DE69534618T2

DE69534618T2 - Verfahren zur herstellung rekombinanter adeno-associated viren (aav) und deren verwendung

Info

Publication number: DE69534618T2
Application number: DE69534618T
Authority: DE
Inventors: Vincent Descamps; Michel Perricaudet
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: CENTELION, VITRY SUR SEINE, FR
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1995-01-18
Publication date: 2006-07-27
Anticipated expiration: 2015-01-19
Also published as: CA2181602A1; NO319885B1; ZA95628B; IL112461A0; EP0741793A1; WO1995020671A1; FR2716682A1; MX9603002A; ATE310097T1; FI962990A; AU706647B2; US5789390A; JPH09509051A; ES2252738T3; NO962950D0; FR2716682B1; AU1539595A; NO962950L; KR100403708B1; DK0741793T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Präparation von Vektoren, die abgeleitet sind von adenoassoziierten Viren (AAV) und den zu diesem Zweck verwendeten Zellen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Präparation von rekombinanten AAV mittels eines tierischen Hilfsvirus. Die Erfindung betrifft außerdem die Verwendung von rekombinanten AAV, die im Besonderen durch Gentherapie und/oder Zelltherapie erhalten werden.
Die Gentherapie besteht in der Korrektur eines Defekts oder einer Anomalie (Mutation, aberrante Expression usw.) oder zur Sicherung der Expression eines Proteins von therapeutischem Interesse durch die Einführung einer genetischen Information in die betroffene/beschädigten Zelle oder das betroffene Organ. Diese genetische Information kann entweder in vitro in eine Zelle, die dem Organ entnommen wurde, eingeführt werden, wobei die modifizierte Zelle dann wieder in den Organismus eingeführt wird, oder direkt in vivo in das entsprechend Gewebe. Unterschiedliche Techniken wurden für den Transfer dieser genetischen Information beschrieben, umfassend die verschiedenen Techniken der Transfektion, die Komplexe von DNA- und DEAE-Dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), von DNA und nuklearen Proteinen (Kaneda et al., Science 243 (1989) 375), von DNA und von Fetten (Felgner et al., PNAS 84 (1987) 7413), von DNA und von Polylysin, die Nutzung von Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) usw. Unlängst tauchte die Nutzung von Viren als Vektoren für den Transfer von Genen als viel versprechende Alternative zu diesen physikochemischen Transfektionstechniken auf. Diesbezüglich wurden verschiedene Viren auf ihre Fähigkeit zur Infektion bestimmter Zellpopulationen hin getestet. Insbesondere die Retroviren (RSV, HMS, MMS usw.), der Virus HSV, die Andenoviren und die adeno-assoziierten Viren.
Unter diesen Viren bieten die adeno-assoziierten Viren (AAV für „adeno-assoziierter Virus") bestimmte attraktive Eigenschaften im Hinblick auf die Verwendung für den Transfer von Genen. Die AAV sind Viren mit einer DNA von relativ geringer Größe, die sich in das Genom, das sie infizieren, auf stabile und ortsspezifische Art einbinden. Sie können ein breites Spektrum an Zellen infizieren, ohne sich auf das Wachstum, die Morphologie und die Differenzierung der Zellen auszuwirken. Im Übrigen scheinen sie nicht in Krankheiten beim Menschen eingebunden zu sein.
Das Genom der AAV wurde geklont, sequenziert und charakterisiert. Es umfasst ungefähr 4700 Basen und enthält an jedem Ende eine invertierte terminale Wiederholungssequenzregion (ITR) von ungefähr 145 Basen, die als Replikationsursprung für den Virus dienen. Der Rest des Genoms ist in 2 essentielle Regionen aufgeteilt, die die Enkapsidationsfunktion tragen: die linke Seite des Genoms, die das Gen rep enthält, das in die Virusreplikation und die Expression der viralen Gene eingebunden ist; die rechte Seite des Genoms, die das Gen cap enthält, das für die Proteine des Viruskapsids kodiert. Die Verwendung von AAV-abgeleiteten Vektoren für den Transfer von Genen in vitro und in vivo wurde in der Literatur beschrieben (vgl. im Besonderen WO-Patentschrift 91/18088; WO-Patentschrift 93/09239; US-Patentschrift 4,797,368, US-Patentschrift 5,139,941, EP-Patentschrift 488 528). Diese Patentanträge beschreiben verschiedene Konstruktionen, die von den AAV abgeleitet sind, in denen die Gene rep und/oder cap nachgewiesen und ersetzt werden durch ein interessierendes Gen und deren Verwendung, um dieses interessierende Gen in vitro (auf Kulturzellen) oder in vivo (direkt in einem Organismus) zu transferieren.
Gleichwohl ist die therapeutische Verwendung der AAV als Vektoren für den Transfer der Gene derzeit begrenzt, im Besonderen aufgrund der Kontaminationsrisiken der rekombi nanten AAV durch einen Wildstammvirus, und der Verwendung für die Herstellung der rekombinanten Viren, der potentiell tumorigenen menschlichen Zelllinien. Die AAV brauchen für ihre Replikation die Gegenwart eines Hilfsvirus („Helper"). Der Begriff Hilfsvirus bezeichnet jeden Virus, der in der Lage ist, die für die Replikation der AAV notwendigen Funktionen in trans zu erbringen. Es kann sich insbesondere um einen Adenovirus, einen Herpesvirus oder einen Virus der Vakzine handeln. In Abwesenheit eines solchen Hilfsvirus bleiben die AAV in latenter Form im Genom der infizierten Zellen, können sich aber nicht replizieren und dadurch Viruspartikel herstellen. Im Allgemeinen werden die rekombinanten AAV also durch Cotransfektion hergestellt, in einer Zelllinie, die mit einem menschlichen Hilfsvirus infiziert ist, (zum Beispiel mit einem Adenovirus), durch ein Plasmid, das das interessierende Gen enthält, umgeben von zwei invertierten terminalen Wiederholungssequenz-Regionen(ITR) des AAV und eines Plasmids, das die Enkapsidationsgene(Gene rep und cap) von AAV tragen. Die hergestellten rekombinanten AAV werden dann mittels der herkömmlichen Techniken gereinigt. Die so erhaltenen AAV sind jedoch im Allgemeinen mit einem Wildstamm-Hilfsvirus kontaminiert, der ebenfalls von der Produktionszelle produziert wird. Die Gegenwart dieses Hilfsvirus kann in vivo sehr verhängnisvolle Folgen, wie zum Beispiel eine pathogene oder eine immunogene Wirkung, haben. Dieser Hilfsvirus kann ebenfalls für Rekombinationsereignisse oder für die Replikation des rekombinanten AAV verantwortlich sein, und daher für seinen Transfer und seine Dissemination.
