phe Asn 915 920 925 -60· 136326-序列表.doc 200932259
He Gly Leu Tyr Lys Gly Thr lie Glu Leu Thr Met Thr He Tyr Asp 930 935 940
Asp Glu Ser Leu Glu Ala Ala Pro Met lie Trp Asp His Phe Asn Ser 945 950 955 960
Ser Lys Phe Ser Asp Phe Arg Glu Lys Ala Leu Met Phe Gly Leu lie 965 970 975
Val Glu Lys Lys Ala Ser Gly Ala Trp Val Leu Asp Ser lie Gly His 980 985 990
Phe Lys Met Ser Val Thr Val Lys Arg Me Me Asp Asn Thr Val Val 995 1000 1005
Val Pro Lys Leu Pro Ala Asn Glu Asp Pro Val Glu Tyr Pro Ala 1010 10)5 1020
Asp Tyr Phe Arg Lys Ser Lys Glu He Pro Leu Tyr lie Asn Thr 1025 1030 1035 〇
Thr Lys Ser Leu Ser Asp Leu Arg Gly Tyr Val Tyr Gin Gly Leu 1040 1045 1050
Lys Ser Gly Asn Val Ser lie lie His Va] Asn Ser Tyr Leu Tyr 1055 丨060 1065
Gly Ala Leu Lys Asp I!e Arg G】y Lys Leu Asp Lys Asp 丁rp Ser 1070 1075 1080
Ser Phe Gly lie Asn lie Gly Lys Ala Gly Asp Thr lie Gly lie 1085 1090 1095
Phe Asp Leu Val Ser Leu Lys Ala Leu Asp Gly Vai Leu Pro Asp 1100 1105 1110
Cly Val Ser Asp Ala Ser Arg Thr Ser Ala Asp Asp Lys Trp Leu 1115 1120 1125
Pro Leu Tyr Leu Leu Gly Leu Tyr Arg Val Gly Arg Thr Gin Met 1130 1135 1140
Pro Glu Tyr Arg Lys Lys Leu Met Asp Gly Leu Thr Asn Gin Cys ]]45 1150 1155
Lys Me I lie Asn Glu Gin Phe Glu Pro Leu Val Pro Glu Gly Arg 1160 1165 1170
Asp lie Phe Asp Val Trp Gly Asn Asp Ser Asn 丁yr Thr Lys lie 1175 1180 1185
Val Ala Ala Val Asp Met Phe Phe His Met Phe Lys Lys His Glu 1190 1195 1200
Cys Ala Ser Phe Arg Tyr Gly Thr lie Val Ser Arg Phe Lys Asp -6J - 136326-序列表.doc 200932259 1205 1210 Ϊ2Ϊ5
Cys Ala Ala Leu Ala Thr Phe G]y His Leu Cys Lys Ile Thr Gly 1220 1225 1230
Met Ser Thr Glu Asp Val Thr Thr Trp He Leu Asn Arg Glu Val 1235 1240 1245
Ala Asp Glu Met Val Gin Met Mel Leu Pro Gly Gin Glu lie Asp 1250 1255 1260
Lys Ala Asp Ser Tyr Met Pro Tyr Leu lie Asp Phe Gly Leu Ser 1265 1270 1275
Ser Lys Ser Pro Tyr Ser Ser Val Lys Asn Pro Ala Phe His Phe 1280 1285 1290
Trp Gly Gin Leu Thr Ala Leu Leu Leu Arg Ser Thr Arg Ala Arg 1295 1300 1305
Asn Ala Arg Gin Pro Asp Asp lie Glu Tyr Thr Ser Leu Thr Thr 13)0 1315 1320
Ala Gly Leu Leu Tyr Ala Tyr Ala Va) Gly Ser Ser Ala Asp Leu 1325 1330 1335
Ala Gin Gin Phe Cys Val Gly Asp Asn Lys Tyr Thr Pro Asp Asp 1340 1345 丨350
Ser Thr Gly Gly Leu Thr Thr Asn Ala Pro Pro Gin Gly Arg Asp 1355 1360 1365
Val Val Glu Trp Leu Gly Trp Phe Glu Asp Gin Asn Arg Lys Pro 1370 1375 1380
Thr Pro Asp Met Met Gin Tyr Ala Lys Arg Ala Val Met Ser Leu 1385 1390 1395
Gin Gly Leu Arg Glu Lys Thr He Gly Lys Tyr Ala Lys Ser Giu 1400 1405 1410
Phe Asp Lys Met Leu Ser Tyr Leu lie Phe Ala Leu Ala Val Ser 1415 1420 1425
