CN101870963A - 表达狗干扰素(α、β或γ)的重组新城疫弱毒疫苗株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达狗干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫弱毒疫苗株，具体地，涉及表达狗干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。本发明还公开了制备所述重组新城疫弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫弱毒疫苗株在制备狗α、β或γ-干扰素中的应用。

Description

表达狗干扰素(α、β或γ)的重组新城疫弱毒疫苗株

技术领域

本发明涉及重组病毒疫苗领域，具体地，本发明涉及表达狗干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫弱毒疫苗株，更具体地，涉及表达狗干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。本发明还公开了制备所述重组新城疫弱毒疫苗株的方法和该重组新城疫弱毒疫苗株在制备狗α、β或γ-干扰素中的应用。

背景技术

干扰素是一组多细胞来源的复杂糖蛋白，它是有核细胞受病毒感染后产生的。另外，寡聚核苷酸、细菌、内毒素等也能刺激免疫细胞产生干扰素，两类干扰素作用相似，但理化性质和抗原性存在差异，前者称为I型，后者称为II型^[1，2]。

白细胞是干扰素的重要来源^[3]，人用干扰素大多从血液中提取，产量有限，且价格昂贵，极大地限制了干扰素的广泛应用。因此，世界各国都在探索大量生产干扰素的途径，如从脐带血，或高等植物中提取；探询稳定高产细胞株；或改变生产方式。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入和分子生物学技术的发展，大量的细胞因子得以克隆，许多细胞因子基因工程药物面市，在治疗畜禽疾病提供了新手段的同时创造了巨大的经济和社会效益^[4]。分子生物学的迅速发展，使干扰素的研究日益深入，特别是PCR技术的广泛应用，对构建动物干扰素基因重组疫苗，提高其免疫效力、降低病毒载体毒性等方面有着重要的意义。

大肠杆菌表达系统已广泛用于制备人和动物干扰素，所表达的重组蛋白在体内外具有明显的抗病毒活性^[5～7]。但大肠杆菌表达的蛋白经尿素溶解、变性后复性率低。而且成本高，不便于大规模生产。毕赤酵母和杆状病毒表达系统是近年来发展起来的真核表达系统，表达的外源蛋白可以获得正确折叠和糖基化^[8，9]，但两种表达系统同样存在成本高、纯化困难的缺点。新近发展起来的新城疫活病毒载体系统，使表达的外源蛋白接近天然状态，无需纯化，成本低廉，利于大规模生产有生物活性的外源蛋白。

基因工程载体技术的研究和应用也促进了干扰素的研究和开发。我国学者陈炬等(陈炬等，中国科学B辑，1990，3：253-260.)首次把人干扰素2A基因在烟草植株中表达成功，随后，人干扰素2B基因在烟草中也表达成功(Edelbaum，O.，et al.，Expression of active human interferon-beta intransgenic plants.J Interferon Res，1992.12(6)：p.449-53.)。

负链RNA病毒的反向遗传操作(Reverse genetic)是通过操作病毒基因组cDNA制造新病毒的过程，其基本过程是：①组装完整的病毒基因组(或重组型基因组)cDNA克隆，5’末端精确地缀于T7启动子后，3’末端精确缀于自我剪切的核酸酶序列和T7转录终止信号之前，构成基因组cDNA转录模板；②以基因组cDNA转录模板与启动病毒复制必须的转录相关功能结构蛋白如核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)和聚合酶蛋白(L)的表达质粒(T7启动子)一起，共转染整合表达T7聚合酶的病毒复制许可细胞；③24-72小时后收获培养上清，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获(rescue)病毒。对基因组cDNA进行突变、缺失或外源基因插入修饰后，通过反向遗传操作系统(reverse genetic system，RGS系统)可获得相应的突变或重组的负链RNA病毒。

申请人之前获得授权的中国专利“新城疫LaSota疫苗株反向遗传操作系统及其应用”(申请号200510097997.8，申请日2005年9月2日)已经建立了一种新城疫LaSota弱毒疫苗株的反向遗传操作系统，并且成功救获了野生型病毒株，并且为进一步开展新城疫病毒活载体疫苗研制及重组新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)相关基础奠定了坚实的基础。

发明内容

基于重组干扰素在治疗狗病毒性疾病和寄生虫病方面广阔的应用前景，本文建立了以新城疫病毒疫苗株，如新城疫病毒LaSota疫苗株为载体的新型表达系统，构建了表达狗α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆，实现了狗α、β、γ干扰素在SPF鸡胚内高效、稳定表达，并对其表达产物进行了抗病毒活性研究。

因此，本发明的一个目的是提供以下各项：

1.一种表达编码狗干扰素的基因的重组新城疫弱毒疫苗株。

2.根据以上1的重组新城疫弱毒疫苗株，其为重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

3.根据以上1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其中所述狗干扰素是狗α、β或γ-干扰素，优选所述狗α、β和γ-干扰素的氨基酸序列分别如SEQID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，更优选编码所述狗α、β和γ-干扰素的基因分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

4.根据以上1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其为rL-Canineα、rL-Canineβ、或rL-Canineγ。

5.根据以上1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株在制备狗干扰素中的应用。

6.一种生产以上1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码狗干扰素的基因的所述新城疫弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该转录辅助质粒包括编码所述新城疫弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫弱毒疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

7.根据以上6的方法，其中所述重组新城疫弱毒疫苗株是重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

8.根据以上6或7的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-CaIFNα、pBRN-FL-CaIFNβ、或pBRN-FL-CaIFNγ(基因序列分别见SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9，质粒图谱分别见图4-6)。

9.根据以上6或7的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP或pBSL。

10.根据以上6-9中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

11.根据以上6-10中任何一项的方法制备的重组新城疫弱毒疫苗株，优选为rL-Canineα、rL-Canineβ、或rL-Canineγ。

12.一种生产狗干扰素的方法，该方法包括：

1)将根据以上1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株接种敏感细胞或接种鸡胚尿囊腔；

2)收获细胞上清液或鸡胚尿囊液。

13.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Canineα的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2622。

12.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Canineβ的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2623。

13.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Canineγ的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2624。

本发明利用新城疫病毒LaSota株作为表达载体，分别构建表达狗α、β、γ-干扰素(Canine interferon-α，Canine interferon-β，Canine interferon-γ)完整开放阅读框的全基因组质粒pBRN-FL-CaIFN-α、pBRN-FL-CaIFN-β、pBRN-FL-CaIFN-γ，转染BHK-21细胞获得表达CaIFN-α、β、γ重组新城疫病毒。采用RT-PCR方法，证实收获的鸡胚尿囊液内的重组病毒含有相应外源基因。重组新城疫(Newcastle disease virus)LaSota弱毒疫苗株rL-Canine、rL-Canine β和rL-Canine γ接种的SPF鸡胚尿囊液于2008年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别为CGMCC No.2622、CGMCC No.2623和CGMCC No.2624。将重组病毒尿囊液经紫外线照射灭活新城疫病毒，利用重组病毒VSV-EGFP在MDCK细胞系上测定rL-Canine α，rL-Canine β，rL-Canine γ抗病毒活性，表达CaIFN的重组新城疫病毒均能有效抑制水疱性口炎病毒(VSV)在狗肾细胞(MDCK)上的复制，rL-Canineα、rL-Canine β、rL-Canine γ接种SPF鸡胚所收尿囊液抗病毒活性分别为2×10⁶IU/mL、2×10⁶IU/mL、2×10⁶IU/mL。结果表明：CaIFN-α，CaIFN-β，CaIFN-γ在重组新城疫病毒rL-Canineα，rL-Canine β，rL-Canineγ接种的SPF鸡胚尿囊液中获得良好表达，并具有高效而稳定的抗病毒活性。

附图说明

图1.狗α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆的酶切与PCR鉴定结果(重组克隆质粒进行PmeI酶切鉴定，产物分别为：1，pBRN-FL-CaIFNα，610bp；2，pBRN-FL-CaIFNβ，640bp；3，pBRN-FL-CaIFNγ，554bp；获得质粒PCR鉴定产物片分别为：4，pBRN-FL-CaIFNα，1490bp；5，pBRN-FL-CaIFNβ，1520bp；6，pBRN-FL-CaIFNγ，1430bp；M1，DNA分子量标准DL15000；M2，DNA分子量标准DL2000)；

图2利用VSV-EGFP-MDCK系统测定rL-CaIFNα/β/γ抗病毒活性(A～C：对接种rL-CaIFNα的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10⁵，2×10⁶，2×10⁷)；D～F：对接种rL-CaIFNβ的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10⁵，2×10⁶，2×10⁷)；G～I：对接种r L-CaIFNγ的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10⁴，2×10⁵，2×10⁶)；J，K：对接种rLaSota的SPF鸡胚尿囊液进行稀释(分别地，2×10¹，2×10²)；L：阴性对照)；

图3.pBRN-FL-PmeI的质粒图谱；

图4.pBRN-FL-CaIFNα质粒图谱；

图5.pBRN-FL-CaIFNβ质粒图谱；

图6.pBRN-FL-CaIFNγ质粒图谱；

图7.质粒pBSNP的序列，带下划线的斜体部分是NP基因的编码序列；

图8.质粒pBSP的序列，带下划线的斜体部分是P基因的编码序列；

图9.质粒pBSL的序列，带下划线的斜体部分是L基因的编码序列。

序列表说明

SEQ ID No.1狗α干扰素氨基酸序列；

SEQ ID No.2狗β干扰素氨基酸序列；

SEQ ID No.3狗γ干扰素氨基酸序列；

SEQ ID No.4狗α干扰素基因；

SEQ ID No.5狗β干扰素基因；

SEQ ID No.6狗γ干扰素基因；

SEQ ID No.7插入狗α干扰素的LaSota基因组序列的质粒：pBRN-FL-CaIFNα；

SEQ ID No.8插入狗β干扰素的LaSota基因组序列的质粒：pBRN-FL-CaIFNβ；

SEQ ID No.9插入狗γ干扰素的LaSota基因组序列的质粒：pBRN-FL-CaIFNγ；

SEQ ID No.10pBRN-FL-PmeI的核苷酸序列。

具体实施方式

下文将参考实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图举例说明本发明，而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。

实施例1狗α、β、γ干扰素在新城疫病毒LaSota疫苗株中的高效稳定表达及抗病毒活性检测

材料和方法

1材料

表达绿色荧光蛋白报告基因的重组水疱性口炎病毒VSV-GFP商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所^[10]。BHK-21细胞(ATCC CCL-10)、MDCK细胞(ATCC No.CCL-22)由本实验室传代培养，培养基为含10％胎牛血清的DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle Media)；SPF鸡胚商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；表达T7聚合酶的痘病毒vTF7-3(ATCC，VR-2153)购自ATCC；新城疫LaSota克隆株rLaSota(按照ZL200510097997.8制备)由本实验室保存；rLaSota反向遗传操作系统基因组转录模板质粒pBRN-FL-PmeI(参见：葛金英，温志远，王永，等。表达绿色荧光蛋白重组新城疫病毒LaSota疫苗株的构建[J].微生物学报，2006，46(4)：547～551)(病毒基因组转录质粒pBRN-FL-PmeI，含有新城疫病毒的基因组全长cDNA，pBRN-FL-PmeI的序列信息见SEQ ID No.10，质粒图谱见图3)。

如ZL200510097997.8或参考文献[11]所述，将表达新城疫病毒(基因组序列：GenBank登录号AY845400)的核蛋白(NP)、磷酸蛋白(P)及大聚合酶蛋白(L)基因的开放阅读框架(ORF)cDNA分别紧接着克隆在pBlueScript载体(Clontech)质粒T7启动子下游，分别构建转录辅助质粒pBSNP，pBSP和pBSL(序列分别如图7-9所示)。

2表达狗α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆的构建

由Genebank登录号AB102731、NM 001135787、EF095772委托上海捷瑞生物工程有限公司合成狗干扰素α、β、γ，合成的片段经EcoRV酶切位点连入同样经此酶处理的pBlueScript载体(Clontech)上，质粒命名为pBS-CaIFNα、pBS-CaIFNβ、pBS-CaIFNγ。

以质粒pBS-CaIFNα、pBS-CaIFNβ、pBS-CaIFNγ为模板，通过PCR引物(表1)在干扰素基因ORF的5′端引入PmeI限制酶识别序列和NDV自身聚合酶L识别的转录终止序列GE(TTAAGAAAAAA)、转录起始序列GS(ACGGGTAGAA)及增强基因表达的Kozak序列(GCCACC)，在干扰素基因ORF的3′端引入PmeI限制酶识别序列(所用引物见表1)；为了确保重组基因组cDNA全长总碱基数仍保持6的倍数，在引物GS和Kozak序列之间加入适当数量碱基进行调整。PCR末端经PmeI酶切插入同样经PmeI处理的pBRN-FL-PmeI载体内，表达狗α、β、γ干扰素的重组基因组全长cDNA克隆命名为pBRN-FL-CaIFNα、pBRN-FL-CaIFNβ、pBRN-FL-CaIFNγ(序列如SEQ ID No.7，SEQ ID No.8，SEQ ID No.9所示，质粒图谱见图4，5，6)。利用引物NDV-3#PF：5′-gtccgtgcattgatcatg-3′和各基因PCR所用下游引物鉴定方向。

