KR20230148714A - 면역원성 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

면역원성 조성물 및 이의 제조방법 Download PDF

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KR20230148714A
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Abstract

본 발명은 면역원성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

면역원성 조성물 및 이의 제조방법{Immunogenic composition and a method for preparing thereof}
본 발명은 면역원성 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
RNA의 5'-캡핑이란 진핵세포 내에서 pre-mRNA 가공 과정의 첫번째 단계로, 전사된 RNA의 5' 말단에 캡(cap)이 씌워지는 과정이다. 천연적으로 발생하는 캡 구조는 구아닌 염기의 위치 N7에서 메틸화되는 리보-구아노신 잔기를 포함한다. 진핵생물의 생체 내에서 mRNA 분자의 5' 말단에 7-메틸구아노신(m7G)이 5' 트리포스페이트 결합을 통해 연결된 5' 캡(cap-0)이 생성되는 단계는 메틸트랜스퍼라제 효소에 의해 매개된다. 또한 진핵생물의 mRNA에는 5' 말단의 첫번째 리보오스 당의 2' 히드록시기의 메틸화(cap-1) 및 두번째 리보오스 당의 2' 히드록시기의 메틸화(cap-2)를 포함하는 추가적 변형이 존재할 수 있다. 이러한 mRNA의 5' 캡핑 과정을 통해 mRNA가 핵에서 세포질로 빠져나갈 때 5' 엑소뉴클레아제 등의 분해효소에 대한 저항성을 획득하게 된다.
특정 유전자를 코딩하는 캡핑된 mRNA를 진핵 생물에 트랜스펙션하거나 세포 또는 배아로 미세주입함으로써 상기 유전자를 인위적으로 발현시킬 수 있다. 그러나, 이 과정에서 캡핑되지 않은 RNA가 사용될 경우, RNA는 빠르게 분해될 뿐만 아니라 면역원성을 가지며 단백질 번역 효율이 급격히 감소된다. 따라서, in vitro에서 mRNA를 합성하기 위해 5' 캡핑이 적절히 수행되는 것은 매우 중요하다.
캡핑된 RNA 전사체는 핵산 치료제, 백신 분야와 같이 단백질 합성을 필요로 하는 치료 및/또는 예방 분야에 적용될 수 있으므로, RNA 치료제 또는 백신으로 적용될 때 생체 내에서 mRNA 안정성을 유지하거나 번역 효율을 개선하거나 면역원성 등의 부작용을 감소시킬 수 있는 캡 구조의 개발이 필요하다.
KR 10-2022-0046693 A
본 발명의 목적은 신규 Cap 구조를 포함하는 면역원성 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명을 구현하는 하나의 양태는 면역원성 조성물이다.
하나의 구체예에서, 상기 면역원성 조성물은 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
앞선 구체예에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 화학식 3 또는 4로 표시되는 5'Cap 구조를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물은 화학식 3으로 표시되는 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 화학식 4로 표시되는 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 5'UTR (미번역 영역) 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 5'UTR (미번역 영역) 서열은 HBA2(Hemoglobin subunit alpha 2) 유래이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 5'UTR 서열은 서열번호 3 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 3'UTR (미번역 영역) 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 3'UTR 서열은 HBB(Hemoglobin subunit beta) 유래이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 3'UTR 서열은 서열번호 5 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 5'UTR 서열; 및 서열번호 5 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 3'UTR 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 면역원성을 나타내는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 유래의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스의 S 단백질(S protein) 또는 그의 단편을 코딩하는 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 코로나 바이러스는 SARS-CoV-2이다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 코로나 바이러스의 S 단백질은 A701V 변이를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 CDS를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리 A 테일(Poly A tail)을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물은 제제화 된 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 폴리뉴클레오티드는 지질 나노입자 내부에 포함된 것일 수 있다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 면역원성 조성물로서, 상기 면역원성 조성물은 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 유도하는 것일 수 있다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 면역원성 조성물의 제조방법이다.
하나의 구체예에서, 상기 제조방법은 하기 화학식 5 내지 8 중 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 염과 DNA 주형을 포함하는 조성물을 혼합하여 mRNA 합성을 수행하는 단계를 포함한다:
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 화학식 7 또는 8 중 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 DNA 주형을 포함하는 조성물을 포함하여 mRNA 합성을 수행하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 DNA 주형은 mRNA 폴리뉴클레오티드에 상보적인 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 DNA 주형은 면역원성을 나타내는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 유래의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 mRNA의 폴리 A 테일링(tailing)을 수행하는 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 mRNA 합성은 인비트로(in vitro)에서 수행된다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 mRNA의 제제화 단계를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 제조방법으로서, 상기 제조방법은 mRNA를 지질 나노입자에 포함된 형태로 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 면역원성 조성물을 제조하기 위한 조성물이다.
하나의 구체예에서, 상기 면역원성 조성물을 제조하기 위한 조성물은 상기 화학식 5 내지 8 중 어느 하나 이상의 화합물과 DNA 주형을 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역원성 조성물을 제조하기 위한 조성물은 RNA 합성에 필요한 구성요소를 포함한다.
앞선 구체예 중 어느 하나에 따른 조성물로서, 상기 면역원성 조성물을 제조하기 위한 조성물은 폴리머라제(polymerase)를 포함한다.
본 발명을 구현하기 위한 다른 하나의 양태는 상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염 질환의 예방 방법이다.
하나의 구체예에서, 상기 바이러스는 코로나 바이러스 및 인플루엔자 바이러스 중 선택되는 것일 수 있다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 발명에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 발명의 하나의 양태는 면역원성 조성물을 제공한다.
상기 면역원성 조성물은 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다:
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
[화학식 4]
일 예로, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 화학식 3 또는 4로 표시되는 5'Cap 구조를 포함할 수 있다.
일 예로, 상기 면역원성 조성물은 상기 화학식 3으로 표시되는 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 상기 화학식 4로 표시되는 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "5' 캡(Cap)"은 mRNA의 말단을 덮는(caps) 변형 독립체를 의미한다. 5' 캡은 일반적으로 변형, 예를 들어 구아닌 유도체에 의해 형성될 수 있다. 이러한 구아닌 뉴클레오티드 유도체의 예시는 상기 화학식 1 내지 4에 포함되어 있다.
일 예로, 5'캡은 5'->5'트리포스페이트(triphosphate) 결합을 통해 5' 말단에 연결 될 수 있다. 일 예로, 5'캡은 메틸화 될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 인비트로(in vitro)에서 5'캡핑될 수 있다. 캡핑, 즉 캡 구조를 형성하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인비트로 전사 시에 캡 유사체(Cap analogue)를 추가하면 전사와 함께 캡핑이 수행될 수 있다. 이를 동시-전사 캡핑 (co-transcriptional capping)이라고도 한다. 동시-전사 방법의 경우, 시험관내 전사 과정 중에 전사와 동시에 RNA 분자에 캡이 통합된다. 다른 예로, 인비트로 전사 후 효소반응을 통해 캡핑을 수행할 수 있다. 이러한 효소 반응에는 트리포스파타제(triphosphatase), 구아닐 트랜스퍼라제와 같은 효소가 관여할 수 있다.
본 발명에서 용어 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 지칭한다.
본 발명에서 개시하는 면역원성 조성물에 포함될 수 있는, 특정 5'Cap 구조를 포함한 폴리뉴클레오티드는 RNA일 수 있다. 보다 구체적으로는 mRNA일 수 있다. 본 발명에서 mRNA는 메신저-RNA를 지칭한다. mRNA는 일반적으로 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하며 RNA의 전사에 관여한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 목적하는 면역원성 조성물로 사용할 수 있는, 목적하는 RNA 서열은 제한 없이 포함될 수 있으며, 본 발명의 Cap 구조로 인하여 면역 반응의 유도가 증진되는 서열은 제한없이 포함한다.
본 발명의 면역원성 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 면역원성을 나타내는 바이러스 유래 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열은 "CDS"로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 mRNA에 포함된 CDS 영역은 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다.
본 발명의 바이러스는 사람 및/또는 동물에서 질병을 일으키는 병원성 바이러스일 수 있고, 이러한 바이러스의 예시로는 오소믹소비리데(Orthomyxoviridae) 속 바이러스, 피코르나비리데(Picorna viridae) 속 바이러스, 레트로비리데(Retroviridae) 속 바이러스, 헤르페스(Herpes) 속 바이러스, 필로비리데(Filoviridae) 속 바이러스, 코로나비리데(Coronaviridae) 속 바이러스, 헤파드나비리데(Hepadnaviridae) 속 바이러스, 플라비비리데(Flaviviridae) 속 바이러스, 부냐비리데(Bunyaviridae) 속 바이러스 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 바이러스는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 일 수 있다.
본 발명에서 용어 "코로나 바이러스" 는, 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는, 약 80-220 nm 크기의 양성 단일가닥 RNA 바이러스(positive-sense single-stranded RNA virus, ssRNA)를 지칭한다. 일 예로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2일 수 있다.
본 발명에서 용어 "SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스 질환-19(coronavirus disease 2019; COVID-19)를 야기하는 바이러스이다. SARS-CoV-2는 양성 단일가닥 RNA 바이러스이다. SARS-CoV-2는 분류학적으로 SARS-CoV의 계통(strain)으로, 동물원성 감염증의 기원(zoonotic origins)을 가지며, 박쥐 코로나바이러스와 근접한 유전적 유사성을 갖는 것으로 간주된다. 상기 SARS-CoV-2는 주로 사람들 간의 긴밀한 접촉을 통해 및/또는 기침이나 재채기시 발생하는 비말을 통해 전파되며, 주로 바이러스 외각의 스파이크(S) 단백질이 인간세포 표면에 존재하는 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)에 결합하여 인간세포에 진입하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 용어 "인플루엔자 바이러스" 는, 오르토믹소바이러스과 (Orthomyxoviridae)에 속하는 바이러스를 말한다. 상기 인플루엔자 바이러스는 단쇄, 나선형 RNA 바이러스로, 핵산의 구성에 따라 A,B,C 형으로 구분할 수 있다. 인간에게 감염을 일으키는 형태는 주로 A형 인플루엔자 바이러스로 알려져 있다. A형 인플루엔자 바이러스는 표면 항원인 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다제(neuraminidase, NA)에 의해서 아형(subtype)이 결정된다. 이러한 HA는 바이러스가 체세포에 부착하는 역할을 하며 16가지 아형(H1~H16)이 있다. NA는 바이러스가 감염된 세포로부터 방출되어 새로운 호흡기 세포로 전파되는데 중요한 역할을 하며, 이는 9가지 아형(N1~N9)이 있다.
상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 A, 인플루엔자 바이러스 B, 인플루엔자 바이러스 C일 수 있으며, 구체적으로는 H1N1형 인플루엔자 바이러스 A, H2N2형 인플루엔자 바이러스 A, H3N2형 인플루엔자 바이러스 A, H2N3형 인플루엔자 바이러스 A, H5N1형 인플루엔자 바이러스 A, H7N9형 인플루엔자 바이러스 A, 또는 인플루엔자 바이러스 B일 수 있다. 또한, 상기 인플루엔자 바이러스는 독감, 감기, 인후염, 기관지염, 폐렴을 일으킬 수 있으며, 인간 외의 동물에서 조류독감, 돼지독감 또는 염소독감 등을 야기시킬 수 있다.
