ES2252738T3

ES2252738T3 - Procedimiento de preparacion de virus adeno-asociados (aav) recombinantes y sus utilizaciones.

Info

Publication number: ES2252738T3
Application number: ES95907045T
Authority: ES
Inventors: Vincent Descamps; Michel Perricaudet
Original assignee: Centelion SAS
Current assignee: Centelion SAS
Priority date: 1994-01-28
Filing date: 1995-01-18
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2015-01-18
Also published as: FR2716682A1; CA2181602A1; FI962990A0; DE69534618T2; ZA95628B; DK0741793T3; KR100403708B1; FR2716682B1; IL112461A0; EP0741793B1; WO1995020671A1; JPH09509051A; ATE310097T1; NO962950L; FI962990A; MX9603002A; NO319885B1; AU1539595A; AU706647B2; US5789390A

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO METODO DE PREPARACION DE VECTORES DERIVADOS DE LOS VIRUS ADENOASOCIADOS (AAV), LAS CELULAS UTILIZADAS PAPA ESTE PROPOSITO, Y LA UTILIZACION DE LOS VECTORES OBTENIDOS, PARTICULARMENTE EN TERAPIA GENICA Y/O CELULAR.

Description

Procedimiento de preparación de virus adeno-asociados (AAV) recombinantes y sus utilizaciones.

La presente invención, se refiere a un nuevo procedimiento de preparación de vectores derivados de los virus adeno-asociados (AAV) y a las células utilizadas a dicho efecto. De una forma más particular, la presente invención, se refiere a un procedimiento de preparación de AVV recombinantes, por mediación de un virus animal auxiliar. La invención, se refiere igualmente a la utilización de los AAV recombinantes obtenidos, especialmente, en terapia genética y / o celular.

La terapia genética, consiste en corregir una deficiencia o una anomalía (mutación, expresión aberrante, etc.) o en asegurar la expresión de una proteína de interés terapéutico, mediante la introducción de una información genética en la célula o en el órgano afectado. Esta información genética, puede introducirse, bien ya sea in vitro, en una célula extraída del órgano, procediéndose entonces a introducir la célula modificada en el organismo, o bien ya sea directamente, in vivo, en el tejido apropiado. Se han descrito distintas técnicas, para la transferencia de esta información genética, entre las cuales, se encuentran técnicas diversas de transfección, las cuales implican complejos de ADN y de DEAE-dextrano (Pagano et al. J. Virol. 1 (1967)891), de ADN y de proteínas nucleares (Kaneda et al., Science 243 (1989)375), de ADN y de lípidos (Felgner et al., PNAS 84 (1987)7413), de ADN y de polilisina, el empleo de liposomas (Fraley et al. J. Biol. Chem. 255 (1980)10431), etc. Más recientemente, ha aparecido el empleo de virus como vectores, para la transferencia de genes, como una alternativa prometedora a estas técnicas físico-químicas de transfección. A dicho efecto, se han sometido a test de ensayo varios virus, con objeto comprobar su capacidad de infectar ciertas poblaciones celulares. De una forma particular, los retro-virus (RSV, HMS, MMS, etc.), el virus HSV, los adenovirus y los virus adeno-asociados.

Entre estos virus, los virus adeno-asociados (AAV, para "virus adeno-asociados"), presentan ciertas propiedades atractivas, en vistas a una utilización para la transferencia de genes. Los AAV, son virus con un ADN de un tamaño relativamente reducido, que se integran en el genoma de las células que éstos infectan, de forma estable y sitio-específica. Éstos son capaces de infectar un amplio espectro de células, sin inducir ningún efecto sobre el crecimiento, la morfología o la diferenciación celular. Además, éstos no parecen encontrase implicados en las patologías, en el hombre.

El genoma de los AAV, se ha clonado, secuenciado y caracterizado. Éste comprende aproximadamente 4700 bases, y contiene, en cada extremo, una región repetida inversa (ITR), de aproximadamente 145 bases, que sirve de origen de replicación para el virus. El resto del genoma, se divide en 2 regiones esenciales que portan las funciones de encapsidación: la parte izquierda del genoma, la cual contiene el gen rep implicado en la replicación viral y la expresión de los genes virales; la parte derecha del genoma, la cual contiene el gen cap que codifica para la proteínas de la cápsida del virus. La utilización de vectores derivados de los AAV, para la transferencia de genes in vitro e in vivo, se ha descrito en la literatura (véanse, especialmente, los documentos de patentes internacionales WO 91 / 18 088; WO 93 / 09 239; los documentos de patentes estadounidenses US 4.797.368, US 5.139.941, y el documento de patente europea EP 488 528). Estos documentos de solicitud de patente, describen diferentes construcciones derivadas de los AAV, en las cuales, los genes rep y / o cap, se suprimen y se reemplazan por un gen de interés, y su utilización para transferir in vitro (sobre células en cultivo) o en vivo (directamente en un organismo), el citado gen de interés.