3重组病毒的拯救

BHK-21细胞(ATCC CCL-10)接种于六孔板内生长达50～80％单层时，转录质粒pBRN-FL-CaIFNα、pBRN-FL-CaIFNβ、pBRN-FL-CaIFNγ分别与转录辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3的BHK-21细胞。转染上清经0.22um孔径滤器过滤后接种9～11天的SPF鸡胚尿囊腔；接种后的SPF鸡胚继续培养3-5天，取鸡胚尿囊液50μl按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验，详细操作方法参见文献^[11]。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存，并按常规方法分别于9-10日龄鸡胚尿囊腔接种进行传代、EID50滴定^[11]。重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Canineα、rL-Canineβ和rL-Canineγ接种的SPF鸡胚尿囊液于2008年7月31日保藏于中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号分别为CGMCC No.2622、CGMCC No.2623和CGMCC No.2624。

4  rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ和rL-CaIFNγ抗病毒活性检测

分别取rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ、rL-CaIFNγ以及rLaSota接种的SPF鸡胚尿囊液2ml放入平皿中，置于紫外灯下照射2h，每间隔20分钟摇动一次，以灭活NDV病毒。经紫外线灭活的尿囊液接种SPF鸡胚以检测病毒灭活是否彻底，每胚100μL，共接3枚，接种后的鸡胚置37℃孵化器内孵化，3天后检测鸡胚尿囊液是否HA阳性。HA阴性样品分装，-70℃保存备用。

用VSV-GFP-MDCK细胞系统测定rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ、rL-CaIFNγ的抗病毒活性，具体为：取灭活后重组病毒rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ、rL-CaIFNγ鸡胚尿囊液，每个样品100μL，用含5％胎牛血清的DMEM进行10倍系列稀释，在生长于96孔细胞培养板上的MDCK细胞上加入2×10¹～2×10⁸稀释的尿囊液，同时取相同稀释倍数的灭活rLaSota鸡胚尿囊液作为对照组，于37℃作用24h。吸出上清后，接种VSV-EGFP(表达增强型绿色荧光蛋白的重组水泡性口炎病毒，商购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)，剂量为200PFU(噬斑形成单位)/孔感染细胞，感作1h后换完全培养液继续培养，同时设空白对照组，24h后荧光显微镜观察结果。以空白对照组为对照，将减少50％VSV-EGFP感染率的样品的最高稀释度定为1个病毒抑制单位(IU)。

5  重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测

取灭活后重组病毒rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ、rL-CaIFNγ鸡胚尿囊液分装，100μL/管，一部分放4℃冰箱长期保存，每间隔1周取出一份进行抗病毒活性检测；另一部分放-70℃冰箱，取冻融1次、2次、3次、4次的样品检测抗病毒活性单位的变化，以检测反复冻融对抗病毒活性的影响。

结果

1表达狗α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆的构建及鉴定

通过PCR引物在狗干扰素基因CaIFNα、CaIFNβ、CaIFNγ的ORF的5′端和3′端引入PmeI限制酶识别序列(所用引物见表1)；由于插入的外源基因为PmeI单切连入pBRN-FL-PmeI载体，因此克隆质粒经PmeI酶切的产物应有两条，一条为载体，约为18kb，另一条为外源基因及其所携带的GE/GS等长约500～700bp(图1)；而经鉴定引物进行PCR扩增，应得到比相应外源基因大200bp左右的条带，产物约700～900bp，电泳结果显示与预期相符(图1)。证明表达狗α、β、γ干扰素的重组基因组全长cDNA克隆构建成功。

表1构建表达狗α、β、γ干扰素基因的全基因组克隆所用引物

注：下划线部分为干扰素基因特异序列，酶切位点用边框表示，Kozak序列用斜体表示，基因起始信号和基因结束信号用小写字符表示，用黑体字符调整碱基数以适应6的倍数规则。

2重组病毒的拯救及鉴定

全基因组转录质粒pBRN-FL-CaIFNα、pBRN-FL-CaIFNβ、pBRN-FL-CaIFNγ分别与转录辅助质粒pBSNP、pBSP和pBSL共转染预先感染vTF7-3的BHK-21细胞。转染上清接种后SPF胚继续培养3-5天，取鸡胚尿囊液50μL按常规进行新城疫病毒的血凝(HA)和血凝抑止(HI)试验。收获HA及HI试验结果阳性尿囊液，-70℃冻存。同时进行RT-PCR鉴定，PCR产物测序结果(数据未显示)证明重组病毒基因组内含有相应的外源基因片段，至此成功拯救出表达狗干扰素α、β、γ的重组新城疫病毒，并分别命名为rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ和rL-CaIFNγ。

3 rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ和rL-CaIFNγ抗病毒活性检测

收获的重组病毒尿囊液经紫外线灭活，进行10倍系列稀释，稀释后的样品处理细胞24h，然后按每孔200PFU的接种量感染VSV-EGFP，24h后经荧光显微镜观察结果。2×10⁵倍稀释rL-CaIFNα和rL-CaIFNβ和2×10⁴倍稀释rL-CaIFNγ可以抑制90％VSV-EGFP的复制，仅有少量荧光出现(图2A，D，G)，2×10⁶稀释的rL-CaIFNα和rL-CaIFNβ以及2×10⁵倍稀释rL-CaIFNγ可部分抑制VSV-EGFP的复制，荧光亮度约为对照组的一半(图2B，E，H)，2×10²倍稀释的rLaSota病毒接种SPF鸡胚尿囊液组也出现大量荧光(图2K)，不能抑制VSV-EGFP的复制，但是10倍稀释时可以非特异性的部分抑制VSV-EGFP在MDCK细胞中的复制(图2J)。未加干扰素样品的对照孔出现大量荧光(图2L)，VSV-EGFP在MDCK细胞中大量复制。测得rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ的抗病毒活性为2×10⁷IU/mL，rL-CaIFNγ抗病毒活性为2×10⁶IU/mL。

4重组病毒尿囊液抗病毒稳定性检测

取灭活后重组病毒rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ和L-CaIFNγ鸡胚尿囊液分装，分别放4℃冰箱长期保存，每间隔5天取出一份进行抗病毒活性检测。重组病毒尿囊液在4℃存放10天时其抗病毒活性未表现明显下降；另一部分放-70℃冰箱，取冻融1次、2次、3次样品检测抗病毒活性单位的变化，结果样品经3次反复冻融抗病毒活性下降小于10倍。

干扰素(IFN)是机体在接触病毒或其他诱生物后分泌的一类蛋白，具有广谱抗病毒、抑制细胞增殖和免疫调节等多种生物学活性^[1]。Camilo等^[12]在牛疱疹病毒中表达了BoIFN-γ并进行了体内抗病毒保护实验，取得了良好效果。国内外研究表明，BoIFN在抗水泡性口炎病毒、口蹄疫病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛白血病病毒以及副流感-3型的试验中均取得了良好效果^[5-9]。IFN 2C具有抗弓形虫作用^[4]。重组BoIFN-γ作为免疫佐剂，曾用于奶牛乳房炎、细菌性疾病的治疗^[13，14]。干扰素在抗病毒以及免疫调节方面的杰出表现使之成为研究焦点。随着重组DNA技术的发展，人们尝试利用多种表达系统探索干扰素大规模生产的捷径。最初研究人员利用大肠杆菌表达干扰素，纯化的蛋白具有广谱抗病毒生物学活性，但纯化困难，且容易复性不完全^[5～8]；之后出现杆状病毒表达系统^[15～17]、酵母表达系统^[14]、疱疹病毒表达系统^[12]等真核表达系统，表达的干扰素近乎天然，但成本高，而且纯化困难。

重组新城疫病毒表达系统表达的牛干扰素蛋白糖基化等蛋白翻译后加工和折叠与哺乳动物相似，表达完整的干扰素蛋白更有利于保持蛋白天然构型与生物学活性，因此新城疫病毒具有绝对的优势成为分泌型外源蛋白表达载体系统。亲本株NDV rLaSota具有良好的鸡胚生长特性，低毒力，高生长滴度，表达的干扰素无需纯化，便于大量生产。NDV rLaSota株作为疫苗载体和外源蛋白功能研究载体具有广阔的应用前景。

本文构建了表达狗α、β、γ干扰素的重组新城疫病毒rL-CaIFNα、rL-CaIFNβ和rL-CaIFNγ，插入基因为带有信号肽的干扰素基因阅读框，干扰素蛋白能够以分泌形式释放到培养上清中。收获的SPF鸡胚尿囊液经紫外线灭活NDV病毒后，具有10⁶IU/mL的高滴度抗病毒活性，与杆状病毒表达系统、酵母表达系统具有相近，甚至更高的抗病毒滴度，但成本相对更低，具有产业化应用潜力。本研究克隆的狗IFN-α、-β、-γ基因，为进一步利用基因工程技术生产重组狗IFN及其生物学功能的研究奠定了基础，期望通过进一步开展深入研究，使重组IFN成为具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的主要药物。

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[14]Fernando Diaz，Felipe M，Araceli P，Verala E，Suarez-Guemes F andMontano L F.Secretion of IFN-γby bovine peripheral blood mononuclearcells stimulated with mycobacterium bovis protein fractions obtained byisoelectric-focusing[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，1999，67：203～212

[15]陈伟业，肇慧君，王喜军，等.重组杆状病毒表达牛β干扰素及其生物学活性研究[J].微生物学报，2007，47(4)：

[16]秦立廷，王喜军，胡森，李志中，陈伟业，等.重组杆状病毒表达牛γ-干扰素及其抗病毒活性研究[J].微生物学报，2007，47(3)：

[17]秦立廷，王喜军，胡森，李志中，陈伟业，等.重组杆状病毒表达猪γ-干扰素及其抗病毒活性的研究[J].生物工程学报，2007，(3)：

序列表

<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所

<120>表达狗干扰素(α、β或γ-干扰素)的重组新城疫LaSota弱毒疫苗株

<130>IB088768

<160>10

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>144

<212>PRT

<213>狗

<400>1

Met Arg Arg Leu Ser Ala Ser Ser Cys Asp His Tyr Thr Thr Asp Phe

1               5                   10                  15

Ala Phe Pro Lys Glu Leu Phe Asp Gly Gln Arg Leu Gln Glu Ala Gln

            20                  25                  30

Ala Leu Ser Val Val His Val Met Thr Gln Lys Val Phe His Leu Phe

        35                  40                  45

Cys Thr Asn Met Ser Ser Ala Pro Trp Asn Met Thr Leu Leu Glu Glu

    50                  55                  60

Leu Cys Ser Gly Leu Ser Glu Gln Leu Asp Asp Leu Asp Ala Cys Pro

65                  70                  75                  80

Leu Gln Glu Ala Gly Leu Ala Glu Thr Pro Leu Met His Glu Asp Ser

                85                  90                  95

Thr Leu Arg Thr Tyr Phe Gln Arg Ile Ser Leu Tyr Leu Gln Asp Arg

            100                 105                 110

Asn His Ser Pro Cys Ala Trp Glu Met Val Arg Ala Glu Ile Gly Arg

        115                 120                 125

Ser Phe Phe Ser Leu Thr Ile Leu Gln Glu Arg Val Arg Arg Arg Lys

    130                 135                 140

<210>2

<211>197

<212>PRT

<213>狗

<400>2

Met Val Ile Gly Glu Thr Leu Pro Ile Phe Ile Met Thr Ser Arg Cys

1               5                   10                  15

Ile Leu Gln Thr Thr Leu Leu Leu Tyr Phe Ser Thr Met Ala Leu Ala

            20                  25                  30

Met Ser Asn Asp Leu Leu Arg Ser Gln Leu Ser Ser Ser Ser Leu Glu

        35                  40                  45

Cys Gln Glu Leu Leu Leu Gln Leu Asn Gly Thr Thr Glu Tyr Cys Leu

    50                  55                  60

Lys Asp Arg Ile Asn Phe Glu Ile Pro Glu Glu Ile Glu Lys Ser Arg

65                  70                  75                  80

Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ile Ile Leu Ile Thr His Glu Met Phe Gln

