CN102133399A - 一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺，步骤如下：(1)、病毒接种与培养：于鸡胚尿囊腔接种稀释至病毒量2.0-6.0LgEID₅₀/ml的工作种子批毒种，置33～35℃培养48～72小时；(2)、病毒收获、病毒灭活、病毒收获液浓缩；(3)、病毒纯化和病毒裂解，纯化后的病毒液加入终浓度的体积比为0.3～0.5％Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20～30℃下作用90～120分钟；(4)、加入PB去裂解剂，(5)、除菌过滤后再配制成半成品：用0.01mol/L、pH7.2的PBS将各型原液稀释至血凝素含量为30μg/株/ml，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为半成品。本发明有益的效果是：增加了新型纯化方法，因而可以达到提高收率、提高有效抗原含量、大幅度降低可导致接种反应的成份残余卵清蛋白和裂解剂含量。

Description

一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺

技术领域

本发明属于疫苗制备领域，尤其是一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺。

背景技术

流行性感冒，是由流感病毒引起的一种传染性极强的病毒性疾病。流感病毒分为甲、乙、丙三型，其中，最常引起发病的是甲型。甲型流感病毒常在10～15年内发生突变，出现新的亚型，引起大流行。由于人体对各型流感病毒之间无交叉免疫能力，故每年都有不同范围的新亚型流感流行。

我国用于流感预防的疫苗有三种：全病毒灭活疫苗、裂解疫苗和亚单位疫苗。流感疫苗中包含三个病毒株，2个甲型，1个乙型，这三个病毒株的活性成分在疫苗的生产过程中都已经被“杀死”，所以接种流感疫苗不会感染流感。上述三种疫苗各有特点：全病毒灭活疫苗免疫效果好，但副作用较大，只能用于成人接种，儿童不能接种；亚单位疫苗副作用较小，但免疫效果一般；裂解疫苗免疫效果好，同时副作用也比较小。裂解疫苗和亚单位疫苗对儿童和成人都可以接种。目前全球使用量最大的是裂解疫苗。

目前，国内厂家生产的主要是流感病毒裂解疫苗。各个厂家的工艺路线也不尽相同，如病毒纯化工艺有的厂家采用分子筛柱层析法，有的采用区带离心法，有的两种方法混用。病毒灭活工艺也不一样，有的先灭活后纯化，有的先纯化后灭活，有的在病毒裂解前灭活，有的在病毒裂解后灭活等。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，而提供一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺。

本发明解决其技术问题采用的技术方案：这种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺，该方法步骤如下：

(1)、病毒接种与培养：于鸡胚尿囊腔接种稀释至病毒量2.0-6.0LgEID50/ml的工作种子批毒种(工作种子批毒种系由世界卫生组织(WHO)推荐、并经国家药品管理部门认可的甲型和乙型流感病毒的当年流行株或相似株按常规方法传代制备成主代毒种库，再按同法制备成工作毒种)，置33～35℃培养48～72小时；

(2)、病毒收获：筛选活鸡胚，置2～8℃一定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后每个容器取样进行尿囊收获液检定；

(3)、病毒灭活：病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200μg/ml的甲醛，置2-8℃灭活15～24小时；灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；

(4)、病毒收获液浓缩：灭活后的尿囊液经澄清处理，然后用截留分子量为1000KD的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；

(5)、病毒纯化：

5.1蔗糖速率区带离心：在静止时以不超过离心腔容积50％的量泵入体积比为50～60％的蔗糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min～40000r/min，连续泵入灭活后的尿囊液，进样完毕，泵入3-4L缓冲液后，调节转速至0r/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；

5.2柱层析：用Sephrose-4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的8％，洗脱液为0.01mol/L、pH7.2的PBS，上样及洗脱线性流速为5～6mm/min，检测波长为280nm，收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；

(6)、病毒裂解：纯化后的病毒液加入终浓度的体积比为0.3～0.5％Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20～30℃下作用90～120分钟；

(7)、加入PB去裂解剂：向裂解后的病毒液中加入等量1mol/L pH7.2磷酸盐溶液(PB)，混合均匀后用离心法或过滤法除去裂解剂，然后将样品用100KD的超滤膜进行超滤洗滤，以进一步去除裂解剂，超滤后的病毒液取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，细菌内毒素含量不高于50EU/ml，微生物限度检查菌数应小于10CFU/ml；

(8)、除菌过滤：纯化后的裂解物经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为单价原液；

(9)、半成品配制：用0.01mol/L、pH7.2的PBS将各型原液稀释至血凝素含量为30μg/株/ml，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为半成品。

本发明有益的效果是：本工艺采用了现有各种工艺的优点，并增加了新型纯化方法，因而可以达到提高收率、提高有效抗原含量、大幅度降低可导致接种反应的成份残余卵清蛋白和裂解剂含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明：

这种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺，该方法步骤如下：

(1)、病毒接种与培养：于鸡胚尿囊腔接种稀释至病毒量2.0-6.0LgEID₅₀/ml的工作种子批毒种(工作种子批毒种系由世界卫生组织(WHO)推荐、并经国家药品管理部门认可的甲型和乙型流感病毒的当年流行株或相似株按常规方法传代制备成主代毒种库，再按同法制备成工作毒种)，置33～35℃培养48～72小时；

(2)、病毒收获：筛选活鸡胚，置2～8℃一定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后每个容器取样进行尿囊收获液检定；