본 발명의 "코로나 바이러스"및 "인플루엔자 바이러스"는 그의 변종을 포함한다. 예를 들면 SARS-CoV-2는 SARS-CoV-2로 분류될 수 있는 모든 변이 형태 또한 제한 없이 포함하며, 그 예시로 알파(B.1.1.7), 베타(B.1.351, B.1.351.2, B.1.351.3), 델타(B.1.617.2, AY.1, AY.2, AY.3), 감마(P.1, P.1.1, P.1.2) 및 오미크론(B.1.1.529, BA.1, BA.1.1, BA.2, BA.3) 변이로 칭해지는 변이를 포함할 수 있다. 변이형 SARS-CoV-2는 스파이크 단백질에 특정 치환 또는 치환 조합을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 SARS-CoV-2의 S 단백질은 A701V 치환을 포함할 수 있다. 그러나, 이에 제한되지는 않는다. 추가적으로, 상기 SARS-CoV-2는 L452R, E484K, K417N/T, E484K, N501Y 또는 이들의 치환 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스의 S 단백질(S protein) 또는 그의 단편을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
일 예로, 본 발명의 mRNA에 포함된 CDS 서열은 서열번호 4의 서열을 가지거나 포함하거나, 또는 상기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 일 예로, 서열번호 4와 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 99% 이상 또는 100%인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 발명의 mRNA는 서열번호 2의 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는, 서열번호 2의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 mRNA는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 2의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 99% 이상 또는 100%인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역원성 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 5'UTR 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "5'UTR 서열"은 개시 코돈의 상류(upstream)에 존재하는 미번역 영역을 지칭한다. 상기 5'UTR은 RNA의 번역을 조절하거나/하고 mRNA를 안정화하는데 관여할 수 있다.
본 발명의 5'UTR 서열은 mRNA의 안정성 및/또는 번역의 정확성을 향상시키도록 변형 또는 최적화 될 수 있다. 예를 들어 5' UTR에 ORF의 시작부분과 유사한 유전자 서열을 피하면 mRNA 번역 시에 frame의 잘못된 시작을 효과적으로 방지할 수 있다. 또한, mRNA의 안정성과 번역의 정확성을 향상시키기 위해 일부 특정 서열을 5' UTR에 추가할 수 있다. 예를 들어 Kozak 시퀀스를 삽입하여 번역 프로세스를 보다 정확하게 시작하도록 구성할 수 있다.
일 예로, 본 발명의 상기 5'UTR (미번역 영역) 서열은 HBA2(Hemoglobin subunit alpha 2) 유래일 수 있다. 일 예로, 상기 5'UTR 서열은 서열번호 3의 서열을 가지거나 포함하거나, 또는 상기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 일 예로, 서열번호 3과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 3의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 99% 이상 또는 100%인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 면역원성 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 3'UTR (미번역 영역) 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 "3'UTR 서열"은 mRNA의 코딩 영역의 하류(downstream)에 존재하는 미번역 영역을 지칭한다.
본 발명의 3'UTR 서열은 mRNA의 안정성 및/또는 번역의 정확성을 향상시키도록 변형 또는 최적화 될 수 있다. 일 예로, 3' UTR에 적절한 서열을 사용하여 mRNA 안정성을 높일 수 있고, 반감기를 늘릴 수 있다
일 예로, 상기 3'UTR 서열은 HBB(Hemoglobin subunit beta) 유래일 수 있다. 일 예로, 상기 3'UTR 서열은 서열번호 5의 서열을 가지거나 포함하거나, 또는 상기 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 일 예로, 서열번호 5과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 5의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 99% 이상 또는 100%인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 발명의 면역원성 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 5'UTR 서열 및 서열번호 5 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 3'UTR 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "변형된 뉴클레오티드"는 임의의 비-전형적인 뉴클레오시드, 뉴클레오티드 또는 이의 대응되는 인산화된 형태를 의미한다. 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 백본 또는 염기 변형을 가질 수 있다. 변형된 뉴클레오티드에 대한 예로는 dI, dU, 8-옥소-dG, dX 및 THF를 포함하며, 그밖에 당업계에 공지된 천연 또는 비-천연 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "비-천연"은 자연에 존재하지 않는 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지질 또는 조성물을 의미한다. 이러한 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지질 또는 조성물은 천연 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드, 탄수화물, 지질 또는 조성물과 한가지 이상의 측면에서 상이할 수 있다. 예를 들어, 폴리머 (예, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩타이드 또는 탄수화물)는 구성성분 빌딩 블록의 종류 및 배열 (예, 뉴클레오티드 서열, 아미노산 서열 또는 당 분자) 측면에서 다를 수 있다. 폴리머는 이를 연결하는 분자(들) 측면에서 천연 폴리머와 다를 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물에 포함되는 폴리뉴클레오티드는 폴리 A 테일(Poly A tail)을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "폴리 A 테일(poly A tail)"은 전형적으로 RNA 분자의 3'말단에 위치하는 아데닐산 잔기들의 연속 또는 불연속 서열을 지칭한다. 폴리 A 테일은 본 발명의 mRNA 3'UTR의 뒤에 이어질 수 있다. 이러한 폴리 A 테일은 20개 이상, 25개 이상, 40개 이상, 60개 이상, 80개 이상, 또는 100개 이상의 아데닐(A) 뉴클레오타이드로 구성되거나 이를 포함할 수 있다. 폴리-A 꼬리의 뉴클레오티드의 개수를 기준으로 전형적으로 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 A 뉴클레오티드이지만, 나머지 뉴클레오티드는 A 뉴클레오티드 이외의 뉴클레오티드, 예컨대, U 뉴클레오티드(우리딜산), G 뉴클레오티드(구아닐산), 또는 C 뉴클레오티드(시티딜산)일 수 있다. 일 예로, 폴리 A 테일은 mRNA의 분해를 지연시키도록 하는 변형을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "면역원성"은 체내에 유입되었을 때 면역반응을 유발하는 성질을 지칭한다. 본 발명의 면역원성 조성물을 개체에 투여하여 개인의 감염을 예방할 수 있다. 따라서, 본 발명의 면역원성 조성물은 백신 조성물일 수 있다.
상기 면역원성 조성물은 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 유도하는 것일 수 있다. 상기 바이러스에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 면역원성 조성물은 제제화된 것일 수 있다. 이러한 제제는 고형 또는 액상, 또는 그의 조합일 수 있다. 일 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 주입, 정맥투여에 적합한 형태로 제제화 된 것일 수 있다.
일 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 입자 형태로 제제화 된 것일 수 있다. 상기 입자는 지질 나노입자 일 수 있다. 그 예로, LNP(Lipid nanoparticle) 또는 LPX(Lipoplex)일 수 있다. LNP 입자는 이온화 가능 양이온성 지질(ionizable cationic lipid) 을 일 구성성분으로 포함하며, mRNA를 캡슐화하거나 전달 효율, 안정화에 도움을 주는 헬퍼 지질(helper lipid), 안정화제(stabilizer) 와 같은 기타 성분 또한 포함할 수 있다. 예를 들어, LNP는 양이온성 지질과 중성 지질(예를 들어, 인지질), 스테롤 또는 스테로이드(예를 들어, 콜레스테롤), PEG-접합된 지질 등을 포함할 수 있다. 이때, 상기 양이온성 지질의 구체예로는 BNT162b2 백신에 사용된 ALC-0315, mRNA-1273 백신에 사용된 SM-102, N,N-dioleyl-N,N-dimethyIammonium chloride (DODAC), N-(l-(2,3-dioleyloxy)propyl)-N,N,N-trimethylammonium chloride(DOTMA), N-(l-(2,3-dioleoyloxy)propyl)-N,N,N- trimethylammonium chloride (DOTAP), N,N-dimethyl-(2,3-dioleyloxy)propylamine (DODMA), N,N-distearyl-N,N-dimethylammonium bromide(DDAB), 1,2-dilinoleyloxy-N,N-dimethylaminopropane(DLinDMA), 1,2-dilinolenyloxy-N,Ndimethylaminopropane (DLenDMA), DLin-KC2-DMA, (6Z,9Z,28Z,31Z)-Heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl 4-(dimethylamino)butanoate (DLinMC3-DMA, CAS 1224606-06-7), ((4-hydroxybutyl)azanediyl)bis(hexane-6,1-diyl)bis(2-hexyldecanoate) 등을 사용할 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 나노입자는 전술한 종류 등의 양이온성 지질(전체 지질의 35 내지 60 mol% 범위), DSPC와 같은 인지질(전체 지질의 5 내지 15 mol% 범위), 콜레스테롤(전체 지질의 30 내지 50 mol% 범위), DMG-PEG2000와 같은 PEG-접합된 지질(전체 지질의 0.5 내지 2.5 mol% 범위)을 포함한 것일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 나노입자는 아래에 나타낸 BNT162b2, 또는 mRNA-1273 백신에 사용된 지질 화합물을 포함한 것일 수 있고, 더욱 구체적으로는 ALC-0315:DSPC:Chol:ALC-0159 (47.5:10:40.8:1.7 mol%)로 이루어진 입자일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 지질 나노입자의 지질로 WO2014/172045A1, WO2020/252589A1, WO2021/000041A1에 개시된 지질 화합물들을 특별한 제한 없이 사용할 수 있고, PNI123/DSPC/Cholesterol/PEG-DMG (50:10:38.5 또는 37.5:1.5 또는 2.5 mol%), PNI123/DOPE/Cholesterol/PEG-DMG를 사용할 수도 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
LPX 입자는 폴리뉴클레오티드를 리포좀과 혼합하여 제조될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 콜로이드 형태로 제제화 될 수 있다. 일 예로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 입자 형태로 제제화되어 콜로이드의 분산된 상을 형성할 수 있다. 그러나 이에 제한되지 않는다.
상기 면역원성 조성물은 약학적으로 허용되는 허용가능한 운반체, 부형제, 결합제, 담체, 보존제, 완충제, 등장화제, 에멀전화제 또는 습윤제를 추가로 포함하는 것일 수 있다.
상기 면역원성 조성물은 포유류에서 항체를 발생시키는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 면역원성 조성물은 1회 투여 용량 또는 다회 투여(multidose) 용량으로 제공될 수 있다. “다회투여량” 또는 "다중투여량"은 하나의 대상체 또는 하나 초과의 대상체에게 투여될 수 있는 1회 초과 (예를 들어, 2회 이상) 하여 접종 가능한 용량을 포함하는 제제 단위를 지칭한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 면역학적 유효량의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 용어 "면역학적 유효량"은 개체에게 투여된 경우, 항원에 대한 항체 반응을 유발하는 데 효과적인 양이다. 면역학적 유효량은 치료될 개체의 건강 및 신체 조건, 이들 개체의 연령, 개체의 면역계가 항체를 합성하는 역량, 필요한 보호 수준, 조성물의 제형, 의료 상황에 대한 치료 의사의 평가, 및 다른 관계된 인자에 따라 다양할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 면역원성 조성물은 어쥬번트(adjuvant)를 포함할 수 있다. 본 발명에서 "어쥬번트" 란 본 발명의 면역원성 조성물의 면역원성을 증가시키는데 사용되는 물질을 말한다. 상기 어쥬번트는 종종 면역 반응을 증진시키기 위하여 제공된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 면역원성 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 면역원성 조성물의 제조방법은 화학식 5 내지 8 중 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 염과 DNA 주형을 포함하는 조성물을 혼합하여 mRNA 합성을 수행하는 단계를 포함할 수 있다:
[화학식 5]
[화학식 6]
[화학식 7]
[화학식 8]
상기 염의 예시로 소듐 염, 포타슘 염, 트리스(Tris), 암모늄 염, 마그네슘 염 등을 들 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, 상기 염은 소듐 염일 수 있다. 구체적으로는 3소듐 염일 수 있다. 그러나 이에 제한되는 것은 아니다.
구체적으로 상기 제조방법은 화학식 7 또는 8 중 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 염을 포함하는 조성물과 DNA 주형을 포함하는 조성물을 포함하여 mRNA 합성을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 DNA 주형은 서열번호 1의 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는, 서열번호 1의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다. 일 예로, 상기 DNA 주형은 서열번호 1의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상 또는 100%인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 1의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상 99% 이상 또는 100%인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 DNA 주형(template)은 mRNA 폴리뉴클레오티드와 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 상기 DNA 주형은 전사를 시작하기 위한 임의의 RNA 폴리머라제에 대한 임의의 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어 상기 DNA 주형은 핵산, 예컨대 cDNA를 클로닝하고 전사를 위한 적절한 발현 카세트 혹은 벡터에 도입함으로써 수득할 수 있다. 상기 DNA 주형은 면역원성을 나타내는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 유래의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 mRNA 합성은 인비트로(in vitro)에서 수행될 수 있다. 이러한 mRNA 합성방법은 당업계에 공지되어 있다.
