CN106801031A - 无成瘤性mdck细胞克隆株 - Google Patents

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Abstract

本发明提供无成瘤性MDCK细胞克隆株，所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK‑C09，保藏编号为：C2016150。本发明通过单细胞克隆培养和筛选，得到了一株无成瘤性的MDCK细胞株（培养物名称：犬肾细胞MDCK‑C09，保藏编号C2016150），为我国开展流感疫苗的相关研究和生产提供无成瘤性的细胞株。

Description

无成瘤性MDCK细胞克隆株
技术领域
本发明涉及一株无成瘤性MDCK细胞克隆株。
背景技术
MDCK细胞（Madin-Daby Canine Kidney Cells, MDCK）由Madin和Darby于1958年从美国Cocker Spaniel母曲架犬肾脏组织分离培育建立，由于其病毒感染效率高、增殖快，且不易变异，是公认的适于流感病毒复制的3种细胞系之一。
流感(Influenza) ，是由甲(A) 、乙(B) 、丙(C) 三型流感病毒分别引起的急性呼吸道传染病，常造成不同程度的流行，包括世界大流行、局部暴发流行及散发。禽流感（BirdFlu或Avian Influenza）是禽流行性感冒的简称，它是由甲型流感病毒的一种亚型（也称禽流感病毒）引起的一种急性传染病，也能感染人类，通常人感染禽流感死亡率约为33%。目前为止无论是流感还是禽流感未找到理想的治疗药物，疫苗接种仍是当今防止疾病发生和流行最有效的手段。
我国流感疫苗和禽流感疫苗生产主要采用鸡胚生产工艺，鸡胚生产工艺存在生产周期长、操作繁琐、工作量大、易污染等诸多缺陷，如遇禽流感大规模爆发，鸡胚的供应也将存在很大问题。若采用传代细胞生产疫苗的工艺将不受鸡胚等天然因素的限制，且生产周期短，工艺简单，如遇流感暴发会快速反应，短时间内可提供大量疫苗产品。另外，贴壁型的传代细胞可用生物反应器微载体规模化培养，生产中可将细胞生长和病毒繁殖自动控制在最适条件范围内，提高细胞密度和病毒滴度，实现大批次量、小批间差，产品具有更好的稳定性和安全性，大量节省劳动力、生产场地和能源消耗，降低生产成本，与鸡胚直接增殖病毒的工艺和转瓶培养传代细胞增殖病毒的工艺相比具有明显优势。
目前国际上已有几家企业已批准利用MDCK细胞生产流感疫苗。荷兰苏威制药公司（Solvay Pharmaceuticals）生产的流感病毒裂解疫苗Influvac®TC于2001年在荷兰获得批准。诺华公司（Novartis Vaccines）经过驯化获得的MDCK细胞株生产的Optaflu®于2007年获得了欧洲药品审评署（EMEA）的批准，Optaflu®在欧盟27个成员国、冰岛和挪威得到了广泛的使用。Optaflu®的上市标志着近50年流感疫苗生产史最重大的创新之一。Flucelvax®灭活疫苗（甲型流感病毒亚型和乙型流感病毒）于2012年11月获得美国FDA批准用于18岁以上成人流感预防接种。阿斯利康(AstraZeneca)旗下的MedImmune公司生产的4价减毒活疫苗Flumist®于2010年获得美国FDA的批准用于2-45岁人群接种。
MDCK细胞用于流感疫苗生产的主要争议是因为其具有成瘤性。2005年11月16日疫苗和相关生物制品顾问委员会（VRBPAC）组织召开的会议讨论了MDCK细胞作为细胞基质用于流感疫苗生产的相关事宜，并且着重讨论了MDCK细胞的成瘤性问题。会议期间诺华公司、荷兰苏威制药公司、美国医学免疫学公司分别做了MDCK细胞的研究报告。诺华公司的研究报告显示无血清悬浮培养型MDCK细胞的成瘤性非常强，10个细胞就可以对裸鼠成瘤，但是对该公司通过驯化获得的MDCK细胞株33016-PF的研究显示该细胞株对裸鼠不成瘤。荷兰苏威制药公司的研究报告显示MDCK细胞（CCL-34）母细胞（P56）接种的细胞量高于107细胞对裸鼠成瘤，建立的细胞库细胞传代至P98代时接种105细胞量就对裸鼠形成肿瘤。美国医学免疫学公司生产流感疫苗使用的细胞是该公司自主研发获得的无成瘤性MDCK贴壁细胞株，接种107细胞量对裸鼠不成瘤。目前，获得无成瘤性MDCK细胞株仍是各国科研人员研究的重点。
发明内容
