CN103820396A - 猪流行性腹泻病毒分离培养方法 - Google Patents

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张春玲
倪建平
訾玉华
何锡忠
李春华
蒋凤英
张婉华
周宗清
彭丽英
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Shanghai Jiamu Biological Products Co ltd
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
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Shanghai Jiamu Biological Products Co ltd
Shanghai Academy of Agricultural Sciences
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Abstract

本发明涉及猪流行性腹泻病毒分离培养方法，将仔猪动小肠冲洗干净后利用培养基进行培养，并进行接种，检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1∶1的悬液，培养收获出现细胞病变(CPE)后收获细胞，继续冻融接种单层vero细胞，利用培养基培养得到出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。与现有技术相比，本发明的分离成功率高，分离得到的猪流行性腹泻病毒病毒毒力强、分离的病毒纯度高。

Description

猪流行性腹泻病毒分离培养方法
技术领域
本发明涉及一种病毒分离培养方法，尤其是涉及猪流行性腹泻病毒分离培养方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(PEDV)是一种主要引起猪的接触性肠道传染病，其特征为呕吐、腹泻、脱水。1971年首发于英国，20世纪80年代初我国陆续发生本病。病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，病毒的感染途径主要是消化道，病毒经口和鼻感染后，进入小肠，而后病毒存在于肠绒毛上皮细胞和肠系膜淋巴结。病毒的复制是在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行。由于病毒增殖首先造成细胞器的损伤，继而出现细细胞功能障碍。肠绒毛萎缩，造成了吸收表面积的减少，小肠黏膜碱性磷酸酶含量显著减少进而引起营养物质吸收障碍，这是引起腹泻的主要原因。
原代培养是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，原代培养的细胞生物学特性变化较少，最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载体。国外早在1993年就有猪肠细胞原代培养的报道。其它类型的猪组织细胞原代培养的报道也不少，国内关于动物体细胞原代培养的报道多集中在其它动物身上，而关于猪IEC原代培养的方法一直较少。目前，国内外尚无通过猪小肠黏膜上皮细胞(IEC)的原代培养分离猪流行性腹泻病毒的报道。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种分离成功率高、分离的病毒毒力强、分离的病毒纯度高的猪流行性腹泻病毒分离培养方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
猪流行性腹泻病毒分离培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)将仔猪动脉放血致死，无菌操作取出小肠，剔除肠系膜，置于37℃预热的DMEM-F12不完全培养基的平皿中备用；
(2)将小肠剪成8～10cm，用注射器吸取PBS液从一端向另一端缓慢冲洗，反复进行冲洗直至将肠内容物全部冲洗出，液体清亮为止，纵向剖开肠管，用清洗液清洗数次，取出小肠，利用DMEM-F12完全培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻刮取肠粘膜组织，用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入无菌II型胶原酶至0.1wt％终浓度；分别置4℃和37℃各消化12h和2h后加等量的DMEM-F12完全培养基终止消化，在1000r/min离心10min后移去上层清液并用DMEM-F12完全培养基悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按(1～5)×105密度接种六孔板，37℃、5v/v％CO2培养；
(3)检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1∶1的悬液，反复冻融3次，上清液经0.45u滤膜过滤，接种于单层猪IEC细胞，37℃吸附1h，加DMEM-F12完全培养基培养，37℃、5v/v％CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞；
(4)将收获的病变细胞反复冻融三次，接种单层vero细胞，37℃吸附1h，加DMEM-F12完全培养基培养，37℃、5v/v％CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。
所述的DMEM-F12不完全培养基的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、D-Glucose 3151mg/L。
所述的清洗液为无血清的DMEM/F12清洗液。
所述的无血清的DMEM/F12清洗液的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose 3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L。
所述的DMEM-F12完全培养基的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L，加入10％的胎牛血清。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)分离成功率高：猪小肠粘膜上皮细胞是猪流行性腹泻病毒的靶细胞，与其他传代细胞相比更适合PEDV的生长繁殖。
(2)分离的病毒毒力强：猪小肠粘膜上皮细胞最能反映和接近体内生长特性，是一种良好的试验载体，病毒在肠上皮细胞中复制增殖，相当于病毒在动物体内的一次复壮过程。
(3)分离的病毒纯度高：一种传代细胞通常可以适应几种不同的病毒生长繁殖，而猪小肠粘膜上皮细胞选择性较单一，作为PEDV的靶细胞，分离的病毒也较为单一。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
猪流行性腹泻病毒分离培养方法，包括以下步骤：
(1)将仔猪动脉放血致死，无菌操作取出小肠，剔除肠系膜，置于37℃预热的DMEM-F12不完全培养基的平皿中备用；
(2)将小肠剪成8～10cm，用注射器吸取PBS液从一端向另一端缓慢冲洗，反复进行冲洗直至将肠内容物全部冲洗出，液体清亮为止，纵向剖开肠管，用清洗液清洗数次，取出小肠，利用DMEM-F12完全培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻刮取肠粘膜组织，用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入无菌II型胶原酶至0.1wt％终浓度；分别置4℃和37℃各消化12h和2h后加等量的DMEM-F12完全培养基终止消化，在1000r/min离心10min后移去上层清液并用DMEM-F 12完全培养基悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按(1～5)×105密度接种六孔板，37℃、5v/v％CO2培养；
(3)检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1∶1的悬液，反复冻融3次，上清液经0.45u滤膜过滤，接种于单层猪IEC细胞，37℃吸附1h，加DMEM-F12完全培养基培养，37℃、5v/v％CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞；
(4)将收获的病变细胞反复冻融三次，接种单层vero细胞，37℃吸附1h，加DMEM-F12完全培养基培养，37℃、5v/v％CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。
其中，使用的DMEM-F12不完全培养基的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl147.5mg/L、D-Glucose 3151mg/L。清洗液为无血清的DMEM/F12清洗液，其组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose 3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L。DMEM-F12完全培养基的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose 3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L，加入10％的胎牛血清。
对实施例分离得到的猪流行性腹泻病毒进行病毒毒力测定，其结果如下所示：
表1
  病毒毒力测定方法   单位
  空斑形成单位(PFU)   1*107(PFU/ml)
  半数细胞培养物感染量(TCID50)   108