                85                  90                  95

Lys Ile Phe Asp Ile Phe Arg Arg Asn Ile Ser Arg Thr Gly Trp Asn

            100                 105                 110

Glu Thr Thr Val Glu Asn Leu Leu Val Lys Leu His Trp Gln Lys Glu

        115                 120                 125

His Leu Glu Ile Ile Leu Glu Asp Val Lys Glu Lys Glu Asn Phe Thr

    130                 135                 140

Trp Asp Asn Arg Thr Leu Leu His Leu Lys Lys Tyr Tyr Leu Arg Ile

145                 150                 155                 160

Val Gln Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser Ile Cys Ala Trp Thr Ile

                165                 170                 175

Val Gln Ala Glu Ile Cys Arg Asn Phe Phe Phe Leu Asn Ile Leu Thr

            180                 185                 190

Asp Tyr Leu Gln Asn

        195

<210>3

<211>166

<212>PRT

<213>狗

<400>3

Met Asn Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Val Ile Leu

1               5                   10                  15

Cys Ser Ser Gly Cys Asn Cys Gln Ala Met Phe Phe Lys Glu Ile Glu

            20                  25                  30

Asn Leu Lys Glu Tyr Phe Asn Ala Ser Asn Pro Asp Val Ser Asp Gly

        35                  40                  45

Gly Ser Leu Phe Val Asp Ile Leu Lys Lys Trp Arg Glu Glu Ser Asp

    50                  55                  60

Lys Thr Ile Ile Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Leu Lys Leu Phe

65                  70                  75                  80

Asp Asn Phe Lys Asp Asn Gln Ile Ile Gln Arg Ser Met Asp Thr Ile

                85                  90                  95

Lys Glu Asp Met Leu Gly Lys Phe Leu Asn Ser Ser Thr Ser Lys Arg

            100                 105                 110

Glu Asp Phe Leu Lys Leu Ile Gln Ile Pro Val Asn Asp Leu Gln Val

        115                 120                 125

Gln Arg Lys Ala Ile Asn Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser

    130                 135                 140

Pro Arg Ser Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg

145                 150                 155                 160

Gly Arg Arg Ala Ser Lys

                165

<210>4

<211>435

<212>DNA

<213>狗

<400>4

atgaggagac tctccgccag ctcttgtgac cactacacca ctgactttgc cttccccaag     60

gaactgtttg atggccagcg gctccaggag gcgcaagccc tctctgtggt ccacgtgatg    120

acccagaagg tcttccacct cttctgcacg aacatgtcct ctgctccttg gaacatgacc    180

ctcctggagg aattgtgctc ggggctctct gagcagctgg atgacctgga tgcctgtccc    240

ctgcaggagg cagggctggc cgagaccccc ctcatgcatg aagactccac cctgaggacc    300

tacttccaaa ggatctccct ctacctgcaa gacaggaacc acagcccgtg tgcctgggag    360

atggtccgag cagaaatcgg gagatccttc ttctccttga ccatcttgca agaaagagta    420

aggaggagga aatga                                                     435

<210>5

<211>594

<212>DNA

<213>狗

<400>5

atggtaatag gtgagactct tcccattttc atcatgacca gtagatgcat cctccaaaca     60

actctcctgt tgtatttctc caccatggct cttgccatga gcaacgactt gcttcgatcc    120

cagctaagca gcagcagttt ggagtgtcag gagctcctat tacagttgaa tggaaccact    180

gaatattgcc tcaaggacag gataaacttc gagatccctg aggaaatcga gaaatcacgc    240

cagttccaga aggaggacat catattgatc acccatgaga tgttccagaa gatctttgat    300

attttcagga gaaatatctc tagaacagga tggaatgaga ccactgtcga gaaccttctt    360

gtgaagctcc actggcagaa ggaacatctg gagataatcc tggaggacgt caaagagaag    420

gaaaacttca cctgggacaa caggactctt ctgcacctga agaaatatta cttaaggatt    480

gtgcagtacc tgaaggccaa ggagtacagc atctgtgcct ggacaatagt ccaagcagaa    540

atctgcagga actttttctt ccttaatata cttacagatt atctccagaa ctga          594

<210>6

<211>501

<212>DNA

<213>狗

<400>6

atgaattata caagctatat cttagcattt cagctttgcg tgattttgtg ttcttctggc     60

tgtaactgtc aggccatgtt ttttaaagaa atagaaaacc taaaggaata ttttaatgca    120

agtaatccag atgtatcgga cggtgggtct cttttcgtag atattttgaa gaaatggaga    180

gaggagagtg acaaaacaat cattcagagc caaattgtct ctttctactt gaaactgttt    240

gacaacttta aagataacca gatcattcaa aggagcatgg ataccatcaa ggaagacatg    300

cttggcaagt tcttaaatag cagcaccagt aagagggagg acttccttaa gctgattcaa    360

attcctgtga acgatctgca ggtccagcgc aaggcgataa atgaactcat caaagtgatg    420

aatgatctct caccaagatc caacctaagg aagcggaaaa ggagtcagaa tctgtttcga    480

ggccgcagag catcgaaata a                                              501

<210>7

<211>20020

<212>DNA

<213>人工

<400>7

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa     60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg    120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt    180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata    240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg    300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac    360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac    420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca    480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg    540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct    600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat    660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt    720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct    780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct    840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa    900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt    960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc   1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca   1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc   1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat   1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg   1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga   1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac   1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg   1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg   1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc   1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg   1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca   1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga   1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa   1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt   1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc   1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt    1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac    2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac    2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc    2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc    2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg    2280

tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc    2340

gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc    2400

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata    2460

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg    2520

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct    2580

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa    2640

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    2700

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt    2760

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg    2820

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg    2880

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct    2940

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc    3000

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg    3060

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc    3120

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt    3180

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa    3240

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat    3300

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct    3360

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg    3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag    3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta    3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg    3600

ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg    3660

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct    3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta    3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg    3840

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc    3900

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg    3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga    4020

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg    4080

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat    4140

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc    4200

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca    4260

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct    4320

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctaggcg gctatatgcg    4380

ttggatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg    4440

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgag ctacgcgatc atggcgacca    4500

cacccgtcct gtggatcccc cgaagtctag aactagtgga tccccctgat acgactcact    4560

ataggaccaa acagagaatc cgtgagttac gataaaaggc gaaggagcaa ttgaagtcgc    4620

acgggtagaa ggtgtgactc tcgagtgcga gcccgaagca caaactcgag aaagccttct    4680

gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc    4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc    4800

actcttaaca gtgatgaccc agaagataga tggagctttg tggtattctg cctccggatt    4860

gctgttagcg aagatgccaa caaaccactc aggcaaggtg ctctcatatc tcttttatgc    4920

tcccactcac aggtaatgag gaaccatgtt gcccttgcag ggaaacagaa tgaagccaca    4980

ttggccgtgc ttgagattga tggctttgcc aacggcacgc cccagttcaa caataggagt    5040

ggagtgtctg aagagagagc acagagattt gcgatgatag caggatctct ccctcgggca    5100

tgcagcaacg gaaccccgtt cgtcacagcc ggggccgaag atgatgcacc agaagacatc    5160

accgataccc tggagaggat cctctctatc caggctcaag tatgggtcac agtagcaaaa    5220

gccatgactg cgtatgagac tgcagatgag tcggaaacaa ggcgaatcaa taagtatatg    5280

cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa    5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc    5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac    5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag    5520

acatcagccc ttgcacttag tagcctctca ggcgacatcc agaagatgaa gcagctcatg    5580

cgtttgtatc ggatgaaagg agataatgcg ccgtacatga cattacttgg tgatagtgac    5640

cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca    5700

tcagtcctag ataaaggtac tgggaaatac caatttgcca gggactttat gagcacatca    5760

ttctggagac ttggagtaga gtacgctcag gctcagggaa gtagcattaa cgaggatatg    5820

gctgccgagc taaagctaac cccagcagca aggaggggcc tggcagctgc tgcccaacgg    5880

gtctccgagg agaccagcag catagacatg cctactcaac aagtcggagt cctcactggg    5940

cttagcgagg gggggtccca agctctacaa ggcggatcga atagatcgca agggcaacca    6000

gaagccgggg atggggagac ccaattcctg gatctgatga gagcggtagc aaatagcatg    6060

agggaggcgc caaactctgc acagggcact ccccaatcgg ggcctccccc aactcctggg    6120

ccatcccaag ataacgacac cgactggggg tattgataaa caaaacccag cctgcttcca    6180

caaaaacatc ccaatgccct cacccgtagt cgacccctcg atttgcggct ctatatgacc    6240

acaccctcaa acaaacatcc ccctctttcc tccctccccc tgctgtacaa ctccgcacgc    6300

cctagatacc acaggcacaa tgcggctcac taacaatcaa aacagagccg agggaattag    6360

aaaaaagtac gggtagaaga gggatattca gagatcaggg caagtctccc gagtctctgc    6420

tctctcctct acctgataga ccaggacaaa catggccacc tttacggatg cagagatcga    6480

cgagctattt gagacaagtg gaactgtcat tgacaacata attacagccc agggtaaacc    6540

agcagagact gttggaagga gtgcaatccc acaaggcaag accaaggtgc tgagcgcagc    6600

atgggagaag catgggagca tccagccacc ggccagtcaa gacaaccccg atcgacagga    6660

cagatctgac aaacaaccat ccacacccga gcaaacgacc ccgcatgaca gcccgccggc    6720

cacatccgcc gaccagcccc ccacccaggc cacagacgaa gccgtcgaca cacagctcag    6780

gaccggagca agcaactctc tgctgttgat gcttgacaag ctcagcaata aatcgtccaa    6840

tgctaaaaag ggcccatggt cgagccccca agaggggaat caccaacgtc cgactcaaca    6900

gcaggggagt caacccagtc gcggaaacag tcaggaaaga ccgcagaacc aagtcaaggc    6960

cgcccctgga aaccagggca cagacgtgaa cacagcatat catggacaat gggaggagtc    7020

acaactatca gctggtgcaa cccctcatgc tctccgatca aggcagagcc aagacaatac    7080

ccttgtatct gcggatcatg tccagccacc tgtagacttt gtgcaagcga tgatgtctat    7140

gatggaggcg atatcacaga gagtaagtaa ggttgactat cagctagatc ttgtcttgaa    7200

acagacatcc tccatcccta tgatgcggtc cgaaatccaa cagctgaaaa catctgttgc    7260

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tagaaaaaac acgggtagaa gattctggat cccggttggc gccctccagg tgcaagatgg     9120

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ttgcacagca agttggtgta gagctcaacc tgtacctaac cgaattgact acagtattcg     9780

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ctggtggaaa tatggattac ttattgacta agttaggtgt agggaacaat caactcagct     9900

cattaatcgg tagcggctta atcaccggta accctattct atacgactca cagactcaac     9960

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aatcatggac cgcgccgtta gccaagttgc gttagagaat gatgaaagag aggcaaaaaa    11040

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accgactagg aattccaggg cagaagaaaa gattacatct acacttggtt ccaatcaaga    11220

tgtagtagat aggatatata agcaagtggc ccttgagtct ccgttggcat tgttaaaaac    11280

tgagaccaca attatgaacg caataacatc tctctcttat cagattaatg gagctgcaaa    11340

caacagtggg tggggggcac ttatccatga cccagattat atagggggga taggcaaaga    11400

actcattgta gatgatgcta gtgatgtcac atcattctat ccctctgcat ttcaagaaca    11460

tctgaatttt atcccggcgc ctactacagg atcaggttgc actcgaatac cctcatttga    11520

catgagtgct acccattact gctacaccca taatgtaata ttgtctggat gcagagatca    11580

ctcacattca tatcagtatt tagcacttgg tgtgctccgg acatctgcaa cagggagggt    11640

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tgtgagtgca actcccctgg gttgtgatat gctgtgctcg aaagtcacgg agacagagga    11760

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ccagtaccac gaaaaggacc tagatgtcac aacattattc ggggactggg tggccaacta    11880

cccaggagta gggggtggat cttttattga cagccgcgta tggttctcag tctacggagg    11940

gttaaaaccc aattcaccca gtgacactgt acaggaaggg aaatatgtga tatacaagcg    12000

atacaatgac acatgcccag atgagcaaga ctaccagatt cgaatggcca ggtcttcgta    12060

taagcctgga cggtttggtg ggaaacgcat acagcaggct atcttatcta tcaaggtgtc    12120

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atacttctct cccgcgttat tatatcctat gacagtcagc aacaaaacag ccactcttca    12300