Die vorliegende Erfindung erbringt eine vorteilhafte Lösung für dieses Problem. Der Antragsteller hat nämlich ein Herstellungsverfahren für rekombinante AAV entwickelt, das es ermöglicht, Vorräte rekombinanter AAV zu produzieren, ohne menschlichen Wildstamm-Hilfsvirus. Das Verfahren der Erfindung ermöglicht es außerdem, die Verwendung von potentiell tumorigenen Produktionszellen zu vermeiden. Das Ver fahren der Erfindung beruht zum Teil auf der Verdeutlichung, dass die rekombinanten AAV unter Verwendung eines Hilfsvirus tierischen Ursprungs hergestellt werden können. Der Antragsteller hat nämlich auf überraschende Weise gezeigt, dass ein Virus tierischen Ursprungs in der Lage war, einen menschlichen AAV zu transkomplementieren und daher als Hilfsvirus für die Herstellung von menschlichen rekombinanten AAV verwendet werden kann. Dieses Ergebnis ist besonders vorteilhaft, weil der als Hilfsvirus verwendete tierische Virus nicht in der Lage ist, sich in den menschlichen Zellen zu verbreiten, und weil keine menschliche Krankheit als Folge einer Infektion mit einem tierischen Hilfsvirus beobachtet wurde. Selbst wenn daher die erhaltenen rekombinanten AAV-Präparationen durch den Hilfsvirus kontaminiert sein können, kann dieser in vivo keine unerwünschte Nebenwirkung verursachen. Außerdem ermöglicht es das Verfahren der Erfindung tierische Produktionszelllinien zu verwenden, die keine bekannten tumorigenen Wirkungen für die derzeit verfügbaren menschlichen Linien aufweisen. Die Erfindung beruht ebenfalls auf der Entwicklung von Zelllinien und Hilfsviren, die für die Herstellung von rekombinanten AAV besonders vorteilhaft sind.
Eine erste Aufgabe der Erfindung liegt also in einem Verfahren zur Herstellung rekombinanter AAV, gemäß dem die Herstellung in Gegenwart eines tierischen Hilfsvirus durchgeführt wird.
Besonders bevorzugt wird die Herstellung in einer tierischen Zelllinie durchgeführt, die mit einem tierischen Hilfsvirus infiziert ist.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ganz allgemein die Verwendung eines tierischen Hilfsvirus für die Präparation rekombinanter AAV.
Wie oben angegeben, bezeichnet der Begriff Hilfsvirus im Sinne der vorliegenden Erfindung jeden Virus, der in der Lage ist, die für die Replikation der AAV notwendigen Funktionen in trans zu erbringen. Der im Verfahren der Erfindung verwendete Hilfsvirus kann ein aus einem Hund, einem Rind, einer Maus, einem Schaf, einem Schwein, Geflügel oder einem Affen stammender Virus sein. Er wird bevorzugt ausgewählt aus den Adenoviren, den Herpesviren und den Viren der Vakzine.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines Adenovirus tierischen Ursprungs besonders vorteilhaft. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbaren Adenoviren tierischen Ursprungs können verschiedenen Ursprungs sein, insbesondere können Sie vom Hund, vom Rind, von der Maus stammen, (Beispiel: Mav1, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), vom Schaf, vom Schwein, von Geflügel oder auch vom Affen stammen, (Beispiel: SAV).
Insbesondere unter den Adenoviren vom Geflügel lassen sich die Serotypen 1 bis 10 zitieren, die in der ATCC (Amerikanische Typus-Kultursammlung) zugänglich sind, wie zum Beispiel die Stämme Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-11 (ATCC VR-921) oder auch die referenzierten Stämme ATCC VR-831 bis 835.
Unter den Adenoviren vom Rind, können die verschiedenen bekannten Serotypen verwendet werden, und im Besonderen jene, die in der ATCC verfügbar sind (Typen 1 bis 8) unter den Referenzen ATCC VR-313, 314, 639–642, 768 und 769.
Es können außerdem die Adenoviren von Mäusen FL (ATCC VR-550) und E20308 (ATCC VR-528), der Adenovirus Typ 5 vom Schaf (ATCC VR-1343), oder Typ 6 (ATCC VR-1340) verwendet werden; der Adenovirus vom Schwein 5359), oder die Adenoviren vom Affen, wie etwa im Besonderen die Adenoviren, die in der ATCC unter den Nummern VR-591–594, 941–943, 195–203 referenziert sind, usw.
Vorzugsweise werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung Adenoviren, die vom Hund stammen, und besonders bevorzugt alle Stämme der Adenoviren CAV1 und CAV2 [zum Beispiel Stamm Manhattan oder A26/61 (ATCC VR-800)] als Hilfsvirus verwendet. Die Adenoviren vom Hund waren Gegenstand zahlreicher Strukturuntersuchungen. So wurden vollständige Restriktionskarten der Adenoviren CAV1 und CAV2 im Stand der Technik beschrieben (Spibey et al., J. Gen. Virol. 70 (1989) 165), und die Gene E1a, E3 sowie die ITR-Sequenzen wurden geklont und sequenziert (vgl. im Besonderen Spibey et al, Virus Res. 14 (1989) 241; Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525). Wie die nachfolgenden Beispiele zeigen, sind die Adenoviren vom Hund in der Lage die AAV für ihre Replikation mit einer besonders hohen Wirksamkeit zu transkomplementieren.
Diese verschiedenen Viren tierischen Ursprungs können, zum Beispiel aus den Stämmen erhalten werden, die in den Sammlungen niedergelegt sind, und dann in den entsprechenden Zelllinien amplifiziert und eventuell modifiziert werden. Die Techniken der Herstellung, Isolierung und Modifikation des Adenovirus oder des Herpesvirus wurden in der Literatur beschrieben und können im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden [Akli et al. Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gene Therapy 1 (1990) 241: Patentschrift EP 185 573 , Levrero et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988 Roemer und Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211 35 Dobson et al, Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al, New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al, New Biol. 4 (1992) 238; WO91/18088, WO90/09441, WO88/10311, WO91/11525]. Diese verschiedenen Viren können dann modifiziert werden, zum Beispiel durch Deletion, Substitution, Addition usw. Insbesondere können diese Viren in bestimmten Fällen so modifiziert werden, damit sie für ihre Replikation defektiv werden.
Wie oben angegeben, wird die Herstellung der rekombinanten AAV gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung bevorzugt in einer tierische Zelllinie durchgeführt, die von einem Hilfsvirus infiziert ist.