Claims (5)

1.猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)将仔猪动脉放血致死，无菌操作取出小肠，剔除肠系膜，置于37℃预热的DMEM-F12不完全培养基的平皿中备用；
(2)将小肠剪成8～10cm，用注射器吸取PBS液从一端向另一端缓慢冲洗，反复进行冲洗直至将肠内容物全部冲洗出，液体清亮为止，纵向剖开肠管，用清洗液清洗数次，取出小肠，利用DMEM-F12完全培养基分离IEC细胞，用玻片轻轻刮取肠粘膜组织，用移液器吹打均匀后转移到细胞培养瓶中，加入无菌II型胶原酶至0.1wt％终浓度；分别置4℃和37℃各消化12h和2h后加等量的DMEM-F12完全培养基终止消化，在1000r/min离心10min后移去上层清液并用DMEM-F 12完全培养基悬浮，重复一次后完全培养基悬浮并计数，按(1～5)×105密度接种六孔板，37℃、5v/v％CO2培养；
(3)检测为阳性的PEDV样品用生理盐水稀释成体积比为1∶1的悬液，反复冻融3次，上清液经0.45u滤膜过滤，接种于单层猪IEC细胞，37℃吸附1h，加DMEM-F12完全培养基培养，37℃、5v/v％CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞；
(4)将收获的病变细胞反复冻融三次，接种单层vero细胞，37℃吸附1h，加DMEM-F12完全培养基培养，37℃、5v/v％CO2培养，出现细胞病变(CPE)后收获细胞，既分离得到猪流行性腹泻病毒。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的DMEM-F12不完全培养基的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、D-Glucose 3151mg/L。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的清洗液为无血清的DMEM/F12清洗液。
4.根据权利要求3所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的无血清的DMEM/F12清洗液的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl 147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L。
5.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒分离培养方法，其特征在于，所述的DMEM-F12完全培养基的组成为NaCl 7000mg/L、KCl311.8mg/L、CaCl2116.6mg/L、L-Arginine HCl147.5mg/L、L-Clutamine 365mg/L、D-Glucose3151mg/L、HEPES 3575mg/L、NaHCO31200mg/L，加入10％的胎牛血清。
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