CN116144608A - 病毒培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种病毒培养方法,所述方法包括:将病毒感染细胞,更换细胞培养液为病毒培养基,进行培养,待细胞全部病变时,收集病毒上清液;其中,所述病毒培养基选自VP‑SFM AGTTM培养基、VaccineXpress培养基或199培养基。利用本发明的方法所获得的病毒滴度高,为病毒的研究奠定了基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地,本发明涉及病毒培养方法。
背景技术
近十几年,溶瘤病毒可以通过诱导机体的抗肿瘤免疫反应来杀伤肿瘤的机制逐渐明确。自2011年德国科学家Jean Rommelaere第一次将溶瘤病毒疗法称作肿瘤免疫治疗以来,溶瘤病毒目前已经被大众接受作为肿瘤免疫治疗的重要分支。相较于其他肿瘤免疫疗法,溶瘤病毒具有杀伤效率高、靶向性好、副作用小、多种杀伤肿瘤途径避免耐药性和成本低廉等优势。
目前,为尽量避免溶瘤病毒培养过程中外源病毒因子引入风险,无血清病毒培养体系是趋势之一,但相较于含血清培养体系,无血清培养条件下,细胞难于培养,扩增病毒滴度低。
因此,目前的溶瘤病毒培养方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此,本发明提出了一种病毒培养方法,利用该方法所获得的病毒滴度高,为病毒的研究奠定了基础。
本发明提出了一种病毒培养方法。根据本发明的实施例,所述病毒培养方法包括:将病毒感染细胞,更换细胞培养液为病毒培养基,进行培养,待细胞全部病变时,收集病毒上清液;其中,所述病毒培养基选自VP-SFM AGTTM培养基、VaccineXpress培养基或199培养基。发明人发现,培养基种类会显著影响培养后的病毒滴度,进而,发明人经过大量实验优化,最终得到了上述较佳的培养基种类,由此,获得的病毒滴度高,为病毒的研究奠定了基础。
根据本发明的实施例,上述病毒培养方法进一步包括:
根据本发明的实施例,所述病毒培养基选自VP-SFM AGTTM培养基。
根据本发明的实施例,所述病毒感染细胞的感染复数MOI值为0.00001~0.001。
根据本发明的实施例,所述病毒感染细胞的感染复数MOI值为0.00005~0.0005。
根据本发明的实施例,所述培养的温度为35~38℃。
根据本发明的实施例,所述培养的温度为35~36.5℃。
根据本发明的实施例,所述病毒上清液的滴度为8~10lgTCID50/ml。
根据本发明的实施例,所述细胞选自Vero细胞。
根据本发明的实施例,所述病毒选自溶瘤病毒。
根据本发明的实施例,所述病毒为重组溶瘤病毒。
根据本发明的实施例,所述重组溶瘤病毒为水疱性口炎病毒。
根据本发明的实施例,所述重组溶瘤病毒表达对细胞受体具有亲和力的病毒蛋白,所述病毒蛋白选自:(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;或(c)与(a)或(b)具有至少80%同源性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述病毒蛋白与细胞受体的结合力的ZDOCK score不低于1800。
根据本发明的实施例,所述细胞受体包括选自烟碱型胆碱受体α5、吻素受体、血清素受体1D、C-C趋化因子受体8和生长抑素受体5的至少之一。
根据本发明的实施例,所述重组溶瘤病毒进一步表达选自下列的至少之一:核蛋白、磷酸蛋白、基质蛋白以及RNA依赖的RNA聚合酶。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出,部分将从下面的描述中变得明显,或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解,其中:
图1显示了基于肿瘤组织大样本的人类膜受体基因的分析流程图。
图2显示了对应的受体基因在各肿瘤中显著上调的病人比例的抖动散点图。
图3显示了反映候选配体分别与肿瘤特异性受体结合强度的ZDOCK score结果。
图4显示了依据筛选出的受体筛选配体的实验结果图。
图5显示了根据本发明一个实施例的信噪比主效应图。
图6显示了qPCR检测得到的BXPC3、HCT-8、HepG2、Su8686、H358、NCL-H460和PANC1细胞样品中的C5、K1R、HID、C8和S5的mRNA的表达量。