Im Allgemeinen werden Zelllinie und Hilfsvirus derselben Art verwendet. Diesbezüglich wurden verschiedene tierische Zelllinien, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, in der Literatur beschrieben. Daher können unter den Linien vom Hund vorteilhafterweise die Linie der Nierenzellen des Windhunds GHK (Flow laboratories) oder der Zelllinie MDCK (ATCC-Nr. CRL6253) sein. Die Kulturbedingungen dieser Zellen und die Präparation der Viren oder der viralen DNA wurden in der Literatur beschrieben (vgl. im Besonderen Macatney et al., Science 44 (1988) 9; Fowlkes et al, J. Mol. Biol. 132 (1979) 163). Andere tierische Linien (die zum Beispiel in den Sammlungen zugänglich sind) können ebenfalls verwendet werden.
Bevorzugt entwickelt das Verfahren der Erfindung die Zelllinie vom Hund, die mit einem Adenovirus vom Hund infiziert ist.
Besonders bevorzugt wird das Verfahren der Erfindung mit der Linie MDCK oder GHK, als Zelllinie vom Hund, oder einem ihrer abgeleiteten Linien realisiert. Unter abgeleitete Linie ist jede Linie zu verstehen, die aus diesen Linien erhalten wird, und dabei ihre Fähigkeit zur Herstellung von rekombinanten AAV behält, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert, infiziert und/oder transfiziert wird. Die abgeleiteten Linien können im Besonderen durch Insertion exogener Gene, Mutagenese und/oder gegebenenfalls Auswahl von Subklonen, erhalten werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Durchführung der Erfindung besitzt die verwendete Zelllinie außerdem Enkapsidationsfunktionen von AAV.
Wie oben angegeben, werden die rekombinanten AAV im Allgemeinen durch Cotransfektion, in der durch einen Hilfsvirus infizierten Zelllinie hergestellt, durch ein Plasmid, das das interessierende Gen enthält, umgeben von zwei invertierten terminalen Wiederholungssequenz-Regionen (ITR) von AAV und einem Plasmid, das die Enkapsidationsfunktionen von AAV trägt. Die Tatsache der Delegation der Enkapsidationsfunktionen des rekombinanten AAV und der Erbringung in trans auf einem Plasmid, ermöglicht es nämlich, wirkungsvolle rekombinante AAV zu herzustellen, das heißt, dass sie nicht in der Lage sind, nach der Infektion in jeder Zielzelle, infektiöse Viruspartikel herzustellen. Die Enkapsidationsfunktionen von AAV werden im Wesentlichen durch die Gene rep und cap gebildet, oder durch jedes funktionale homologe Gen. Das Gen rep ist in die virale Replikation eingebunden, sowie in der Expression der viralen Gene und dem Gen-Cap-Code für die Hülleproteine des Virus (VP1, VP2 und VP3). Diese Gene wurden charakterisiert und ihre Sequenz wurde in der Literatur beschrieben (Srivastava et al, J. Virol. 45 (1983) 555). Ein funktionales Homolog entspricht jedem Gen, das durch Modifikation (Mutation, Suppression, Addition usw.) der Gene rep oder cap erhalten wurde, wobei es eine Aktivität gleicher Art aufweist. Derartige funktionale homologe Gene können ebenfalls Gene sein, die durch Hybridisierung aus Nukleinsäurebanken mittels Sonden erhalten wurden, die den Genen rep oder cap entsprechen.
Um die Herstellung von rekombinanter defektiver AAV zu ermöglichen, besitzt die Zelllinie gemäß der Erfindung also bevorzugt die Enkapsidationsfunktionen von AAV Besonders bevorzugt besitzt die verwendete Zelllinie eine oder mehrere Kopien der Gene rep und cap von AAV, oder funktionale homologe Gene.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können die Enkapsidations funktionen von AAV durch ein Enkapsidationsplasmid erbracht werden und/oder durch den verwendeten tierischen Hilfsvirus und/oder können im Genom der Zelllinie integriert sein.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung, werden alle Enkapsidationsfunktionen durch ein so genanntes Enkapsidationsplasmid erbracht. In diesem Fall umfasst das Verfahren der Erfindung bevorzugt die Cotransfektion einer tierischen Zelllinie, die durch einen tierischen Hilfsvirus infiziert ist, durch einen Vektor, der ein interessierendes Gen trägt und mindestens ein ITR von AAV und durch das genannte Enkapsidationsplasmid von AAV. Besonders bevorzugt trägt das Enkapsidationsplasmid von AAV mindestens die Gene rep und cap von AAV oder funktionale homologe Gene.
In jeder anderen besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden die Enkapsidationsfunktionen durch den verwendeten tierischen Hilfsvirus erbracht, und/oder sind im Genom der Zelllinie integriert. In diesem Fall umfasst das Verfahren gemäß der Erfindung die Transfektion eines Vektors, der jedes interessierende Gen trägt, und mindestens ein ITR von AAV in einer Zelllinie, die durch einen tierischen Hilfsvirus infiziert ist, und die Enkapsidationsfunktionen enthält (integriert im Genom und/oder getragen durch den Hilfsvirus). Diese Ausführungsform ist besonders vorteilhaft, weil sie es ermöglicht, die Nutzung eines Enkapsidationsplasmids zu vermeiden.
Besonders bevorzugt wird im Verfahren der Erfindung ist das Gen rep von AAV oder ein funktionales Homolog davon, in das Genom der Zelllinie integriert, und das Gen cap von AAV oder ein funktionales Homolog davon, wird durch den tierischen Hilfsvirus getragen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung wird eine Zelllinie verwendet, die die Gene rep und cap von AAV oder die funktionalen homologen Gene, eingefügt in ihr Genom, umfasst. In dieser bevorzugten Form können die Gene rep und cap von AAV oder ihre funktionalen Homologe in eine einzige Konstruktion eingeführt werden, oder nacheinander auf getrennten Konstruktionen. In den verschiedenen Ausführungsformen können die Enkapsidationsfunktionen unter die Kontrolle ihres eigenen Promoters, unter die von heterologen Promotern oder von artifiziellen Promotern gestellt werden. Bevorzugt werden die Enkapsidationsfunktionen unter die Kontrolle von Elementen zur Regulierung und zur induktiblen Transkription gestellt, die es ermöglichen die Expression der Enkapsidationsfunktionen je nach den Bedingungen zu induzieren oder zu unterdrücken. Gans besonders bevorzugt in der Konstruktion der Erfindung wird das Gen rep von AAV oder ein funktionales homologes Gen unter die Kontrolle eines induzierbaren Promoters gestellt.
Weiter in einer anderen bevorzugten Ausführungsvariante der Erfindung wird ein Hilfsvirus verwendet, der in seinem Genom die Gene rep und cap von AAV oder die funktionalen homologen Gene umfasst.
Der Antragsteller hat nämlich gezeigt, dass es möglich ist, die Enkapsidationsfunktionen, oder bestimmte von ihnen, direkt in das Genom des verwendeten Hilfsvirus einzuführen. Auf die gleiche Art hat der Antragsteller ebenfalls gezeigt, dass es möglich ist, die Enkapsidationsfunktionen, oder bestimmte von ihnen, auf stabile Weise direkt in das Genom der verwendeten Zelllinie einzuführen.