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gaatcaaacc gaatgccggc gcgtgctcga attccatgtt gccagttgac cacaatcagc    12840

cagtgctcat gcgatcagat taagccttgt caatagtctc ttgattaaga aaaaatgtaa    12900

gtggcaatga gatacaaggc aaaacagctc atggtaaata atacgggtag aacatggcga    12960

gctccggtcc tgaaagggca gagcatcaga ttatcctacc agagtcacac ctgtcttcac    13020

cattggtcaa gcacaaacta ctctattact ggaaattaac tgggctaccg cttcctgatg    13080

aatgtgactt cgaccacctc attctcagcc gacaatggaa aaaaatactt gaatcggcct    13140

ctcctgatac tgagagaatg ataaaactcg gaagggcagt acaccaaact cttaaccaca    13200

attccagaat aaccggagtg ctccacccca ggtgtttaga agaactggct aatattgagg    13260

tcccagattc aaccaacaaa tttcggaaga ttgagaagaa gatccaaatt cacaacacga    13320

gatatggaga actgttcaca aggctgtgta cgcatataga gaagaaactg ctggggtcat    13380

cttggtctaa caatgtcccc cggtcagagg agttcagcag catccgtacg gacccggcat    13440

tctggtttca ctcaaaatgg tccacagcca agtttgcatg gctccatata aaacagatcc    13500

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cccataaggt aggccaagtc tttgtcactc ctgaacttgt cgttgtgacg catacgaatg    13620

agaacaagtt cacatgtctt acccaggaac ttgtattgat gtatgcagat atgatggagg    13680

gcagagatat ggtcaacata atatcaacca cggcggtgca tctcagaagc ttatcagaga    13740

aaattgatga cattttgcgg ttaatagacg ctctggcaaa agacttgggt aatcaagtct    13800

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caggtacatt tgcaggagat ttcttcgcat tcaacctgca ggagcttaaa gacattctaa    13920

ttggcctcct ccccaatgat atagcagaat ccgtgactca tgcaatcgct actgtattct    13980

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ggtacagaaa gaagaatgca ggtgtgtggc cgcgagtcaa agtggataca atatatggga    14220

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ctaatcgcct cttgatagag tttttagagt caaatgattt tgatccatat aaagagatgg    14520

aatatctgac gacccttgag taccttagag atgacaatgt ggcagtatca tactcgctca    14580

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atggagtcat tcaggatagc atatccttga ccaagagtat gctagcgatg agtcaactgt    14760

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tgttcgtagg agaccctttc aatcctccaa gtgaccctac tgactgtgac ctctcaagag    15060

tccctaatga tgacatatat attgtcagtg ccagaggggg tatcgaagga ttatgccaga    15120

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ggtcagacac attcttcata tacagcaaac gaatcttcaa agatggagca atcctcagtc    15420

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taattaagat tgcgcttact aggaggccat taggcataaa gaggctgatg cggatagtca    16200

attattctag catgcatgca atgctgttta gagacgatgt tttttcctcc agtagatcca    16260

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atctggagtc atatcccacg atagagctaa tgaacattct ttcaatatcc agcgggaagt    17220

tgattggcca gtctgtggtt tcttatgatg aagatacctc cataaagaat gacgccataa    17280

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gagtaagagg cctagacaat attgtcttat atatgggtga tttatacaag aatatgccag    17460

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aacagtgcac gagacagatc ctagaggtta caatactagg tcttagagtc gaaaatctca    19320

ataaaatagg cgatataatc agtctagagc ttaaaggcat gatctccatg gaggacctta  19380

tcccactaag gacatacttg aagcatagta cctgccctaa atatttgaag gctgtcctag  19440

gtattaccaa actcaaagaa atgtttacag acacttctgt actgtacttg actcgtgctc  19500

aacaaaaatt ctacatgaaa actataggca atgcagtcaa cggatattac agtaactgtg  19560

actcttaacg aaaatcacat attaataggc tccttttttg gccaattgta ttcttgttga  19620

tttaatcata ttatgttaga aaaaagttga accctgactc cttaggactc gaattcgaac  19680

tcaaataaat gtcttaaaaa aaggttgcgc acaattattc ttgagtgtag tctcgtcatt  19740

caccaaatct ttgtttggtg ggtcggcatg gcatctccac ctcctcgcgg tccgacctgg  19800

gcatccgaag gaggacgtcg tccactcgga tggctaaggg aggggccccc gcggggctgc  19860

taacaaagcc cgaaaggaag ctgagttggc tgctgccacc gctgagcaat aactagcata  19920

accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg ctgaaaggag gaactatatc  19980

cggatcgaga cctcgatact agtgcggtgg agctgaattc                        20020

<210>8

<211>20495

<212>DNA

<213>人工

<400>8

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa     60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg    120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt    180

gcgggatatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc tagcgctata    240

tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc gctttggccg    300

ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga tcatggcgac    360

cacacccgtc ctgtggatcc tctacgccgg acgcatcgtg gccggcatca ccggcgccac    420

aggtgcggtt gctggcgcct atatcgccga catcaccgat ggggaagatc gggctcgcca    480

cttcgggctc atgagcgctt gtttcggcgt gggtatggtg gcaggccccg tggccggggg    540

actgttgggc gccatctcct tgcatgcacc attccttgcg gcggcggtgc tcaacggcct    600

caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat    660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt    720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct    780

ctgggtcatt ttcggcgagg accgctttcg ctggagcgcg acgatgatcg gcctgtcgct    840

tgcggtattc ggaatcttgc acgccctcgc tcaagccttc gtcactggtc ccgccaccaa    900

acgtttcggc gagaagcagg ccattatcgc cggcatggcg gccgacgcgc tgggctacgt    960

cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc   1020

cggcggcatc gggatgcccg cgttgcaggc catgctgtcc aggcaggtag atgacgacca   1080

tcagggacag cttcaaggat cgctcgcggc tcttaccagc ctaacttcga tcactggacc   1140

gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat   1200

tgtaggcgcc gccctatacc ttgtctgcct ccccgcgttg cgtcgcggtg catggagccg   1260

ggccacctcg acctgaatgg aagccggcgg cacctcgcta acggattcac cactccaaga   1320

attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac   1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg   1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg   1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc   1560

tgctgcaaaa cgtctgcgac ctgagcaaca acatgaatgg tcttcggttt ccgtgtttcg   1620

taaagtctgg aaacgcggaa gtcagcgccc tgcaccatta tgttccggat ctgcatcgca   1680

ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga   1740

ccctgagtga tttttctctg gtcccgccgc atccataccg ccagttgttt accctcacaa   1800

cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt   1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc   1920

aaacaggaaa aaaccgccct taacatggcc cgctttatca gaagccagac attaacgctt   1980

ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac   2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac   2100

ctctgacaca tgcagctccc ggagacggtc acagcttgtc tgtaagcgga tgccgggagc   2160

agacaagccc gtcagggcgc gtcagcgggt gttggcgggt gtcggggcgc agccatgacc   2220

cagtcacgta gcgatagcgg agtgtatact ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg   2280

tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc   2340

gcatcaggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc   2400

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata    2460

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg    2520

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct    2580

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt  ccccctggaa   2640

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    2700

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt    2760

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg    2820

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg    2880

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct    2940

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc    3000

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg    3060

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc    3120

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt    3180

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa    3240

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat    3300

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct    3360

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg    3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag    3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta    3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg    3600

ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg    3660

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct    3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta    3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg    3840

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc    3900

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg    3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga    4020

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg    4080

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat    4140

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc    4200

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca    4260

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct    4320

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctaggcg gctatatgcg    4380

ttggatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg    4440

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgag ctacgcgatc atggcgacca    4500

cacccgtcct gtggatcccc cgaagtctag aactagtgga tccccctgat acgactcact    4560

ataggaccaa acagagaatc cgtgagttac gataaaaggc gaaggagcaa ttgaagtcgc    4620

acgggtagaa ggtgtgactc tcgagtgcga gcccgaagca caaactcgag aaagccttct    4680

gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc    4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc    4800

actcttaaca gtgatgaccc agaagataga tggagctttg tggtattctg cctccggatt    4860

gctgttagcg aagatgccaa caaaccactc aggcaaggtg ctctcatatc tcttttatgc    4920

tcccactcac aggtaatgag gaaccatgtt gcccttgcag ggaaacagaa tgaagccaca    4980

ttggccgtgc ttgagattga tggctttgcc aacggcacgc cccagttcaa caataggagt    5040

ggagtgtctg aagagagagc acagagattt gcgatgatag caggatctct ccctcgggca    5100

tgcagcaacg gaaccccgtt cgtcacagcc ggggccgaag atgatgcacc agaagacatc    5160

accgataccc tggagaggat cctctctatc caggctcaag tatgggtcac agtagcaaaa    5220

gccatgactg cgtatgagac tgcagatgag tcggaaacaa ggcgaatcaa taagtatatg    5280

cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa    5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc    5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac    5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag    5520

acatcagccc ttgcacttag tagcctctca ggcgacatcc agaagatgaa gcagctcatg    5580

cgtttgtatc ggatgaaagg agataatgcg ccgtacatga cattacttgg tgatagtgac    5640

cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca    5700

tcagtcctag ataaaggtac tgggaaatac caatttgcca gggactttat gagcacatca    5760

ttctggagac ttggagtaga gtacgctcag gctcagggaa gtagcattaa cgaggatatg    5820

gctgccgagc taaagctaac cccagcagca aggaggggcc tggcagctgc tgcccaacgg    5880

gtctccgagg agaccagcag catagacatg cctactcaac aagtcggagt cctcactggg    5940

cttagcgagg gggggtccca agctctacaa ggcggatcga atagatcgca agggcaacca    6000

gaagccgggg atggggagac ccaattcctg gatctgatga gagcggtagc aaatagcatg    6060

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ccatcccaag ataacgacac cgactggggg tattgataaa caaaacccag cctgcttcca    6180

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tctctcctct acctgataga ccaggacaaa catggccacc tttacggatg cagagatcga    6480

cgagctattt gagacaagtg gaactgtcat tgacaacata attacagccc agggtaaacc    6540

agcagagact gttggaagga gtgcaatccc acaaggcaag accaaggtgc tgagcgcagc    6600

atgggagaag catgggagca tccagccacc ggccagtcaa gacaaccccg atcgacagga    6660

cagatctgac aaacaaccat ccacacccga gcaaacgacc ccgcatgaca gcccgccggc    6720

cacatccgcc gaccagcccc ccacccaggc cacagacgaa gccgtcgaca cacagctcag    6780

gaccggagca agcaactctc tgctgttgat gcttgacaag ctcagcaata aatcgtccaa    6840

tgctaaaaag ggcccatggt cgagccccca agaggggaat caccaacgtc cgactcaaca    6900

gcaggggagt caacccagtc gcggaaacag tcaggaaaga ccgcagaacc aagtcaaggc    6960

cgcccctgga aaccagggca cagacgtgaa cacagcatat catggacaat gggaggagtc    7020

acaactatca gctggtgcaa cccctcatgc tctccgatca aggcagagcc aagacaatac    7080

ccttgtatct gcggatcatg tccagccacc tgtagacttt gtgcaagcga tgatgtctat    7140

gatggaggcg atatcacaga gagtaagtaa ggttgactat cagctagatc ttgtcttgaa    7200

acagacatcc tccatcccta tgatgcggtc cgaaatccaa cagctgaaaa catctgttgc    7260

agtcatggaa gccaacttgg gaatgatgaa gattctggat cccggttgtg ccaacatttc    7320

atctctgagt gatctacggg cagttgcccg atctcacccg gttttagttt caggccctgg    7380

agacccctct ccctatgtga cacaaggagg cgaaatggca cttaataaac tttcgcaacc    7440

agtgccacat ccatctgaat tgattaaacc cgccactgca tgcgggcctg atataggagt    7500

ggaaaaggac actgtccgtg cattgatcat gtcacgccca atgcacccga gttcttcagc    7560

caagctccta agcaagttag atgcagccgg gtcgatcgag gaaatcagga aaatcaagcg    7620

ccttgctcta aatggctaat tactactgcc acacgcagcg ggtccctgtc cactcggcat    7680

cacacggaat ctgcaccgag ttcccccccg cagacccaag gtccaactct gtttaaactt    7740

agaaaaaata cgggtagaag tgccgccacc atgaggagac tctccgccag ctcttgtgac    7800

cactacacca ctgactttgc cttccccaag gaactgtttg atggccagcg gctccaggag    7860

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ctcatgcatg aagactccac cctgaggacc tacttccaaa ggatctccct ctacctgcaa    8100

gacaggaacc acagcccgtg tgcctgggag atggtccgag cagaaatcgg gagatccttc    8160

ttctccttga ccatcttgca agaaagagta aggaggagga aatgagttta aacccaagcg    8220

gcaatcctct ctcgcttcct cagccccact gaatggacgc gtaaccgtaa ttaatctagc    8280

tacatttaag attaagaaaa aatacgggta gaattggagt gccccaattg tgccaagatg    8340

gactcatcta ggacaattgg gctgtacttt gattctgccc attcttctag caacctgtta    8400

gcatttccga tcgtcctaca aggcacagga gatgggaaga agcaaatcgc cccgcaatat    8460

aggatccagc gccttgactt gtggactgat agtaaggagg actcagtatt catcaccacc    8520

tatggattca tctttcaagt tgggaatgaa gaagccactg tcggcatgat cgatgataaa    8580

cccaagcgcg agttactttc cgctgcgatg ctctgcctag gaagcgtccc aaataccgga    8640

gaccttattg agctggcaag ggcctgtctc actatgatag tcacatgcaa gaagagtgca    8700

actaatactg agagaatggt tttctcagta gtgcaggcac cccaagtgct gcaaagctgt    8760

agggttgtgg caaacaaata ctcatcagtg aatgcagtca agcacgtgaa agcgccagag    8820

aagattcccg ggagtggaac cctagaatat aaggtgaact ttgtctcctt gactgtggta    8880

ccgaagaagg atgtctacaa gatcccagct gcagtattga aggtttctgg ctcgagtctg    8940

tacaatcttg cgctcaatgt cactattaat gtggaggttg acccgaggag tcctttggtt    9000

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atgaccaccg tagataggaa ggggaagaaa gtgacatttg acaagctgga aaagaaaata    9120

aggagccttg atctatctgt cgggctcagt gatgtgctcg ggccttccgt gttggtaaaa    9180

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aaaacacggg tagaagattc tggatcccgg ttggcgccct ccaggtgcaa gatgggctcc     9600