일 예로 상기 DNA 주형은 mRNA의 폴리 A 테일에 대응하는 dA 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 폴리 A 테일에 대응하는 dA 뉴클레오티드 서열 내에 dA, dG, dT, dC 등의 뉴클레오티드가 포함될 수 있다.
상기 제조방법은 mRNA 의 폴리 A 테일링을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 폴리 A 테일링은 주형 DNA에 의해 암호화된 폴리 A 테일이 의존적 RNA 중합효소에 의해 전사되거나, 또는 합성된 mRNA에 폴리 A 서열을 부착하여 수행될 수 있다.
상기 제조방법은 mRNA를 제제화 하는 단계를 포함할 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용할 있다. 그 예로, 상기 제조방법은 mRNA를 지질 나노입자에 포함된 형태로 제조하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 면역원성 조성물을 제조하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 면역원성 조성물을 제조하기 위한 조성물은 전술한 화학식 5 내지 8 중 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 염; 및 DNA 주형을 포함할 수 있다. 상기 화학식의 화합물 및 DNA 주형에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 면역원성 조성물을 제조하기 위한 조성물에는 RNA를 합성하기 위해 필요한 구성요소가 포함될 수 있다. 구체적으로는 인비트로(in vitro)의 전사(IVT)를 위한 구성요소가 포함될 수 있다. 일 예로, 상기 조성물은 RNA 폴리머라제를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 조성물은 ATP, GTP, UTP, CTP 또는 이의 유사체(analogue)를 포함할 수 있다. 일 예로, 상기 조성물은 완충액을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 면역원성 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염 질환의 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 면역원성 조성물은 바이러스 감염에 의해 발병되는 질환을 예방하는 데 사용될 수 있다. 본 발명의 용어 "예방" 이란 질환 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 개체는 바이러스 감염질환이 발생할 수 있는 동물은 제한 없이 포함한다. 구체적으로는, 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 바이러스 감염 질환이 치료되는 개체는 제한 없이 포함한다.
상기 면역원성 조성물, 바이러스에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 발명에서 개시하는 특정 5'Cap 구조를 포함한 mRNA는 인비트로 전사 효율이 높으며 이를 포함한 조성물의 면역원성이 우수하므로 백신 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예> Cap Reagent 제조
3가지 Cap Reagent에 해당하는 제조예 20-22 화합물을 제조하였다.
약어의 설명
이하 사용되는 약어는 다음과 같다.
TBSCl: 삼차-뷰틸다이메틸실일 클로라이드
DMAP: 4-디메틸아미노피리딘
DMSO: 디메틸설폭사이드
TFA: 트리플루오로아세트산
DCM: 다이클로로메테인
TEP: 트리에틸포스페이트
DPS: 2,2'-디피리딜 디설파이드
PPh3: 트리페닐포스핀
DMF: 디메틸포름아미드
DMS: 디메틸설페이트
PW: 증류수
EDTA: 에틸렌다이아민테트라아세트산
THF: 테트라하이드로퓨란
ACN: 아세토니트릴
TEA: 트리에틸아민
TCA: 트리클로로아세트산
스킴 1
제조예 1: 5'-O-tert-부틸디메틸실릴-구아노신 (1)의 제조
구아노신 20 g(70.6mmol)을 디메틸설폭사이드 200ml에 용해한 후 질소 하에서 트리에틸아민 21.6 g(155.4mmol), tert-부틸디메틸실릴 클로라이드 21.2 g(141.2mmol), 디메틸아미노피리딘 860 mg(7mmol)을 첨가하였다. 실온에서 24시간 교반한 후 0 ~ 5℃의 증류수에 서서히 적가하여 생성된 침전물을 여과하였다. 여과된 침전물을 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 목적 화합물 24.4 g(87%)(1)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, CD3OD, 25℃): δ= 7.96 (s, 1H), 5.89 (d, 1H), 4.47 (t, 1H), 4.33 (t, 1H), 4.08 (m, 1H), 3.94 ~ 3.87 (m, 2H), 0.94 (m, 9H), 0.12 (m, 6H).
제조예 2: 2',3'-피발로일-5'-O-tert-부틸디메틸실릴-구아노신 (2)의 제조
5'-O-tert-부틸디메틸실릴-구아노신 10 g(25.2mmol)(1)을 무수 피리딘 100ml에 녹이고 피발릭 무수화물 23.4 g(125.6mmol)을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 반응 완결 후 에틸 아세테이트 500 ml를 투입하고 포화 중조 수용액 400 ml, 20% 구연산 400 ml로 세척한 후 황산 마그네슘으로 건조하고 감압증류하였다. 컬럼 트로마토그래피를 이용하여 목적 화합물 10.26 g(72%)(2)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.70 (s, 1H), 7.83 (d, 1H), 6.51 (br, 2H), 5.93 (d, 1H), 5.69 (m, 1H), 5.40 (m, 1H), 4.21 (m, 1H), 3.86 (m, 2H), 1.20 (s, 9H), 1.04 (s, 9H), 0.88 (s, 9H), 0.08 (s, 6H).
제조예 3: 2',3'-피발로일-구아노신 (3)의 제조
2',3'-피발로일-5'-O-tert-부틸디메틸실릴-구아노신 10 g(17.6mmol)(2)을 디클로로메탄 300mL에 녹이고 증류수 8ml와 트리플루오로아세트산 70ml를 차례로 첨가하였다. 30분 교반한 후 2N 수산화 나트륨으로 중화하였다. 유기층과 수층을 분리하여 수층을 디클로로메탄 300ml로 추출하고 유기층을 모아 포화 중조 수용액과 염수로 세척한 후 황산 마그네슘으로 건조하고 감압증류하였다. 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 목적 화합물 5.16 g(64.7%)(3)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.69 (s, 1H), 7.97 (d, 1H), 6.49 (br, 2H), 5.92 (d, 1H), 5.72 (dd, 1H), 5.45 (t, 1H), 5.40 (dd, 1H), 4.16 (m, 1H), 3.67 (m, 2H), 1.21 (m, 9H), 1.05 (m, 9H).
실시에 4: 2',3'-피발로일-구아노신 5'-모노포스페이트 (pG(2',3' Pivaloyl))(4)의 제조
2',3'-피발로일-구아노신 4.51 g (10 mmol) (3)을 트라이에틸 인산염 40 mL에 투입하고 60-70 ℃에서 용해하였다. 반응액을 0 ℃로 냉각하고 옥시 염화인 2.8 mL (30 mmol)를 첨가한 후 실온으로 승온하여 질소 하에서 3시간 교반하였다. 1M 트리에틸암모늄 바이카보네이트 버퍼 100 mL (pH 8.5)를 서서히 적가하여 8시간 교반한 후 증류수 1 L를 투입하였다. 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 분리하고 메탄올 50 mL로 4회 공비하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄 염 3.79 g (수율 60.0 %) (4)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6, 25℃): δ= 10.72 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 6.68 (br, 2H), 5.94 (d, 1H), 5.83 (m, 1H), 5.46 (m, 1H), 4.28 (m, 1H), 4.00 (m, 2H), 1.21 (m, TEA overlapped, 9H), 1.03 (m, 9H). LC-MS (ESI, m/z) = 532.17 [M + H+]
제조예 5: 2',3'-피발로일-구아노신 5'-디포스페이트 이인산염 (ppG(2',3' Pivaloyl)) (5)의 제조
pG(2',3' Pivaloyl) 트리에틸암모늄 염 3.16 g (5.0 mmol)(4)을 디메틸포름아미드 250 mL에 투입한 후 이미다졸 3.40 g (50 mmol), 트리페닐포스핀 6.56 g (25 mmol), 2,2'-디피리딜 디설파이드 5.51 g (25 mmol), 트리에틸아민 0.51 g (5.0 mmol)을 첨가하여 5시간 교반하였다. 과염소산나트륨 2.45 g (20 mmol)를 아세톤 430 mL에 녹인 용액에 반응액을 투입하여 4 ℃로 냉각한 다음 생성된 결정을 여과하고 차가운 아세톤으로 세척한 후 진공 건조 하였다.
건조된 im-pG(2',3' Pivaloyl)를 디메틸포름아미드 30 mL에 투입하고 염화 아연 1.36 g (10 mmol), 트리에틸암모늄 인산염 5.98 g (30 mmol) 투입한 후 실온에서 3 ~ 16시간 교반하였다. 반응 완결 후 반응액에 증류수 870 mL, 에틸렌다이아민테트라아세트산 9.79 g (33.5 mmol) 혼합액을 투입한 후 20분간 교반하였다. 반응액을 1M 중조 수용액을 이용하여 pH 6 ~ 7로 중화시킨 후 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 분리하고 메탄올 35 mL로 4회 공비하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄 염 2.44 g (수율 60.0%) (5) 을 얻었다. . 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 7.99 (s, 1H), 6.00 (d, 1H), 5.71 (m, 1H), 5.52 (m, 1H), 4.49 (m, 1H), 4.16 (m, 2H), 1.11 (m, TEA overlapped, 9H), 0.95 (m, 9H). 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -8.38 (d, 1P), -10.69 (d, 1P).
제조예 6: 7-메틸-2',3'-피발로일-구아노신 5'-이인산염 (pp7mG(2',3' Pivaloyl)) (6)의 제조
ppG(2',3' Pivaloyl) 트리에틸암모늄 염 2.44 g(3.0 mmol) (5) 을 증류수 50mL에 용해하고 빙초산을 이용하여 반응액의 pH를 4.0으로 맞추었다. 반응액에 디메틸설페이트 10mL (105.45 mmol)를 30분에 걸쳐 서서히 첨가한 후 4시간 교반하였다. 이때 반응액의 pH는 0.1 N 수산화나트륨을 이용하여 4.0±0.5로 유지하였다. 반응액을 다이클로로메탄 150 mL로 3회 추출하여 미반응 디메틸설페이트를 제거한 후 수층을 pH 5.5로 맞추고 증류수 500 mL를 투입하였다. 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 pp7mG(2',3' Pivaloyl)를 분리하고 증류, 진공 건조하여 트리에틸암모늄염 1.74 g (수율 80%) (6) 을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 9.35 (s, 1H), 6.30 (d, 1H), 5.71 (m, 1H), 5.58 (m, 1H), 4.69 (m, 1H), 4.32 ~ 4.15 (m, 2H), 4.11 (s, 3H), 1.25(m, 9H), 1.19 (m, 9H). LC-MS (ESI, m/z) = 624.14 [M - H]-
제조예 7: 7-메틸-2',3'-피발로일-구아노신 5'-이인산염 이미다졸라이드 (im-pp7mG(2',3'Pivaloyl) (7)제조
pp7mG(2',3' Pivaloyl) 트리에틸암모늄 염 1.26 g (1.73mmol) (6)을 디메틸포름아미드 25 mL에 용해하고 이미다졸 941.63 mg (13.83 mmol), 2,2'-디피리딜 디설파이드 1.14 g (5.19 mmol), 트리에틸아민 0.482 mL (3.46 mmol), 트라이페닐포스핀 1.36 g (5.19 mmol)을 투입한 다음 6 ~ 8시간 교반하였다. 과염소산나트륨 847 mg (6.92 mmol)을 아세톤 175 mL에 녹인 용액에 반응액을 투입하여 4 ℃로 냉각한 다음 생성된 결정을 여과하고 차가운 아세톤으로 세척한 후 진공 건조하여 목적 화합물 967 mg (수율 80.0 %)을 얻었다 (7).