图7显示了细胞杀伤实验中所测得的病毒在不同的MOI情况下对BXPC3、HCT-8、HepG2、Su8686、H358和PANC1细胞的杀伤效果。
图8显示了具有不同G蛋白的病毒株在不同的MOI情况下对NCL-H358和NCL-H460细胞的杀伤效果。
图9显示了REV DQ408670.1病毒株和FJINFβ病毒株对NCL-H358和NCL-H460细胞的杀伤效果。
图10显示了REV DQ0.1病毒株对正常细胞安全的实验结果图。
附图标记:C5表示CHRNA5,S5表示SSTR5,K1R表示KISS1R,H1D表示HTR1D,C8表示CCR8。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的,仅用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提出了一种病毒培养方法。根据本发明的实施例,所述病毒培养方法包括:将病毒感染细胞,更换细胞培养液为病毒培养基,进行培养,待细胞全部病变时,收集病毒上清液;其中,所述病毒培养基选自VP-SFM AGTTM培养基、VaccineXpress培养基或199培养基。发明人发现,培养基种类会显著影响培养后的病毒滴度,进而,发明人经过大量实验优化,最终得到了上述较佳的培养基种类,这三种培养基均为无血清培养基,既可以避免外源因子引入而对病毒产生影响,病毒也可以在此培养基中很好地扩增,由此,获得的病毒滴度高,为病毒的研究奠定了基础。
根据本发明的实施例,所述病毒培养基选自VP-SFM AGTTM培养基。由此,可以进一步提高病毒滴度。
根据本发明的实施例,所述病毒感染细胞的感染复数MOI值为0.00001~0.001。发明人经过大量实验得到上述较佳的感染复数MOI值,由此,可以进一步提高病毒滴度。其中,所述病毒感染细胞的感染复数MOI值为0.00005~0.0005,效果更佳。
根据本发明的实施例,所述培养的温度为35~38℃。发明人经过大量实验得到上述较佳的培养温度,由此,可以进一步提高病毒滴度。其中,所述培养的温度为35~36.5℃,效果更佳。
根据本发明的实施例,所述病毒上清液的滴度为8~10lgTCID50/ml。由此,表明本发明培养方法所得病毒上清液的滴度较高。
根据本发明的实施例,所述细胞选自Vero细胞。病毒感染上述细胞,可以获得较大的滴度。
根据本发明的实施例,所述病毒选自溶瘤病毒。由此,采用该方法可以提高溶瘤病毒滴度。
根据本发明的实施例,所述病毒为重组溶瘤病毒。
根据本发明的实施例,所述重组溶瘤病毒为水疱性口炎病毒。
根据本发明的实施例,所述重组溶瘤病毒表达对细胞受体亲和力高的病毒蛋白,所述病毒蛋白选自:(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;(b)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;或(c)与(a)或(b)具有至少80%同源性的氨基酸序列。由此,该重组溶瘤病毒具有较高的肿瘤细胞特异性和/或肿瘤治疗广谱性。
MKCFLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTGLQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNDICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISTDITFFSEDRELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGDKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSGLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDEILFFGDTGLSKNPIDFVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIYLYIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGR(SEQ ID NO:1)。
MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO:2)
根据本发明的实施例,表达上述病毒蛋白的重组水疱性口炎病毒对肿瘤细胞的特异性靶向性更强,对肿瘤的杀伤更加广谱,杀伤效果更加显著。