De cualquier modo, la utilización terapéutica de los AAV, como vectores para la transferencia de genes, se encuentra actualmente limitada, debido especialmente a los riesgos de contaminación de los AAV recombinantes mediante un virus auxiliar salvaje, y de la utilización de líneas celulares humanas potencialmente tumorígenas, para la producción de virus recombinantes. Los AAV, tienen necesidad de la presencia de un virus auxiliar ("helper") para su replicación. El término virus auxiliar, designa todo virus capaz de aportar, en trans, las funciones necesarias para la replicación de los AAV. Éste puede tratarse, de una forma particular, de un adenovirus, de un virus del herpes, o de un virus vacunal. En ausencia de un virus auxiliar de este tipo, los AAV, permanecen en forma latente, en el genoma de las células infectadas, pero no pueden replicarse para, de esta forma, producir partículas virales. Generalmente, los AAV recombinantes, se producen por lo tanto por co-tranfección de una línea celular infectada por un virus auxiliar humano (por ejemplo, un adenovirus) de un plásmido que contenga el gen de interés cercado por dos regiones repetidas inversas (ITR) de AAV, y de un plásmido que porte los genes de encapsidación (genes rep y cap) de los AAV. Los AAV recombinantes producidos, se purifican, a continuación, mediante técnicas clásicas. Mientras tanto, los AAV de esta forma obtenidos, se encuentran generalmente contaminados por virus auxiliar salvaje, igualmente producido por la célula productora. La presencia de este virus auxiliar, puede tener, in vivo, consecuencias muy nefastas, tales como, por ejemplo, un efecto patógeno o inmunógeno. Este virus auxiliar, puede igualmente ser responsable de acontecimientos de recombinaciones, o inducir, la replicación de los AAV recombinantes y, así, de este modo, su transmisión y su diseminación.

La presente invención, aporta una solución ventajosa a este problema. El solicitante, ha puesto efectivamente a punto, un procedimiento de producción de AAV recombinantes, el cual permite producir reservas de AAV recombinantes, desprovistos de virus auxiliar humano salvaje. El procedimiento de la invención, permite igualmente evitar la utilización de células productoras potencialmente tumorígenas. El procedimiento de la invención, se basa, en parte, en la evidencia en cuanto al hecho de que, los AAV recombinantes, pueden producirse utilizando un virus auxiliar de origen animal. El solicitante, ha mostrado, en efecto, el hecho de que, de una forma sorprendente, un virus de origen animal, era capaz de trans-complementar un AAV humano y, debido a ello, éste podía utilizarse como virus auxiliar para la producción de AAV recombinantes humanos. Este resultado, es particularmente ventajoso, debido al hecho de que, el virus animal utilizado como virus auxiliar, no es capaz de propagarse en las células humanas, y no se ha observado ninguna patología humana, consecutivamente a una infección mediante un virus animal auxiliar. Debido a ello, incluso si las preparaciones de AAB recombinantes obtenidas, pueden contaminarse por virus auxiliar, esto no podrá ocasionar, in vivo, ningún efecto secundario no deseable. Además, el procedimiento de la invención, permite utilizar líneas de células productoras animales, las cuales se encuentran desprovistas de los efectos tumorígenos conocidos para las líneas humanas actualmente disponibles. La invención, se basa igualmente en la puesta a punto de las líneas celulares y de virus auxiliares particularmente ventajosos para la producción de AAV recombinantes.

Un primer objeto de la invención, reside por lo tanto en un procedimiento de producción de AAV recombinantes, según el cual, la producción, se realiza en presencia de un virus auxiliar humano.

De una forma más preferible, la producción, se realiza en una línea celular animal infectada por un virus de origen animal.

La invención, se refiere igualmente, de una forma general, a la utilización de un virus auxiliar animal, para la preparación de AAV recombinantes.

Tal y como se ha indicado anteriormente, arriba, el término virus auxiliar, designa, en el sentido de la presente invención, todo virus capaz de aportar, en trans, las funciones necesarias para la replicación de los AAV. El virus auxiliar utilizable en el procedimiento de la invención, puede ser un virus de origen canino, bovino, murino, ovino, aviar, o incluso símico. De una forma preferible, éste se elige de entre los adenovirus, los virus del herpes o los virus del tipo vacunal.

De una forma particularmente ventajosa, en el ámbito de la presente invención, se utiliza un adenovirus de origen animal. Los adenovirus de origen animal utilizables en el ámbito de la presente invención, puede ser de orígenes diversos y, de una forma particular, éstos pueden ser de origen canino, bovino, murino, (por ejemplo: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990)81), ovino, porcino, aviar, o incluso símico (por ejemplo: SAV).