스킴 2
제조예 8: 2',2'-디플루오로-구아노신 5'-모노포스페이트 (pG(2'FF)) (8)의 제조
2',2'-디플루오로-구아노신의 경우 상업적으로 입수하여 추가 처리없이 시작물질로 사용하였다. 2',2'-디플루오로-구아노신 3.03 g (10 mmol)을 트라이에틸 인산염 40 mL에 투입하고 60 ~ 70 ℃에서 용해하였다. 반응액을 0 ℃로 냉각하고 옥시 염화인 2.8 mL (30 mmol)를 첨가한 후 실온으로 승온하여 질소 하에서 3시간 교반하였다. 1M 트리에틸암모늄 바이카보네이트 버퍼 100 mL (pH 8.5)를 서서히 적가하여 8시간 교반한 후 증류수 1 L를 투입하였다. 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 분리하고 메탄올 50 mL로 4회 공비하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄 염 2.9 g (수율 60%) (8)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃):δ= 8.41 (s, 1H), 6.50 (t, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.24 ~ 4.14 (m, overlapped, 3H); 19F NMR (377 MHz, D2O, 25℃):δ= -119.81 (s, 2F); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃):δ= 2.04 (s, 1P).
제조예 9: 2',2'-디플루오로-구아노신 5'-디포스페이트 이인산염 (ppG(2'FF)) (9)의 제조
pG(2'FF) 트리에틸암모늄 염 2.42 g (5.0 mmol) (8) 을 디메틸포름아미드 250 mL에 투입한 후 이미다졸 3.40 g (50 mmol), 트리페닐포스핀 6.56 g (25 mmol), 2,2'-디피리딜 디설파이드 5.51 g (25 mmol), 트리에틸아민 0.51 g (5.0 mmol)을 첨가하여 5시간 교반하였다. 과염소산나트륨 2.45 g (20 mmol)를 아세톤 430 mL에 녹인 용액에 반응액을 투입하여 4℃로 냉각한 다음 생성된 결정을 여과하고 차가운 아세톤으로 세척한 후 진공 건조 하였다. 건조된 im-pG(2'-FF)를 디메틸포름아미드 30 mL에 투입하고 염화 아연 1.36 g (10 mmol), 트리에틸암모늄 인산염 5.98 g (30 mmol) 투입한 후 실온에서 3 ~ 16시간 교반하였다. 반응 완결 후 반응액에 증류수 870 mL, 에틸렌다이아민테트라아세트산 9.79 g (33.5 mmol) 혼합액을 투입한 후 20분간 교반하였다. 반응액을 1M 중조 수용액을 이용하여 pH 6 ~ 7로 중화시킨 후 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 분리하고 메탄올 35 mL로 4회 공비하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄 염 2.0 g (수율 60.0%) (9)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃):δ= 8.38 (s, 1H), 6.50 (t, 1H), 4.65 (m, 1H), 4.32 ~ 4.20 (m, overlapped, 3H); 19F NMR (377 MHz, D2O, 25℃): δ= -119.87 (s, 2F); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃):δ= -8.71 (d, 1P), -10.55 (d, 1P).
제조예 10: 7-메틸-2',2'-디플루오로-구아노신 5'-이인산염 (pp7mG(2'FF)) (10)의 제조
ppG(2'FF) 트리에틸암모늄 염 2.0 g(3.0 mmol) (9)을 증류수 50mL에 용해하고 빙초산을 이용하여 반응액의 pH를 4.0으로 맞추었다. 반응액에 디메틸설페이트 10mL (105.45 mmol)를 30분에 걸쳐 서서히 첨가한 후 4시간 교반하였다. 이때 반응액의 pH는 0.1 N 수산화나트륨을 이용하여 4.0±0.5로 유지하였다. 반응액을 다이클로로메탄 150 mL로 3회 추출하여 미반응 디메틸설페이트를 제거한 후 수층을 pH 5.5로 맞추고 증류수 500 mL를 투입하였다. 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 pp7mG(2'-FF)를 분리하고 증류, 진공 건조하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄염 1.41 g (수율 80.0 %) (10)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃):δ= 9.34 (s, 1H), 6.62 (d, 1H), 4.75 (m, 1H), 4.40 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 3.82 (s, 3H). 19F NMR (377 MHz, D2O, 25℃):δ= -121.12 (s, 1F), -121.23 (s, 1F). LC-MS (ESI, m/z) = 476.01 [M - H]-
제조예 11: 7-메틸-2',2'-디플루오로-구아노신 5'-이인산염 이미다졸라이드 (Im-pp7mG(2'FF)) (11)제조
pp7mG(2'FF) 트리에틸암모늄 염 1.0 g (1.73mmol) (10) 을 디메틸포름아미드 25 mL에 용해하고 이미다졸 941.63 mg (13.83 mmol), 2,2'-디피리딜 디설파이드 1.14 g (5.19 mmol)을 첨가하였다. 반응액에 트리메틸아민 0.482 mL (3.46 mmol), 트라이페닐포스핀 1.36 g (5.19 mmol)을 투입한 다음 6-8시간 교반하였다. 과염소산나트륨 847 mg (6.92 mmol)을 아세톤 175 mL에 녹인 용액에 반응액을 투입하여 4℃로 냉각한 다음 생성된 결정을 여과하고 차가운 아세톤으로 세척한 후 진공 건조하여 목적 화합물 761 mg (수율 80.0 %) (11)을 얻었다.
스킴 3
제조예 12: 3'-피발로일-구아노신 모노포스페이트 (pG(3' Pivaloyl)) (12)의 제조
상업적으로 입수한 구아노신 모노포스페이트를 추가처리 없이 시작물질로 사용하였다. 구아노신 모노포스페이트 5 g (11.8 mmol)을 증류수 50ml에 녹이고 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5로 적정하였다. 상온에서 피발릭 무수화물 9.56 g (51.3 mmol)을 첨가하여 실온에서 교반하였다. 상온에서 1M NaOH를 이용하여 pH 9.5 ~ 9.6을 유지하며 4 ~ 12시간 동안 반응하였다. 반응 완결 후 50% 아세트산을 투입하여 pH를 7.0으로 적정 후 여과하여 여액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 목적 화합물을 분리하고 증류, 질소 건조하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄염 4.06 g (수율 53.0 %) (12)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃):δ= 8.10 (m, 1H), 8.07 (m, 0.45H), 6.03 (m, 0.45H), 5.92 (m, 1H), 5.50 (m, 0.45H), 5.36 (m, 1H), 4.98 (t, 1H), 4.67 (t, 0.45H), 4.41 (m, 1H), 4.30 (m, 0.45H), 4.00 (m, overlapped, 4.35H), 1.22 (s, 9H), 1.13 (s, 4.5H); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= 2.46 (s, 0.56P), 2.25 (s, 1P).
제조예 13: 3'-피발로일-구아노신 5'-디포스페이트 이인산염 (ppG(3' Pivaloyl)) (13)의 제조
pG(3' Pivaloyl) 트리에틸암모늄 염 4.09 g (6.29 mmol)(12)을 디메틸포름아미드 70 mL에 투입한 후 이미다졸 2.55 g (37.5 mmol), 트리페닐포스핀 4.91 g (18.7mmol), 2,2'-디피리딜 디설파이드 4.09 g (18.6mmol), 트리에틸아민 0.64g (6.3mmol)을 첨가하여 1 ~ 12시간 교반하였다. 반응 완결 후, 과염소산나트륨 3.08 g (25.16 mmol)를 아세톤 556 mL에 녹인 용액에 반응액을 투입하여 4℃로 냉각한 다음 생성된 결정을 여과하고 차가운 아세톤으로 세척한 후 진공 건조 하였다. 건조된 im-pG(3' Pivaloyl)를 디메틸포름아미드 90 mL에 투입하고 염화 아연 2.57 g (18.87 mmol), 트리에틸암모늄 인산염 5.98 g (37.74 mmol) 투입한 후 실온에서 3 ~ 16시간 교반하였다. 반응 완결 후 반응액에 증류수 1.1 L, 에틸렌다이아민테트라아세트산 11 g (37.74 mmol) 혼합액을 투입한 후 20분간 교반하였다. 반응액을 1M 중조 수용액을 이용하여 pH 6 ~ 7로 중화시킨 후 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 분리하고 메탄올 35 mL로 4회 공비하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄 염 3.66 g (수율 70.0%) (13) 을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃):δ= 8.11 (s, 1H), 8.05 (s, 0.51H), 6.04 (d, 0.52H), 5.94 (d, 1H), 5.55 (t, 0.52H), 5.43 (dd, 1H), 5.06 (dd, 1H), 4.46 (m, 1H), 4.33 (m, 0.53H), 4.29 ~ 4.17 (m, overlapped, 4H); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -9.62 (m, 1.5P), -10.74 (m, 1.5P).
제조예 14: 7-메틸-3'-피발로일-구아노신 5'-이인산염 (pp7mG(3' Pivaloyl)) (14)의 제조
ppG(3' Pivaloyl) 트리에틸암모늄 염 3.25 g(3.91 mmol) (13)을 증류수 66mL에 용해하고 빙초산을 이용하여 반응액의 pH를 4.0으로 맞추었다. 반응액에 디메틸설페이트 19.7 g (156 mmol)를 30분에 걸쳐 서서히 첨가한 후 4시간 교반하였다. 이때 반응액의 pH는 1M 수산화나트륨을 이용하여 4.0±0.5로 유지하였다. 반응액을 다이클로로메탄 195 mL로 3회 추출하여 미반응 디메틸설페이트를 제거한 후 수층을 pH 5.5로 적정하였다. 반응액을 DEAE Sephadex 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 pp7mG(3' Pivaloyl)를 분리하고 증류, 진공 건조하여 트리에틸암모늄염 2.33 g (수율 80%) (14) 을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃):δ= 9.29 (s, 0.69H), 9.24 (s, 0.53H), 6.18 (d, 0.85H), 6.10 (d, 1H), 5.56 (dd, 0.85H), 5.36 (dd, 1H), 4.94 (m, 1H), 4.73 (m, 0.85H), 4.57 (m, 1H), 4.41 (m, 0.85H), 4.35 (m, 0.85H), 4.25 ~ 4.13 (m, overlapped, 2.85H), 4.10 (s, 3H), 4.09 (s, 0.85H), 1.22 (s, 9H), 1.19 (s, 7.6H). LC-MS (ESI, m/z) = 542.10 [M + H+]
제조예 15: 7-메틸-3'-피발로일-구아노신 5'-이인산염 이미다졸라이드 (im-pp7mG(3'Pivaloyl) (15) 제조
pp7mG(3' Pivaloyl) 트리에틸암모늄 염 1.29 g (1.73mmol) (14)을 디메틸포름아미드 22 mL에 용해하고 이미다졸 707 mg (10.38 mmol), 2,2'-디피리딜 디설파이드 1.14 g (5.19 mmol)을 첨가하였다. 반응액에 트리에틸아민 175 mg (1.73 mmol), 트라이페닐포스핀 1.36 g (5.19 mmol)을 투입한 다음 1 ~ 12시간 교반하였다. 반응 완결 후, 과염소산나트륨 847 mg (6.92 mmol)을 아세톤 175 mL에 녹인 용액에 반응액을 투입하여 4 ℃로 냉각한 다음 생성된 결정을 여과하고 차가운 아세톤으로 세척한 후 진공 건조하여 목적 화합물 796 mg (수율 75.0 %)을 얻었다 (15).