需要说明的是,本申请所述的“同源性”是指氨基酸序列具有相似性,其氨基酸序列中个别氨基酸的差异不影响蛋白自有功能的发挥。“同源性氨基酸序列”是指一种多肽的氨基酸序列中,进行单一或多个氨基酸的取代、删除、添加而所衍生出的氨基酸序列。具体地,本申请所述的“具有某百分比序列同源性”是通过如下公式计算获得的:
1-差异氨基酸的数量/基准氨基酸序列的氨基酸数×100%,
其中,基准氨基酸序列的氨基酸数量是指被比较的氨基酸序列的数量,如所述的“G蛋白与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一种具有至少80%序列同源性”中的基准氨基酸序列为SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2。
上述具有同源性的氨基酸序列在生物学上、化学上或者结构上具有相似性,并具有相似的生物学活性。结构上相似指的是氨基酸具有相似长度的侧链,如丙氨酸、甘氨酸或丝氨酸,或具有相似大小的侧链。化学相似性指的是氨基酸具有相同的荷电或者都是亲水或者疏水的。例如疏水残基异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或者甲硫氨酸相互取代。或者极性氨基酸相互取代,例如用精氨酸取代赖氨酸、谷氨酸取代天冬氨酸、谷氨酰胺取代天冬酰胺,丝氨酸取代苏氨酸等等。生物学的相似性是指具有序列同源性的氨基酸序列在生物学功能上类似,如根据本发明实施例的重组水疱性口炎病毒均具有与肿瘤广谱和特异性的高亲和力和结合力。
水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis Virus,VSV)属于弹状病毒科水疱病毒属的病毒,分为两个血清型:新泽西型(VSV-NJ)和印第安那型(VSV-IND)。病毒粒子为子弹状或圆柱状,大小为150~180nm×50~70nm。病毒有囊膜,囊膜上均匀密布有长约10nm的纤突。病毒内部为紧密盘旋的螺旋对称的核衣壳。该病毒根据患病动物的口腔粘膜、牙垫、舌头、嘴唇、鼻孔、蹄和乳头中的经典水疱性病变命名。通过昆虫媒介传播,疾病仅限于其自然宿主,例如马、牛和猪。在人类中,感染是轻度且无症状的。
VSV基因组为不分节段的单股负链RNA(ssRNA)病毒,长度约为11KB。从3’端至5’端依次排列着N、NS、M、G、L五个不重叠的基因,分别编码核(N)蛋白、磷酸(P)蛋白、基质(M)蛋白、糖(G)蛋白及RNA依赖的RNA聚合酶(L)蛋白等5种不同的蛋白。N基因的3’端是先导序列(Leader),5’端是拖尾序列(Trailor),各基因间有间隔序列。3’端先导RNA在感染细胞中是最早的病毒转录物,长度为47个核苷酸,不戴帽也不翻译,其功能尚未完全清楚,可能是抑制宿主RNA的合成。N蛋白是启动基因组合成所必需的,可有效的保护病毒RNA免受各种核酸酶的消化。N蛋白有高的抗原性免疫原性,刺激机体产生非中和抗体细胞免疫,且在转录复制中担任了重要的角色,它对维持基因组RNA呈伸展形式可能是必要的,与复制调节有关。P蛋白,VSV-NJ与VSV-IND病毒株的同源性为41%,其作用是与聚合酶L,核蛋白N组成聚合酶复合物以及基因组RNA共同维持病毒的转录活性。M蛋白在病毒致病机制和病毒复制方面起关键作用,富含碱性氨基酸,并含有高度碱性的氨基末端结构域,可通过与核衣壳结合而抑制转录,同时辅助病毒从宿主中出芽,是涉及出芽过程的惟一多肽。G蛋白是病毒的主要表面抗原,决定着病毒的毒力,也是病毒的保护性抗原。它可刺激机体产生中和抗体。L基因编码RNA poly E蛋白,它可能决定RNA的转录活性,与P蛋白结合以催化mRNA的复制。该蛋白是聚合酶复合物和复制酶复合物的核心成分,涉及起始、延伸、甲基化、戴帽、聚(A)尾形成等等。此外,在每个基因之间的间隔序列有广泛的同源性,这些序列有一个共同的结构,即3’-AUAC(U)7NAUUGUCNN-UAG-5’。这些基因之间的保守序列是一种关键信号,以影响多聚酶的活性或酶的切割活性,而在复制过程中,这些信号被掩盖,不起作用。
在本发明的描述中,术语“重组VSV病毒”、“重组水疱性口炎病毒”、“本发明重组病毒”可互换使用,是指如上所述的能够特异性感染肿瘤细胞的重组VSV病毒,所述的重组VSV病毒特异性感染肿瘤细胞,并且所述重组VSV病毒特异性结合于选自下组的肿瘤细胞的特异性受体:烟碱型胆碱受体α5、吻素受体、血清素受体1D、C-C趋化因子受体8和生长抑素受体5。