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acacaggtcg gttctgtgat agaagaactt gacacctcat actgtataga aactgactta    10620

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accaaactca aagaaatgtt tacagacact tctgtactgt acttgactcg tgctcaacaa  19980

aaattctaca tgaaaactat aggcaatgca gtcaacggat attacagtaa ctgtgactct  20040

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<210>9

<211>20651

<212>DNA

<213>人工

<400>9

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ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg    120

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caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa    2640

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    2700

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aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa    3240

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat    3300

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct    3360

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg    3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag    3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta    3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg    3600

ccattgctgc aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg    3660

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct    3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta    3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg    3840

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc    3900

cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg    3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga    4020

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg    4080

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat    4140

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc    4200

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca    4260

catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct    4320

ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtcttcaaga attctaggcg gctatatgcg    4380

ttggatgcaa tttctatgcg cacccgttct cggagcactg tccgaccgct ttggccgccg    4440

cccagtcctg ctcgcttcgc tacttggagc cactatcgag ctacgcgatc atggcgacca    4500

cacccgtcct gtggatcccc cgaagtctag aactagtgga tccccctgat acgactcact    4560

ataggaccaa acagagaatc cgtgagttac gataaaaggc gaaggagcaa ttgaagtcgc    4620

acgggtagaa ggtgtgactc tcgagtgcga gcccgaagca caaactcgag aaagccttct    4680

gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc    4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc    4800

actcttaaca gtgatgaccc agaagataga tggagctttg tggtattctg cctccggatt    4860

gctgttagcg aagatgccaa caaaccactc aggcaaggtg ctctcatatc tcttttatgc    4920

tcccactcac aggtaatgag gaaccatgtt gcccttgcag ggaaacagaa tgaagccaca    4980

ttggccgtgc ttgagattga tggctttgcc aacggcacgc cccagttcaa caataggagt    5040

ggagtgtctg aagagagagc acagagattt gcgatgatag caggatctct ccctcgggca    5100

tgcagcaacg gaaccccgtt cgtcacagcc ggggccgaag atgatgcacc agaagacatc    5160

accgataccc tggagaggat cctctctatc caggctcaag tatgggtcac agtagcaaaa    5220

gccatgactg cgtatgagac tgcagatgag tcggaaacaa ggcgaatcaa taagtatatg    5280

cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa    5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc    5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac    5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag    5520