스킴 4
제조예 16: N2-이소부티릴-2',3'-디아세톡시-구아노신 (16)의 제조
N2-이소부티릴-5'-O-디엠티 구아노신 2.4 g (3.66 mmol)을 디클로로메탄 12 ml에 녹인 후 피리딘 1.47 ml (18.3 mmol), 무수아세트산 1.78 ml (18.3 mmol)을 투입하여 실온에서 5시간 동안 교반 하였다. 반응액에 에틸아세테이트 24 ml를 가하여 추출 후 중조 포화 수용액 14.4 ml, 20% 시트르산 수용액 14.4 ml, 증류수 14.4 ml에서 세척하였다. 유기층을 황산나트륨으로 건조 후 감압 증류한 잔사를 하루 동안 질소 건조 하였다. 건조물에 3% 트리클로로아세트산 수용액 36 ml를 첨가하여 실온에서 3시간 동안 반응 후 메탄올 24 ml를 가하여 추가로 2시간 30분 동안 교반 하였다. 반응액을 감압 증류하여 디클로로메탄 36 ml, 증류수 18 ml를 가한 후 중조 포화 수용액을 투입하여 중화 하였다. 유기층을 분리한 뒤 황산나트륨으로 건조 후 감압 증류하였다. 감압 증류한 잔사를 에틸아세테이트 12 ml에 녹인 후 실온에서 헥센 108 ml에 서서히 첨가하여 결정화 하였다. 생성된 결정을 여과하고 헥센 12 ml에 3회 반복 세척한 후 진공 건조하여 목적 화합물 (16) 1.43 g (수율 89.6 %)을 얻었다. LC-MS (ESI, m/z) = 438.16 [M + H+]
제조예 17: (N2-이소부티릴-2',3'-디아세톡시-구아노시닐)-N6-벤조일-2'-메톡시-아데노시닐 시아노에틸 인산 에스테르 (17)의 제조
5'-O-디엠티-N6-벤조일-2'-메톡시-아데노신 아미디트 경우 상업적으로 입수하여 추가 처리 없이 시작물질로 사용하였다. N2-이소부티릴-2',3'-디아세톡시-구아노신 (16) 1.43 g (3.28 mmol)과 5'-O-디엠티-N6-벤조일-2'-메톡시-아데노신 아미디트 3.78 g (4.26 mmol)을 1H-테트라졸 28.4 mL (0.45 M 아세토나이트릴 용액, 12.79 mmol)에 용해하고 실온에서 1시간 교반 하였다. 아이오딘 544 mg (2.15 mmol)을 테트라하이드로퓨란:증류수:피리딘 혼합액 (v:v:v, 7:2:1) 56.7 ml에 녹인 후 그 용액을 반응액에 투입하고 45분 동안 교반 하였다. 반응액에 10% 티오황산나트륨 수용액 7.2 ml를 첨가한 후, 디클로로메탄 43 ml, 증류수 14.3 ml를 가한 후 유기층을 분리하였다. 분리된 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 감압 증류한 다음 하루 동안 질소 건조하였다. 건조물에 3% 트리클로로아세트산 수용액 21.5 ml를 첨가하여 실온에서 3시간 동안 반응 후 메탄올 14.3 ml를 가하여 추가로 2시간 30분 동안 교반 하였다. 반응액을 감압 증류하여 디클로로메탄 21.5 ml, 증류수 10.7 ml를 가한 후 중조 포화 수용액을 투입하여 중화 하였다. 분리한 유기층을 증류수에 세척한 후 황산나트륨으로 건조하여 감압 증류하였다. 감압 증류한 잔사를 디클로로메탄 28.6 ml에 녹인 후 실온에서 메틸 삼차 부틸 에테르 86 ml에 서서히 첨가하여 결정화 하였다. 생성된 결정을 여과하고 하루 동안 진공 건조하여 목적 화합물 (17) 2.7 g (수율 87.8 %)을 얻었다. LC-MS (ESI, m/z) = 938.28 [M + H+]
제조예 18: p(OCE) 2 A bz (2'OMe)p(OCE)G ib (2',3'OAc) (18)의 제조
(N2-이소부티릴-2',3'-디아세톡시-구아노시닐)-N6-벤조일-2'-메톡시-아데노시닐 시아노에틸 인산 에스테르 (17) 2 g (2.13mmol), 비스(2-시아노에틸)-N,N-디이소프로필포스포아미디트 1.11 ml (4.26 mmol)을 1H-테트라졸 9.47 mL (0.45 M 아세토나이트릴 용액, 4.26 mmol)에 용해하고 실온에서 30분 동안 교반 하였다. 아이오딘 811 mg (3.2 mmol)을 테트라하이드로퓨란:증류수:피리딘 혼합액 (v:v:v, 7:2:1) 30 ml에 녹인 후 그 용액을 반응액에 투입하고 30분 동안 교반 하였다. 반응액에 10% 티오황산나트륨 수용액 20 ml를 첨가한 후, 디클로로메탄 100 ml, 증류수 40 ml를 가한 후 유기층을 분리하였다. 분리된 유기층을 황산나트륨으로 건조하고 감압 증류 하였다. 감압 증류한 농축액을 디클로로메탄 27 ml를 가하여 녹인 후 실온에서 메틸 삼차 부틸 에테르 133 ml에 서서히 첨가하여 결정화 하였다. 생성된 결정을 여과하고 하루 동안 진공 건조하여 목적 화합물 (18) 2.2 g (수율 92.2 %)을 얻었다. LC-MS (ESI, m/z) = 1124.30 [M + H+]
제조예 19: pA(2'OMe)pG (19)의 제조
p(OCE)2Abz(2'OMe)p(OCE)Gib(2',3'OAc) (18) 2 g (1.78 mmol)을 메탄올 44 mL와 진한 암모니아 44 mL의 혼합액에 투입한 후 50 ~ 55℃에서 24시간 동안 교반 하였다. 반응이 완결되면 용매를 감압 증류하고 농축물에 메탄올 20 mL를 투입하여 3회 증류하였다. 농축액은 다시 증류수에 용해 후 DEAE Sepharose 컬럼 과 역상 크로마토그래피를 이용하여 정제하여 목적 화합물의 트리에틸암모늄 염 (19) 1.13 g (수율 70 %)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.44 (s, 1H), 8.12 (s, 1H), 7.90 (s, 1H), 6.07 (m, 1H), 5.80 (m, 1H), 4.46 ~ 4.01 (m, 8H), 3.45 (m, 3H) LC-MS (ESI, m/z) = 707.13 [M + H+]
스킴 5
제조예 20: 7mG(2',3'Pivaloyl)pppA(2'OMe)pG (20)의 제조
디메틸포름아미드 27.5 mL에 염화마그네슘 0.55 g을 첨가하여 용해 하였다. 반응액에 Im-pp7mG(2', 3'Pivaloyl) (7) 0.69g (0.99 mmol) 및 pA(2'OMe)pG (19) 0.5 g (0.55 mmol)를 투입하여 실온에서 24시간 교반 하였다. 반응이 완결된 후 25 mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 수용액 275 mL를 적가하여 반응을 종결하고 실온으로 냉각한 후 1M 중조 수용액으로 중화하였다. 반응액을 DEAE Sepharose 컬럼 (140 x 210 mm)을 이용하여 정제하고 증류 후 진공 건조하였다. 건조된 고체를 2.5 ml 증류수에 녹인 후 과염소산나트륨 299 mg (2.44 mmol)를 아세톤 15 mL에 녹인 용액에 투입하여 4 ℃로 냉각한 다음 생성된 결정을 여과하고 차가운 아세톤으로 세척한 후 진공 건조하여 목적 화합물의 나트륨 염 (20) 0.46 g (수율 60.0 %)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.20 (s, 1H), 7.91 (s, 1H), 7.75 (s, 1H), 5.75 ~ 5.72 (m, 2H), 5.65 (m, 1H), 5.33 (m, 1H), 5.24 (m, 1H), 4.60 (m, 1H), 4.29 ~ 3.96 (m, 12H), 3.91 (m, 3H), 3.26 (m, 3H), 1.02 (s, 9H), 0.90 (s, 9H)); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃):δ= -0.32 (s, 1P), -11.01 ~ -11.22 (dd, 2P), -22.26 (t, 1P). LC-MS (ESI, m/z) = 1314.27 [M + H+].
스킴 6
제조예 21: 7mG(2'FF)pppA(2'OMe)pG (21)의 제조
제조예 20과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 제조예 20의 Im-pp7mG(2',3'Pivaloyl) (7) 대신 제조예 11의 Im-pp7mG(2'FF) (11)을 사용하여 제조예 21의 화합물을 제조하였다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.32 (s, 1H), 8.03 (s, 1H), 7.87 (s, 1H), 6.45 (d, 1H), 5.89 (d, 1H), 5.76 (d, 1H), 4.87 ~ 4.83 (m, 2H), 4.55 (m, 1H), 4.45 (m, 3H), 4.32 ~ 4.14 (m, 8H), 3.68 (s, 3H), 3.36 (s, 3H); 19F NMR (377 MHz, D2O, 25℃): δ= -120.73 (s, 1F), -120.95 (s, 1F); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -0.32 (s, 1P), -10.82 ~ -11.14 (dd, 2P), -22.45 (t, 1P). LC-MS (ESI, m/z) = 1164.16 [M - H]-
스킴 7
제조예 22: 7mG(3'Pivaloyl)pppA(2'OMe)pG (22)의 제조
제조예 20과 동일한 방법으로 실시하되, 상기 제조예 20의 Im-pp7mG(2',3'Pivaloyl) (7) 대신 제조예 15의 Im-pp7mG(3'Pivaloyl) (15)을 사용하여 제조예 22의 화합물 (2'O 와 3'O인 위치이성질체: 0.65:1 몰 비율)을 제조하였다. 상기 스킴 7의 제조예 22 화합물 구조는 3'Pivaloyl에 해당한다. 1H NMR (400 MHz, D2O, 25℃): δ= 8.17 (d, 1.65H), 7.93 (d, 1.65H), 7.76 (d, 1.65H), 5.79 ~ 5.64 (m, 4.95H), 5.26 (m, 0.65H), 5.11 (m, 1H), 3.88 (d, 4.95H), 3.26 (d, 4.95H), 1.06 (s, 9H), 1.02 (s, 5.85H); 31P NMR (162 MHz, D2O, 25℃): δ= -0.35 (s, 1.65P), -10.85 (dd, 3.3P), -22.31 (t, 1.65P). LC-MS (ESI, m/z) = 1230.22 [M + H+].
실시예 1. Cap Reagent 종류에 따른 mRNA 합성 및 IVT 수율 확인
본 실시예에서는 Cap Reagent 종류에 따른 mRNA 합성 공정의 IVT 수율을 확인하고자 하였다.
실시예 1-1. mRNA 합성 공정 및 재료
상기 백신에 사용되는 mRNA를 합성하기 위해, 반응 용기 (RNase-free tube)에 선형 플라스미드 DNA(서열번호 1) 주형 원액 (L-DNA)을 포함한 mRNA 합성 공정 (In vitro transcription, IVT)에 필요한 물질을 첨가한 후, 표 1의 조건에 따라 히팅 블록 (37 ℃)에서 2 ~ 3시간 동안 mRNA 합성을 진행하였다.
IVT 반응 부피에 10X Transcription buffer를 첨가하여 1X의 농도로 사용하였으며, 10X Transcription buffer의 조성은 Tris-Cl buffer : Spermidine : Triton X = 4 : 2 : 1 의 부피 비와 같다.
상기 mRNA 합성 공정 조건은 하기 표 1에 나타낸 바와 같으며, Cap Reagent는 전술한 제조예에서 제조한 Cap Reagent 1 ~ 3 (표 2) 또는 Trilink Clean Cap Reagent AG (3’OMe) (Catalog No: N-7413)일 수 있다.
mRNA 합성 공정을 종료하기 위해 DNase1을 2KU/mL 농도로 첨가하여 히팅 블록 (37 ℃)에서 15 ~ 30 분간 반응한다. 이후, 합성이 종료된 mRNA 샘플들을 대상으로 Fluorometer 장비를 이용하여 mRNA의 농도 분석을 3회 반복하여 실시한 뒤, 이들의 평균 결과 값을 산출하여 mRNA 농도를 구하고, 농도와 반응 부피를 곱하여 mRNA 함량을 산출하였다.