De una forma más particular, entre los adenovirus aviares, se pueden citar los serotipos 1 a 10, accesibles en la ATCC, como por ejemplo, las cepas Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-11 (ATCC VR-921) o incluso las cepas referenciadas ATCC VR-831 a 835.

Entre los adenovirus bovinos, se pueden utilizar los diferentes serotipos conocidos y, especialmente, aquéllos disponibles en la ATCC (tipos 1 a 8), bajo las referencias ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 y 769.

Se pueden igualmente utilizar los adenovirus murinos FL (ATCC VR-550) y E20308 (ATCC VR-528), el adenovirus ovino tipo 5 (ATCC VR-1343), o tipo 6 (ATCC VR-1340); el adenovirus porcino 5359), o los adenovirus símicos tales como, especialmente, los adenovirus de referencia en la ATCC, bajo los números VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.

De una forma preferente, en el ámbito de la presente invención, se utilizan, como virus auxiliar, adenovirus de origen canino y, de una forma más preferente, todas las cepas de los adenovirus CAV1 y CAV2 [cepa Manhattan ó A26/61 (ATCC VR-800) por ejemplo]. Los adenovirus caninos, han sido objeto de numerosos estudios estructurales. Así, de este modo, los mapas de restricción completos de los adenovirus CAV1 y CAV2, se han descrito ya en el arte anterior de la técnica (Spibey et al., Gen. Virol. 70 (1989) 165) y, los genes E1a, E3, así como las secuencias ITR, se han clonado y se han secuenciado (véase especialmente Spibey et al., Virus Res. 14 (1989) 241; Linné, Virus Res. 23 (1992) 119, WO 91/11525). Tal y como muestran los ejemplos que se facilitan posteriormente, a continuación, los adenovirus caninos, son capaces de trans-complementar los AAV, para su replicación, con una eficacia particularmente importante.

Estos diferentes virus de origen animal, pueden obtenerse, por ejemplo, a partir de cepas depositadas en las colecciones, a continuación, pueden amplificarse en líneas celulares competentes y, eventualmente, modificarse. En la literatura especializada, se han descrito técnicas de producción, de aislamiento y de modificación de adenovirus, o de virus del herpes y, éstas, pueden utilizarse en el ámbito de la presente invención [Akli et al., Nature Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., Human Gen Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levreo et al., Gene 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., Science 259 (1993) 988; Roemer et Friedmann, Eur. J. Biochem. 208 (1992) 211; Dabson et al., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca et al., New Biol. 2 (1990) 739; Miyanohara et al., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/18 088, WO 90/ 09441, WO 88/10 311, WO 91 /11 525]. Estos diferentes virus, pueden modificarse a continuación, por ejemplo, mediante deleción, substitución, adición, etc. De una forma particular, en ciertos casos, estos virus, pueden modificarse, para convertirse en defectivos para su replicación.

Tal y como se ha indicado anteriormente, arriba, la producción de los AAV recombinantes según el procedimiento de la presente invención, se realiza, de una forma preferible, en una línea celular animal, infectada por el virus auxiliar.

Generalmente, la línea celular y el virus auxiliar utilizados, son de la misma especie. A dicho efecto, en la literatura especializada, se han descrito diferentes líneas celulares animales, utilizables en el ámbito de la presente invención. Así, de este modo, entre las líneas caninas, se pueden citar, de una forma ventajosa, la línea de células renales del lebrel GHK (Flow Laboratories) o la línea celular MDCK (ATCC nº CRL6253). Las condiciones de cultivo de estas células y de la preparación de los virus o del ADN viral, se han descrito en la literatura especializada (véase, especialmente, Macatney et al., Science 44 (1988) 9; Fowlkes et al., J. Mol. Biol.. 132 (1979) 163). Pueden también utilizarse otras líneas animales (por ejemplo, accesibles en colecciones).

De una forma ventajosa, el procedimiento de la invención, aplica una línea celular canina, infectada por un adenovirus canino.

De una forma más preferible, el procedimiento de la invención, se realiza con la línea MDCK ó GHK, o un derivado de éstas, como línea de célula canina. Por línea derivada, se entiende toda línea obtenida a partir de estas líneas, y que conserve su capacidad de producir AAV recombinantes, cuando éstas de cultivan, se infectan y / o se transfectan en las condiciones apropiadas. Pueden obtenerse líneas derivadas, de una forma especial, mediante la inserción de genes exógenos, mutagénesis, y / o selección de sub-clones, eventualmente.

En una forma preferible de aplicación de la invención, la línea celular utilizada, posee, además, las funciones de encapsidación de AAV.