Diesbezüglich hat die Erfindung ebenfalls jede tierische Zelllinie zur Aufgabe, die durch einen Hilfsvirus infizierbar ist, für die Herstellung von rekombinanten AAV, welche alle oder einen Teil der Enkapsidationsfunktionen von AAV umfassen, die in seinem Genom integriert sind. Bevorzugt betrifft die Erfindung jede tierische Zelllinie, die die Gene rep und cap von AAV oder ein funktionales homologes Gen umfasst, das in ihrem Genom integriert ist. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung jede tierische Zelllinie, die die Gene rep und cap von AAV oder funktionale homologe Gene umfasst, die in seinem Genom integriert sind.
Ganz besonders bevorzugt handelt es sich um eine Zelllinie vom Hund, wie zum Beispiel eine Linie, die aus den Linien MDCK oder GHK erhalten wird.
Die Zelllinien der Erfindung können durch Transfektion eines DNA-Fragments erhalten werden, das die Enkapsidationsfunktion(en) von AAV unter der Kontrolle der Expressionssignale trägt. Die Transfektion kann mittels jeder dem Fachmann bekannten Technik realisiert werden (Kalziumphosphatfällung, Lipofektion, Elektroporation, Verwendung von Liposomen usw.). Bevorzugt wird die Transfektion in Gegenwart von Kalziumphosphat realisiert (vgl. Beispiel 5). Um die Expression der Enkapsidationsfunktionen zu kontrollieren, können verschiedene Expressionssignale verwendet werden. Es kann sich insbesondere um eigene Promoter der Gene rep oder cap, um heterologe oder sogar synthetische Promoter handeln. In einer besonders interessanten Ausführungsform werden in den Zelllinien gemäß der Erfindung die Enkapsidationsfunktionen von AAV der Kontrolle von induzierbaren Promotern (LTR-MMTV, Tc usw.) unterstellt. Die Nutzung dieser Promoter ist besonders vorteilhaft, da sie es ermöglicht, die Wirkung des Genes rep, im Besonderen auf den verwendeten Hilfsvirus, zu modulieren. Die Erfindung hat also jede Zelllinie zur Aufgabe, die für die Herstellung von rekombinanten AAV durch einen Hilfsvirus infizierbar ist, umfassend alle oder einen Teil der Enkapsidationsfunktionen von AAV, integriert in seinem Genom, unter der Kontrolle eines oder mehrerer induktibler Promoter.
Im Falle einer Linie, die die Gene rep und cap von AAV (oder funktionale Homologe) umfasst, können diese Gene transfiziert werden, entweder auf einer einzigen Konstruk tion, oder nacheinander, auf zwei getrennten Konstruktionen. Diese zweite Präparationsart ist besonders vorteilhaft, weil sie die Rekombinationsereignisse maximal beschränkt. Die so erhaltenen Linien sind also besonders stabil. Im Übrigen trägt die für die Transfektion verwendete Konstruktion vorteilhafterweise ebenfalls ein Gen, das die Selektion der transformierten Zellen ermöglicht, und zum Beispiel das Geneticin-Resistenzgen. Das Resistenzgen kann ebenfalls von einem verschiedenen DNA-Fragment getragen werden, das mit dem ersten cotransfiziert wurde.
Nach der Transfektion werden die transformierten Zellen selektioniert (zum Beispiel nach ihrer Geneticinresistenz) und ihre DNA wird analysiert durch einen Northen blot, um die Integration des oder der DNA-Fragmente (im Falle der Verwendung von 2 getrennten Konstruktionen) im Genom zu verifizieren. Die Fähigkeit der erhaltenen Zellen, AAV zu enkapsidieren, kann anschließend durch Infektion mittels eines rekombinanten AAV ohne die genannten Funktionen getestet werden.
Die Erfindung hat ebenfalls zur Aufgabe jeden Hilfsvirus für die Herstellung von rekombinanten AAV, umfassend, alle oder einen Teil der in seinem Genom eingefügten Enkapsidationsfunktionen der AAV. Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung jeden Hilfsvirus für die Herstellung von rekombinanten AAV, umfassend, das in seinem Genom eingefügte Gen rep von AAV oder ein funktionales homologes Gen. Weiter bevorzugt betrifft die Erfindung jeden Hilfsvirus für die Herstellung von rekombinanten AAV, umfassend, die in seinem Genom eingefügten Gene rep und cap von AAV, oder die funktionalen homologen Gene.
Vorteilhafterweise ist der Hilfsvirus für die Herstellung von rekombinanten AAV ein Adenovirus. Die Adenoviren, umfassend die Enkapsidationsfunktionen der AAV gemäß der Erfindung, können präpariert werden durch homologe Rekombi nation zwischen einem Adenovirus und einem Plasmid, das unter anderem die genannten Enkapsidationsfunktionen trägt. Die homologe Rekombination erfolgt nach der Cotransfektion der genannten Adenoviren und des Plasmids in einer geeigneten Zelllinie. Als Beispiel für eine Linie ist die menschliche embryonale Nierenlinie 293 zu nennen (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), die im Besonderen, integriert in ihr Genom, die linke Seite des Genoms eines Adenovirus Ad5 (12 %) enthält, oder die Linie MDCK. Dann werden die Vektoren, die sich multipliziert haben, gemäß den herkömmlichen Techniken der Molekularbiologie rückgewonnen und gereinigt.
Noch weiter bevorzugt ist der Adenovirus ein Adenovirus tierischen Ursprungs, vorzugsweise ausgewählt aus den Adenoviren des Hundes (CAV1 und CAV2). Die Enkapsidationsfunktionen von AAV können in die verschiedenen Regionen des Genoms des Hilfsvirus der Erfindung eingeführt werden. Vorteilhafterweise werden die Enkapsidationsfunktionen in eine Region eingefügt, in der sie die Fähigkeit des Virus, die AAV zu transkomplementieren, nicht stören. Es ist ebenfalls möglich, die Enkapsidationsfunktionen in eine funktionale Region des Genoms des Hilfsvirus einzufügen, wobei diese Region entweder durch ein Plasmid oder durch die verwendete Zelllinie in trans eingebracht wird. So ist es zum Beispiel möglich, das Gen rep, das Gen cap oder die Gene rep und cap als Ersatz für das Gen E1 einzufügen. Der erhaltene Adenovirus kann als Hilfsvirus für die Herstellung von rekombinanten AAV in der Zelllinie 293 verwendet werden, die das Gen E1 in ihrem Genom trägt (vgl. Beispiel 6).