No. 물질명 농도
1 선형 플라스미드 DNA 주형 0.05 mg/mL
2 ATP solution 10 mM
3 CTP solution 10 mM
4 N1-Methylpseudo-UTP solution 10 mM
5 GTP solution 2 mM
6 Cap Reagent 8 mM
7 DTT solution 10 mM
8 MgCl2 solution 50 mM
9 RNase inhibitor 2 KU/mL
10 Pyrophosphatase 20 unit/mL
11 T7 RNA Polymerase 300 KU/mL
실시예 1-2. IVT 공정 수율 도출
IVT 공정 수율을 도출하기 위해, 상기 4가지의 Cap Reagent를 사용하여 합성한 mRNA의 함량을 투입한 L-DNA 함량으로 나누어 Cap Reagent에 따른 IVT 수율을 정량화하였다. 구체적으로, IVT 수율이 100일 경우, 1 μg L-DNA로 100 μg mRNA를 합성하였음을 의미한다. 이후, Cap Reagent의 대표 제조사인 Trilink 의 Clean Cap Reagent AG (3'OMe) 물질에 의한 IVT 수율을 100 %로 지정하였으며, 한미정밀화학 Cap Reagent 1 ~ 3 에서의 IVT 수율을 Trilink Clean Cap Reagent에서의 IVT 수율로 나누어 Trilink 대비 한미정밀화학 제조사의 IVT 공정 수율 (%)를 산출하였으며, 결과는 표 3과 같다. 구체적으로, Trilink Clean Cap에 의한 IVT 수율이 50이고 한미정밀화학 Cap Reagent에 의한 IVT 수율이 60일 경우, 한미정밀화학 Cap Reagent에 의한 IVT 수율(%)은 120 %이다.
[수학식 1]
IVT 공정 수율 = (합성한 mRNA 양) / (첨가한 L-DNA 양)
[수학식 2]
IVT 공정 수율 (%) = {(한미정밀화학 Cap Reagent 1 ~ 3 에 의한 IVT 공정 수율) / (Trilink Clean Cap Reagent에 의한 IVT 공정 수율)} * 100 (%)
후보군 IVT 수율 (%) 비교군 (Trilink)
Cap 1 101.8 % 100.0 %
Cap 2 71.5 % 100.0 %
Cap 3 105.3 % 100.0 %
실험결과 IVT 효율은 Cap 3, Cap 1, Cap 2 순으로, Cap 3에서 가장 우수한 효율이 확인되었으며 비교군에 비해 높은 효율을 나타내었다.
실시예 1-3. poly A tailing 공정
본 실시예에서는 Cap 1, 2, 3을 사용하여 제조된 mRNA에 Poly (A) tailing 공정을 수행하여, IVT mRNA 3' 말단에 50 ~ 200 nt 길이의 3' 폴리(A) 꼬리를 부착하였다. 구체적으로, DNase 1를 첨가하여 mRNA 합성 반응이 종결된 IVT mRNA을 포함한 Poly (A) tailing 공정에 필요한 물질을 반응 용기 (RNase-free tube)에 첨가한 후, 표 4의 조건에 따라 히팅 블록 (37 ℃)에서 30분 ~ 1시간 동안 Poly (A) tailing 공정을 수행하였다. 이후, Poly (A) tailing 공정을 종료하기 위해, 4 ℃에 반응 용기를 정치하였다.
No. 물질명 부피 비
1 IVT mRNA 20
2 10X Poly(A) Polymerase Reaction Buffer 10
3 10 mM ATP solution 10
4 Poly (A) Polymerase enzyme (4 KU/mL) 2
5 Nulcease free water 58
실시예 2. mRNA 제조 후 LNP 캡슐화
본 실시예에서는 상기 실시예 1의 Cap 1, 2, 3을 사용하여 Poly (A) tailing 공정이 완료된 mRNA 원액과 Lipid mixture를 Formulation 하여, Lipid 내에 mRNA가 봉입된 mRNA-LNP (Lipid nanoparticle)을 제조하였다.
구체적으로, Poly (A) tailing 반응 및 정제가 완료된 mRNA 원액을 Formulation Buffer로 0.17 mg/mL로 희석 및 상용화 Lipid mixture인 GenVoy-ILM (PRECISION NANOSYSTEMS) (PNI Catalog Number NWW0041, 규격 2mL)를 ethanol로 1/2 희석 후, 각각 syringe에 충진하였다. 그 후, Ignite™ 장비에 미세관 Cartridge를 장착 후 mRNA 희석액이 담긴 syringe와 Lipid mixture 희석액이 담긴 syringe를 장착하고, 3:1의 부피비로 반응하여 N/P ratio = 4의 조건으로 Formulation 공정을 수행하였다. Tube에 회수된 formulation 반응액을 Centrifugal ultrafiltration unit MWCO 50 kDa를 이용하여 20배 이상 부피의 PBS로 Buffer exchange 및 농축을 진행하였다.
회수된 mRNA-LNP 원액은 4 ℃에 보관하여 mRNA 함량 및 캡슐화 비율 측정 후, 동물실험 투여에 사용하였다.
실시예 3. mRNA-LNP 완제의약품의 캡슐화 효율 도출
본 실시예에서는 실시예 2에서 제조된 mRNA-LNP 완제의약품의 Total-RNA 함량과 Free-RNA 함량을 측정하여 LNP에 함입된 mRNA의 비율을 산출하였다.
Triton X와 같은 Surfactant를 사용하여 mRNA-LNP 완제의약품을 Lysis하여 Encapsulated mRNA의 방출이 가능하여 Total-RNA 농도를 측정하였으며, TE buffer 반응을 통해 mRNA-LNP 내부에 함입되지 않은 Free-RNA 농도를 측정하였다. Total-RNA 함량 대비 Total-RNA 함량에서 Free-RNA 함량을 뺀 함량에 대한 퍼센트 농도에 의해 캡슐화 효율 (Encapsulation efficiency) 산출이 가능하다.
구체적으로, 2 % Triton X 시액을 조제하여 microplate에서 mRNA-LNP 샘플들과 2% Triton X를 1 : 1의 부피 비로 혼합하여 Total-RNA를 준비하고, mRNA-LNP 샘플들과 TE Buffer를 1 : 1의 부피 비로 혼합하여 Free-RNA를 준비한 후, shaker 를 이용하여 37 ℃에서 10분 간 반응하였다. Ribogreen assay법을 사용하여 RNA를 특이적으로 염색한 후, microplate reader 장비를 이용하여 형광 excitation (485 nm) 및 emission (528 nm) 파장에서 측정한 형광값을 통해 RNA 농도를 산출하였다.
[수학식 3]
RNA 캡슐화 효율 = [{(Total-RNA 농도) - (Free-RNA 농도)}/(Total RNA 농도)] * 100 (%)
<<Encapsulation efficiency% 결과>>
Group 사용 Cap 물질 Formulation Encapsulation
efficiency %
1 Cap 1 GenVoy LNP 91.2
2 Cap 2 GenVoy LNP 89.7
3 Cap 3 GenVoy LNP 90.2
4 CleanCap (TriLink Clean Cap AG (3'OMe)) GenVoy LNP 86.4
실시예 4. 동물 모델을 이용한 백신 제제의 면역원성 평가
본 실시예에서는 상기 실시예 1의 Cap 1, 2, 3을 사용하여 제조된 mRNA가 백신의 면역원성에 미치는 영향을 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 실시예 2에 개시한 바와 같이 Cap 1, Cap 2, Cap 3를 사용하여 제조된 mRNA 원액 (실험군) 및 CleanCap (Trilink)을 사용하여 제조된 mRNA 원액 (대조군)을 Lipid Mixture와 formulation 한 후, 제조된 mRNA-LNP 원액을 동물 모델 (마우스)에 10 ug Dose로 접종하였다.
상기 접종된 동물 모델의 혈청을 시료로 사용하여, 백신 제제에 의해 생성된 IgG의 항체가를 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로 측정하였다. 구체적으로, 96-well plate의 표면을 1 μg/mL의 항원으로 코팅한 뒤, 이를 2 ~ 8 ℃에서 18 ± 2시간 동안 인큐베이션하였다. 상기 인큐베이션된 플레이트를 세척한 후, 실온에서 1시간 동안 BSA 용액으로 블로킹하였다. 이후, 상기 플레이트를 세척한 후 연속 희석을 통해 준비된 혈청 희석액을 플레이트에 분주하였다. 2차 항체인 Goat Anti-Mouse IgG-Alkaline phosphatase conjugates를 희석하여 플레이트에 첨가한 뒤, 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 상기 플레이트를 세척하고, 여기에 1 mg/mL p-nitrophenylamine buffer를 첨가한 뒤, 실온에서 다시 2시간 동안 반응시켰다. 이후, 각 웰에 3 M NaOH를 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 405 nm와 690 nm의 흡광도를 측정하여, IgG 항체가의 Optical Density (OD)값을 산출하였다.
표 6은 백신 제제 접종에 의한 IgG 항체가의 OD값을 Cap 물질 후보군 별로 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
후보군 실험군 (OD) 비교군 (OD) OD 차이
Cap 1 3867.6 77053.9 -73186.3
Cap 2 34.5 77053.9 -77019.4
Cap 3 89528.4 77053.9 12474.5
그 결과, 상기 표 6에 나타낸 바와 같이, 일 실시예에 따른 Cap 후보물질 중 Cap 3를 사용하는 경우, 대조군에 비해 백신 접종에 의한 면역 반응의 유도가 증진됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> SK bioscience Co., Ltd. <120> Immunogenic composition and a method for preparing thereof <130> KPA220466-KR-P1 <150> KR 10-2022-0047750 <151> 2022-04-18 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 6857 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSKBS01-SPIKE(Wh,A701V)F-AG <220> <221> misc_feature <222> (424)..(1012) <223> Ori <220> <221> misc_feature <222> (1183)..(2043) <223> AmpR <220> <221> misc_feature <222> (2657)..(2675) <223> T7 promoter <220> <221> misc_feature <222> (2674) <223> Transcription initiation site <220> <221> misc_feature <222> (2676)..(2716) <223> 5'UTR <220> <221> misc_feature <222> (2726)..(6550) <223> SARS-CoV2 Wuhan strain Spike gene A701V CDS <220> <221> misc_feature <222> (6557)..(6826) <223> 3'UTR <400> 1 atcaagcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac 60 aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt 120 gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc 180 gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg 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tccagttcga tgtaacccac 1920 tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa 1980 aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact 2040 catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg 2100 atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg 2160 aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag 2220 gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 2280 catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 2340 ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc 2400 agagcagatt gtactgagag tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag 2460 gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg 2520 atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca gctggcgaaa gggggatgtg ctgcaaggcg 2580 attaagttgg gtaacgccag ggttttccca gtcacgacgt tgtaaaacga cggccagtga 2640 attcgagctc ggtacctaat acgactcact ataaggagaa ctcttctggt ccccacagac 2700 tcagagagaa gccaccggat ccaccatgtt cgtgttcctg gtgctgctgc ctctggtgtc 2760 cagccagtgc gtgaatctga ccactcggac ccagttaccg cctgcttata ccaacagctt 2820 caccagagga gtgtactatc ctgacaaggt gttcagaagc tccgtgctcc acagcacaca 2880 ggacctgttt ctgccattct tcagcaatgt gacctggttc cacgccatcc acgtgtccgg 2940 aaccaacggc acaaagagat ttgataaccc tgttctgcca ttcaacgacg gcgtgtactt 3000 cgcttccaca gagaagtcca acatcatcag aggctggatc ttcggcacca ccctggatag 3060 caagacccag agcctcctga tcgtgaacaa cgccacgaac gtcgtgatca aggtgtgcga 3120 gttccagttc tgtaatgacc ccttcttggg cgtttattac cacaagaaca acaagagctg 3180 gatggaatct gagtttagag tatattccag cgctaacaat tgcaccttcg agtacgttag 3240 ccagcccttc ctcatggacc tggaaggcaa gcagggcaat ttcaagaacc tgagagagtt 3300 cgtattcaag aacatcgacg gctacttcaa gatctacagc aagcacacac ctatcaacct 3360 agtgcgcgat ctgccacagg gcttcagcgc tctggaaccc ctggtcgatc tgcctatagg 3420 catcaacatc accagattcc aaaccctgct ggcgctgcac agatcctacc tgacccctgg 3480 agacagctct agcggatgga ccgccggcgc tgccgcctac tacgtaggct acctgcagcc 3540 taggaccttc ctgctgaagt acaacgagaa cggcaccatc accgatgccg tggactgtgc 3600 cctggaccct ctatctgaga caaagtgcac cctgaagagc ttcaccgtgg aaaagggcat 3660 ctaccagacc agtaacttta gagtgcagcc caccgaaagc atcgtgagat tccctaacat 3720 caccaatctg tgtcctttcg gcgaggtgtt taacgccaca agattcgcca gcgtctacgc 