Tal y como se ha indicado anteriormente, arriba, los AAV recombinantes, se producen generalmente por co-transfección, en una línea celular cercada por dos regiones repetidas inversas (ITR) de AVV y de un plásmido que porta las funciones de encapsidación de AAV. El hecho de suprimir las funciones de encapsidación del AAV recombinante y de aportarlas, en trans, sobre un plásmido, permite efectivamente el preparar AAV recombinantes defectivos, es decir, incapaces de producir, después de la infección en una célula diana, partículas virales infecciosas. Las funciones de encapsidación de los AAV, se encuentran esencialmente constituidas por los genes rep y cap, o por todo gen homólogo funcional. El gen rep, se encuentra implicado en la replicación viral, así como en la expresión de los genes virales y, el gen cap, codifica para las proteínas de envoltura del virus (VP1, VP2 y VP3). Estos genes, se han caracterizado y, su secuencia, se ha descrito en la literatura (Srivastava et al., J. Virol. 45 (1983) 555). Un homólogo funcional, corresponde a todo gen obtenido por modificación (mutación, supresión, adición, etc.), de los genes rep y cap, y presentan una actividad de la misma naturaleza. Tales genes homólogos funcionales, pueden igualmente ser genes obtenidos por hibridación, a partir de bancos de ácidos nucleicos, por mediación de sondas correspondientes a los genes rep ó cap.

Para permitir la producción de AAV recombinantes defectivos, la línea celular según la invención, posee por lo tanto, de una forma ventajosa, las funciones de encapsidación de AAV. De una forma más preferente, la línea celular utilizada, posee una o varias copias de los genes rep y cap de AAV, o de genes homólogos funcionales.

Según la presente invención, las funciones de encapsidación de AAV, pueden aportarse por un plásmido de encapsidación y / o por el virus auxiliar animal utilizado y / o integrarse en el genoma de la línea celular.

En una forma particular de realización de la presente invención, todas las funciones de encapsidación, se aportan por una plásmido denominado de encapsidación. En este caso, el procedimiento de la invención, comprende, de una forma ventajosa, la co-transfección de una línea celular animal infectada por un virus auxiliar animal, por un vector que porta un gen de interés, y por lo menos, una ITR de AAV, y por el citado plásmido de encapsidación de AAV. De una forma más preferente, el plásmido de encapsidación de AAV, porta, por lo menos, los genes rep y cap de AAV, u homólogos funcionales.

En otra forma de realización particularmente ventajosa de la presente invención, las funciones de encapsidación, se aportan por el virus auxiliar animal utilizado y / o se integran al genoma de la línea celular. En este caso, el procedimiento de la invención, comprende la transfección de un vector que porta un gen de interés, y por lo menos una ITR de AAV, en una línea celular infectada por un virus auxiliar animal y que contiene las funciones de encapsidación (integradas al genoma y / o aportadas por el virus auxiliar). Esta forma de realización, es particularmente ventajosa, debido al hecho de que, ésta, permite evitar el empleo de un plásmido de encapsidación.

De una forma más preferible, en el procedimiento de la invención, el gen rep de AAV, o un homólogo funcional de éste, se integra al genoma de la línea celular y el gen cap de AAV, o un homólogo funcional de éste, se aporta por el virus auxiliar animal. En otra variante preferida de puesta en ejecución de la invención, se utiliza una línea celular, la cual comprende, insertados en su genoma, los genes rep y cap de AAV, o genes homólogos funcionales. En esta forma preferida, los genes rep o cap de AAV, o sus homólogos funcionales, pueden introducirse sobre una construcción única o, secuencialmente, sobre construcciones separadas. En estas diferentes formas de realización, las funciones de encapsidación, pueden emplazarse bajo el control de su propio promotor, promotores heterólogos o promotores artificiales. De una forma ventajosa, las funciones de encapsidación, se emplazan bajo el control de elementos inducibles de regulación de la transcripción, que permiten inducir o reprimir la expresión de las funciones de encapsidación, según las condiciones. De una forma particularmente ventajosa, en las construcciones de la invención, el gen rep de AAV, o un gen homólogo funcional, se emplaza bajo el control de un promotor inducible.

Siempre en una variante preferida de puesta en ejecución de la presente invención, se utiliza un virus auxiliar que comprende, en su genoma, los genes rep y cap de AAV, o genes homólogos funcionales.

El solicitante, ha mostrado, en efecto, que es posible el insertar las funciones de encapsidación, o algunas de ellas, directamente en el genoma del virus auxiliar utilizado. De la misma forma, el solicitante, ha mostrado igualmente que es posible el insertar las funciones de encapsidación, o algunas de ellas, de forma estable, directamente en el genoma de la línea celular utilizada.