根据本发明的实施例,所述病毒蛋白包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中任一种具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同源性的氨基酸序列。
根据本发明的实施例,所述重组水疱性口炎病毒不携带异源基因。发明人发现,不携带异源基因的重组水疱性口炎病毒对肿瘤细胞的杀伤效果显著高于携带外源基因的重组水疱性口炎病毒。根据本发明的实施例,在本文中所描述的术语“异源基因”如无特别说明,是指在野生型水疱性口炎病毒中未曾报道过的基因。或者换句话说,在重组水疱性口炎病毒中所编码的蛋白均为野生型水疱性口炎病毒中表达的。
根据本发明的实施例,所述病毒蛋白与细胞受体的结合力的ZDOCK score不低于1800。本领域技术人员能够理解,通过输入病毒蛋白和细胞受体的序列,可以容易地获得病毒蛋白和细胞受体之间的结合力表征参数ZDOCK score。发明人发现,当ZDOCK score 1800时,例如不小于1900,不小于2000,优选不小于2100,携带病毒蛋白的病毒与携带对应受体的肿瘤细胞之间的结合力将显著提高。根据本发明的实施例,ZDOCK score是可以常规软件确定的,例如参见Pierce BG,Hourai Y,Weng Z.(2011)Accelerating Protein Dockingin ZDOCK Using an Advanced 3D Convolution Library.PLoS One 6(9):e24657.。
根据本发明的实施例,上述病毒蛋白包括选自GenBank索取号为X03633.1的G蛋白和GenBank索取号为DQ408670.1的G蛋白的至少之一。本发明的发明人意外地发现GenBank索取号为X03633.1的G蛋白和GenBank索取号为DQ408670.1的G蛋白与肿瘤细胞的受体具有显著强于其他G蛋白的结合力。
根据本发明的实施例,所述重组水疱性口炎病毒进一步表达选自下列的至少之一:核蛋白、磷酸蛋白、基质蛋白以及RNA依赖的RNA聚合酶。发明人意外地发现,通过将这些蛋白与GenBank索取号为X03633.1的G蛋白和GenBank索取号为DQ408670.1的G蛋白的至少之一进行组合构建得到的重组病毒,具有更强的肿瘤杀伤活性。发明人认为有可能是因为对于肿瘤细胞而言,多种不同来源的蛋白组合有可能会引发与相同来源的蛋白组合不同的免疫反应,从而进一步提高对肿瘤细胞的杀伤作用。
相应地,所述重组水疱性口炎病毒携带:编码所述核蛋白的核酸分子;编码所述磷酸蛋白的核酸分子;编码所述基质蛋白的核酸分子;或者编码所述RNA依赖的RNA聚合酶的核酸分子
优选地,所述编码所述核蛋白的核酸分子、所述编码所述磷酸蛋白的核酸分子、所述编码所述基质蛋白的核酸分子和所述编码所述RNA依赖的RNA聚合酶的核酸分子的至少之一衍生自水疱性口炎病毒Mudd summer亚型病毒株。发明人意外地发现,通过将这些蛋白与GenBank索取号为X03633.1的G蛋白和GenBank索取号为DQ408670.1的G蛋白的至少之一进行组合构建得到的重组病毒,具有更强的肿瘤杀伤活性。发明人认为有可能是因为对于肿瘤细胞而言,多种不同来源的蛋白组合有可能会引发与相同来源的蛋白组合不同的免疫反应,从而进一步提高对肿瘤细胞的杀伤作用。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1基于肿瘤组织大样本的人类膜受体基因的分析
以下将参考图1详细描述基于肿瘤组织大样本的人类膜受体基因的分析的方法。
1.1人类膜受体基因及其表达数据预处理与分析
本发明从已有的研究中整理总结出在人类细胞中表达的受体基因信息(参考文献:(Synchronous birth is a dominant pattern in receptor-ligand evolution,BMCGenomics.Grandchamp and Monget,2018Aug 14;19(1):611.)。发明人从UCSC Xena(http://xena.ucsc.edu/)下载了癌症病人的基因表达矩阵(归一化值)、基因突变信息以及相关临床资料。数据中包含的癌种有:肾上腺皮质癌、膀胱尿路上皮癌、乳腺浸润癌、宫颈鳞状细胞癌和宫颈内膜腺癌、胆管癌、结肠腺癌、结肠腺癌/Rectum腺癌食管癌、淋巴样肿瘤弥漫性大B细胞淋巴瘤、食道癌、FFPE试验第二阶段、胶质母细胞瘤、胶质瘤、头颈部鳞状细胞癌、肾染色体、泛肾队列(KICH+KIRC+KIRP)、肾脏肾透明细胞癌、肾脏肾乳头状细胞癌、急性髓性白血病、脑低级脑胶质瘤、肝肝细胞癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、间皮瘤、卵巢浆液性囊腺癌、胰腺腺癌、嗜铬细胞瘤和副神经节瘤、前列腺腺癌、直肠腺癌、肉瘤、皮肤黑色素瘤、胃腺癌、胃和食道癌、睾丸生殖细胞肿瘤、甲状腺癌、胸腺瘤、子宫体子宫内膜癌、子宫癌肉瘤、葡萄膜黑色素瘤