3780 ctggaaccgg aagcggatca gcaactgcgt ggctgattac tccgtccttt ataacagcgc 3840 tagcttcagc acatttaaat gctacggagt gagcccaaca aagctgaacg acctgtgctt 3900 caccaacgtg tacgccgata gcttcgtgat cagaggcgat gaggtgagac agattgcccc 3960 tggccagaca ggcaagatcg ccgattacaa ctataagctg cccgacgact tcaccggctg 4020 tgtgatcgct tggaacagca acaacctcga tagcaaggtg ggaggaaatt acaactacct 4080 gtataggctg ttcagaaaaa gcaatctgaa gcctttcgag agagacatca gcaccgaaat 4140 ctaccaggcc ggatctacac cttgcaacgg cgtggagggc ttcaactgtt acttccctct 4200 gcaatcatac ggcttccagc ctaccaacgg cgtgggctac cagccctacc gagtcgtggt 4260 gctgagcttt gaactgctgc atgcgcccgc gacagtgtgc ggccctaaga aaagcaccaa 4320 cctggtgaag aacaaatgcg tgaacttcaa ctttaacggg ctgactggca ccggtgtcct 4380 gaccgagagc aacaagaagt ttctgccctt ccagcaattc ggcagagaca tcgccgacac 4440 caccgacgcc gtccgcgacc cccagaccct ggagatcctc gatattacac cttgtagctt 4500 cggcggcgtc agcgttatca cacccggaac aaacacaagc aatcaggtgg ccgtgctgta 4560 ccagggcgtg aactgcacag aggtgcctgt ggcaatccac gccgaccagc tgacccctac 4620 ctggcgggtg tactctaccg gcagcaatgt gttccagaca agagccggct gcctgatcgg 4680 cgccgaacac gtgaacaaca gctacgaatg tgacatccct attggcgccg gaatctgcgc 4740 ctcttaccag acacagacca actcacctcg gagagccaga tctgtggcga gccaatctat 4800 catcgcctac accatgtctc tcggcgtgga aaactctgtg gcctacagca acaactctat 4860 cgcaatcccc acaaacttca ccatcagcgt gacaaccgag atcctgccgg tgtctatgac 4920 caagacatcc gtggactgca ccatgtacat ctgcggcgac tccacagaat gcagcaatct 4980 gctgttgcag tacggcagct tctgcacaca attaaatcgt gccctgacag gcattgccgt 5040 ggaacaggat aagaataccc aggaagtgtt cgcccaggtg aagcagattt acaagacccc 5100 acctatcaag gacttcggcg gctttaattt ctcccagatc ctgcctgacc cctctaagcc 5160 ttctaagaga agttttatcg aggacctgct gttcaataaa gtgaccctgg ccgatgccgg 5220 gttcatcaag cagtacggcg attgcctggg cgacatcgcc gccagagatc ttatttgcgc 5280 ccagaaattc aacggactga cagtgctgcc tcctttgctg accgacgaga tgattgccca 5340 gtataccagc gccctgctgg ccggaaccat cacgtccggc tggacattcg gcgccggcgc 5400 cgccttgcag atccccttcg ccatgcagat ggcctaccgg tttaatggca tcggcgtgac 5460 gcagaacgtg ctgtacgaga accagaaact gatcgctaac cagtttaact ccgccatcgg 5520 caagatccag gacagcctga gctccaccgc cagcgccctg ggcaagctgc aagacgtggt 5580 gaaccagaat gcccaagccc tgaacaccct ggtgaagcag ctgagctcta acttcggcgc 5640 catcagcagc gtgctgaacg acattctgag cagactggac cctccagaag ccgaggtgca 5700 gatcgaccgg ctgatcaccg gccggctgca atccctgcag acctacgtga cccaacagct 5760 gatccgggcc gccgagatca gagcctcggc taacctggcc gccacaaaga tgagcgagtg 5820 cgtgctgggc cagtctaaaa gagtggactt ctgcggtaaa ggataccacc tgatgagttt 5880 tcctcaaagc gcccctcacg gcgtggtgtt cctgcatgtg acatacgtcc ccgcccagga 5940 gaagaatttt accacagccc ctgctatctg tcacgatggc aaagcccact tcccacggga 6000 gggcgtgttt gtgagcaacg gcacccactg gttcgtgacc cagagaaact tctacgaacc 6060 tcagatcatc acgaccgaca acacctttgt gagcggcaac tgcgacgtgg tgatcggcat 6120 cgtgaacaat accgtgtacg accctctgca gcccgaactg gattctttca aggaggaact 6180 ggacaagtac ttcaagaacc acaccagccc tgatgtggac ctgggcgaca tcagcggcat 6240 caatgcctcc gtggtgaata tccagaaaga gatcgacaga ctgaatgagg tggctaagaa 6300 ccttaatgag agcctgatcg atctgcagga gctgggcaag tacgagcagt acatcaagtg 6360 gccttggtac atctggctgg gattcatcgc cggactgatc gctatcgtga tggtcaccat 6420 catgctgtgc tgcatgacca gctgctgtag ctgcctgaag ggatgctgta gctgtggcag 6480 ctgctgcaag ttcgacgagg atgacagcga gcctgtgctg aagggcgtga agctgcacta 6540 cacctgataa tctagaagct cgcttgtcaa tttctattaa aggttccttt gttccctaag 6600 tccaactact aaactggggg atattatgaa gggccttgag catctggatt ctgcctaata 6660 aaaaacattt attttcattg catcgatagc tcgctttctt gctgtccaat ttctattaaa 6720 ggttcctttg ttccctaagt ccaactacta aactggggga tattatgaag ggccttgagc 6780 atctggattc tgcctaataa aaaacattta ttttcattgc ccgcggaaaa aaaaaaaaaa 6840 aaaaaaaagt cttcgat 6857 <210> 2 <211> 4233 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mRNA <220> <221> misc_feature <222> (4185)..(4233) <223> poly A <400> 2 aggagaacuc uucugguccc cacagacuca gagagaagcc accggaucca ccauguucgu 60 guuccuggug cugcugccuc ugguguccag ccagugcgug aaucugacca cucggaccca 120 guuaccgccu gcuuauacca acagcuucac cagaggagug uacuauccug acaagguguu 180 cagaagcucc gugcuccaca gcacacagga ccuguuucug ccauucuuca gcaaugugac 240 cugguuccac gccauccacg uguccggaac caacggcaca aagagauuug auaacccugu 300 ucugccauuc aacgacggcg uguacuucgc uuccacagag aaguccaaca ucaucagagg 360 cuggaucuuc ggcaccaccc uggauagcaa gacccagagc cuccugaucg ugaacaacgc 420 cacgaacguc gugaucaagg ugugcgaguu ccaguucugu aaugaccccu ucuugggcgu 480 uuauuaccac aagaacaaca agagcuggau ggaaucugag uuuagaguau auuccagcgc 540 uaacaauugc accuucgagu acguuagcca gcccuuccuc auggaccugg aaggcaagca 600 gggcaauuuc aagaaccuga gagaguucgu auucaagaac aucgacggcu acuucaagau 660 cuacagcaag cacacaccua ucaaccuagu gcgcgaucug ccacagggcu ucagcgcucu 720 ggaaccccug gucgaucugc cuauaggcau caacaucacc agauuccaaa cccugcuggc 780 gcugcacaga uccuaccuga ccccuggaga cagcucuagc ggauggaccg ccggcgcugc 840 cgccuacuac guaggcuacc ugcagccuag gaccuuccug cugaaguaca acgagaacgg 900 caccaucacc gaugccgugg acugugcccu ggacccucua ucugagacaa agugcacccu 960 gaagagcuuc accguggaaa agggcaucua ccagaccagu aacuuuagag ugcagcccac 1020 cgaaagcauc gugagauucc cuaacaucac caaucugugu ccuuucggcg agguguuuaa 1080 cgccacaaga uucgccagcg ucuacgccug gaaccggaag cggaucagca acugcguggc 1140 ugauuacucc guccuuuaua acagcgcuag cuucagcaca uuuaaaugcu acggagugag 1200 cccaacaaag cugaacgacc ugugcuucac caacguguac gccgauagcu ucgugaucag 1260 aggcgaugag gugagacaga uugccccugg ccagacaggc aagaucgccg auuacaacua 1320 uaagcugccc gacgacuuca ccggcugugu gaucgcuugg aacagcaaca accucgauag 1380 caagguggga ggaaauuaca acuaccugua uaggcuguuc agaaaaagca aucugaagcc 1440 uuucgagaga gacaucagca ccgaaaucua ccaggccgga ucuacaccuu gcaacggcgu 1500 ggagggcuuc aacuguuacu ucccucugca aucauacggc uuccagccua ccaacggcgu 1560 gggcuaccag cccuaccgag ucguggugcu gagcuuugaa cugcugcaug cgcccgcgac 1620 agugugcggc ccuaagaaaa gcaccaaccu ggugaagaac aaaugcguga acuucaacuu 1680 uaacgggcug acuggcaccg guguccugac cgagagcaac aagaaguuuc ugcccuucca 1740 gcaauucggc agagacaucg ccgacaccac cgacgccguc cgcgaccccc agacccugga 1800 gauccucgau auuacaccuu guagcuucgg cggcgucagc guuaucacac ccggaacaaa 1860 cacaagcaau cagguggccg ugcuguacca gggcgugaac ugcacagagg ugccuguggc 1920 aauccacgcc gaccagcuga ccccuaccug gcggguguac ucuaccggca gcaauguguu 1980 ccagacaaga gccggcugcc ugaucggcgc cgaacacgug aacaacagcu acgaauguga 2040 caucccuauu ggcgccggaa ucugcgccuc uuaccagaca cagaccaacu caccucggag 2100 agccagaucu guggcgagcc aaucuaucau cgccuacacc augucucucg gcguggaaaa 2160 cucuguggcc uacagcaaca acucuaucgc aauccccaca aacuucacca ucagcgugac 2220 aaccgagauc cugccggugu cuaugaccaa gacauccgug gacugcacca uguacaucug 2280 cggcgacucc acagaaugca gcaaucugcu guugcaguac ggcagcuucu gcacacaauu 2340 aaaucgugcc cugacaggca uugccgugga acaggauaag aauacccagg aaguguucgc 2400 ccaggugaag cagauuuaca agaccccacc uaucaaggac uucggcggcu uuaauuucuc 2460 ccagauccug ccugaccccu cuaagccuuc uaagagaagu uuuaucgagg accugcuguu 2520 caauaaagug acccuggccg augccggguu caucaagcag uacggcgauu gccugggcga 2580 caucgccgcc agagaucuua uuugcgccca gaaauucaac ggacugacag ugcugccucc 2640 uuugcugacc gacgagauga uugcccagua uaccagcgcc cugcuggccg gaaccaucac 2700 guccggcugg acauucggcg ccggcgccgc cuugcagauc cccuucgcca ugcagauggc 2760 cuaccgguuu aauggcaucg gcgugacgca gaacgugcug uacgagaacc agaaacugau 2820 cgcuaaccag uuuaacuccg ccaucggcaa gauccaggac agccugagcu ccaccgccag 2880 cgcccugggc aagcugcaag acguggugaa ccagaaugcc caagcccuga acacccuggu 2940 gaagcagcug agcucuaacu ucggcgccau cagcagcgug cugaacgaca uucugagcag 3000 acuggacccu ccagaagccg aggugcagau cgaccggcug aucaccggcc ggcugcaauc 3060 ccugcagacc uacgugaccc aacagcugau ccgggccgcc gagaucagag ccucggcuaa 3120 ccuggccgcc acaaagauga gcgagugcgu gcugggccag ucuaaaagag uggacuucug 3180 cgguaaagga uaccaccuga ugaguuuucc ucaaagcgcc ccucacggcg ugguguuccu 3240 gcaugugaca uacguccccg cccaggagaa gaauuuuacc acagccccug cuaucuguca 3300 cgauggcaaa gcccacuucc cacgggaggg cguguuugug agcaacggca cccacugguu 3360 cgugacccag agaaacuucu acgaaccuca gaucaucacg accgacaaca ccuuugugag 3420 cggcaacugc gacgugguga ucggcaucgu gaacaauacc guguacgacc cucugcagcc 3480 cgaacuggau ucuuucaagg aggaacugga caaguacuuc aagaaccaca ccagcccuga 3540 uguggaccug ggcgacauca gcggcaucaa ugccuccgug gugaauaucc agaaagagau 3600 cgacagacug aaugaggugg cuaagaaccu uaaugagagc cugaucgauc ugcaggagcu 