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht so die Herstellung rekombinanter AAV, die therapeutisch verwendbar sind. Die erhaltenen rekombinanten AAV können jedes AAV sein, dessen Genom mindestens durch die Einfügung eines Gens von Bedeutung modifiziert wurde. wie oben angegeben, wurden die verschiedenen Typen rekombinanter AAV im Stand der Technik beschrieben. (WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, 1355,139,941 , EP 488 528 ).
Im Allgemeinen umfassen diese AAV teilweise oder vollständige Deletionen in den Genen rep und/oder cap, auf deren Ebene ein interessierendes Gen eingefügt wird. Diese rekombinanten AAV können präpariert werden aus verschiedenen Serotypen von AAV, wie etwa den AAV1. AAV2, AAV3 und AAV4, und, bevorzugt aus den Stämmen AAV2. Bei dem interessierenden Gen kann es sich insbesondere um ein therapeutisches Gen handeln.
Im Sinne der Erfindung wird unter therapeutischem Gen im Besonderen jedes Gen verstanden, das für ein Proteinprodukt, das eine therapeutische Wirkung hat, kodiert. Das so kodierte Proteinprodukt kann ein Protein, ein Peptid usw. sein. Dieses Proteinprodukt kann homolog gegenüber der Zielzelle sein (das heißt, ein Produkt, das normalerweise in der Zielzelle exprimiert ist, wenn diese keine Krankheit aufweist). In diesem Fall ermöglicht die Expression eines Proteins zum Beispiel eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines inaktiven oder schwach aktiven Proteins aufgrund einer Modifikation zu beseitigen, oder auch das genannte Protein zu überexprimieren. Das therapeutische Gen kann auch für einen Mutanten eines Zellproteins kodieren, der eine gesteigerte Stabilität, eine modifizierte Aktivität usw. hat. Das Proteinprodukt kann ebenfalls heterolog gegenüber der Zielzelle sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein zum Beispiel eine fehlerhafte Aktivität in der Zelle vervollständigen oder einbringen, und ihr dadurch ermöglichen, gegen eine Krankheit zu kämpfen oder eine Immunantwort zu stimulieren.
Unter den therapeutischen Produkten im Sinne der vorliegenden Erfindung lassen sich insbesondere die Enzyme, die Blutderivate, die Hormone, die Lymphokine Interleukine, Interferone, TNF usw. nennen: (FR 9203120), die Wachstumsfaktoren (Erythropoietin, G-CSF, M-CSF, GM-CSF usw.), die Neurotransmitter oder ihre Vorläufer oder Syntheseenzyme, die trophischen Faktoren: BDNF, CNTF, NGF, IGF. GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/Pleiotrophin usw.; die Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE usw. (FR 93 05125), die Lipoprotein-Lipase (LPL), das Dystrophin oder ein Minidystrophin (FR 9111947), das CFTR-Protein, das mit der Mukoviszidose assoziiert ist, die Tumorsuppressorgene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev usw. (FR 93 04745), die Gene, die für die Faktoren kodieren, die in die Koagulation eingebunden sind: Die Faktoren VII, VIII, IX, die Gene, die bei der Reparatur der DNA eine Rolle spielen, die Suizidgene (Thymidinkinase, Cytosin Desaminase) usw.
Das therapeutische Gen kann ebenfalls ein Gen oder eine Antisense-Sequenz sein, deren Expression in der Zielzelle es ermöglicht, die Expression der Gene oder die Transkription von zellulärer mRNA zu kontrollieren. Derartige Sequenzen können zum Beispiel in der Zielzelle in RNA transkribiert werden, komplementär zu zellulärer mRNA, und so ihre Translation in Protein blockieren, gemäß der in der Patentschrift EP 140 308 beschriebenen Technik. Die Antisense-Oligonukleotide umfassen ebenfalls die Sequenzen, die für Ribozyme kodieren, die in der Lage sind, selektiv die Ziel-RNA zu zerstören ( EP 321 201 ).
Das interessierende Gen kann ebenfalls eine oder mehrere Sequenz(en) umfassen, die für ein als Antigen wirksames Peptid kodieren, das in der Lage ist, beim Mensch oder beim Tier eine Immunantwort hervorzurufen. In dieser besonderen Ausführungsform der Erfindung können die rekombinanten AAV für die Realisierung, entweder von Vakzinen oder für immuntherapeutische Behandlungen beim Menschen oder beim Tier, im Besonderen gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebserkrankungen, verwendet werden. Es kann sich im Besonderen um als Antigen wirksame Peptide, die spezifisch sind für den Epstein-Barr-Virus, den HIV-Virus, den Hepatitis-B-Virus ( EP 185 573 ), den Pseudorabies-Virus oder auch um tumorspezifische Viren ( EP 259 212 ) handeln.
Bevorzugt umfasst das interessierende Gen ebenfalls Sequenzen, die ihre Expression in der gewünschten Zelle oder im gewünschten Organ ermöglichen. Es kann sich um Sequenzen handeln, die natürlich für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen geeignet sind, in der infizierten Zelle zu funktionieren. Es kann sich ebenfalls um Sequenzen verschiedenen Ursprungs handeln (die verantwortlich sind für die Expression anderer oder sogar synthetischer Proteine). Im Besonderen kann es sich um Promotersequenzen von Eukaryotengenen oder viralen Genen handeln. Es kann sich zum Beispiel um Promotersequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle stammen, die infiziert werden soll. Ebenso kann es sich um Promotersequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen. Diesbezüglich können zum Beispiel die Promoter der Gene E1A, MLP, CMV, LTR-RSV usw. zitiert werden. Überdies können die Expressionssequenzen modifiziert werden durch Addition von Aktivationssequenzen, von Regulationssequenzen, oder indem dem interessierenden Gen eine gewebespezifische Expression verliehen wird.
Im Übrigen können die interessierenden Gene ebenfalls eine Signalsequenz umfassen, die das synthetisierte Therapieprodukt in die Sekretionswege der Zielzelle lenkt. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des Therapieprodukts sein, aber es kann sich auch um jede andere funktionale Signalsequenz oder um eine künstliche Signalsequenz handeln.