发明人从下载的数据中首先剔除少于三个的样本肿瘤及正常组织信息,然后进行差异表达分析。发明人使用limma软件(版本:3.38.3)来执行差异表达分析(参考文献:(Limma Powers Differential Expression Analyses for RNA-Sequencing andMicroarray Studies.Nucleic Acids Research,43,e47,Ritchie,M.E.,et al.(2015))。分析中采用了limma R包的voom模型。只有当基因满足标准|log2FC|>1,P值<0.05才会被认定为是差异基因。
1.2数据分析
使用R语言计算各组间膜受体基因表达差异倍数(log2FC)和p值。选择|log2FC|大于等于2.0被视为有显著性上调/下调差异表达基因。t检验的p值小于0.01被判定为差异有统计学意义。使用ComplexHeatmap R包生成每个比较组对的log2FC矩阵的热图。
然后,发明人根据一系列筛选条件,比如选择在肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌和肝癌癌种中选择大于等于70%的癌症样本中显著上调的基因(即log2FC≥2.0的基因);本底表达量高等条件,选出10余个受体。
具体地,发明人对每个基因在不同肿瘤样本中的log2FC值,使用ggplot2和ggbeeswarm软件绘制抖动散点图(如图2所示),用以展示该基因在各肿瘤中显著上调的病人比例。
另外,发明人将筛选出来的13个受体与备选配体做分子对接,选择结合力最优的为最终选择的5个受体。
结果如图4所示(其中,图3所示配体编号以及所对应的配体名称和氨基酸序列捕获号如表1所示),C5(烟碱型胆碱受体α5)、S5(生长抑素受体5)、K1R(吻素受体)、H1D(血清素受体1D)、C8(C-C趋化因子受体8)为肿瘤细胞和正常细胞中差异表达的受体蛋白。
表1配体名称及氨基酸序列捕获号
实施例2根据受体选择病毒配体
发明人选择16种水疱性口炎病毒同源配体,与实施例1筛选获得的5种肿瘤特异性受体分别进行建模和对接,生成的对接的结果会按照ZDOCK score分数进行排序,得分越高,则说明结合越强,结果可信度越高。同时综合分析这些构象的聚类结果,发现,ZDOCK分数是ZDOCK程序计算的形状互补分数,根据参数设置,ZDOCK分数还将包括静电和去溶剂能项。ZDOCK分数越高越好。进而发明人通过ZDOCK score函数来评价结合的强弱,获得了筛选出肿瘤特异性受体结合能力强的配体(结果如图4所示),其中,结合效果最优的配体为DQ408670.1-lig-F和X03633.1-lig-FL,对应的氨基酸序列的捕获号为DQ408670.1,GENEID:X03633.1。
实施例3重组病毒构建及培养条件优化
3.1细胞与病毒
表2细胞与病毒基本信息
名称 | 代次/滴度 |
Vero细胞 | P142 |
病毒工作种子 | 9.167lgTCID50/ml |
病毒工作种子的获得方式如下:
发明人将来源于Mudd summer亚型病毒株的L、N、P、M蛋白组合结合捕获序列号为GENE ID:DQ408670.1,GENE ID:X03633.1,GENE ID:KP.1或GENE ID:HQ593628.1的G蛋白构建重组水疱性口炎病毒REV DQ0.1、REV X.1、REV KP.1和REV HQ.1。
病毒株REV DQ0.1、REV X.1、REV KP.1和REV HQ.1的包装方法如下所述:
体外重组VSV需要包含病毒基因组的全长质粒(包含G蛋白),以及病毒包装所需要的骨架蛋白的辅助质粒(N、P、L、M),通过体外转染的方法将质粒转入BHK21细胞中,病毒在细胞内组装成熟后出芽释放到细胞外(参考文献:Vesicular stomatitis virus-basedvaccine protects hamsters against lethal challenge with Andes virus.Journalof virology 85,12781-12791,doi:10.1128/JVI.00794-11(2011),Brown,K.S.,Safronetz,D.,Marzi,A.,Ebihara,H.&Feldmann,H.)。