本发明提供了一株无成瘤性MDCK细胞克隆株。本发明对ATCC引进的MDCK细胞（CCL-34）母细胞（P55）通过单细胞克隆、染色体分析和裸鼠接种筛选得到了无成瘤性的MDCK细胞克隆株，并在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行了保藏，保藏编号为：C2016150，分类命名：犬肾细胞MDCK-C09，保藏日期为：2016年7月27日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
本发明的第一个目的是提供无成瘤性MDCK细胞克隆株，所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK-C09，保藏编号为：C2016150。
本发明的第二个目的是提供无成瘤性MDCK细胞克隆株在流感疫苗生产中的应用。
作为优选，所述MDCK细胞克隆株作为细胞基质用于流感疫苗生产。
作为优选，将MDCK细胞克隆株接种动物后，所述MDCK细胞克隆株对接种动物不成瘤。
本申请人通过单细胞克隆培养和筛选，得到了一株无成瘤性的MDCK细胞株（分类命名：犬肾细胞MDCK-C09，保藏编号C2016150），为我国开展流感疫苗的相关研究和生产提供无成瘤性的细胞株。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为MDCK单细胞克隆生长过程；其中，A.第9天，B.第12天；
图2为MDCK细胞；其中，A.未克隆的MDCK细胞，B.MDCK-C09，C.MDCK-C35，Aa.培养前24h似成纤维状，Ab.培养72h呈致密的上皮型，Ba.培养24h似成纤维状，Bb.培养72h呈密的上皮型，Ca.培养48h呈岛样生长，Cb.培养96h呈致密的上皮型.10X；
图3为MDCK细胞染色体数量分布比例图；
图4为活细胞接种裸鼠观察结果；其中，A.阳性对照Hela细胞，B.阴性对照MRC-5细胞，C.MDCK-C09。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1
1.材料
1.1 MDCK细胞株（CCL-34），2014年7月16日从ATCC引进，引进时细胞代次为P55，在ATCC的保藏号：60245139。在本实验室传代培养8代（P63）时建库保存，入库编号为MDCK-W-63。裸鼠成瘤结果为10/10（即试验的10只裸鼠全部长出肿瘤）。
1.2 DMEM(H)培养基，货号：BGLM-101.01，批号20150128、20160615，兰州百灵生物技术有限公司生产。使用时加10%胎牛血清（体积百分数）。
1.3胎牛血清，批号：20150715，兰州百灵生物技术有限公司生产。
1.4 0.25%胰蛋白酶（含EDTA），批号：20150715、20151228，兰州百灵生物技术有限公司生产。
1.5 D-PBSA（无钙镁离子），批号：20150312，兰州百灵生物技术有限公司生产。
1.6 U型96孔细胞培养板：批号140029，货号163320；
24孔细胞培养板：批号7193630，货号142475；
均为Thermo公司生产。
1.7 细胞培养瓶
T25货号：430639，批号：12814601；
T75货号：430641，批号：08514601；
T225货号：431081，批号：28913010；
均为corning公司生产。
1.8 冻存管1.5ml（货号：5000-1020，批号1115432，ThermoFisher公司生产）。
1.9 BALB/c裸鼠（4-7周龄）雌鼠，北京维通利华试验动物技术有限公司，在甘肃中医学院实验动物中心饲养。
1.10 对照细胞
Hela细胞和MRC-5细胞，均为甘肃省动物细胞工程技术研究中心保藏。
2 主要仪器设备
2.1生物显微镜（CKX-41，日本，OLYMPUS）。
2.2 CO2培养箱（3111，美国，ThermoFisher）。
2.3 细胞计数仪（CASY TT，美国，INNOVATIS）。
2.4其它设备：各种规格的移液器。
3.方法
3.1细胞复苏培养
按常规方法在38-39℃水浴中快速解冻细胞，用10ml DMEM(H)培养基悬浮后1000rpm离心5min。弃上清用20ml DMEM(H)培养基将细胞转移至75cm细胞培养瓶中，置37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养至生长单层。
3.2单细胞悬液制备
采用有限稀释法制备单细胞悬液。