A dicho efecto, la invención, tiene igualmente por objeto toda línea celular animal, infectable por un virus auxiliar, para la producción de AAV recombinantes, que comporta la totalidad o parte de las funciones de encapsidación, integradas en su genoma. De una forma preferente, la invención, concierne a toda línea celular animal, que comprende el gen rep de AAV, o un gen homólogo funcional, integrado en su genoma. En otra forma preferida, la invención, concierne a toda línea celular animal, que comporte los genes rep y cap de AAV, o genes homólogos infectados, integrados en su genoma.

De una forma particularmente ventajosa, se trata de una línea celular canina, tal como, por ejemplo, una línea obtenida a partir de las líneas MDCK ó GHK.

Las líneas celulares de la invención, pueden obtenerse por transfección de un fragmento de ADN, que porte la función o las funciones de encapsidación de AAV, bajo el control de señales de expresión. La transfección, puede realizarse mediante toda técnica conocida por parte de la persona experta en este arte de la técnica (precipitación con fosfato de calcio, lipofección, electroporación, utilización de liposomas, etc.). De una forma preferente, la transfección, se realiza en presencia de fosfato cálcico (véase el ejemplo 5). Para controlar la expresión de las funciones de encapsidación, pueden utilizarse diferentes señales de expresión. Puede tratarse, de una forma particular, de promotores apropiados, de los genes rep ó cap, de promotores heterólogos, o incluso sintéticos. En una forma de realización particularmente interesante, en las líneas celulares según la invención, las funciones de encapsidación de AAV, se emplazan bajo el control de promotores inducibles (LTR-MMTV, Tc, etc.). El empleo de tales tipos de promotores, es particularmente ventajoso, debido al hecho de que, éste, permite modular el efecto del gen rep, especialmente, sobre el virus auxiliar utilizado. La invención, tiene por lo tanto igualmente por objeto, toda línea celular infectable por un virus auxiliar para la producción de AAV recombinantes, que comporta la totalidad o parte de las funciones de encapsidación de AAV integrados en su genoma, bajo el control de uno o varios promotores inducibles.

En el caso de una línea que comporte los genes rep y cap de AAV (u homólogos funcionales), estos genes, pueden transfectarse, bien ya sea sobre una construcción única, o bien ya sea, de una forma secuencial, sobre dos construcciones separadas. Esta segunda forma de preparación, es particularmente ventajosa, debido al hecho de que, ésta, limita al máximo los acontecimientos de recombinación. Las líneas de esta forma obtenidas, son por lo tanto particularmente estables. Además, de una forma ventajosa, la construcción utilizada para la transfección, porta igualmente un gen que permite la selección de células transformadas y, por ejemplo, el gen de resistencia a la geneticina. El gen de resistencia, puede igualmente aportarse mediante un fragmento de ADN diferente, co-tranfectado con el primero.

Después de la transfección, las células transformadas, se seleccionan (por ejemplo, para su resistencia a la geneticina) y, su ADN, se analiza mediante procedimiento de Northen blot (transferencia de Northen), para verificar la integración del fragmento o de los fragmentos de ADN (en el caso de la utilización de 2 construcciones separadas), en el genoma. Puede procederse, a continuación, a someter a test de ensayo, la capacidad de las células obtenidas, para encapsidar los AAV, por infección, por mediación de un AAV recombinante, desprovisto de las citadas funciones.

La invención, tiene asimismo por objeto, todo virus auxiliar para la producción de AAV recombinantes, que comprende, en su genoma, la totalidad o parte de las funciones de encapsidación de los AAV. De una forma más preferente, la invención, se refiere a todo virus auxiliar, para la producción de AAV recombinantes, que comprende, insertado en su genoma, el gen rep de AAV, o un gen homólogo funcional. Siempre de una forma preferente, la invención, concierne a todo virus auxiliar para la producción de AAV recombinantes, que comprende, insertados en su genoma, los genes rep y cap de AAV, o genes homólogos funcionales.

De una forma ventajosa, el virus auxiliar para la producción de AAV recombinantes, es un adenovirus. Los adenovirus que comprenden las funciones de encapsidación de los AAV en concordancia con la presente invención, pueden prepararse mediante recombinación homóloga entre un adenovirus y un plásmido, que porte, entre otras, las citadas funciones de encapsidación. La recombinación homóloga, se produce después de la co-transfección de los citados adenovirus y plásmido, en una línea celular apropiada. A título de ejemplo de línea, se puede mencionar la línea del riñón embrionario humano 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), la cual contiene principalmente, integrada en su genoma, la parte izquierda del genoma de un adenovirus Ad5 (12%) o la línea MDCK. A continuación, los vectores que se han multiplicado, se recuperan y se purifican, según las técnicas clásicas de biología molecular.