Die rekombinanten AAV, die gemäß der vorliegenden Erfindung präpariert wurden, können für den Transfer der interessierenden Gene in vitro, ex vivo oder in vivo verwendet werden. In vitro können sie es ermöglichen ein Gen auf eine Zelllinie zu transferieren, zum Beispiel im Hinblick auf die Herstellung eines rekombinanten Proteins. Ex vivo können sie verwendet werden, um ein Gen auf eine Population von Zellen, die einem Organismus entnommen wurden, zu transferieren, eventuell selektiert und amplifiziert, mit dem Ziel, den Zellen die gewünschten Eigenschaften im Hinblick auf ihre Readministration in einen Organismus zu verleihen. In vivo können sie für den Transfer der Gene durch direkte Administration einer gereinigten Lösung verwendet werden, eventuell assoziiert mit einem oder mehreren Arzneiträgern. In letztem Fall können die rekombinanten AAV im Hinblick auf die Administrationen auf topischem, kutanem, oralem, rektalem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem, intraokularem, transkutanem usw. Weg formuliert sein. Vorzugsweise sind sie mit einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel für eine injizierbare Formulierung verbunden, im Besonderen für eine direkte Injektion auf der Eben des gewünschten Organs. Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen, oder um trockene, im Besonderen, lyophilisierte Zusammensetzungen handeln, die, gegebenenfalls durch die Addition von sterilisiertem Wasser oder von physiogischer Kochsalzlösung, die Bildung von injizierbaren Lösungen ermöglichen. Die für die Injektion verwendeten AAV-Dosen sowie die Anzahl der Administrationen können, abhängig von verschiedenen Parametern, und im Besonderen abhängig von der verwendeten Administrationsart, der betreffenden Krankheit, des zu exprimierenden Gens, oder auch der angestrebten Behandlungsdauer, angepasst werden,
Die vorliegende Erfindung stellt so ein besonders vorteilhaftes Verfahren für die Präparation von rekombinanten AAV bereit, die therapeutisch verwendbar sind, im Besonderen in einem Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen, umfassend die Administration in vivo eines rekombinanten AAV, das ein Gen betrifft, das tauglich ist, die genannte Erkrankung zu mildern.
Besonders bevorzugt ist dieses Verfahren anwendbar auf Erkrankungen, die aus einer Defizienz an einem Protein- oder Nukleinprodukt resultieren und das interessierende Gen kodiert für das genannte Proteinprodukt oder enthält das genannte Nukleinprodukt.
Die vorliegende Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele umfassender beschrieben, wobei diese der Erläuterung dienen und nicht beschränkend sind.
Allgemeine Techniken der Molekularbiologie
Die in der Molekularbiologie herkömmlich verwendeten Verfahren, wie etwa die präparativen Extraktionen von Plasmid-DNA, die Zentrifugierung von Plasmid-DNA im Cäsiumchloridgradienten, die Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, die Reinigung von DNA-Fragmenten durch Elektroelution, die Phenol- oder Phenol-Chloroform-Extraktion von Proteinen, die DNA-Fällung in salzigem Medium durch Ethanol oder Isopropanol, die Transformation in Escherichia coli usw. ... sind dem Fachmann gut bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben [Maniatis T. et al., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M, et al. (eds), „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York. 1987].
Die Plasmide vom Typ pBR322, pUC und die Phagen der Serie M13 stammen aus kommerziellen Beständen (Bethesda Research Laboratories).
Für die Ligationen können die DNA-Fragmente der Größe nach separiert werden mittels Elektrophorese auf Agarose- oder Acrylamidgelen, mittels Phenol oder einer Phenol-Chloroform-Mischung extrahiert werden, oder in Ethanol gefällt und dann in Gegenwart von DNA-Ligase von Phage T4 (Biolabs) gemäß den Empfehlungen des Lieferanten inkubiert werden.
Das Auffüllen der 5' überhängenden Enden kann durch das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase 1 des Bakteriums E. coli (Biolabs) gemäß den Spezifikationen des Lieferanten durchgeführt werden. Der Abbau der 3' überhängenden Enden wird in Gegenwart von DNA-Polymerase von Phage T4 (Biolabs) durchgeführt, die gemäß den Empfehlungen des Herstellers verwendet wird. Der Abbau der 5' überhängenden Enden wird durch eine Behandlung mittels S1-Nuklease durchgeführt.
Die gezielte In-vitro-Mutagenese mittels synthetischer Oligodeoxynukleotide kann gemäß dem von Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749–8764] entwickelten Verfahren unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Testkits durchgeführt werden.
Die enzymatische Amplifikation der DNA-Fragmente mittels der so genannten PCR-Technik [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350–1354; Mullis ; K.B. und Falcona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335–350] kann unter Verwendung eines „DNA thermal cyclers" (Perkin Elmer Cetus) gemäß den Spezifikationen des Herstellers durchgeführt werden.
Die Verifikation der Nukleotidsequenzen kann mittels des von Sauger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463–5467] entwickelten Verfahrens unter Verwendung des von Amersham vertriebenen Testkits durchgeführt werden.
1. Erläuterung der Figuren
1: Darstellung des Plasmids pREP-CAP
2: Darstellung des Plasmids pAAV-EPO-NEO
3: Darstellung des Plasmids pAd-RepCap
BEISPIEL 1 – Konstruktion des Enkapsidationsplasmids pREP-CAP
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines so genannten Enkapsidationsplasmids, das die für die Enkapsidation eines rekombinanten AAV notwendigen Funktionen trägt. Genauer gesagt, trägt dieses Plasmid, das als pREP-CAP bezeichnet wird, die Gene rep und cap von AAV2.
Das Plasmid pREP-CAP wurde auf folgende Art konstruiert: Das Genom von AAV2, deletiert von dessen ITR, wurde aus dem Plasmid p201 durch Digestion mittels des Enzyms XbaI isoliert. Das Plasmid p201 enthält das gesamte Genom von AAV2, das am Ort PvuII des Plasmids pEMBL8 geklont wurde (Samulski et al., J. Virol. 61(1987) 3096). Das so erhaltene Fragment, das die Gene rep und cap trägt, wurde dann am Ort XbaI des Plasmids Bluescript (Stratagen) geklont. Die Struktur dieses Plasmids wird in 1 dargestellt.
BEISPIEL 2- Konstruktion des Plasmids AAV pAAV-EPO-NEO
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Plasmids AAV, das die cDNA, die für Erythropoietin kodiert, ein Markergen und zwei ITRs von AAV2 trägt. Dieses Plasmid wurde als pAAV-EPO-NEO (2) bezeichnet.
Für die Konstruktion dieses Plasmids wurde eine Expressionskassette, die die cDNA enthält, die für das Erythropoietin (Cynomolgus) unter der Kontrolle der LTR des Rous-Sarkom-Virus (RSV) kodiert, gefolgt vom Gen neo, das die Neomycinresistenz unter der Kontrolle des frühen Promoters des Virus SV40 verleiht. Diese Kassette wurde dann an den Orten SacII-KpnI des Plasmids p201 eingefügt, wobei es das entsprechende Fragment ersetzt, das die Gene rep und cap enthält (2).
BEISPIEL 3 – Herstellung des Adenovirus vom Hund CAV2 in der Zelllinie MDCK
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung des Adenovirus vom Hund CAV2 in der Hundezelllinie MDCK.