Pro lie Leu Gly Lys lie Glu He Val Phe Pro Gin His Thr Thr 1430 1435 1440
Gly Asp Trp Lys Arg Val Pro His Glu Tyr Asn Tyr Cys Pro Thr 1445 1450 1455
Ser Ala Asp Lys Asn Ser His Gly Thr Gin Thr Gly He Pro Val 1460 1465 1470
Glu Leu Thr Met Pro Lys Gly Leu Thr Thr His Gin Val Glu Gly 1475 1480 1485 -62- 】36326-序列表.doc 200932259
Phe Met Cys His Ser Ala Leu Trp Met Thr Thr Cys Asp Phe Arg 1490 1495 1500
Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr He Thr His Ser He His Asn Glu Glu 1505 1510 1515
Pro Thr Asp Tyr Gin Cys Leu Glu Ala Me Lys Ser Tyr Lys Asp 1520 1525 1530
Gly Val Ser Phe Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gin Ser Cys Gly Tyr 1535 1540 1545
Gly Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala His lie Val Thr Val Thr Pro 1550 1555 1560
His Ser Val Lys Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp lie Asp Pro 1565 1570 1575
His Phe lie Gly Gly Arg Cys Lys Gly Gin lie Cys Glu Thr Val 1580 1585 1590
His Asn Ser Thr Lys Trp Phe Thr Ser Ser Asp Gly Glu Ser Val 1595 1600 1605
Cys Ser Gin Leu Phe Thr Leu Val Gly Gly lie Phe Phe Ser Asp 1610 1615 1620
Ser Glu Glu He Thr Ser Met Gly Leu Pro Glu Thr Gly He Arg 1625 1630 1635
Ser Asn Tyr Phe Pro Tyr lie Ser Thr Glu Gly Me Cys Lys Met 1640 1645 1650
Pro Phe Cys Arg Lys Gin Gly Tyr Lys Leu Lys Asn Asp Leu Trp 1655 1660 1665
Phe Gin He Met Asp Pro Asp Leu Asp Lys Thr Val Arg Asp Leu 1670 1675 1680
Pro His lie Lys Asp Cys Asp Leu Ser Ser Ser lie Me Thr Pro 1685 1690 1695
Gly Glu His Ala Thr Asp lie Ser Leu He Ser Asp Val Glu Arg 1700 1705 1710 lie Leu Asp Tyr Ala Leu Cys Gin Asn Thr Trp Ser Lys He Glu 1715 1720 1725
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Leu His Tyr Phe Thr Ser Lys Tyr Leu Arg Val Glu Leu Glu Ser 1760 1765 1770 -63- 136326-序列表.doc 200932259
Pro Va! lie Pro Arg Met Glu Gly Lys Val Ala Gly Thr Arg lie 1775 1780 1785
Val Arg Gin Leu Trp Asp Gin Trp Phe Pro Phe Gly Glu Val Glu 1790 1795 1800
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Pro Leu His He lie Gly Thr Gly Glu Val Asp Ser Asp lie Lys 1820 1825 丨830
Met Glu Arg Val Val Lys His Trp Glu His Pro His lie Glu Ala 1835 1840 1845
Ala Gin Thr Phe Leu Lys Lys Asp Asp Thr Gly G)u Val Leu Tyr 1850 1855 I860
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Gly Trp Phe Ser Gly Trp Arg Ser Ser Leu Met Gly Val Leu Val 1880 1885 1890
Val lie lie Gly Phe Val He Leu Met Phe Leu He Arg Met Glu 1895 1900 1905
Val His Asp Phe Glu Thr Asp Glu Phe Asn Asp Phe Asn Glu Asp 1910 1915 1920
Asp Tyr Ala Thr Arg Glu Phe Leu Asn Pro Asp Glu Arg Met Thr 1925 1930 1935