3660 gggcaaguac gagcaguaca ucaaguggcc uugguacauc uggcugggau ucaucgccgg 3720 acugaucgcu aucgugaugg ucaccaucau gcugugcugc augaccagcu gcuguagcug 3780 ccugaaggga ugcuguagcu guggcagcug cugcaaguuc gacgaggaug acagcgagcc 3840 ugugcugaag ggcgugaagc ugcacuacac cugauaaucu agaagcucgc uugucaauuu 3900 cuauuaaagg uuccuuuguu cccuaagucc aacuacuaaa cugggggaua uuaugaaggg 3960 ccuugagcau cuggauucug ccuaauaaaa aacauuuauu uucauugcau cgauagcucg 4020 cuuucuugcu guccaauuuc uauuaaaggu uccuuuguuc ccuaagucca acuacuaaac 4080 ugggggauau uaugaagggc cuugagcauc uggauucugc cuaauaaaaa acauuuauuu 4140 ucauugcccg cggaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagucuu cgauaaaaaa aaaaaaaaaa 4200 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 4233 <210> 3 <211> 41 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' UTR <400> 3 gagaacucuu cuggucccca cagacucaga gagaagccac c 41 <210> 4 <211> 3825 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV2 Wuhan strain Spike gene A701V CDS <400> 4 auguucgugu uccuggugcu gcugccucug guguccagcc agugcgugaa ucugaccacu 60 cggacccagu uaccgccugc uuauaccaac agcuucacca gaggagugua cuauccugac 120 aagguguuca gaagcuccgu gcuccacagc acacaggacc uguuucugcc auucuucagc 180 aaugugaccu gguuccacgc cauccacgug uccggaacca acggcacaaa gagauuugau 240 aacccuguuc ugccauucaa cgacggcgug uacuucgcuu ccacagagaa guccaacauc 300 aucagaggcu ggaucuucgg caccacccug gauagcaaga cccagagccu ccugaucgug 360 aacaacgcca cgaacgucgu gaucaaggug ugcgaguucc aguucuguaa ugaccccuuc 420 uugggcguuu auuaccacaa gaacaacaag agcuggaugg aaucugaguu uagaguauau 480 uccagcgcua acaauugcac cuucgaguac guuagccagc ccuuccucau ggaccuggaa 540 ggcaagcagg gcaauuucaa gaaccugaga gaguucguau ucaagaacau cgacggcuac 600 uucaagaucu acagcaagca cacaccuauc aaccuagugc gcgaucugcc acagggcuuc 660 agcgcucugg aaccccuggu cgaucugccu auaggcauca acaucaccag auuccaaacc 720 cugcuggcgc ugcacagauc cuaccugacc ccuggagaca gcucuagcgg auggaccgcc 780 ggcgcugccg ccuacuacgu aggcuaccug cagccuagga ccuuccugcu gaaguacaac 840 gagaacggca ccaucaccga ugccguggac ugugcccugg acccucuauc ugagacaaag 900 ugcacccuga agagcuucac cguggaaaag ggcaucuacc agaccaguaa cuuuagagug 960 cagcccaccg aaagcaucgu gagauucccu aacaucacca aucugugucc uuucggcgag 1020 guguuuaacg ccacaagauu cgccagcguc uacgccugga accggaagcg gaucagcaac 1080 ugcguggcug auuacuccgu ccuuuauaac agcgcuagcu ucagcacauu uaaaugcuac 1140 ggagugagcc caacaaagcu gaacgaccug ugcuucacca acguguacgc cgauagcuuc 1200 gugaucagag gcgaugaggu gagacagauu gccccuggcc agacaggcaa gaucgccgau 1260 uacaacuaua agcugcccga cgacuucacc ggcuguguga ucgcuuggaa cagcaacaac 1320 cucgauagca aggugggagg aaauuacaac uaccuguaua ggcuguucag aaaaagcaau 1380 cugaagccuu ucgagagaga caucagcacc gaaaucuacc aggccggauc uacaccuugc 1440 aacggcgugg agggcuucaa cuguuacuuc ccucugcaau cauacggcuu ccagccuacc 1500 aacggcgugg gcuaccagcc cuaccgaguc guggugcuga gcuuugaacu gcugcaugcg 1560 cccgcgacag ugugcggccc uaagaaaagc accaaccugg ugaagaacaa augcgugaac 1620 uucaacuuua acgggcugac uggcaccggu guccugaccg agagcaacaa gaaguuucug 1680 cccuuccagc aauucggcag agacaucgcc gacaccaccg acgccguccg cgacccccag 1740 acccuggaga uccucgauau uacaccuugu agcuucggcg gcgucagcgu uaucacaccc 1800 ggaacaaaca caagcaauca gguggccgug cuguaccagg gcgugaacug cacagaggug 1860 ccuguggcaa uccacgccga ccagcugacc ccuaccuggc ggguguacuc uaccggcagc 1920 aauguguucc agacaagagc cggcugccug aucggcgccg aacacgugaa caacagcuac 1980 gaaugugaca ucccuauugg cgccggaauc ugcgccucuu accagacaca gaccaacuca 2040 ccucggagag ccagaucugu ggcgagccaa ucuaucaucg ccuacaccau gucucucggc 2100 guggaaaacu cuguggccua cagcaacaac ucuaucgcaa uccccacaaa cuucaccauc 2160 agcgugacaa ccgagauccu gccggugucu augaccaaga cauccgugga cugcaccaug 2220 uacaucugcg gcgacuccac agaaugcagc aaucugcugu ugcaguacgg cagcuucugc 2280 acacaauuaa aucgugcccu gacaggcauu gccguggaac aggauaagaa uacccaggaa 2340 guguucgccc aggugaagca gauuuacaag accccaccua ucaaggacuu cggcggcuuu 2400 aauuucuccc agauccugcc ugaccccucu aagccuucua agagaaguuu uaucgaggac 2460 cugcuguuca auaaagugac ccuggccgau gccggguuca ucaagcagua cggcgauugc 2520 cugggcgaca ucgccgccag agaucuuauu ugcgcccaga aauucaacgg acugacagug 2580 cugccuccuu ugcugaccga cgagaugauu gcccaguaua ccagcgcccu gcuggccgga 2640 accaucacgu ccggcuggac auucggcgcc ggcgccgccu ugcagauccc cuucgccaug 2700 cagauggccu accgguuuaa uggcaucggc gugacgcaga acgugcugua cgagaaccag 2760 aaacugaucg cuaaccaguu uaacuccgcc aucggcaaga uccaggacag ccugagcucc 2820 accgccagcg cccugggcaa gcugcaagac guggugaacc agaaugccca agcccugaac 2880 acccugguga agcagcugag cucuaacuuc ggcgccauca gcagcgugcu gaacgacauu 2940 cugagcagac uggacccucc agaagccgag gugcagaucg accggcugau caccggccgg 3000 cugcaauccc ugcagaccua cgugacccaa cagcugaucc gggccgccga gaucagagcc 3060 ucggcuaacc uggccgccac aaagaugagc gagugcgugc ugggccaguc uaaaagagug 3120 gacuucugcg guaaaggaua ccaccugaug aguuuuccuc aaagcgcccc ucacggcgug 3180 guguuccugc augugacaua cguccccgcc caggagaaga auuuuaccac agccccugcu 3240 aucugucacg auggcaaagc ccacuuccca cgggagggcg uguuugugag caacggcacc 3300 cacugguucg ugacccagag aaacuucuac gaaccucaga ucaucacgac cgacaacacc 3360 uuugugagcg gcaacugcga cguggugauc ggcaucguga acaauaccgu guacgacccu 3420 cugcagcccg aacuggauuc uuucaaggag gaacuggaca aguacuucaa gaaccacacc 3480 agcccugaug uggaccuggg cgacaucagc ggcaucaaug ccuccguggu gaauauccag 3540 aaagagaucg acagacugaa ugagguggcu aagaaccuua augagagccu gaucgaucug 3600 caggagcugg gcaaguacga gcaguacauc aaguggccuu gguacaucug gcugggauuc 3660 aucgccggac ugaucgcuau cgugaugguc accaucaugc ugugcugcau gaccagcugc 3720 uguagcugcc ugaagggaug cuguagcugu ggcagcugcu gcaaguucga cgaggaugac 3780 agcgagccug ugcugaaggg cgugaagcug cacuacaccu gauaa 3825 <210> 5 <211> 270 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'UTR <400> 5 agcucgcuug ucaauuucua uuaaagguuc cuuuguuccc uaaguccaac uacuaaacug 60 ggggauauua ugaagggccu ugagcaucug gauucugccu aauaaaaaac auuuauuuuc 120 auugcaucga uagcucgcuu ucuugcuguc caauuucuau uaaagguucc uuuguucccu 180 aaguccaacu acuaaacugg gggauauuau gaagggccuu gagcaucugg auucugccua 240 auaaaaaaca uuuauuuuca uugcccgcgg 270

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1 내지 4 중 어느 하나의 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 면역원성 조성물:
    [화학식 1]

    [화학식 2]

    [화학식 3]

    [화학식 4]
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 화학식 3 또는 4로 표시되는 5'Cap 구조를 포함하는 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은,
    화학식 3으로 표시되는 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및
    화학식 4로 표시되는 5'Cap 구조를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 5'UTR (미번역 영역) 서열을 포함하는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 5'UTR 서열은 HBA2(Hemoglobin subunit alpha 2) 유래인, 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 5'UTR 서열은 서열번호 3 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 3'UTR (미번역 영역) 서열을 포함하는, 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 3'UTR 서열은 HBB(Hemoglobin subunit beta) 유래인, 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 3'UTR 서열은 서열번호 5 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 서열을 포함하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는,
    서열번호 3 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 5'UTR 서열; 및
    서열번호 5 또는 이와 80% 이상 상동성 또는 동일성을 갖는 3'UTR 서열을 포함하는, 조성물.
  11. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 면역원성을 나타내는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 유래의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는, 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4의 CDS를 포함하는, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 폴리 A 테일(Poly A tail)을 포함하는, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 지질 나노입자 내부에 포함된 것인, 조성물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역원성 조성물은 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스에 대한 면역을 유도하는 것인, 조성물.
  16. 하기 화학식 5 내지 8 중 어느 하나 이상의 화합물 또는 이의 염과 DNA 주형을 포함하는 조성물을 혼합하여 mRNA 합성을 수행하는 단계를 포함하는, 면역원성 조성물의 제조방법:
    [화학식 5]

    [화학식 6]

    [화학식 7]

    [화학식 8]
  17. 제16항에 있어서, 상기 DNA 주형은 면역원성을 나타내는 코로나 바이러스 또는 인플루엔자 바이러스 유래의 펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는, 제조방법.
  18. 제16항에 있어서, 상기 제조방법은 mRNA의 폴리 A 테일링(tailing)을 수행하는 단계를 포함하는, 제조방법.
  19. 제16항에 있어서, 상기 제조방법은 mRNA를 지질 나노입자에 포함된 형태로 제조하는 단계를 포함하는, 제조방법.
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