3.2溶液和材料
表3溶液和材料基本信息
溶液/材料名称 | 生产厂家 |
VP-SFM AGTTM培养基 | Gibco |
VaccineXpress培养基 | Hyclone |
199培养基 | 清大天一 |
T-flask 75cm2 w/vent cap | Corning |
3.3以重组水疱性口炎病毒REV DQ0.1为例,按照下列方法培养溶瘤病毒,另外三种重组水疱性口炎病毒的培养条件与此一致,在此不再赘述。
实验组1:
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.00001。更换细胞培养液为病毒培养基(VP-SFM AGTTM培养基),35.0℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组2
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.0001。更换细胞培养液为病毒培养基(VP-SFM AGTTM培养基),36.5℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组3
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.001。更换细胞培养液为病毒培养基(VP-SFM AGTTM培养基),38.0℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组4
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.00001。更换细胞培养液为病毒培养基(VaccineXpress培养基),36.5℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组5
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.0001。更换细胞培养液为病毒培养基(VaccineXpress培养基),38.0℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组6
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.001。更换细胞培养液为病毒培养基(VaccineXpress培养基),35.0℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组7
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.00001。更换细胞培养液为病毒培养基(199培养基),38.0℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组8
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.0001。更换细胞培养液为病毒培养基(199培养基),35.0℃培养,待细胞完全病变后,收集病毒上清液。
实验组9
1、细胞培养
复苏Vero细胞,传至75cm2培养瓶,待细胞生长至90%以上汇合度时待用。
2、病毒培养
待细胞生长至90%以上汇合度时,进行细胞计数。将重组病毒感染细胞,感染复数MOI值为0.001。更换细胞培养液为病毒培养基(199培养基),36.5℃培养,待细胞完全病变后,收集重组溶瘤病毒上清液。
测定和分析:
测定实验组1~9所得病毒上清液的病毒滴度,结果如表4所示。
表4病毒滴度
采用Minitab软件对试验结果进行分析,分析结果如表5、图5所示。
表5信噪比响应表
水平 | 培养基 | 接毒MOI | 培养温度 |
1 | 19.33 | 18.48 | 19.13 |
2 | 18.07 | 19.25 | 19.04 |
3 | 19.05 | 18.72 | 18.28 |
Delta | 1.26 | 0.77 | 0.85 |
排秩 | 1 | 3 | 2 |
由信噪比响应表可看出,培养基对病毒培养影响因素最大,其次影响因素分别为病毒接种MOI和病毒培养温度。
由信噪比主效应图可看出,培养基为VP-SFM AGTTM培养基、病毒接种MOI为0.0001、病毒培养温度为35.0℃时,病毒滴度最高。