Die MDCK-Zellen wurden in einem DMEM-Medium kultiviert, das durch 10 % Kälberserum angereichert wurde (vgl. auch Macatney et al., Science 44 (1988) 9 für die Kulturbedingungen). Die konfluenten Zellen wurden dann mittels einer CAV2 Virussuspension infiziert (ungefähr 5 pfu/Zelle). 30 bis 48 Stunden nach der Infektion wurden die infizierten Zellen eingesammelt und durch Zentrifugierung konzentriert. Das erhaltene Zentrifugat kann verwendet werden, um die Adenoviren CAV2 auf Cäsiumchlorid zu reinigen. Wenn die Werte jedoch zu gering sind, wird das Zentrifugat vorzugsweise einem Gefrier-Auftau-Zyklus unterzogen, dann wird der erhaltene Überstand für die Amplifikation der Viren CAV2 verwendet. Zu diesem Zweck wird der Überstand verwendet, um die MDCK-Zellen unter den gleichen Bedingungen erneut zu infizieren, dann wird das oben beschriebene Protokoll für die Rückgewinnung der Viren wiederholt. Dieses Verfahren ermöglicht es, eine gereinigte Lösung des Adenovirus CAV2 zu erhalten, der als Hilfsvirus für die Herstellung von rekombinanten AAV verwendbar ist.
BEISPIEL 4 – Herstellung von rekombinanten AAV, die das Gen von Erythropoietin in der MDCK-Zelllinie tragen, infiziert durch einen Adenohilfsvirus vom Hund.
Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung von rekombinanten AAV, die das Gen von Erythropoietin in der MDCK-Zelllinie tragen, infiziert durch einen Adenohilfsvirus vom Hund CAV2.
Die MDCK-Zellen (50 % der Konfluenz) wurden mit 5–10 pfu/Zelle des Adenovirus CAV2 infiziert, der unter den Bedingungen von Beispiel 3 präpariert wurde.
Vier bis 6 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen durch Lipofektion (Fegner et al., PNAS 84 (1987) 7413) mit 5 μg des Plasmids pAAV-EPO-NEO und 5 μg des Plasmids pREP-CAP cotransfiziert. 48 bis 72 Stunden danach wurden die Zellen gesammelt und mehreren Gefrier-Auftau-Zyklen unterzogen. Die erhaltene Suspension wurde dann zentrifugiert (15 Minuten bei 4000 Umdrehungen/mm), dann wurde der Überstand, der die rekombinanten AAV enthält, rückgewonnen und 30 Minuten lang auf 56° C erwärmt.
Um das infektiöse Potential und die Expression des Erythropoietin zu verifizieren, wurden Proben des Überstands verwendet, um die Hela-Zellen zu infizieren. Die Hela-Zellen stammen aus einem Karzinom des menschlichen Epithelgewebes. Diese Linie ist zugänglich in der ATCC (Ref. CCL2) sowie die Bedingungen, die deren Kultur ermöglichen. 24 Stunden nach der Infektion wurden die Zellen und der Überstand eingesammelt. Die Gegenwart des Genoms von rekombinanten AAV-EPO in den Zellen wurde danach durch Hybridisierungsexperimente in „Southern blot" auf der zellulären DNA extrahiert gemäß Hirt-Technik (Gluzman und Van Doren, J. Virol. 45 (1983) 91), bestätigt Außerdem wurde die Gegenwart von Erythropoietin in dem Überstand durch biologischen Test gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen eindeutig, dass die rekombinanten AAV in einem tierischen System (Zelllinie und Hilfsvirus) wirksam präpariert werden können.
BEISPIEL 5 – Konstruktion der Zelllinien, die Enkapsidationsfunktionen von AAV enthalten.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion der Zelllinien, die alle oder einen Teil der Enkapsidationsfunktionen von AAV enthalten. Diese Linien ermöglichen die Konstruktion von rekombinanten AAV gemäß der Erfindung, die für diese Regionen deletiert wurden, ohne auf ein Enkapsidationsplasmid zurückgreifen zu müssen. Diese Viren wurden durch Rekombination in vivo erhalten, und können wichtige hetero loge Sequenzen umfassen.
Die Linien der Erfindung werden durch Transfektion der entsprechenden Zellen durch ein DNA-Fragment konstruiert, das die Gene trägt, angegeben unter der Kontrolle eines Promoters der Transkription und eines Terminators (Ort der Polyadenylation).
Die Transfektion kann auf verschiedene Arten realisiert werden, und im Besonderen in Gegenwart von Kalziumphosphat, durch Lipofektion, Elektroporation usw. In diesem Beispiel wird die Transfektion in Gegenwart von Kalziumphosphat realisiert.
Der Terminator kann entweder der natürliche Terminator des transfizierten Gens, oder ein verschiedener Terminator, wie zum Beispiel der Terminator des frühen Indikators des Virus SV40, sein.
In den beschriebenen Zelllinien werden die Gene rep und/oder cap unter die Kontrolle eines induzierbaren Promoters gestellt: die LTR von MMTV (Pharmacia), die durch Dexamethason induziert ist. Es versteht sich, dass andere Promoter verwendet werden können, und insbesondere die LTR-Varianten von MMTV, die zum Beispiel die heterologen Regulationsregionen (Region „enhancer" im Besonderen) oder der Promoter Tetracyclin (Tc). Im Übrigen, wie in der Beschreibung angegeben, kann der Promoter ebenfalls der eigene Promoter des verwendeten Gens sein.
Vorteilhafterweise trägt das DNA-Fragment ebenfalls ein Gen, das die Selektion der transformierten Zellen ermöglicht. Es kann sich insbesondere um ein Antibiotika-Resistenzgen handeln, wie zum Beispiel das Geneticin-Resistenzgen. Dieses Markergen kann ebenfalls von einem verschiedenen DNA-Fragment getragen werden, das mit dem ersten cotransfiziert wurde.
Nach der Transfektion werden die transformierten Zellen selektioniert (Geneticinresistenz) und ihre DNA wird analysiert durch einen Northen blot, um die Integration des oder der DNA-Fragmente (im Falle der Verwendung von 2 getrennten Konstruktionen) im Genom zu verifizieren. Die Zellen werden danach auf ihre Fähigkeit getestet, die rekombinanten AAV nach der Infektion durch den Hilfsvirus und Transfektion mit einem geeigneten AAV-Plasmid zu enkapsidieren.
Diese Technik ermöglicht es, die folgenden Zelllinien zu erhalten:

1. MDCK-Zellen, die das Gen rep besitzen unter der Kontrolle der LTR von MMTV;
2. MDCK-Zellen, die auf einem gleichen DNA-Fragment die Gene rep und cap besitzen, unter der Kontrolle der LTR von MMTV;
3. MDCK-Zellen, die auf 2 unterschiedlichen DNA-Fragmenten die Gene rep und cap besitzen, unter der Kontrolle der LTR von MMTV;

BEISPIEL 6 – Konstruktion eines Adenovirus, der die Enkapsidationsfunktionen von AAV enthält.