3.2.1取生长至单层的MDCK细胞，倒掉培养瓶中的培养基，加入 10ml 的 PBS 轻轻摇动清洗，共清洗两遍；
3.2.2加入5ml 的0.25%胰蛋白酶，在37℃下进行消化细胞至细胞变圆，弃去胰酶；
3.2.3加入10ml DMEM(H)培养基，吹打细胞至完全分散，于1000rpm离心10min；
3.2.4离心完毕后，将上清液倒掉，加入DMEM(H)培养基 10ml，将细胞重新均匀悬浮后计数；
3.2.5细胞稀释方法：细胞计数浓度→10×104/ml→1×104/ml→1×103/ml，吸取1×103/ml细胞100μl至20ml DMEM(H)培养基中混合均匀，即每200μl中约含1个细胞。
3.3单细胞培养
用12道移液器将上述稀释好的单细胞悬液加到U型96孔细胞培养板中，每孔加200μl，即每孔加1个细胞，共加5块培养板，并于 37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。培养2h后取出细胞板，在显微镜下逐孔观察，标记出只有1个细胞的孔，再放回培养箱继续培养。每天观察只接种了一个细胞的孔内的生长情况，并在培养第4d和8d对单细胞孔各换液一次，换液量每孔200μl。
3.4单克隆细胞株的挑选
3.4.1单细胞培养至11-13d时，每天用显微镜观察单细胞孔中的生长情况，依据细胞长势和形态挑选优势克隆株40株分别进行扩大培养，此时优势株细胞可覆盖接种孔低面40%以上的生长面。在传代扩大培养期间可淘汰生长不良的细胞株。
3.4.2细胞扩大培养
（1）挑选的单克隆细胞株每次培养操作时要逐孔依次进行，防止细胞间交叉污染，如同时操作多个孔，有细胞间交叉污染的风险。从第一次传代的先后顺序编号，依次为MDCK-C01、。
（2）从96孔培养板到24孔培养板扩大培养
用移液器吸掉孔内的培养基，每次加入200μl PBS，用移液器轻轻吹洗两下，吸去PBS，共吹洗两次。每孔加入0.25%胰蛋白酶50μl，置于培养箱消化，从第5min起，每隔1min取出在显微镜下观察消化情况，直到细胞完全变圆并有轻微脱落感时，轻轻吸去上层胰酶，加入100μl的DMEM(H)培养基，再轻轻吹打几次使细胞完全悬浮后转移至24孔细胞培养板，置37℃，5% CO2的培养箱中继续培养。1孔96孔培养板中的细胞传代至24孔培养板的1孔，24孔培养板培养时每孔加1mlDMEM(H)培养基。每天观察24孔培养板中的生长状况，待细胞长成单层细胞时继续扩大培养（需要48h-72h）。
（3）从24孔到T25细胞培养瓶扩大培养
依照（2）的方法，清洗用PBS每次加1ml，消化用0.25%胰蛋白酶每孔加0.5ml，用10mlDMEM(H)培养基传代至T25细胞培养瓶至生长成单层细胞（需要72h-120h）。
（4）从T25细胞培养瓶到T75细胞培养瓶扩大培养
依照（3）的方法，清洗用PBS每次加10mlPBS，消化用0.25%胰蛋白酶每瓶加5ml，用40mlDMEM(H)培养基传代至2个T75细胞培养瓶中，每瓶20ml，培养至细胞成致密单层（需要48h-96h）。
3.4.3单克隆细胞株原始细胞库的建立
（1）根据培养过程中细胞的长势和形态情况，挑选优势克隆株进行保种冻存。
（2）按上述3.4.2（3）方法消化成单细胞悬液，消化T75细胞培养瓶中的细胞时清洗用PBS每次加20ml，消化用0.25%胰蛋白酶每瓶加10ml。每瓶用10ml培养液悬浮后两瓶细胞合并计数，于1000rpm离心10min后弃上清。
（3）用细胞冻存液重新悬浮离心后的细胞并调整细胞浓度为1-2×106个/ml，每支冻存管按1ml分装，贴标签后按常规方法在液氮中保存，标签要标记细胞编号、细胞株名称、克隆株号、细胞代次和冻存日期等信息，建立原始细胞库，保存种子细胞。
细胞冻存液由以下体积百分数的各组分组成：10%DMSO（二甲基亚砜）+20%胎牛血清+70%DMEM培养基。
3.4.4单克隆细胞株染色体数测定
依照3.1的方法分别复苏原始细胞库的细胞各1支，按哺乳动物细胞染色体常规分析方法，制备染色体标本，每株克隆株细胞统计50个以上处于中期分裂相细胞的染色体数量，并统计染色体数量处于78±2的细胞占的数量（MDCK细胞来源于犬肾，犬类的正常染色体数为78条）。
3.4.5单克隆细胞株的成瘤性初步检查
选取染色体众数（78±2）大于80%的单克隆细胞株，依照3.1的方法复苏培养，按照《中华人民共和国药典》（2015年版三部）“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规”的附录二进行成瘤性检查（每只裸鼠接种1.0×107个活细胞）。