实施例4肿瘤细胞受体的检测以及细胞杀伤结果
本实施例中利用实施例3培养的不同病毒对不同肿瘤细胞进行杀伤效果验证。
3.1q-PCR检测:
用Trizol法提取1×106的BXPC3、HCT-8、HepG2、Su8686、H358、NCL-H460(H460)和PANC1细胞样品,以500ng/μL RNA进行20μL体系的反转录,用SYBR GREEN法进行荧光定量PCR检测7个细胞样品中C5、K1R、HID、C8和S5基因mRNA的表达。
结果如图6所示。qPCR检测结果显示,BXPC3、HCT-8、HepG2、Su8686、H358、NCL-H460和PANC1细胞样品C5受体基因mRNA表达水平较高,但不同细胞中,相对表达量高的受体存在差异,比如H460细胞中表达量最高的为C5、H1D受体,而其它细胞中C5和C8受体基因表达水平较高。
3.2细胞杀伤实验(CCK):
将状态良好的BXPC3、HCT-8、HepG2、Su8686、H358和PANC1细胞制成5×104个/mL的细胞悬液按100μL/孔加入96孔板中,边缘补齐培养基减少蒸发,过夜培养。用Opti-MEM将已知滴度病毒稀释为MOI:0.01、MOI:0.1和MOI:1的病毒工作液,将96孔板中培养液吸弃,每孔加入50μL病毒稀释液,每个稀释液重复3复孔,另取Opti-MEM重复3孔作空白对照。病毒稀释液加入2h后换液,1%FBS培养基每孔100μL。48/72h后每孔加入10μL CCK8检测液,37℃孵育2h后OD450酶标仪读数。
图7显示了REV DQ0.1对不同细胞的CCK杀伤结果,CCK检测结果显示,MOI:0.01、MOI:0.1和MOI:1的REV DQ0.1病毒工作液均对BXPC3、HCT-8、HepG2、Su8686、H358和PANC1细胞具有显著的杀伤效果。
实验结果如图8所示。CCK检测结果显示,REV DQ0.1、REV X.1在MOI:0.01、MOI:0.1和MOI:1的病毒工作液对NCL-H358和NCL-H460细胞的杀伤效果显著优于REV KP.1和REVHQ.1。同时结合图6结果,NCL-H358中CCR8和C5表达量较高,NCL-H460中C5、H1D表达量较高,以及结合图4受体与配体的结合热图结果,DQ408670.1和X03633.1G蛋白与C8、H1D受体的结合力强。综合反应了,当重组水疱性口炎病毒与肿瘤细胞受体具有高结合力时,重组病毒对高表达所述受体的肿瘤细胞的杀伤效果更加显著。
实施例5基于选定G蛋白,不同L、N、P、M组合的病毒株对肿瘤细胞杀伤结果
细胞杀伤实验(CCK):
利用反义遗传学方法,发明人构建了REV DQ0.1病毒株、REV DQ0.1-V1和REVDQ0.1-V2病毒株,其中,REV DQ0.1-V1是在REV DQ0.1病毒株的基础上变更了L、M蛋白,而REV DQ0.1-V2是在REV DQ0.1病毒株的基础上变更了N、P蛋白。
将状态良好的H358和H460细胞制成5×104个/mL的细胞悬液按100μL/孔加入96孔板中,边缘补齐培养基减少蒸发,过夜培养。用Opti-MEM将已知滴度3株病毒株稀释为MOI:0.01的病毒工作液,将96孔板中培养液吸弃,每孔加入50μL病毒稀释液,每个稀释液重复3复孔,另取Opti-MEM重复3孔作空白对照。病毒稀释液加入2h后换液,1%FBS培养基每孔100μL。72h后每孔加入10μL CCK8检测液,37℃孵育2h后OD450酶标仪读数。
实验结果如表6所示。3株病毒株REV DQ0.1,REV DQ0.1-V1和REV DQ0.1-V2结果相似,在MOI:0.01的病毒工作液均对H358和H460细胞具有显著的杀伤效果。
表6:MOI:0.01时病毒对肿瘤细胞的抑制率%
实施例6基于选定G蛋白以及插入外源基因的病毒株对肿瘤细胞杀伤结果
细胞杀伤实验(CCK):
利用反义遗传学方法,发明人在构建的REV DQ0.1病毒株中插入了异源基因INFβ,以构建病毒株FJ-INFβ。
将状态良好的H358和H460细胞制成5×104个/mL的细胞悬液按100μL/孔加入96孔板中,边缘补齐培养基减少蒸发,过夜培养。用Opti-MEM将已知滴度REV DQ0.1病毒株和FJ-INFβ病毒株分别稀释为MOI:0.01、MOI:0.1和MOI:1的病毒工作液,将96孔板中培养液吸弃,每孔加入50μL病毒稀释液,每个稀释液重复3复孔,另取Opti-MEM重复3孔作空白对照。病毒稀释液加入2h后换液,1%FBS培养基每孔100μL。72h后每孔加入10μL CCK8检测液,37℃孵育2h后OD450酶标仪读数。