Tyr Leu Asn His Ala Asp Tyr Asn Leu Asn Ser Pro Leu lie Ser 1940 1945 1950
Asp Asp lie Asp Asn Leu lie Arg Lys Phe Asn Ser Leu Pro lie 1955 1960 1965
Pro Ser Met Trp Asp Ser Lys Asn Trp Asp Gly Val Leu Glu Met 1970 1975 1980
Leu Thr Ser Cys Gin Ala Asn Pro Me Pro Thr Ser Gin Met His 1985 1990 1995
Lys Trp Met Gly Ser Trp Leu Met Ser Asp Asn His Asp Ala Ser 2000 2005 2010
Gin Gly Tyr Ser Phe Leu His Glu Val Asp Lys Glu Ala Glu lie 2015 2020 2025
Thr Phe Asp Val Val Glu Thr Phe He Arg Gly Trp Gly Asn Lys 2030 2035 2040
Pro lie Glu Tyr lie Lys Lys Glu Arg Trp Thr Asp Ser Phe Lys 2045 2050 2055 -64- 136326-序列表.doc 200932259 lie Leu Ala 丁yr Leu Cys Gin Lys Phe Leu Asp Leu His Lys Leu 2060 2065 2070
Thr Leu lie Leu Asn Ala Va) Ser Glu Val Glu Leu Leu Asn Leu 2075 2080 2085
Ala Arg Thr Phe Lys Gly Lys Val Arg Arg Ser Ser His Gly Thr 2090 2095 2100
Asn lie Cys Arg He Arg Val Pro Ser Leu Gly Pro Thr Phe lie 2105 2110 2115
Ser Glu Gly Trp Ala Tyr Phe Glu Lys Leu Asp lie Leu Met Asp 2120 2125 2130
Arg Asn Phe Leu Leu Met Val Lys Asp Va丨 lie Ile Gly Arg Met 2135 2140 2145
Gin Thr Val Leu Ser Mel Val Cys Arg lie Asp Asn Leu Phe Ser 2150 2155 2160 ❹
Glu Gin Asp lie Phe Ser Leu Leu Asn lie Tyr Arg He Gly Asp 2165 2170 2)75
Lys lie Val Glu Arg Gin Gly Asn Phe Ser Tyr Asp Leu lie Lys 2180 2185 2190
Met Val Glu Pro lie Cys Asn Leu Lys Leu Met Lys Leu Ala Arg 2195 2200 2205
Glu Ser Arg Pro Leu Val Pro Gin Phe Pro His Phe Glu Asn His 2210 2215 2220 lie Lys Thr Ser Val Asp Glu Gly Ala Lys lie Asp Arg Gly He 2225 2230 2235
Arg Phe Leu His Asp Gin lie Met Ser Val Lys Thr Val Asp Leu 2240 2245 2250
Thr Leu Val He Tyr Gly Ser Phe Arg His Trp Gly His Pro Phe 2255 2260 2265
He Asp Tyr Tyr Thr Gly Leu Glu Lys Leu His Ser Gin Val Thr 2270 2275 2280
Met Lys Lys Asp He Asp Val Ser Tyr Ala Lys Ala Leu Ala Ser 2285 2290 2295
Asp Leu Ala Arg lie Val Leu Phe Gin Gin Phe Asn Asp His Lys 2300 2305 2310
Lys Trp Phe Val Asn Gly Asp Leu Leu Pro His Asp His Pro Phe 2315 2320 2325
Lys Ser His Val Lys Glu Asn Thr Trp Pro Thr Ala Ala Gin Val -65- 136326-序列表.doc 200932259 2330 2335 2340
Gin Asp Phe Gly Asp Lys Trp His Glu Leu Pro Leu lie Lys Cys 2345 2350 2355
Phe Glu lie Pro Asp Leu Leu Asp Pro Ser lie lie Tyr Scr Asp 2360 2365 2370
Lys Ser His Ser Met Asn Arg Ser Glu Val Leu Lys His Val Arg 2375 2380 2385
Met Asn Pro Asn Thr Pro He Pro Ser Lys Lys Val Leu Gin Thr 2390 2395 2400
Met Leu Asp Thr Lys Ala Thr Asn Trp Lys Glu Phe Leu Lys Glu 2405 2410 2415
He Asp Glu Lys Gly Leu Asp Asp Asp Asp Leu lie lie Gly Leu 2420 2425 2430
Lys Gly Lys Glu Arg Glu Leu Lys Leu Ala Gly Arg Phe Phe Ser 2435 2440 2445