Todavía de una forma más particular, el edenovirus, es un adenovirus de origen animal, elegido, de una forma preferente, entre los adenovirus caninos (CAV1 y CAV2). Las funciones de encapsidación de AAV, pueden introducirse en diferentes regiones del genoma del virus auxiliar de la invención. De una forma ventajosa, las funciones de encapsidación, se insertan en una región que no perturbe la capacidad del virus, de transcomplementar los AAV. Es generalmente posible el insertar las funciones de encapsidación en una región funcional del genoma del virus auxiliar, región ésta, la cual se aporta, a continuación, en trans, bien ya sea mediante un plásmido, o bien ya sea mediante la línea celular utilizada. Así, de esta forma, es posible, por ejemplo, el injertar el gen rep, el gen cap o los genes rep y cap, como reemplazo del gen E1. El adenovirus obtenido, puede utilizarse como virus auxiliar para la producción de AAV recombinantes, en la línea celular 293, la cual porta el gen E1 en su genoma (véase el ejemplo 6).

El procedimiento de la invención, permite de este modo la producción de AAV recombinantes, susceptible de poderse utilizar terapéuticamente. LOs AAV recombinantes obtenidos, pueden ser cualquier AAV, en donde, el genoma, se ha modificado, por lo menos, mediante la inserción de un gen de interés. Tal y como se ha indicado anteriormente, arriba, en el arte anterior de la técnica especializada, se han descrito diferentes tipos de AAV recombinantes (WO 91 / 18 088; WO 93 / 09 239; US 4.797.368, US 5.139.941, EP 488 528). Generalmente, estos AAV, comprenden deleciones parciales o totales, en los genes rep y / o cap, al nivel de los cuales, se ha insertado un gen de interés. Estos AAV recombinantes, pueden prepararse a partir de diferentes serotipos de AAV, tales como los AAV1, AAV2, AAV3 y AAV4 y, de una forma preferente, a partir de las cepas AAV2. En cuanto a lo referente al gen de interés, este puede tratarse, en particular, de un gen terapéutico.

En el sentido de la presente invención, se entiende como gen terapéutico, especialmente, todo gen que codifique para un producto proteínico, que tenga un efecto terapéutico. El producto proteínico, puede ser una proteína, un péptido, etc. este producto proteínico, puede ser homólogo, con respecto a la célula diana (es decir, un producto que se expresa, normalmente, en la célula diana, cuando ésta no presenta ninguna patología). En este caso, la expresión de una proteína, permite, por ejemplo, el paliar una expresión insuficiente en la célula, o la expresión de una proteína inactiva o débilmente activa, debido a una modificación, o incluso el sobre-expresar la citada proteína. El gen terapéutico, puede también codificar para un mutante de una proteína celular, que tenga una estabilidad acrecentada, una actividad modificada, etc. El producto proteínico, puede igualmente ser heterólogo con respecto a la célula diana. En este caso, una proteína expresada, puede por ejemplo complementar o aportar una actividad deficiente en la célula, permitiéndole luchar contra una patología, o estimular una respuesta inmunitaria.

Entre los productos terapéuticos, en el sentido de la presente invención, se pueden citar, de una forma más particular, las enzimas, los derivados sanguíneos, las hormonas, las linfocinas : interleucinas, interferones, TNF, etc. (FR 92 03120), los factores del crecimiento (eritropoyetina, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), los neurotrasmisores, o los precursores o enzimas de síntesis, los factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP / pleyotrofina, etc.; las apolipoproteínas: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc. (FR 93 05125), la lipoproteína lipasa (LPL), la distrofina, o una minidistrofina (FR 91 11947), la proteína CFTR asociada a la mucoviscidosis, los genes supresores de tumores: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), los genes que codifican para los factores implicados en la coagulación: Factores CII, CIII, IX, los genes que intervienen en la reparación del ADN, los genes suicidas (timidina-quinasa, citosina-desaminasa), etc.

El gen terapéutico, puede ser, igualmente, un gen o una secuencia antisentido, cuya expresión en la célula diana, permite controlar la expresión de genes o la transcripción de ARNm celulares. Las secuencias de este tipo, pueden transcribirse, por ejemplo, en la célula diana, en ARN complementarios de ARNm celulares, y bloquear, de esta forma, su traducción en proteína, según la técnica descrita en la patente europea EP 140 308. Los antisentidos, comprenden igualmente las secuencias que codifican para las ribozimas, que son capaces de destruir selectivamente los ARN dianas (EP 321 201).

El gen de interés, puede igualmente comportar una o varias secuencias que codifican para un péptido antigénico, capaz de generar, en el hombre o en el animal, una respuesta inmunitaria. En esta forma particular de puesta en ejecución de la invención, los AAV recombinantes, pueden utilizarse para la realización de, bien ya sea vacunas, o bien ya sea tratamientos inmunoterapéuticos, aplicados al hombre o al animal, especialmente, contra microorganismos, virus o cánceres. Puede tratarse, especialmente, de péptidos antigénicos específicos del virus de Epstein Barr, del virus HIV, del virus de la hepatitis B (EP 185 573), del virus de la pseudo-rabia, o también, específicos de tumores (EP 259 212).