3.4.6无成瘤性细胞株的主细胞库建立、复检和保藏
（1）依照3.1的方法，从单克隆细胞株原始细胞库中复苏1支初步检查不成瘤的单克隆细胞株接种到1个T75细胞培养瓶培养，并按照1个T75→2个T225→8个T225的比例扩大培养后冻存，建立主细胞库。冻存方法同3.4.3，其中，在T225细胞培养瓶细胞清洗每次加50mlPBS，消化用0.25%胰蛋白酶每瓶加20ml。
（2）依照3.1的方法复苏主细胞库的细胞1支，按照《中华人民共和国药典》（2015年版三部）“生物制品生产检定用动物细胞基质制备及检定规”的附录二进行成瘤性复查（每只裸鼠接种1.0×107个活细胞）。
（3）取成瘤性复查仍不成瘤的MDCK单克隆细胞株主细胞库中的细胞，用加干冰的包装快运至中国典型培养物保藏中心（武汉）进行保藏。
4结果
4.1 通过单细胞克隆培养和筛选，最后选择了10株优势细胞株建立了原始细胞库，均呈上皮型细胞，编号分别为：MDCK-C01、MDCK-C04、MDCK-C09、MDCK-C19、MDCK-C20、MDCK-C21、MDCK-C23、MDCK-C25、MDCK-C26和MDCK-C35。其中，MDCK-C23、MDCK-C25、MDCK-C26和MDCK-C35等四株在每代培养前48h呈岛样生长，生长速度较慢，1：6的分瓶比例传代时72-96小时才能形成致密单层。其它六株为生长速度较快，培养前期似成纤维状，1：6的分瓶比例传代时48-72小时可形成致密单层。两类细胞形成致密单层后，形态无明显区别。冻存的细胞活力均好，细胞冻存信息见下表1。
表1.单克隆细胞株的冻存信息表
54.2单克隆细胞的染色体数量78条所占的比例在3.3-56.5%，78±2条所占比例在16.7-83%，其中，MDCK-C09株的染色体78条所占比例为56.5%属最高，78±2条所占比例82.6%；MDCK-C23株的染色体78±2条所占比例83%属最高，78条所占比例为52.3%；MDCK-C35株的78±2条占比例也超过80%，达到了82%，78条所占比例为54%。
其余7株78±2条占比例均低于80%。统计结果见表2。
表2.单克隆细胞株染色体统计结果表
4.3 成瘤性初步检查
对染色体数（78±2）大于80%的MDCK-C09、MDCK-C23和MDCK-C35三株细胞进行初步成瘤性检查，裸鼠成瘤结果分别为0/10、1/10和3/10。
表3 成瘤性初步检查结果
4.4无成瘤性细胞株的主细胞库建立、复检和保藏
4.4.1从单克隆细胞株原始细胞库中复苏1支成瘤性初步检查不成瘤的MDCK-C09株细胞，经扩大培养后冻存500支，细胞密度为：1.79×106个/ml，冻存活力：100%（胎盘蓝染色后镜下没有看到死细胞），建立了主细胞库。
4.4.2 从单克隆细胞株主细胞库中复苏1支MDCK-C09株，进行成瘤性复检，结果为：0/10，再次证明该细胞株不具有成瘤性。
表4 成瘤性复检结果
4.4.3从单克隆细胞株主细胞库中取MDCK-C09株，用加干冰的包装快运至中国典型培养物保藏中心（CCTCC）进行保藏，分类命名：犬肾细胞MDCK-C09，保藏编号：C2016150，保藏日期为：2016年7月27日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。
经实验，本发明的细胞株犬肾细胞MDCK-C09是贴壁培养型。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.无成瘤性MDCK细胞克隆株，其特征在于：所述无成瘤性MDCK细胞克隆株保藏于中国典型培养物保藏中心，分类命名：犬肾细胞MDCK-C09，保藏编号为：C2016150。
2.权利要求1所述的无成瘤性MDCK细胞克隆株在流感疫苗生产中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述MDCK细胞克隆株作为细胞基质用于流感疫苗生产。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：将MDCK细胞克隆株接种动物后，所述MDCK细胞克隆株对接种动物不成瘤。
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