Leu Met Ser Trp Lys Leu Arg Glu Tyr Phe Val lie Thr Glu Tyr 2450 2455 2460
Leu lie Lys Thr His Phe Val Pro Met Phe Lys Gly Leu Thr Met 2465 2470 2475
Ala Asp Asp Leu Thr Ala Val lie Lys Lys Met Leu Asp Ser Ser 2480 2485 2490
Ser Gly Gin Gly Leu Lys Ser Tyr Glu Ala lie Cys He Ala Asn 2495 2500 2505
His He Asp Tyr Glu Lys Trp Asn Asn His Gin Arg Lys Leu Ser 2510 2515 2520
Asn Gly Pro Val Phe Arg Va] Met Gly Gin Phe Leu Gly Tyr Pro 2525 2530 2535
Ser Leu lie Glu Arg Thr His Glu Phe Phe Glu Lys Ser Leu lie 2540 2545 2550
Tyr Tyr Asn Gly Arg Pro Asp Leu Met Arg Val His Asn Asn Thr 2555 2560 2565
Leu He Asn Ser Thr Ser Gin Arg Val Cys 丁rp Gin Gly G]n Glu 2570 2575 2580
Gly Gly Leu Glu Gly Leu Arg Gin Lys Gly Trp Ser lie Leu Asn 2585 2590 2595
Leu Leu Val lie Gin Arg Glu Ala Lys lie Arg Asn Thr Ala Val 2600 2605 2610 -66 - 136326-序列表.doc 200932259
Lys Val Leu Ala Gin Gly Asp Asn Gin Val lie Cys Thr Gin Tyr 26】5 2620 2625
Lys Thr Lys Lys Ser Arg Asn Val Va) Glu Leu Gin Gly Ala Leu 2630 2635 2640
Asn Gin Met Val Ser Asn Asn Glu Lys lie Met Thr Ala lie Lys 2645 2650 2655
Me Gly Thr Gly Lys Leu Gly Leu Leu He Asn Asp Asp Glu Thr 2660 2665 2670
Met Gin Ser Ala Asp Tyr Leu Asn Tyr Gly Lys lie Pro lie Phe 2675 2680 2685
Arg Gly Val lie Arg Gly Leu Glu Thr Lys Arg Trp Ser Arg Val 2690 2695 2700
Thr Cys Val Thr Asn Asp Gin lie Pro Thr Cys Ala Asn lie Met 2705 27]0 2715
Ser Ser Val Ser Thr Asn Ala Leu Thr Va) Ala His Phe Ala Glu 2720 2725 2730
Asn Pro lie Asn Ala Met He Gin Tyr Asn Tyr Phe Gly Thr Phe 2735 2740 2745
Ala Arg Leu Leu Leu Met Met His Asp Pro Ala Leu Arg Gin Ser 2750 2755 2760
Leu Tyr Glu Va! Gin Asp Lys He Pro Gly Leu His Ser Ser Thr 2765 2770 2775
Phe Lys Tyr Ala Met Leu Tyr Leu Asp Pro Ser lie Gly Gly Val 2780 2785 2790
Ser Gly Met Ser Leu Ser Arg Phe Leu He Arg A)a Phe Pro Asp 2795 2800 2805
Pro Val Thr Glu Ser Leu Ser Phe 丁rp Arg Phe lie His Val His 2810 2815 2820
Ala Arg Ser Glu His Leu Lys Glu Met Ser Ala Val Phe Gly Asn 2825 2830 2835
Pro Glu lie Ala Lys Phe Arg lie Thr His lie Asp Lys Leu Val 2840 2845 2850
Glu Asp Pro Thr Ser Leu Asn lie Ala Met Gly Met Ser Pro Ala 2855 2860 2865
Asn Leu Leu Lys Thr Glu Va] Lys Lys Cys Leu lie Glu Ser Arg 2870 2875 2880
Gin Thr lie Arg Asn Gin Val lie Lys Asp Ala Thr lie Tyr Leu 2885 2890 2895 -67- 136326-序列表.doc 200932259
Tyr His Glu Glu Asp Arg Leu Arg Ser Phe Leu Trp Ser He Asn 2900 2905 2910
Pro Leu Phe Pro Arg Phe Leu Ser Glu Phe Lys Ser Gly Thr Phe 2915 2920 2925
Leu Gly Val Ala Asp Gly Leu He Ser Leu Phe Gin Asn Ser Arg 2930 2935 2940