acatcagccc ttgcacttag tagcctctca ggcgacatcc agaagatgaa gcagctcatg    5580

cgtttgtatc ggatgaaagg agataatgcg ccgtacatga cattacttgg tgatagtgac    5640

cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca    5700

tcagtcctag ataaaggtac tgggaaatac caatttgcca gggactttat gagcacatca    5760

ttctggagac ttggagtaga gtacgctcag gctcagggaa gtagcattaa cgaggatatg    5820

gctgccgagc taaagctaac cccagcagca aggaggggcc tggcagctgc tgcccaacgg    5880

gtctccgagg agaccagcag catagacatg cctactcaac aagtcggagt cctcactggg    5940

cttagcgagg gggggtccca agctctacaa ggcggatcga atagatcgca agggcaacca    6000

gaagccgggg atggggagac ccaattcctg gatctgatga gagcggtagc aaatagcatg    6060

agggaggcgc caaactctgc acagggcact ccccaatcgg ggcctccccc aactcctggg    6120

ccatcccaag ataacgacac cgactggggg tattgataaa caaaacccag cctgcttcca    6180

caaaaacatc ccaatgccct cacccgtagt cgacccctcg atttgcggct ctatatgacc    6240

acaccctcaa acaaacatcc ccctctttcc tccctccccc tgctgtacaa ctccgcacgc    6300

cctagatacc acaggcacaa tgcggctcac taacaatcaa aacagagccg agggaattag    6360

aaaaaagtac gggtagaaga gggatattca gagatcaggg caagtctccc gagtctctgc    6420

tctctcctct acctgataga ccaggacaaa catggccacc tttacggatg cagagatcga    6480

cgagctattt gagacaagtg gaactgtcat tgacaacata attacagccc agggtaaacc    6540

agcagagact gttggaagga gtgcaatccc acaaggcaag accaaggtgc tgagcgcagc    6600

atgggagaag catgggagca tccagccacc ggccagtcaa gacaaccccg atcgacagga    6660

cagatctgac aaacaaccat ccacacccga gcaaacgacc ccgcatgaca gcccgccggc    6720

cacatccgcc gaccagcccc ccacccaggc cacagacgaa gccgtcgaca cacagctcag    6780

gaccggagca agcaactctc tgctgttgat gcttgacaag ctcagcaata aatcgtccaa    6840

tgctaaaaag ggcccatggt cgagccccca agaggggaat caccaacgtc cgactcaaca    6900

gcaggggagt caacccagtc gcggaaacag tcaggaaaga ccgcagaacc aagtcaaggc    6960

cgcccctgga aaccagggca cagacgtgaa cacagcatat catggacaat gggaggagtc    7020

acaactatca gctggtgcaa cccctcatgc tctccgatca aggcagagcc aagacaatac    7080

ccttgtatct gcggatcatg tccagccacc tgtagacttt gtgcaagcga tgatgtctat    7140

gatggaggcg atatcacaga gagtaagtaa ggttgactat cagctagatc ttgtcttgaa    7200

acagacatcc tccatcccta tgatgcggtc cgaaatccaa cagctgaaaa catctgttgc    7260

agtcatggaa gccaacttgg gaatgatgaa gattctggat cccggttgtg ccaacatttc    7320

atctctgagt gatctacggg cagttgcccg atctcacccg gttttagttt caggccctgg    7380

agacccctct ccctatgtga cacaaggagg cgaaatggca cttaataaac tttcgcaacc    7440

agtgccacat ccatctgaat tgattaaacc cgccactgca tgcgggcctg atataggagt    7500

ggaaaaggac actgtccgtg cattgatcat gtcacgccca atgcacccga gttcttcagc    7560

caagctccta agcaagttag atgcagccgg gtcgatcgag gaaatcagga aaatcaagcg    7620

ccttgctcta aatggctaat tactactgcc acacgcagcg ggtccctgtc cactcggcat    7680

cacacggaat ctgcaccgag ttcccccccg cagacccaag gtccaactct gtttaaactt    7740

agaaaaaata cgggtagaag cgccaccatg gtaataggtg agactcttcc cattttcatc    7800

atgaccagta gatgcatcct ccaaacaact ctcctgttgt atttctccac catggctctt    7860

gccatgagca acgacttgct tcgatcccag ctaagcagca gcagtttgga gtgtcaggag    7920

ctcctattac agttgaatgg aaccactgaa tattgcctca aggacaggat aaacttcgag    7980

atccctgagg aaatcgagaa atcacgccag ttccagaagg aggacatcat attgatcacc    8040

catgagatgt tccagaagat ctttgatatt ttcaggagaa atatctctag aacaggatgg    8100

aatgagacca ctgtcgagaa ccttcttgtg aagctccact ggcagaagga acatctggag    8160

ataatcctgg aggacgtcaa agagaaggaa aacttcacct gggacaacag gactcttctg    8220

cacctgaaga aatattactt aaggattgtg cagtacctga aggccaagga gtacagcatc    8280

tgtgcctgga caatagtcca agcagaaatc tgcaggaact ttttcttcct taatatactt    8340

acagattatc tccagaactg agtttaaacc caagcggcaa tcctctctcg cttcctcagc    8400

cccactgaat ggacgcgtaa ccgtaattaa tctagctaca tttaagatta agaaaaaata    8460

cgggtagaat tggagtgccc caattgtgcc aagatggact catctaggac aattgggctg    8520

tactttgatt ctgcccattc ttctagcaac ctgttagcat ttccgatcgt cctacaaggc    8580

acaggagatg ggaagaagca aatcgccccg caatatagga tccagcgcct tgacttgtgg    8640

actgatagta aggaggactc agtattcatc accacctatg gattcatctt tcaagttggg    8700

aatgaagaag ccactgtcgg catgatcgat gataaaccca agcgcgagtt actttccgct    8760

gcgatgctct gcctaggaag cgtcccaaat accggagacc ttattgagct ggcaagggcc    8820

tgtctcacta tgatagtcac atgcaagaag agtgcaacta atactgagag aatggttttc    8880

tcagtagtgc aggcacccca agtgctgcaa agctgtaggg ttgtggcaaa caaatactca    8940

tcagtgaatg cagtcaagca cgtgaaagcg ccagagaaga ttcccgggag tggaacccta    9000

gaatataagg tgaactttgt ctccttgact gtggtaccga agaaggatgt ctacaagatc    9060

ccagctgcag tattgaaggt ttctggctcg agtctgtaca atcttgcgct caatgtcact    9120

attaatgtgg aggttgaccc gaggagtcct ttggttaaat ctctgtctaa gtctgacagc    9180

ggatactatg ctaacctctt cttgcatatt ggacttatga ccaccgtaga taggaagggg    9240

aagaaagtga catttgacaa gctggaaaag aaaataagga gccttgatct atctgtcggg    9300

ctcagtgatg tgctcgggcc ttccgtgttg gtaaaagcaa gaggtgcacg gactaagctt    9360

ttggcacctt tcttctctag cagtgggaca gcctgctatc ccatagcaaa tgcttctcct     9420

caggtggcca agatactctg gagtcaaacc gcgtgcctgc ggagcgttaa aatcattatc     9480

caagcaggta cccaacgcgc tgtcgcagtg accgccgacc acgaggttac ctctactaag     9540

ctggagaagg ggcacaccct tgccaaatac aatcctttta agaaataagc tgcgtctctg     9600

agattgcgct ccgcccactc acccagatca tcatgacaca aaaaactaat ctgtcttgat     9660

tatttacagt tagtttacct gcctatcaag ttagaaaaaa cacgggtaga agattctgga     9720

tcccggttgg cgccctccag gtgcaagatg ggctccagac cttctaccaa gaacccagca     9780

cctatgatgc tgactatccg ggttgcgctg gtactgagtt gcatctgtcc ggcaaactcc     9840

attgatggca ggcctcttgc agctgcagga attgtggtta caggagacaa agccgtcaac     9900

atatacacct catcccagac aggatcaatc atagttaagc tcctcccgaa tctgcccaag     9960

gataaggagg catgtgcgaa agcccccttg gatgcataca acaggacatt gaccactttg    10020

ctcacccccc ttggtgactc tatccgtagg atacaagagt ctgtgactac atctggaggg    10080

gggagacagg ggcgccttat aggcgccatt attggcggtg tggctcttgg ggttgcaact    10140

gccgcacaaa taacagcggc cgcagctctg atacaagcca aacaaaatgc tgccaacatc    10200

ctccgactta aagagagcat tgccgcaacc aatgaggctg tgcatgaggt cactgacgga    10260

ttatcgcaac tagcagtggc agttgggaag atgcagcagt ttgttaatga ccaacttaat    10320

aaaacagctc aggaattaga ctgcatcaaa attgcacagc aagttggtgt agagctcaac    10380

ctgtacctaa ccgaattgac tacagtattc ggaccacaaa tcacttcacc tgctttaaac    10440

aagctgacta ttcaggcact ttacaatcta gctggtggaa atatggatta cttattgact    10500

aagttaggtg tagggaacaa tcaactcagc tcattaatcg gtagcggctt aatcaccggt    10560

aaccctattc tatacgactc acagactcaa ctcttgggta tacgggtaac tctaccttca    10620

gtcgggaacc taaataatat gcgtgccacc tacttggaaa ccttatccgt aagcacaacc    10680

aggggatttg cctcggcact tgtccccaaa gtggtgacac aggtcggttc tgtgatagaa    10740

gaacttgaca cctcatactg tatagaaact gacttagatt tatattgtac aagaatagta    10800

acgttcccta tgtcccctgg tatttattcc tgcttgagcg gcaatacgtc ggcctgtatg    10860

tactcaaaga ccgaaggcgc acttactaca ccatacatga ctatcaaagg ttcagtcatc    10920

gccaactgca agatgacaac atgtagatgt gtaaaccccc cgggtatcat atcgcaaaac    10980

tatggagaag ccgtgtctct aatagataaa caatcatgca atgttttatc cttaggcggg    11040

ataactttaa ggctcagtgg ggaattcgat gtaacttatc agaagaatat ctcaatacaa    11100

gattctcaag taataataac aggcaatctt gatatctcaa ctgagcttgg gaatgtcaac    11160

aactcgatca gtaatgcttt gaataagtta gaggaaagca acagaaaact agacaaagtc    11220

aatgtcaaac tgactagcac atctgctctc attacctata tcgttttgac tatcatatct    11280

cttgtttttg gtatacttag cctgattcta gcatgctacc taatgtacaa gcaaaaggcg    11340

caacaaaaga ccttattatg gcttgggaat aatactctag accagatgag agccactaca    11400

aaaatgtgaa cacagatgag gaacgaaggt ttccctaata gtaatttgtg tgaaagttct    11460

ggtagtctgt cagttcagag ggttaagaaa aaactaccgg ttgtagatga ccaaaggacg    11520

atatacgggt agaacggtaa gagaggccgc ccctcaattg cgagccaggc ttcacaacct    11580

ccgttctacc gcttcaccga caacggtcct caatcatgga ccgcgccgtt agccaagttg    11640

cgttagagaa tgatgaaaga gaggcaaaaa atacatggcg cttgatattc cggattgcaa    11700

tcttattctt aacagtagtg accttggcta tatctgtagc ctccctttta tatagcatgg    11760

gggctagcac acctagcgat cttgtaggca taccgactag gaattccagg gcagaagaaa    11820

agattacatc tacacttggt tccaatcaag atgtagtaga taggatatat aagcaagtgg    11880

cccttgagtc tccgttggca ttgttaaaaa ctgagaccac aattatgaac gcaataacat    11940

ctctctctta tcagattaat ggagctgcaa acaacagtgg gtggggggca cttatccatg    12000

acccagatta tatagggggg ataggcaaag aactcattgt agatgatgct agtgatgtca    12060

catcattcta tccctctgca tttcaagaac atctgaattt tatcccggcg cctactacag    12120

gatcaggttg cactcgaata ccctcatttg acatgagtgc tacccattac tgctacaccc    12180

ataatgtaat attgtctgga tgcagagatc actcacattc atatcagtat ttagcacttg    12240

gtgtgctccg gacatctgca acagggaggg tattcttttc tactctgcgt tccatcaacc    12300

tggacgacac ccaaaatcgg aagtcttgca gtgtgagtgc aactcccctg ggttgtgata    12360

tgctgtgctc gaaagtcacg gagacagagg aagaagatta taactcagct gtccctacgc    12420

ggatggtaca tgggaggtta gggttcgacg gccagtacca cgaaaaggac ctagatgtca    12480

caacattatt cggggactgg gtggccaact acccaggagt agggggtgga tcttttattg    12540

acagccgcgt atggttctca gtctacggag ggttaaaacc caattcaccc agtgacactg    12600

tacaggaagg gaaatatgtg atatacaagc gatacaatga cacatgccca gatgagcaag    12660

actaccagat tcgaatggcc aggtcttcgt ataagcctgg acggtttggt gggaaacgca    12720

tacagcaggc tatcttatct atcaaggtgt caacatcctt aggcgaagac ccggtactga    12780

ctgtaccgcc caacacagtc acactcatgg gggccgaagg cagaattctc acagtaggga    12840

catctcattt cttgtatcaa cgagggtcat catacttctc tcccgcgtta ttatatccta    12900

tgacagtcag caacaaaaca gccactcttc atagtcctta tacattcaat gccttcactc    12960

ggccaggtag tatcccttgc caggcttcag caagatgccc caacccgtgt gttactggag    13020

tctatacaga tccacatccc ctaatcttct atagaaacca caccttgcga ggggtattcg    13080

ggacaatgct tgatggtgta caagcaagac ttaaccctgc gtctgcagta ttcgatagca    13140

catcccgcag tcgcattact cgagtgagtt caagcagtac caaagcagca tacacaacat    13200

caacttgttt taaagtggtc aagactaata agacctattg tctcagcatt gctgaaatat    13260

ctaatactct cttcggagaa ttcagaatcg tcccgttact agttgagatc ctcaaagatg    13320

acggggttag agaagccagg tctggctagt tgagtcaatt ataaaggagt tggaaagatg    13380

gcattgtatc acctatcttc tgcgacatca agaatcaaac cgaatgccgg cgcgtgctcg    13440

aattccatgt tgccagttga ccacaatcag ccagtgctca tgcgatcaga ttaagccttg    13500

tcaatagtct cttgattaag aaaaaatgta agtggcaatg agatacaagg caaaacagct    13560

catggtaaat aatacgggta gaacatggcg agctccggtc ctgaaagggc agagcatcag    13620

attatcctac cagagtcaca cctgtcttca ccattggtca agcacaaact actctattac    13680

tggaaattaa ctgggctacc gcttcctgat gaatgtgact tcgaccacct cattctcagc    13740

cgacaatgga aaaaaatact tgaatcggcc tctcctgata ctgagagaat gataaaactc    13800

ggaagggcag tacaccaaac tcttaaccac aattccagaa taaccggagt gctccacccc    13860

aggtgtttag aagaactggc taatattgag gtcccagatt caaccaacaa atttcggaag    13920

attgagaaga agatccaaat tcacaacacg agatatggag aactgttcac aaggctgtgt    13980

acgcatatag agaagaaact gctggggtca tcttggtcta acaatgtccc ccggtcagag    14040

gagttcagca gcatccgtac ggacccggca ttctggtttc actcaaaatg gtccacagcc    14100

aagtttgcat ggctccatat aaaacagatc cagaggcatc tgatggtggc agctaggaca    14160

aggtctgcgg ccaacaaatt ggtgatgcta acccataagg taggccaagt ctttgtcact    14220

cctgaacttg tcgttgtgac gcatacgaat gagaacaagt tcacatgtct tacccaggaa    14280

cttgtattga tgtatgcaga tatgatggag ggcagagata tggtcaacat aatatcaacc    14340

acggcggtgc atctcagaag cttatcagag aaaattgatg acattttgcg gttaatagac    14400

gctctggcaa aagacttggg taatcaagtc tacgatgttg tatcactaat ggagggattt    14460

gcatacggag ctgtccagct actcgagccg tcaggtacat ttgcaggaga tttcttcgca    14520

ttcaacctgc aggagcttaa agacattcta attggcctcc tccccaatga tatagcagaa    14580

tccgtgactc atgcaatcgc tactgtattc tctggtttag aacagaatca agcagctgag    14640

atgttgtgtc tgttgcgtct gtggggtcac ccactgcttg agtcccgtat tgccgcaaag    14700

gcagtcagga gccaaatgtg cgcaccgaaa atggtagact ttgatatgat ccttcaggta    14760

ctgtctttct tcaagggaac aatcatcaac gggtacagaa agaagaatgc aggtgtgtgg    14820

ccgcgagtca aagtggatac aatatatggg aaggtcattg ggcaactaca tgcagattca    14880

gcagagattt cacacgatat catgttgaga gagtataaga gtttatctgc acttgaattt    14940

gagccatgta tagaatatga ccctgtcacc aacctgagca tgttcctaaa agacaaggca    15000

atcgcacacc ccaacgataa ttggcttgcc tcgtttaggc ggaaccttct ctccgaagac    15060

cagaagaaac atgtaaaaga agcaacttcg actaatcgcc tcttgataga gtttttagag    15120

tcaaatgatt ttgatccata taaagagatg gaatatctga cgacccttga gtaccttaga    15180

gatgacaatg tggcagtatc atactcgctc aaggagaagg aagtgaaagt taatggacgg    15240

atcttcgcta agctgacaaa gaagttaagg aactgtcagg tgatggcgga agggatccta    15300

gccgatcaga ttgcaccttt ctttcaggga aatggagtca ttcaggatag catatccttg    15360

accaagagta tgctagcgat gagtcaactg tcttttaaca gcaataagaa acgtatcact    15420

gactgtaaag aaagagtatc ttcaaaccgc aatcatgatc cgaaaagcaa gaaccgtcgg    15480

agagttgcaa ccttcataac aactgacctg caaaagtact gtcttaattg gagatatcag    15540

acaatcaaat tgttcgctca tgccatcaat cagttgatgg gcctacctca cttcttcgaa    15600

tggattcacc taagactgat ggacactacg atgttcgtag gagacccttt caatcctcca    15660

agtgacccta ctgactgtga cctctcaaga gtccctaatg atgacatata tattgtcagt    15720

gccagagggg gtatcgaagg attatgccag aagctatgga caatgatctc aattgctgca    15780

atccaacttg ctgcagctag atcgcattgt cgtgttgcct gtatggtaca gggtgataat    15840

caagtaatag cagtaacgag agaggtaaga tcagacgact ctccggagat ggtgttgaca    15900