De una forma preferente, el gen de interés, comprende igualmente secuencias que permiten su expresión en la célula o el órgano deseado. Puede tratarse de secuencias que son naturalmente responsables de la expresión del gen considerado, cuando estas secuencias son susceptibles de funcionar en la célula infectada. Puede igualmente tratarse de secuencias de origen diferente (responsables de la expresión de otras proteínas, o incluso sintéticas). Especialmente, puede tratarse de secuencias promotoras de genes eucariotas o víricos. Así, por ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras nacidas del genoma de la célula que se desea infectar. Además, puede tratarse de secuencias promotoras nacidas del genoma de un virus. A dicho efecto, pueden citarse, por ejemplo, los promotores de los genes E1A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. Por el contrario, estas secuencias de expresión, pueden modificarse mediante la adición de secuencias de activación, de regulación, o que confieran, al gen de interés, una especificidad de expresión relativa a los tejidos.

Además, el gen de interés, puede igualmente comportar una secuencia señal que digiera el producto terapéuticamente sintetizado en las vías de secreción de la célula diana. Esta secuencia señal, puede ser la secuencia señal natural del producto terapéutico, pero puede igualmente tratarse de cualquier otra secuencia señal funcional, o de una secuencia señal artificial.

Los AAV recombinantes preparados según la presente invención, pueden utilizarse para la transferencia de genes de interés, in vitro, ex vivo, o in vivo. In vitro, éstos pueden permitir la transferencia de un gen a una línea celular, por ejemplo, en vistas a producir una proteína recombinante. Ex vivo, éstos pueden utilizarse para transferir un gen sobre una población de células extraídas a partir de un organismo, eventualmente seleccionado y amplificado, con la finalidad de conferir, a estas células, las propiedades deseadas, en vistas a su readmisión a un organismo. In vivo, éstos pueden utilizarse para la transferencia de genes, mediante administración directa de una solución purificada, eventualmente asociada a uno o varios vehículos farmacéuticos. En este último caso, los AAV recombinantes, pueden formularse en vistas de administraciones por vía tópica, cutánea, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, sub-cutánea, intraocular, transdérmica, etc. De una forma preferente, éstos se asocian a un vehículo farmacéuticamente aceptable, para una formulación inyectable, especialmente, para una inyección directa al nivel del órgano deseado. Puede tratarse, de una forma particular, de soluciones estériles, isotónicas, o de composiciones secas, especialmente, liofilizadas, las cuales, mediante la adición, según el caso, de agua esterilizada o de suero fisiológico, permiten la constitución de soluciones inyectables. Las dosis de AAV utilizadas para la inyección, así como el número de administraciones, pueden adaptarse, en función de diferentes parámetros y, principalmente, en función del modo de administración utilizado, de la patología concernida, del gen a expresar, o también, de la duración del tratamiento buscado.

La presente invención, proporciona, de este modo, un procedimiento particularmente ventajoso, para la preparación de AAV recombinantes, utilizables desde el punto de vista terapéutico, especialmente, en un procedimiento de tratamiento de enfermedades, el cual comprende la administración in vivo, de un AAV recombinante que contiene un gen apto para corregir la citada enfermedad. De una forma más particular, este procedimiento, es aplicable a las enfermedades que resultan de una deficiencia de un producto proteínico o nucleico y, el gen de interés, codifica para el citado producto proteínico, o contiene el citado producto nucleico.

La presente invención, se describirá ahora, de una forma más completa, mediante la ayuda de los ejemplos que se facilitan a continuación, los cuales deben considerarse como ilustrativos y no limitativos.

Técnicas generales de biología molecular

Los procedimientos clásicamente utilizados en biología molecular, tales como las extracciones preparativas de ADN plasmídico, la configuración de ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, la electroforesis sobre geles de agarosa o de acrilamida, la purificación de fragmentos de ADN mediante electroelución, las extracciones de proteínas con fenol, o con fenol-cloroformo, la precipitación de ADN en medio salino mediante etanol o mediante isopropanol, la transformación en Escherichia coli, etc., son bien conocidos por parte de la persona experta en el arte de esta técnica especializada, y se describen, de una forma abundante, en la literatura especializada [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", - Clonación molecular, un manual de laboratorio -, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", - Protocolos actuales en biología molecular-, John Wiley & Sons, New York, 1987].

Los plásmidos del tipo pBR322, pUC, y los fagos de la serie M13, son de origen comercial (Bethesda Research Laboratories).

Para las ligaduras, los fragmentos de ADN, pueden separarse, según su tamaño, mediante electroforesis en geles de agarosa o de acrilamida, extractos de fenol, o mediante una mezcla de fenol / cloroformo, precipitarse con etanol y, a continuación, incubarse en presencia de ADN ligasa del fago T4 (Biolabs), según las recomendaciones del proveedor.