Thr Me Arg Asn Ser Phe Lys Lys Lys Tyr His Arg Glu Leu Asp 2945 2950 2955
Asp Leu lie Val Arg Ser Glu Val Ser Ser Leu Thr His Leu Gly 2960 2965 2970
Lys Leu His Leu Arg Arg Gly Ser Cys Lys Met Trp Thr Cys Ser 2975 2980 2985
Ala Thr His Ala Asp Thr Leu Arg Tyr Lys Ser Trp Gly Arg Thr 2990 2995 3000 〇
Val He Gly Thr Thr Val Pro His Pro Leu Glu Met Leu Gly Pro 3005 3010 3015
Gin His Arg Lys Glu Thr Pro Cys Ala Pro Cys Asn Thr Ser Gly 3020 3025 3030
Phe Asn Tyr Val Ser Val His Cys Pro Asp Gly lie His Asp Val 3035 3040 3045
Phe Ser Ser Arg Gly Pro Leu Pro A!a Tyr Leu Gly Ser Lys Thr 3050 3055 3060
Ser Glu Ser Thr Ser lie Leu Gin Pro Trp Glu Arg Clu Ser Lys 3065 3070 3075
Val Pro Leu lie Lys Arg Ala Thr Arg Leu Arg Asp Ala lie Ser 3080 3085 3090
Trp Phe Val Glu Pro Asp Ser Lys Leu Ala Met Thr He Leu Ser 3095 3]00 3105
Asn lie His Ser Leu Thr Gly Glu Glu Trp Thr Lys Arg Gin His 3110 3115 3120
Gly Phe Lys Arg Thr Gly Ser Ala Leu His Arg Phe Ser Thr Ser 3125 3130 3135
Arg Met Ser His Gly Gly Phe Ala Ser Gin Ser Thr Ala Ala Leu 3140 3145 3150
Thr Arg Leu Met Ala Thr Thr Asp Thr Met Arg Asp Leu Gly Asp 3155 3160 3165
Gin Asn Phe Asp Phe Leu Phe Gin Ala Thr Leu Leu Tyr Ala Gin 3170 3175 3180 -68- 136326-序列表.doc 200932259 lie Thr Thr Thr Val Ala Arg Asp Gly Trp lie Thr Ser Cys Thr 3185 3190 3195
Asp His Tyr His lie Ala Cys Lys Ser Cys Leu Arg Pro lie Glu 3200 3205 3210
Glu lie Thr Leu Asp Ser Ser Met Asp Tyr Thr Pro Pro Asp Val 3215 3220 3225
Ser His Val Leu Lys Thr Trp Arg Asn Gly Glu Gly Ser Trp Gly 3230 3235 3240
Gin Glu Ile Lys Gin Ile Tyr Pro Leu G】u Gly Asn 丁rp Lys Asn 3245 3250 3255
Leu Ala Pro Ala Glu Gin Ser Tyr Gin Va! Gly Arg Cys He Giy 3260 3265 3270
Phe Leu Tyr Gly Asp Leu Ala Tyr Arg Lys Ser Thr His Ala Glu 3275 3280 3285 〇
Asp Ser Ser Leu Phe Pro Leu Ser lie Gin Gly Arg lie Arg Gly 3290 3295 3300
Arg Gly Phe Leu Lys Gly Leu Leu Asp Gly Leu Met Arg Ala Ser 3305 3310 3315
Cys Cys Gin Val lie His Arg Arg Ser Leu Ala His Leu Lys Arg 3320 3325 3330
Pro Ala Asn Ala Va! Tyr Gly Gly Leu lie Tyr Leu lie Asp Lys 3335 3340 3345
Leu Ser Val -Ser Pro Pro Phe He Ser Leu Thr Arg Ser Gly Pro 3350 3355 3360
He Arg Asp Glu Leu Glu Thr lie Pro His Lys lie Pro Thr Ser 3365 3370 3375
Tyr Pro Thr Ser Asn Arg Asp Met Gly Va3 He Val Arg Asn Tyr 3380 3385 3390
Phe Lys Tyr Gin Cys Arg Leu lie Glu Lys Gly Lys Tyr Arg Ser 3395 3400 3405
His Tyr Ser Gin Leu Trp Leu Phe Ser Asp Val Leu Ser lie Asp 3410 3415 3420
Phe lie Gly Pro Phe Scr lie Ser Thr Thr Leu Leu G!n lie Leu 3425 3430 3435
Tyr Lys Pro Phe Leu Ser Gly Lys Asp Lys Asn Glu Leu Arg Glu 3440 3445 3450