cagttgcatc aagccagtga taatttcttc aaggaattaa ttcatgtcaa tcatttgatt    15960

ggccataatt tgaaggatcg tgaaaccatc aggtcagaca cattcttcat atacagcaaa    16020

cgaatcttca aagatggagc aatcctcagt caagtcctca aaaattcatc taaattagtg    16080

ctagtgtcag gtgatctcag tgaaaacacc gtaatgtcct gtgccaacat tgcctctact    16140

gtagcacggc tatgcgagaa cgggcttccc aaagacttct gttactattt aaactatata    16200

atgagttgtg tgcagacata ctttgactct gagttctcca tcaccaacaa ttcgcacccc    16260

gatcttaatc agtcgtggat tgaggacatc tcttttgtgc actcatatgt tctgactcct    16320

gcccaattag ggggactgag taaccttcaa tactcaaggc tctacactag aaatatcggt    16380

gacccgggga ctactgcttt tgcagagatc cagcgactag aagcagtggg attactgagt    16440

cctaacatta tgactaatat cttaactagg ccgcctggga atggagattg ggccagtctg    16500

tgcaacgacc catactcttt caattttgag actgttgcaa gcccaaatat tgttcttaag    16560

aaacatacgc gaagagtcct atttgaaact tgttcaaatc ccttattgtc tggagtgcac    16620

acagaggata atgaggcaga agagaaggca ttggctgaat tcttgcttaa tcaagaggtg    16680

attcatcccc gcgttgcgca tgccatcatg gaggcaagct ctgtaggtag gagaaagcaa    16740

attcaagggc ttgttgacac aacaaacacc gtaattaaga ttgcgcttac taggaggcca    16800

ttaggcataa agaggctgat gcggatagtc aattattcta gcatgcatgc aatgctgttt    16860

agagacgatg ttttttcctc cagtagatcc aaccacccct tagtctcttc taatatgtgt    16920

tctctgacac tggcagacta tgcacggaat agaagctggt cacctttgac gggaggcagg    16980

aaaatactgg gtgtatctaa tcctgatacg atagaactcg tagagggtga gattcttagt    17040

gtaagcggag ggtgtacaag atgtgacagc ggagatgaac aatttacttg gttccatctt    17100

ccaagcaata tagaattgac cgatgacacc agcaagaatc ctccgatgag ggtaccatat    17160

ctcgggtcga agacacagga gaggagagct gcctcacttg caaaaatagc tcatatgtcg    17220

ccacatgtaa aggctgccct aagggcatca tccgtgttga tctgggctta tggggataat    17280

gacgtaaatt ggactgctgc tcttacgatt gcaaaatctc ggtgtaatgt aaacttagag    17340

tatcttcggt tactgtcccc tttacccacg gctgggaatc ttcaacatag actagatgat    17400

ggtataactc agatgacatt cacccctgca tctctctaca ggtgtcacct tacattcaca    17460

tatccaatga ttctcaaagg ctgttcactg aagaaggagt caaagagggg aatgtggttt    17520

accaacagag tcatgctctt gggtttatct ctaatcgaat cgatatttcc aatgacagca    17580

accaggacat atgatgagat cacactgcac ctacatagta aatttagttg ctgtatcaga    17640

gaagcacctg ttgcggttcc tttcgagcta cttggggtgg taccggaact gaggacagtg    17700

acctcaaata agtttatgta tgatcctagc cctggatcgg agggagactt tgcgagactt    17760

gacttagcta tcttcaagag ttatgagctt aatctggagt catatcccac gatagagcta    17820

atgaacattc tttcaatatc cagcgggaag ttgattggcc agtctgtggt ttcttatgat    17880

gaagatacct ccataaagaa tgacgccata atagtgtacg acaatacccg aaattggatc    17940

agtgaagctc agaattcaga tgtggtccgc ctatttgaat atgcagcact tgaagtgctc    18000

ctcaactgtt cttaccaact ctattacctg agagtaagag gcctagacaa tattgtctta    18060

tatatgggtg atttatacaa gaatatgcca ggaattctac tttccaacat tgcagctaca    18120

atatctcatc ccgtcattca ttcaaggtta catgcagtgg gcctggtcaa ccatgacgga    18180

tcacaccaac ttgcagatac ggattttatc gaaatgtctg caaaactatt agtatcttgc    18240

acccgacgtg tgatctccgg cttatattca ggaaataagt atgatctgct gttcccatct    18300

gtcttagatg ataacctgaa tgagaagatg cttcagctga tatcccggtt atgctgtctg    18360

tacacggtac tctttgctac aacaagagaa atcccgaaaa taagaggctt aactacaaaa    18420

gagaaatgtt caatacccac tgagtattta ctgtcggatg ctgtgaaacc attacttagc    18480

cccgatcaag tgagctctat catgtctcct aacataatta cattcccagc taatccgtac    18540

tacatgtctc ggaagagcct caatttgatc agggaaaggg aggacaggga tactatcctg    18600

gtgttgttgt tcccccaaga gccattatta gagttccctt ctgtgcaaga tattggtgct    18660

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gctccagcaa ggtatgacgc attcacactt agtcagattc atcctgaact cacatctcca    18780

aatccggagg aagactactt agtacgatac ttgttcagag ggatagggac tgcatcttcc    18840

tcttggtata aggcatctca tctcctttct gtacccgagg taagatgtgc aagacacggg    18900

aactccttat acttagctga agggagcgga gccatcatga gtcttctcga actgcatgta    18960

ccacatgaaa ctatctatta caatacgctc ttttcaaatg agatgaaccc cccgcaatga    19020

catttcgggc cgaccccaac tcagtttttg aattcggttg tttataggaa tctacaggcg    19080

gaggtaacat gcaaagatgg atttgtccaa gagttccgtc cattatggag agaaaataca    19140

gaggaaagtg acctgacctc agataaagca gtggggtata ttacatctgc agtgccctac    19200

agatctgtat cattgctgca ttgtgacatt gaaactcctc cagggtccaa tcaaagctta    19260

ctagatcaac tagctatcaa tttatctctg attgccatgc attctgtaag ggagggcggg    19320

gtagtaatca tcaaagtgtt gtatgcaatg ggatactact ttcatctact catgaacttg    19380

tttgctccgt gttccacaaa aggatatatt ctctctaatg gttatgcatg tcgaggagat    19440

atggagtgtt acctggtatt tgtcatgggt tacctgggcg ggcctacatt tgtacatgag    19500

gtggtgagga tggcaaaaac tctggtgcag cggcacggta cgctcttgtc taaatcagat    19560

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agtcctttac caagattaat aaagtacttg aggaagaata ttgacactgc gctgattgaa    19680

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ataactcaga taacccagat tatcgctagt cacattgaca cagttatccg gtctgtgata    19800

tatatggaag ctgagggtga tctcgctgac acagtatttc tatttacccc ttacaatctc  19860

tctactgacg ggaaaaagag gacatcactt aaacagtgca cgagacagat cctagaggtt  19920

acaatactag gtcttagagt cgaaaatctc aataaaatag gcgatataat cagtctagag  19980

cttaaaggca tgatctccat ggaggacctt atcccactaa ggacatactt gaagcatagt  20040

acctgcccta aatatttgaa ggctgtccta ggtattacca aactcaaaga aatgtttaca  20100

gacacttctg tactgtactt gactcgtgct caacaaaaat tctacatgaa aactataggc  20160

aatgcagtca acggatatta cagtaactgt gactcttaac gaaaatcaca tattaatagg  20220

ctcctttttt ggccaattgt attcttgttg atttaatcat attatgttag aaaaaagttg  20280

aaccctgact ccttaggact cgaattcgaa ctcaaataaa tgtcttaaaa aaaggttgcg  20340

cacaattatt cttgagtgta gtctcgtcat tcaccaaatc tttgtttggt gggtcggcat  20400

ggcatctcca cctcctcgcg gtccgacctg ggcatccgaa ggaggacgtc gtccactcgg  20460

atggctaagg gaggggcccc cgcggggctg ctaacaaagc ccgaaaggaa gctgagttgg  20520

ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga  20580

ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccggatcgag acctcgatac tagtgcggtg  20640

gagctgaatt c                                                       20651

<210>10

<211>20558

<212>DNA

<213>人工

<400>10

ttctcatgtt tgacagctta tcatcgataa gctttaatgc ggtagtttat cacagttaaa     60

ttgctaacgc agtcaggcac cgtgtatgaa atctaacaat gcgctcatcg tcatcctcgg    120

caccgtcacc ctggatgctg taggcatagg cttggttatg ccggtactgc cgggcctctt    180

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caacctacta ctgggctgct tcctaatgca ggagtcgcat aagggagagc gtcgaccgat    660

gcccttgaga gccttcaacc cagtcagctc cttccggtgg gcgcggggca tgactatcgt    720

cgccgcactt atgactgtct tctttatcat gcaactcgta ggacaggtgc cggcagcgct    780

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cttgctggcg ttcgcgacgc gaggctggat ggccttcccc attatgattc ttctcgcttc   1020

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gctgatcgtc acggcgattt atgccgcctc ggcgagcaca tggaacgggt tggcatggat   1200

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attggagcca atcaattctt gcggagaact gtgaatgcgc aaaccaaccc ttggcagaac   1380

atatccatcg cgtccgccat ctccagcagc cgcacgcggc gcatctcggg cagcgttggg   1440

tcctggccac gggtgcgcat gatcgtgctc ctgtcgttga ggacccggct aggctggcgg   1500

ggttgcctta ctggttagca gaatgaatca ccgatacgcg agcgaacgtg aagcgactgc   1560

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ggatgctgct ggctaccctg tggaacacct acatctgtat taacgaagcg ctggcattga   1740

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cgttccagta accgggcatg ttcatcatca gtaacccgta tcgtgagcat cctctctcgt   1860

ttcatcggta tcattacccc catgaacaga aatccccctt acacggaggc atcagtgacc   1920

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ctggagaaac tcaacgagct ggacgcggat gaacaggcag acatctgtga atcgcttcac   2040

gaccacgctg atgagcttta ccgcagctgc ctcgcgcgtt tcggtgatga cggtgaaaac   2100

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gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc    2700

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cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct    2940

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc    3000

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg    3060

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc    3120

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt    3180

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa    3240

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat    3300

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct    3360

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg    3420

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag    3480

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta    3540

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg    3600

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gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct    3720

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta    3780

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg    3840

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cggcgtcaac acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg    3960

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga    4020

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gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc    4200

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gccaacatgt cttccgtatt tgatgagtac gaacagctcc tcgcggctca gactcgcccc    4740

aatggagctc atggaggggg agaaaaaggg agtaccttaa aagtagacgt cccggtattc    4800

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cagcaaggca gggtccaaaa gaaatacatc ctctaccccg tatgcaggag cacaatccaa    5340

ctcacgatca gacagtctct tgcagtccgc atctttttgg ttagcgagct caagagaggc    5400

cgcaacacgg caggtggtac ctctacttat tataacctgg taggggacgt agactcatac    5460

atcaggaata ccgggcttac tgcattcttc ttgacactca agtacggaat caacaccaag    5520

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cagatgagct ttgcgcctgc cgagtatgca caactttact cctttgccat gggtatggca    5700

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caagctccta agcaagttag atgcagccgg gtcgatcgag gaaatcagga aaatcaagcg    7620

ccttgctcta aatggctaat tactactgcc acacgcagcg ggtccctgtc cactcggcat    7680

cacacggaat ctgcaccgag ttcccccccg cagacccaag gtccaactct gtttaaactt    7740

agaaaaaata cgggtagaag tgccaccatg aattatacaa gctatatctt agcatttcag    7800

ctttgcgtga ttttgtgttc ttctggctgt aactgtcagg ccatgttttt taaagaaata    7860

gaaaacctaa aggaatattt taatgcaagt aatccagatg tatcggacgg tgggtctctt    7920

ttcgtagata ttttgaagaa atggagagag gagagtgaca aaacaatcat tcagagccaa    7980

attgtctctt tctacttgaa actgtttgac aactttaaag ataaccagat cattcaaagg    8040

agcatggata ccatcaagga agacatgctt ggcaagttct taaatagcag caccagtaag    8100

agggaggact tccttaagct gattcaaatt cctgtgaacg atctgcaggt ccagcgcaag    8160

gcgataaatg aactcatcaa agtgatgaat gatctctcac caagatccaa cctaaggaag    8220

cggaaaagga gtcagaatct gtttcgaggc cgcagagcat cgaaataagt ttaaacccaa    8280

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tataggatcc agcgccttga cttgtggact gatagtaagg aggactcagt attcatcacc    8580

acctatggat tcatctttca agttgggaat gaagaagcca ctgtcggcat gatcgatgat    8640

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gcaactaata ctgagagaat ggttttctca gtagtgcagg caccccaagt gctgcaaagc    8820

tgtagggttg tggcaaacaa atactcatca gtgaatgcag tcaagcacgt gaaagcgcca    8880

gagaagattc ccgggagtgg aaccctagaa tataaggtga actttgtctc cttgactgtg    8940

gtaccgaaga aggatgtcta caagatccca gctgcagtat tgaaggtttc tggctcgagt    9000

ctgtacaatc ttgcgctcaa tgtcactatt aatgtggagg ttgacccgag gagtcctttg    9060

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cttatgacca ccgtagatag gaaggggaag aaagtgacat ttgacaagct ggaaaagaaa    9180

ataaggagcc ttgatctatc tgtcgggctc agtgatgtgc tcgggccttc cgtgttggta     9240

aaagcaagag gtgcacggac taagcttttg gcacctttct tctctagcag tgggacagcc     9300

tgctatccca tagcaaatgc ttctcctcag gtggccaaga tactctggag tcaaaccgcg     9360

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ccttttaaga aataagctgc gtctctgaga ttgcgctccg cccactcacc cagatcatca     9540

tgacacaaaa aactaatctg tcttgattat ttacagttag tttacctgcc tatcaagtta     9600

gaaaaaacac gggtagaaga ttctggatcc cggttggcgc cctccaggtg caagatgggc     9660

tccagacctt ctaccaagaa cccagcacct atgatgctga ctatccgggt tgcgctggta     9720

ctgagttgca tctgtccggc aaactccatt gatggcaggc ctcttgcagc tgcaggaatt     9780

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gttaagctcc tcccgaatct gcccaaggat aaggaggcat gtgcgaaagc ccccttggat     9900

gcatacaaca ggacattgac cactttgctc accccccttg gtgactctat ccgtaggata     9960

caagagtctg tgactacatc tggagggggg agacaggggc gccttatagg cgccattatt    10020

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caagccaaac aaaatgctgc caacatcctc cgacttaaag agagcattgc cgcaaccaat    10140

gaggctgtgc atgaggtcac tgacggatta tcgcaactag cagtggcagt tgggaagatg    10200

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ccacaaatca cttcacctgc tttaaacaag ctgactattc aggcacttta caatctagct    10380

ggtggaaata tggattactt attgactaag ttaggtgtag ggaacaatca actcagctca    10440

ttaatcggta gcggcttaat caccggtaac cctattctat acgactcaca gactcaactc    10500

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ttggaaacct tatccgtaag cacaaccagg ggatttgcct cggcacttgt ccccaaagtg    10620