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Adenovirus, der in seinem Genom eingefügte die Gene rep und cap von AAV enthält. Der Adenovirus Ad-RSV.Rep-Cap wurde durch homologe In-vivo-Rekombination zwischen dem mutanten Adenovirus Ad.dl1324 [Thimmappaya et al., Cell 31(1982) 543] und dem Vektor pAd.RSV.Rep-Cap erhalten.
6.1. Konstruktion des Plasmids pAd.RSV.Rep-Cap (3)
Das Plasmid pAd.RSV.Rep-Cap wurde aus einem Plasmid pAd.RSV.ßGa1 [Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. (1992) 626] durch Substitution des Gens ß-gal durch ein DNA-Fragment, das die Gene rep und cap von AAV trägt, konstruiert. Zu diesem Zweck wurde das Fragment XbaI, das das Genom von AAV2 enthält, deletiert von seinen ITR, aus dem Plasmid p201 (vgl. Beispiel 1) isoliert. Dieses Fragment wurde dann am Ort XbaI des Plasmids Bluescript subkloniert. Dieser Schritt ermöglicht es dann, das Fragment zu isolieren, umfassend die Gene rep und cap von AAV in Form eines Fragments NotI-ClaI.
Dieses Fragment wurde dann an den Orten XbaI geklont (gelegen nach der linken ITR) und Cla2 (gelegen vor PIX von Ad5) des Vektors pAd.RSV.ßGal, resultierend in der Substitution des Gens ßgal durch die Gene rep und cap.
6.2. Konstruktion des rekombinanten defektiven Adenovirus Ad.RSV.Rep-Cap
Das Plasmid pAd.RSV.Rep-Cap und der Adenovirus Ad.dl1324 die durch das Enzym ClaI linearisiert wurden, werden in der Linie 293 in Gegenwart von Kalziumphosphat cotransfiziert, um die homologe Rekombination zu ermöglichen. Die so erzeugten rekombinanten Adenoviren werden durch Reinigung auf Plaque selektioniert. Nach Isolierung wird die DNA des rekombinanten Adenovirus in der Zelllinie 293 amplifiziert. Die Viruspartikel werden im Allgemeinen durch Zentrifugierung auf dem Cäsiumchloridgradienten gemäß der bekannten Techniken (vgl. im Besonderen Graham et al., Virology 52 (1973) 456) gereinigt. Der Adenovirus Ad.RSV.Rep-Cap kann bei –80 °C in 20 % Glycerol konserviert werden.
Die gleiche Strategie kann wiederholt werden, indem eines der Gene rep oder cap eingefügt wird. Im Übrigen kann die Einfügung an verschiedenen Orten des Genoms des Adenovirus realisiert werden.

Claims

Herstellungsverfahren von menschlichen rekombinanten adeno-assoziierten Viren (AAV, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung in einer Zelllinie 5 bei Vorhandensein eines nicht menschlichen, tierischen Hilfsvirus realisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung in einer durch ein nicht menschliches, tierisches Hilfsvirus infizierten 10 tierischen Zelllinie realisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht menschliche, tierische Hilfsvirus ein aus einem Hund, einem Rind, einer Maus, einem Schaf, einem Schwein, Geflügel oder einem Affen 15 stammendes Virus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht menschliche, tierische Hilfsvirus aus den Adenoviren, den Herpesviren und den Viren der Vakzine ausgewählt wird. 20 5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht menschliche, tierische Hilfsvirus ein Adenovirus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht menschliche, tierische 25 Hilfsvirus ein Hunde-Adenovirus ist.
Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das nicht menschliche, tierische Hilfsvirus aus den Stämmen CAV-1 und CAV-2 ausgewählt wird.
Verfahren gemäß Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Herstellung in einer Hunde-Zelllinie realisiert wird.
Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch 5 gekennzeichnet, dass die Zelllinie die Linie MDCK oder GHK oder ein Derivat davon ist.
Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie darüber hinaus die Enkapsidationsfunktionen von AAV 10 besitzt.
Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Enkapsidationsfunktionen von AAV durch die Gene rep und cap von AAV oder eventuell der Kontrolle von heterologen Regulationselementen der 15 Transkription unterstehende funktionale Homologe gebildet werden.
Verfahren gemäß Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Enkapsidationsfunktionen von AAV durch ein Enkapsidationsplasmid und/oder durch 20 das nicht menschliche, tierische Hilfsvirus erbracht werden und/oder in das Genom der Zelllinie integriert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Gen rep von AAV oder ein 25 funktionales Homolog davon in das Genom der Linie integriert wird und das Gen cap von AAV oder ein funktionales Homolog davon, durch das nicht menschliche, tierische Virus getragen wird.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch 30 gekennzeichnet, dass die Gene rep und cap von AAV oder funktionale homologe Gene in das Genom der Zelllinie integriert werden.
Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Gene reg und ca von AAV oder 5 funktionale homologe Gene durch das Hilfsvirus getragen werden.
Durch ein nicht menschliches, tierisches Hilfsvirus infizierbare, tierische Zelllinie für die Herstellung von rekombinanten menschlichen AAV mit in 10 seinem Genom integrierten Enkapsidationsfunktionen von AAV.
Durch ein nicht menschliches, tierisches Hilfsvirus infizierbare Zelllinie für die Herstellung von menschlichen rekombinanten AAV mit unter der 15 Kontrolle eines oder mehrerer induzierbarer Promoter in seinem Genom integrierten Enkapsidationsfunktionen von AAV.
Zelllinie gemäß Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie das Gen rep von AAV oder ein 20 in sein Genom integriertes funktionale homologes Gen umfasst,
Zelllinie gemäß Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Gene rep und cap von AAV oder in sein Genom integrierte funktionale homologe 25 Gene umfasst.
Zelllinie gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass der induzierbare Promoter aus dem LTR von MMTV oder dem Promoter Tc gewählt wird.
Zelllinie gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, das sie ausgehend von den Linien MDCK oder GHK gewonnen wird.
Nicht menschlicher, tierischer Hilfsvirus für die Herstellung von rekombinanten menschlichen AAVs mit den in seinem Genom eingeführten Enkapsidationsfunktionen von AAV.
Hilfsvirus gemäß Anspruch 22, dadurch 10 gekennzeichnet, dass bei ihm das Gen reg von AAV oder ein funktionales homologes Gen in ein Genom eingefügt ist.
Hilfsvirus gemäß Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass bei ihm die Gene rep und cap von 15 AAV oder funktionale homologe Gene in sein Genom eingefügt sind.
Hilfsvirus gemäß Anspruch 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen nicht menschlichen, tierischen Adenovirus handelt.
Hilfsvirus gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen bevorzugt aus den Adenoviren CAV1 und CAV2 ausgewählten Hunde-Adenovirus handelt.