Leu Ala Asn Leu Ser Ser Leu Leu Arg Ser Gly Glu Gly Trp Glu 69- 136326-序列表.doc 200932259 3455 3460 3465
Asp He His Val Lys Phe Phe Thr Lys Asp lie Leu Leu Cys Pro 3470 3475 3480
Glu Glu lie Arg His Ala Cys Lys Phe Gly lie Ala Lys Asp Asn 3485 3490 3495
Asn Lys Asp Met Ser Tyr Pro Pro Trp Gly Arg Glu Ser Arg Gly 3500 3505 3510
Thr lie Thr Thr lie Pro Va) Tyr Tyr Thr Thr Thr Pro Tyr Pro 3515 3520 3525
Lys Met Leu Glu Met Pro Pro Arg He Gin Asn Pro Leu Leu Ser 3530 3535 3540
Gly He Arg Leu Gly Gin Leu Pro Thr Gly Ala His Tyr Lys lie 3545 3550 3555
Arg Ser lie Leu His Gly Met Gly Me His Tyr Arg Asp Phe Leu 3560 3565 3570
Ser Cys Gly Asp Gly Ser Gly Gly Met Thr Ala Ala Leu Leu Arg 3575 3580 3585
Glu Asn Val His Ser Arg Gly lie Phe Asn Ser Leu Leu Glu Leu 3590 3595 3600
Ser Gly Ser Val Mel Arg Gly Ala Ser Pro Glu Pro Pro Ser Ala 3605 3610 3615
Leu Glu Thr Leu Gly Gly Asp Lys Ser Arg Cys Val Asn Gly Glu 3620 3625 3630
Thr Cys Trp Glu Tyr Pro Ser Asp Leu Cys Asp Pro Arg Thr Trp 3635 3640 3645
Asp Tyr Phe Leu Arg Leu Lys Ala Gly Leu Gly Leu Gin Jle Asp 3650 3655 3660
Leu lie Val Met Asp Met Glu Val Arg Asp Ser Ser Thr Ser Leu 3665 3670 3675
Lys lie G!u Thr Asn Val Arg Asn Tyr Val His Arg He Leu Asp 3680 3685 3690
Glu Gin Gly Val Leu He Tyr Lys Thr Tyr Gly Thr Tyr lie Cys 3695 3700 3705
Glu Ser Glu Lys Asn Ala Vai Thr I!e Leu Gly Pro Met Phe Lys 3710 3715 3720
Thr Val Asp Leu Val Gin Thr Glu Phe Ser Ser Ser Gin Thr Ser 3725 3730 3735 -70- 136326-序列表.doc 200932259 GIu Val Tyr Met Va) Cys Lys Giy Leu Lys Lys Leu lie Asp Glu 3740 3745 3750
Pro Asn Pro Asp Trp Ser Ser lie Asn Glu Ser Trp Lys Asn Leu 3755 3760 3765
Tyr Ala Phe Gin Ser Ser Glu Gin Glu Phc Ala Arg Ala Lys Lys 3770 3775 3780
Val Ser Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Gly lie Pro Scr Gin Phe lie 3785 3790 3795
Pro Asp Pro Phe Val Asn lie Glu Thr Met Leu Gin lie Phe Gly 3800 3805 3810
Val Pro Thr Gly Val Ser His Ala Ala Ala Leu Lys Ser Ser Asp 3815 3820 3825
Arg Pro Ala Asp Leu Leu Thr lie Ser Leu Phe Tyr Mel Ala lie 3830 3835 3840
lie Ser Tyr Tyr Asn lie Asn His He Arg Val Gly Pro He Pro 3845 3850 3855
Pro Asn Pro Pro Ser Asp Gly lie Ala Gin Asn Va] Gly lie Ala 3860 3865 3870 lie Thr Gly lie Ser Phe Trp Leu Ser Leu Met Glu Lys Asp He 3875 3880 3885
Pro Leu Tyr Gin Gin Cys Leu Ala Val lie Gin Gin Ser Phe Pro 3890 3895 3900 lie Arg Trp Glu Ala Val Ser Val Lys Gly Gly Tyr Lys Gin Lys 3905 3910 3915
Trp Ser Thr Arg Gly Asp Gly Leu Pro Lys Asp Thr Arg lie Ser 3920 3925 3930
Asp Ser Leu Ala Pro lie Gly Asn Trp lie Arg Ser Leu Glu Leu 3935 3940 3945