结果如图9所示,REV DQ0.1病毒株对H358和H460细胞杀伤显著优于FJ-INFβ。
实施例7REV DQ0.1病毒株对正常细胞杀伤检测
细胞杀伤实验(CCK):
将状态良好的肺正常细胞BEAS-2B制成5×104个/mL的细胞悬液按100μL/孔加入96孔板中,边缘补齐培养基减少蒸发,过夜培养。用Opti-MEM将已知滴度REV DQ0.1病毒稀释为MOI:0.01、MOI:0.1和MOI:1的病毒工作液,将96孔板中培养液吸弃,每孔加入50μL病毒稀释液,每个稀释液重复3复孔,另取Opti-MEM重复3孔作空白对照。病毒稀释液加入2h后换液,1%FBS培养基每孔100μL。72h后每孔加入10μL CCK8检测液,37℃孵育2h后OD450酶标仪读数。
实验结果如图10所示。CCK检测结果显示,REV DQ0.1病毒株在MOI:0.01、MOI:0.1和MOI:1的病毒工作液均对BEAS-2B细胞没有明显的杀伤效果。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (10)
1.一种病毒培养方法,其特征在于,包括:
将病毒感染细胞,更换细胞培养液为病毒培养基,进行培养,待细胞全部病变时,收集病毒上清液;
其中,所述病毒培养基选自VP-SFM AGTTM培养基、VaccineXpress培养基或199培养基。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述病毒培养基选自VP-SFM AGTTM培养基。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述病毒感染细胞的感染复数MOI值为0.00001~0.001。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述病毒感染细胞的感染复数MOI值为0.00005~0.0005。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养的温度为35~38℃。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述培养的温度为35~36.5℃。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述病毒上清液的滴度为8~10lgTCID50/ml。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述细胞选自Vero细胞。
9.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述病毒选自溶瘤病毒。
10.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述病毒为重组溶瘤病毒;
可选的,所述重组溶瘤病毒为水疱性口炎病毒;
可选的,所述重组溶瘤病毒表达对细胞受体具有亲和力的病毒蛋白,所述病毒蛋白选自:
(a)SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;
(b)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列;或
(c)与(a)或(b)具有至少80%同源性的氨基酸序列;
可选的,其特征在于,所述病毒蛋白与细胞受体的结合力的ZDOCK score不低于1800;
可选的,所述细胞受体包括选自烟碱型胆碱受体α5、吻素受体、血清素受体1D、C-C趋化因子受体8和生长抑素受体5的至少之一;
可选的,所述重组溶瘤病毒进一步表达选自下列的至少之一:核蛋白、磷酸蛋白、基质蛋白以及RNA依赖的RNA聚合酶。
Applications Claiming Priority (2)
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---|---|---|---|
CN2021111513383 | 2021-09-29 | ||
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Publications (1)
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