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tcatgcaatg ttttatcctt aggcgggata actttaaggc tcagtgggga attcgatgta    10980

acttatcaga agaatatctc aatacaagat tctcaagtaa taataacagg caatcttgat    11040

atctcaactg agcttgggaa tgtcaacaac tcgatcagta atgctttgaa taagttagag    11100

gaaagcaaca gaaaactaga caaagtcaat gtcaaactga ctagcacatc tgctctcatt    11160

acctatatcg ttttgactat catatctctt gtttttggta tacttagcct gattctagca    11220

tgctacctaa tgtacaagca aaaggcgcaa caaaagacct tattatggct tgggaataat    11280

actctagacc agatgagagc cactacaaaa atgtgaacac agatgaggaa cgaaggtttc    11340

cctaatagta atttgtgtga aagttctggt agtctgtcag ttcagagggt taagaaaaaa    11400

ctaccggttg tagatgacca aaggacgata tacgggtaga acggtaagag aggccgcccc    11460

tcaattgcga gccaggcttc acaacctccg ttctaccgct tcaccgacaa cggtcctcaa    11520

tcatggaccg cgccgttagc caagttgcgt tagagaatga tgaaagagag gcaaaaaata    11580

catggcgctt gatattccgg attgcaatct tattcttaac agtagtgacc ttggctatat    11640

ctgtagcctc ccttttatat agcatggggg ctagcacacc tagcgatctt gtaggcatac    11700

cgactaggaa ttccagggca gaagaaaaga ttacatctac acttggttcc aatcaagatg    11760

tagtagatag gatatataag caagtggccc ttgagtctcc gttggcattg ttaaaaactg    11820

agaccacaat tatgaacgca ataacatctc tctcttatca gattaatgga gctgcaaaca    11880

acagtgggtg gggggcactt atccatgacc cagattatat aggggggata ggcaaagaac    11940

tcattgtaga tgatgctagt gatgtcacat cattctatcc ctctgcattt caagaacatc    12000

tgaattttat cccggcgcct actacaggat caggttgcac tcgaataccc tcatttgaca    12060

tgagtgctac ccattactgc tacacccata atgtaatatt gtctggatgc agagatcact    12120

cacattcata tcagtattta gcacttggtg tgctccggac atctgcaaca gggagggtat    12180

tcttttctac tctgcgttcc atcaacctgg acgacaccca aaatcggaag tcttgcagtg    12240

tgagtgcaac tcccctgggt tgtgatatgc tgtgctcgaa agtcacggag acagaggaag    12300

aagattataa ctcagctgtc cctacgcgga tggtacatgg gaggttaggg ttcgacggcc    12360

agtaccacga aaaggaccta gatgtcacaa cattattcgg ggactgggtg gccaactacc    12420

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taaaacccaa ttcacccagt gacactgtac aggaagggaa atatgtgata tacaagcgat    12540

acaatgacac atgcccagat gagcaagact accagattcg aatggccagg tcttcgtata    12600

agcctggacg gtttggtggg aaacgcatac agcaggctat cttatctatc aaggtgtcaa    12660

catccttagg cgaagacccg gtactgactg taccgcccaa cacagtcaca ctcatggggg    12720

ccgaaggcag aattctcaca gtagggacat ctcatttctt gtatcaacga gggtcatcat    12780

acttctctcc cgcgttatta tatcctatga cagtcagcaa caaaacagcc actcttcata    12840

gtccttatac attcaatgcc ttcactcggc caggtagtat cccttgccag gcttcagcaa    12900

gatgccccaa cccgtgtgtt actggagtct atacagatcc acatccccta atcttctata    12960

gaaaccacac cttgcgaggg gtattcggga caatgcttga tggtgtacaa gcaagactta    13020

accctgcgtc tgcagtattc gatagcacat cccgcagtcg cattactcga gtgagttcaa    13080

gcagtaccaa agcagcatac acaacatcaa cttgttttaa agtggtcaag actaataaga    13140

cctattgtct cagcattgct gaaatatcta atactctctt cggagaattc agaatcgtcc    13200

cgttactagt tgagatcctc aaagatgacg gggttagaga agccaggtct ggctagttga    13260

gtcaattata aaggagttgg aaagatggca ttgtatcacc tatcttctgc gacatcaaga    13320

atcaaaccga atgccggcgc gtgctcgaat tccatgttgc cagttgacca caatcagcca    13380

gtgctcatgc gatcagatta agccttgtca atagtctctt gattaagaaa aaatgtaagt    13440

ggcaatgaga tacaaggcaa aacagctcat ggtaaataat acgggtagaa catggcgagc    13500

tccggtcctg aaagggcaga gcatcagatt atcctaccag agtcacacct gtcttcacca    13560

ttggtcaagc acaaactact ctattactgg aaattaactg ggctaccgct tcctgatgaa    13620

tgtgacttcg accacctcat tctcagccga caatggaaaa aaatacttga atcggcctct    13680

cctgatactg agagaatgat aaaactcgga agggcagtac accaaactct taaccacaat    13740

tccagaataa ccggagtgct ccaccccagg tgtttagaag aactggctaa tattgaggtc    13800

ccagattcaa ccaacaaatt tcggaagatt gagaagaaga tccaaattca caacacgaga    13860

tatggagaac tgttcacaag gctgtgtacg catatagaga agaaactgct ggggtcatct    13920

tggtctaaca atgtcccccg gtcagaggag ttcagcagca tccgtacgga cccggcattc    13980

tggtttcact caaaatggtc cacagccaag tttgcatggc tccatataaa acagatccag    14040

aggcatctga tggtggcagc taggacaagg tctgcggcca acaaattggt gatgctaacc    14100

cataaggtag gccaagtctt tgtcactcct gaacttgtcg ttgtgacgca tacgaatgag    14160

aacaagttca catgtcttac ccaggaactt gtattgatgt atgcagatat gatggagggc    14220

agagatatgg tcaacataat atcaaccacg gcggtgcatc tcagaagctt atcagagaaa    14280

attgatgaca ttttgcggtt aatagacgct ctggcaaaag acttgggtaa tcaagtctac    14340

gatgttgtat cactaatgga gggatttgca tacggagctg tccagctact cgagccgtca    14400

ggtacatttg caggagattt cttcgcattc aacctgcagg agcttaaaga cattctaatt    14460

ggcctcctcc ccaatgatat agcagaatcc gtgactcatg caatcgctac tgtattctct    14520

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gtagactttg atatgatcct tcaggtactg tctttcttca agggaacaat catcaacggg    14700

tacagaaaga agaatgcagg tgtgtggccg cgagtcaaag tggatacaat atatgggaag    14760

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tataagagtt tatctgcact tgaatttgag ccatgtatag aatatgaccc tgtcaccaac    14880

ctgagcatgt tcctaaaaga caaggcaatc gcacacccca acgataattg gcttgcctcg    14940

tttaggcgga accttctctc cgaagaccag aagaaacatg taaaagaagc aacttcgact    15000

aatcgcctct tgatagagtt tttagagtca aatgattttg atccatataa agagatggaa    15060

tatctgacga cccttgagta ccttagagat gacaatgtgg cagtatcata ctcgctcaag    15120

gagaaggaag tgaaagttaa tggacggatc ttcgctaagc tgacaaagaa gttaaggaac    15180

tgtcaggtga tggcggaagg gatcctagcc gatcagattg cacctttctt tcagggaaat    15240

ggagtcattc aggatagcat atccttgacc aagagtatgc tagcgatgag tcaactgtct    15300

tttaacagca ataagaaacg tatcactgac tgtaaagaaa gagtatcttc aaaccgcaat    15360

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ttgatgggcc tacctcactt cttcgaatgg attcacctaa gactgatgga cactacgatg    15540

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cctaatgatg acatatatat tgtcagtgcc agagggggta tcgaaggatt atgccagaag    15660

ctatggacaa tgatctcaat tgctgcaatc caacttgctg cagctagatc gcattgtcgt    15720

gttgcctgta tggtacaggg tgataatcaa gtaatagcag taacgagaga ggtaagatca    15780

gacgactctc cggagatggt gttgacacag ttgcatcaag ccagtgataa tttcttcaag    15840

gaattaattc atgtcaatca tttgattggc cataatttga aggatcgtga aaccatcagg    15900

tcagacacat tcttcatata cagcaaacga atcttcaaag atggagcaat cctcagtcaa    15960

gtcctcaaaa attcatctaa attagtgcta gtgtcaggtg atctcagtga aaacaccgta    16020

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gacttctgtt actatttaaa ctatataatg agttgtgtgc agacatactt tgactctgag    16140

ttctccatca ccaacaattc gcaccccgat cttaatcagt cgtggattga ggacatctct    16200

tttgtgcact catatgttct gactcctgcc caattagggg gactgagtaa ccttcaatac    16260

tcaaggctct acactagaaa tatcggtgac ccggggacta ctgcttttgc agagatccag    16320

cgactagaag cagtgggatt actgagtcct aacattatga ctaatatctt aactaggccg    16380

cctgggaatg gagattgggc cagtctgtgc aacgacccat actctttcaa ttttgagact    16440

gttgcaagcc caaatattgt tcttaagaaa catacgcgaa gagtcctatt tgaaacttgt    16500

tcaaatccct tattgtctgg agtgcacaca gaggataatg aggcagaaga gaaggcattg    16560

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attaagattg cgcttactag gaggccatta ggcataaaga ggctgatgcg gatagtcaat    16740

tattctagca tgcatgcaat gctgtttaga gacgatgttt tttcctccag tagatccaac    16800

caccccttag tctcttctaa tatgtgttct ctgacactgg cagactatgc acggaataga    16860

agctggtcac ctttgacggg aggcaggaaa atactgggtg tatctaatcc tgatacgata    16920

gaactcgtag agggtgagat tcttagtgta agcggagggt gtacaagatg tgacagcgga    16980

gatgaacaat ttacttggtt ccatcttcca agcaatatag aattgaccga tgacaccagc    17040

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attgacacag ttatccggtc tgtgatatat atggaagctg agggtgatct cgctgacaca    19740

gtatttctat ttacccctta caatctctct actgacggga aaaagaggac atcacttaaa    19800

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Claims (15)

1.一种表达编码狗干扰素的基因的重组新城疫弱毒疫苗株。

2.根据权利要求1的重组新城疫弱毒疫苗株，其为重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

3.根据权利要求1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其中所述狗干扰素是狗α、β或γ-干扰素，优选所述狗α、β和γ-干扰素的氨基酸序列分别如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示，更优选编码所述狗α、β和γ-干扰素的基因分别如SEQ ID No.4、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示。

4.根据权利要求1或2的重组新城疫弱毒疫苗株，其为rL-Canineα、rL-Canineβ、或rL-Canineγ。

5.根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株在制备狗干扰素中的应用。

6.一种生产权利要求1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株的方法，该方法包括：

(1)构建转录质粒，该转录质粒包括其中插入编码狗干扰素的基因的所述新城疫弱毒疫苗株的基因组cDNA序列；

(2)构建一个或多个转录辅助质粒，该转录辅助质粒包括编码所述新城疫弱毒疫苗株的核蛋白(NP)的cDNA序列、编码所述新城疫弱毒疫苗株的磷酸蛋白(P)的cDNA序列、和编码所述新城疫弱毒疫苗株的大聚合酶蛋白(L)的cDNA序列；

(3)将所述转录质粒和转录辅助质粒共转染所述新城疫弱毒疫苗株复制许可的宿主细胞，培养转染后的宿主细胞；

(4)收获上清液，过滤后继续敏感细胞传代或接种鸡胚尿囊腔救获重组病毒株。

7.根据权利要求6的方法，其中所述重组新城疫弱毒疫苗株是重组新城疫LaSota弱毒疫苗株。

8.根据权利要求6或7的方法，其中所述转录质粒是pBRN-FL-CaIFNα、pBRN-FL-CaIFNβ、或pBRN-FL-CaIFNγ。

9.根据权利要求6或7的方法，其中所述转录辅助质粒是质粒pBSNP、pBSP或pBSL。

10.根据权利要求6-9中任何一项的方法，其中所述宿主细胞是BHK-21。

11.根据权利要求6-10中任何一项的方法制备的重组新城疫弱毒疫苗株，优选为rL-Canineα、rL-Canineβ、或rL-Canineγ。

12.一种生产狗干扰素的方法，该方法包括：

1)将根据权利要求1-4中任何一项的重组新城疫弱毒疫苗株接种敏感细胞或接种鸡胚尿囊腔；

2)收获细胞上清液或鸡胚尿囊液。

13.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Canineα的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2622。

14.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Canineβ的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2623。

15.重组新城疫LaSota弱毒疫苗株rL-Canineγ的SPF鸡胚尿囊液，其保藏号为CGMCC No.2624。

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