Val Arg Asn Gin Val Arg Leu Asn Pro Phe Asn Glu lie Leu Phe 3950 3955 3960
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Ser Lys Glu Asp Arg Ser lie Leu Met Leu Lys Ser Asp Leu His 3995 4000 4005
Glu Glu Asn Ser 丁rp Arg Asp 4010 4015 -71 - 136326-序列表,doc

Claims (1)

  1. 200932259 十、申請專利範圍： 1. 一種分離之基因修飾之水皰性口炎病毒（vsv)，其具有 至少—個胺基酸突變在一個對應於至少一個以下位置之 區域中： M蛋白質之位置119或142之胺基酸； G蛋白質之位置109、224、438、477或481之胺基酸；及 L蛋白質之位置205、220或1450之胺基酸。 2. 如請求項1之基因修飾之VSV，其中編碼該基因修飾之 〇 VSV之核酸另外包含編碼至少一種異源抗原或其片段之 核酸。 3. 如請求項1之基因修飾之VSV，其中該種異源抗原或其片 段係來自病原微生物。 4. 如請求項3之基因修飾之vsv，其中獲得編碼該異源抗原 之核酸之該病原微生物係選自由病毒、細菌、原生動物 及真读組成之群D 5. 如請求項4之基因修飾之VSV，其中該異源抗原係選自由 © 以下組成之群：人類免疫缺陷病毒（HIV)抗原、HTLV抗 原、SIV抗原、RSV抗原、PIV抗原、hsv抗原、CMV抗 原、埃-巴一氏病毒抗原（Epstein-Barr virus antigen)、水 殖-帶狀范疹病毒抗原、腮腺炎病毒抗原、麻疹病毒抗 原、流感病毒抗原、脊髓灰質炎病毒抗原、鼻病毒抗 原、A型肝炎病毒抗原、B型肝炎病毒抗原、^型肝炎病 毒抗原、諾沃克病毒（Norwalk virus)抗原、彼衣病毒抗 原、阿爾發病毒抗原、風療病毒抗原、狂犬病病毒抗 136326.doc 200932259 原、馬堡病毒（Marburg virus)抗原、伊波拉病毒（Ebola virus)抗原、乳頭狀瘤病毒抗原、多形瘤病毒抗原、間 質肺炎病毒抗原、冠狀病毒抗原、霍亂弧菌於/0 cholerae)抗原、、惡性癍原、義（piasm〇(^um 抗 原、間日癔原蟲（户νί·ν<3Λ：)抗原、印形瘧原蟲 (Plasmodium ovale)坑原、三 Q 瘧恿螽（p!asm〇dium malariae)抗原、链氏龜原螽（plasm〇dium kn〇wlesi)抗 原肺k鏈球菌（汾rePi〇C〇CCWiy 所以）抗原、釀膿 鍵球菌〇S7re/?iococ⑽办〇客6抗原、幽門螺桿菌 #謂·）抗原、無乳鏈球菌（加咖〇c〇ccw5 叹a/acnae)抗原、腦膜炎奈瑟球菌η·α meningitidis、私琢、淋病奈瑟球菌（iVe心⑺·β 抗原、白喉棒狀桿菌（c〇〇^hcie咖所 diphtheHae)抗滑、、破傷虱後遠（cl〇stridium 原、百日咳博德特氏達（5or<^eie//a 抗原、嗜血 桿菌（//aem叩M/w)抗原、衣原體（C7^w>;^a)抗原及大腸 桿菌（五《sc/ieWc/zz’a (7〇/〇抗原。 1 6. 如請求項5之基因修飾之VSV，其中該異源抗原包含HIV 蛋白質。 7. 如請求項6之基因修飾之VSV，其中該HIV蛋白質係由一 個選自由 gag、env、p〇i、、⑻、vpr、rev 及 VfM 組成之群之基因編碼。 8. 如請求項6之基因修飾之Λ/SV，其中該HIV蛋白質為HIV gag蛋白質。 136326.doc 200932259 9.如凊求項8之基因修飾之VSV，其中該HIV gag蛋白質具 有至少一個突變在位置165、27〇、329或348。 10_如請求項1至9中任一項之基因修飾之vsv，其中該突變 包含一種保守或非保守胺基酸改變。 11. 如請求項1之基因修飾之vsv ’其中該突變係在該μ蛋白 質之位置119或142或在該Μ蛋白質之位置1 19及142。 12. 如請求項1之基因修飾之vsv，其中該Μ蛋白質之位置 119之該胺基酸突變為Τ—Ν突變，該μ蛋白質之位置Μ2 〇 之該胺基酸突變為Ρ — Τ突變。 13. 如請求項1之基因修飾之vsv，其中該G蛋白質之位置 109、224、438、477或481之該胺基酸突變分別為 K—N、N—T、S —I、A—V/G —L· 或 V—I 突變。 14. 如請求項1之基因修飾之VSV，其中該L蛋白質之位置 205、220或1450之該胺基酸突變分別為p—l、K—E或 L—^1 〇 ❹15.如請求項9之基因修飾之VSV，其中該HIV gag蛋白質之 位置165、270、329或348之該胺基酸突變分別為S->G、 L —S、D—N 或 T—K。 16. 如請求項丨至15中任一項之基因修飾之ν^ν，其中該等胺 基酸之任一者或多者之突變導致該病毒基因型及/或表型 之穩定性增加。 17. 如請求項16之基因修飾之VSV，其中該等胺基酸之任一 者或多者之突變另外導致該病毒感染的細胞產生病毒之 產率增加。 136326.doc 200932259 18. 如請求項1至15中任一項之基因修飾之vsv，其另外在基 因組中包含至少2種其他突變，該等突變選自由以下組 成之群：溫度敏感突變、點突變、基因洗牌（gene shuffling)犬變、柄突變（G_stem mutation)、非細胞病 變Μ基因犬變、雙義RNA突變（ambisense RNA muta· tion)、戴斷（truncated) G基因突變、G基因插入突變及基 因缺失突變。 19. 一種產生如請求項1至15中任一項之基因修飾之vsv的方 法’該方法包含VSV在連續哺乳動物細胞株中以約〇.〇〇1 至約〇·1個空斑形成單位（PFIJ)/ml範圍内之低感染倍率 (multiplicity of infecti〇n)(MOI)„_ 系列傳代至少 5_15次傳 代’其中該病毒具有至少！