(3)、病毒灭活：病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200μg/ml的甲醛，置2-8℃灭活15～24小时；灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；

(4)、病毒收获液浓缩：灭活后的尿囊液经澄清处理，然后用截留分子量为i000KD的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；

(5)、病毒纯化：

5.1蔗糖速率区带离心：在静止时以不超过离心腔容积50％的量泵入体积比为50～60％的蔗糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min～40000r/min，连续泵入灭活后的尿囊液，进样完毕，泵入3-4L缓冲液后，调节转速至0r/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；

5.2柱层析：用Sephrose-4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的8％，洗脱液为0.01mol/L、pH7.2的PBS，上样及洗脱线性流速为5～6mm/min，检测波长为280nm，收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；

(6)、病毒裂解：纯化后的病毒液加入终浓度的体积比为0.3～0.5％Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20～30℃下作用90～120分钟；

(7)、加入PB去裂解剂：向裂解后的病毒液中加入等量1mol/L pH7.2磷酸盐溶液，混合均匀后用离心法或过滤法除去裂解剂，然后将样品用100KD的超滤膜进行超滤洗滤，以进一步去除裂解剂，超滤后的病毒液取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，细菌内毒素含量不高于50EU/ml，微生物限度检查菌数应小于10CFU/ml；

(8)、除菌过滤：纯化后的裂解物经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为单价原液；

(9)、半成品配制：用0.01mol/L、pH7.2的PBS将各型原液稀释至血凝素含量为30μg/株/ml，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为半成品。

用专利工艺制备的半成品检测结果见下表。

从上表可看出，采用新工艺制备的疫苗卵清蛋白和裂解剂残留量远远低于药典标准。

本专利的特点是：

1.改进了密度梯度离心工艺。采用大型连续流超速区带离心机(K II)取代小型超速区带离心机(CP70)，即将“超速区带离心法”改为“连续流超速区带离心法”，使尿囊液处理量大幅度增加。

2.取消了离心后的超滤除糖及浓缩步骤，直接进行下一步层析，减少了纯化步骤和抗原损失。

3.改进了裂解剂去除工艺。将CP70超速离心机除裂解剂工艺改为用磷酸盐溶液(PB)沉淀去除裂解剂工艺。该法可特异性去除裂解剂，且血凝素回收率可达95％以上，并可节省购置离心机的大量费用。

4.改进了超滤浓缩工艺。将传统的超滤方法改为衡滤法，即可减少抗原损伤和聚合，又可减少疫苗中的主要杂蛋白成分卵清蛋白的聚合，从而更多地去除卵清蛋白，提高疫苗的安全性，减少副反应发生率。

5.在半成品配制中取消柳硫汞防腐剂。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种制备流感病毒裂解疫苗的新工艺，其特征是：该方法步骤如下：

(1)、病毒接种与培养：于鸡胚尿囊腔接种稀释至病毒量2.0-6.0LgEID₅₀/ml的工作种子批毒种，置33～35℃培养48～72小时；

(2)、病毒收获：筛选活鸡胚，置2～8℃一定时间冷胚后，收获尿囊液于容器内，澄清过滤后每个容器取样进行尿囊收获液检定；

(3)、病毒灭活：病毒灭活前取样测定蛋白含量，控制蛋白质含量在不超过5mg/ml的范围内进行病毒灭活，收获的含有病毒的尿囊液加入终浓度为200μg/ml的甲醛，置2-8℃灭活15～24小时；灭活结束分别对每个病毒灭活容器采样，进行病毒灭活验证试验和细菌内毒素含量测定；

(4)、病毒收获液浓缩：灭活后的尿囊液经澄清处理，然后用截留分子量为1000KD的超滤膜超滤浓缩不超过10倍；

(5)、病毒纯化：

5.1蔗糖速率区带离心：在静止时以不超过离心腔容积50％的量泵入体积比为50～60％的蔗糖溶液，同时调节机器转速至35000r/min～40000r/min，连续泵入灭活后的尿囊液，进样完毕，泵入3-4L缓冲液后，调节转速至0r/min，待机器停稳，在280nm波长监测下，收集病毒峰；

5.2柱层析：用Sephrose-4FF凝胶柱色谱法纯化，上样量不超过凝胶体积的8％，洗脱液为0.01mol/L、pH7.2的PBS，上样及洗脱线性流速为5～6mm/min，检测波长为280nm，收集第一峰，纯化后取样进行蛋白质含量测定；

(6)、病毒裂解：纯化后的病毒液加入终浓度的体积比为0.3～0.5％Triton X-100及去氧胆酸钠，混匀后置20～30℃下作用90～120分钟；

(7)、加入PB去裂解剂：向裂解后的病毒液中加入等量1mol/L pH7.2磷酸盐溶液，混合均匀后用离心法或过滤法除去裂解剂，然后将样品用100KD的超滤膜进行超滤洗滤，以进一步去除裂解剂，超滤后的病毒液取样进行细菌内毒素含量测定和微生物限度检查，细菌内毒素含量不高于50EU/ml，微生物限度检查菌数应小于10CFU/ml；

(8)、除菌过滤：纯化后的裂解物经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为单价原液；

(9)、半成品配制：用0.01mol/L、pH7.2的PBS将各型原液稀释至血凝素含量为30μg/株/ml，经0.22μm孔径的滤膜过滤，即为半成品。