xl06 PFU/ml之效價及至少一 或多種如請求項1至14中任一項之突變。 20. 如請求項19之方法，其中該病毒具有至少1><1〇7 pFu/mi 之效價。 21. 如請求項19或20中任一項之方法，其中該細胞株為 Vero、BHK或293細胞株。 22. 如請求項19至2丨中任一項之方法，其中與未以約〇〇〇1至 約〇· 1個空斑形成單位（PFU)/細胞範圍内之低Μ〇ι傳代約 5至15次的病毒株獲得之產率相比，該方法導致病毒產 率高5至100倍。 23. 如請求項19至22中任一項之方法，甘士斗廿 β〈万忐，其中該基因修飾之 VSV展示該病毒基因型及/或表型之穩定性增加。 24. —種免疫原性組合物，其包含如請求項丨至^中 一項 136326.doc 200932259 之基因修飾之VSV的任一者或多者及醫藥學上可接受之 載劑。 25. 如請求項24之免疫原性組合物，其另外包含佐劑。 26. —種保護哺乳動物抵抗病原微生物感染之方法該方法 包含投與免疫有效量之如請求項丨至15中任一項之基因 修飾的VSV。 27· —種保護哺乳動物抵抗病原微生物感染之方法，該方法 包含投與免疫有效量之如請求項24或25中任一項之免疫 〇 原性組合物。 28· —種使病毒適應在細胞培養物中生長之方法，其包含 a·以每個細胞約0.001至約〇丨個空斑形成單位 (pFU)範圍内之低感染倍率（M〇I)，用該病毒感 染該細胞培養物； b·收穫含有該病毒之細胞培養基； c·澄清該細胞培養基； d. 冷凍該細胞培養基；及 e. 重複步驟a)至d)約5至約15次， 其中4方去導致病毒生產’產率增加$至⑽倍及該病毒 基因型及表型特徵之穩定性增加。
    之任何先前存在的突變。 31·如請求項29之方法，其y 其中該病毒為減毒病毒。 其中該方法可維持與病毒減毒相關 之低神經毒性概況。 其中該方法可維持與病毒減毒相關 136326.doc 200932259 32.如請求項28夕士、土 之方法，其中該方法係用於免疫原性組合物 之大規模生產。 33·如請求項 32$ *^、土 ^ , .t,, 之方法，其中與未以每個細胞約〇 〇〇1至約 個二斑形成單位範圍内之低感染倍率傳代約5至15次 的病毒株獲得之產率相比，該方法導致病毒產率高5至 100 倍。 *月求項30之方法，其中與病毒減毒相關的先前存在之 突變係選自由以下組成之群：溫度敏感突變、點突變、 © 基口洗牌大變、G柄突變、非細胞病變μ基因突變、雙 義RNA^冑、截斷G基因突變、G基因插入突變及基因缺 失突變。 月长項29之方法，其中該減毒病毒為水皰性口炎病毒 (VSV)株。 36. 如凊求項30之方法，其中該vsv具有至少一個胺基酸突 變在一個對應於至少—個以下位置之區域中： ❿ M蛋白質之位置1 19或142之胺基酸； G蛋白質之位置109、224、438、477或481之胺基酸；及 L蛋白質之位置205、220或1450之胺基酸。 37. 如請求項36之方法，其中該突變包含一種保守或非保守 胺基酸改變。 38. 如凊求項36之方法，其中該突變係在該μ蛋白質之位置 119或142或在該JV[蛋白質之位置Η 9及142。 39. 如&求項38之方法，其中該Μ蛋白質之位置119之該胺基 酸突變為Τ—Ν突變，且該Μ蛋白質之位置142之該胺基 136326.doc 200932259 酸突變為ρ—>·丁突變。 40_如請求項36之方法，其中該g蛋白皙 來㈡寶之位置109、224、 43 8、477或481之該胺基酸突變分 又刀乃丨J為K—N、N—T、 S—I、（A—V/G—L)或 V->I突變。 41.如請求項3 6之方法，其中該l蛋白暂令/ 皮曰質之位置205、220或 1450之該胺基酸突變分別為p —l、K3EiL—工。 42·如請求項35之方法，其中該州株係選自印第安納 (ad1 —株或新澤西（New Jersey)株或伊斯法罕（Isfahan) ❾ 血清型或其他水皰病毒。 43·如請求項36或42中任一項之方法，其中該vsv株含有編 碼至少一種異源抗原之核酸。 44·:請求項43之方法，其中該異源抗原係自一種選自由病 毋—田菌、原生動物及真菌組成之群之病原微生物獲 得。 45.如請求項43之方法，其中該異源抗原係選自由以下組成 之群：人類免疫缺陷病毒（HIV)抗原、HTLV抗原、SIV 抗原、RSV抗原、PIV抗原、HSV抗原、CMV抗原、埃_ 巴二氏病毒抗原、水痘-帶狀疱疹病毒抗原、腮腺炎病毒 抗原、麻疹病毒抗原、流感病毒抗原、脊髓灰質炎病毒 抗原、鼻病毒抗原、A型肝炎病毒抗原、B型肝炎病毒抗 原c型肝炎病毒抗原、諾沃克病毒抗原、彼衣病毒抗 原、阿爾發病毒抗原、風疹病毒抗原、狂犬病病毒抗 原、馬堡病毒抗原、伊波拉病毒抗原、乳頭狀瘤病毒抗 原、多形瘤病毒抗原、間質肺炎病毒抗原、冠狀病毒抗 136326.doc 200932259 原、霍亂弧菌抗原、惡性瘧原蟲抗原、間日瘧原蟲抗 原、卵形癔原蟲抗原、三日瘧原蟲抗原、諾氏瘧原蟲抗 原、肺炎鏈球菌抗原、釀膿鏈球菌抗原、幽門螺桿菌抗 原、無乳鏈球菌抗原、腦膜炎奈瑟球菌抗原、淋病奈瑟 球菌抗原、白喉棒狀桿菌抗原、破傷風梭菌抗原、百日 咳博德特氏菌抗原、嗜血桿菌抗原、衣原體抗原及大腸 桿菌抗原。 46.如請求項43之方法，其中該異源抗原包含HIV蛋白質。 Ο 47.如請求項46之方法，其中該HIV蛋白質係由一個選自由 gag > env > p〇\ > vif ' nef ' tat ' vpr > rev^L vpuis. 之基因編碼。 48·如請求項46之方法，其中該HIV蛋白質為HIV gag蛋白 質。 49.如請求項48之方法，其中該HIV gag蛋白質具有至少— 個突變在位置165、270、329或348。 50_如請求項49之方法，其中該HIV gag蛋白質之位置165、 0 270、329或348之該胺基酸突變分別為S —G、L—S、 D—N 或 T—>K 〇 136326.doc
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