El llenado de los extremos 5' prominentes, puede efectuarse mediante el fragmento de Klenow del ADN polimerasa I de E. coli (Biolabs), según las especificaciones del proveedor. La destrucción de los extremos 3' prominentes, se efectúa en presencia de la ADN polimerasa del fago T4 (Biolabs), utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de las extremidades 5' prominentes, se efectúa mediante un tratamiento de conducido mediante la nucleasa S1.

La mutagénesis dirigida in vivo, mediante oligodesoxinucleótidos sintéticos, puede efectuarse según el procedimiento desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764], utilizando el equipo, a modo de kit, distribuido por la firma Amersham.

La amplificación enzimática de los fragmentos de ADN, mediante la técnica denominada de PCR [Polymerasa-catalyzed Chain Reaction, - Reacción en cadena catalizada mediante polimerasa -, Saiki R.K. et al., Science 230 (1985) 1350 - 1354; Mullis K.B. et Faloona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335 - 350], puede efectuarse utilizando un "DNA thermal cycler", - Ciclador térmico de ADN (Perkin Elmer Cetus), según las especificaciones del fabricante.

La verificación de las secuencias nucleótidas, puede efectuarse mediante el procedimiento desarrollado por Sanger et al. [Porc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463 - 5467], utilizando el equipo, a modo de kit, distribuido por la firma Amersham.

Leyenda de las figuras

Figura 1: Representación del plásmido pREP-CAP

Figura 2: Representación del plásmido pAAV-EPO-NEO

Figura 3: Representación del plásmido pAd-RepCap.

Ejemplo 1 Construcción del plásmido de encapsidación pREP-CAP

Este ejemplo, describe la construcción del un plásmido denominado de encapsidación, que las funciones de encapsidación de un AAV recombinante. De una forma más precisa, este plásmido, designado como pREP-CAP, porta los genes rep y cap del AAV2.

El plásmido pREP-CAP, se construyó de la forma siguiente: El genoma del AAV2, del cual se suprimieron sus ITR, se aisló a partir del plásmido p201, mediante la digestión por mediación de la enzima XbaI. El plásmido p201, contiene el conjunto del genoma del AAV2, clonado en el sitio PvuII, del plásmido pEMBL8 (Samulski et al., J. Virol. 61 (1987) 3096). El fragmento de esta forma obtenido, el cual porta los genes rep y cap, se clonó, a continuación, en el sitio XbaI del plásmido Bluescript (Stratagene). La estructura de este plásmido, se encuentra representada sobre la figura 1.

Ejemplo 2 Construcción del plásmido AAV pAAV-EPO-NEO

Este ejemplo, describe la construcción de un plásmido AAV, que porta el cDNA que codifica para la eritropoyetina, un gen marcador, y dos ITR de AAV2. Esta plásmido, se designado como pAAV-EPO-NEO (figura 2).

Para la construcción de este plásmido, se procedió a preparar una casete de expresión, que contiene el cDNA que codifica para la eritropoyetina (cynomolgus), bajo el control del LTR del virus del "sarcoma de rous" (RSV), seguido de un gen que neo-confiere la resistencia a la neomicina, bajo control del promotor precoz del virus SV40. Esta casete, se insertó, a continuación, en los sitios SacII-KpnI, del plásmido p201, como reemplazo del fragmento correspondiente que contiene los genes rep y cap (figura 2).

Ejemplo 3 Producción de adenovirus canino CAV2, en la línea celular MDCK

Este ejemplo, describe la producción de adenovirus canino CAV2, en la línea celular canina MDCK.

Se procedió a cultivar las células MDCK, en un medio DMEM, suplementado con un 10% de suero de ternero vacuno (véase, también, Mcatney et al., Science 4 (1988) 9, para las condiciones de cultivo). Las células de confluencia, se infectaron, a continuación, mediante una suspensión de virus CAV2 (aproximadamente 5 pfu / célula). Después de un transcurso de tiempo de 30 a 48 horas, a partir de la infección, las células infectadas, se recolectaron y se concentraron mediante centrifugación. La torta obtenida, puede utilizarse para purificar los adenovirus CAV2, sobre cloruro de cesio. No obstante, si las valoraciones de titración, son demasiado reducidos, la torta, de una forma preferible, se somete a un ciclo de congelación - descongelación y, a continuación, el sobrenadante obtenido, se utiliza para amplificar los virus CAV2. Para ello, el sobrenadante, se utiliza para reinfectar, en las mismas condiciones, las células MDCK y, a continuación, se repite el protocolo descrito anteriormente, arriba, para la recuperación del virus. Este procedimiento, permite la obtención de una solución purificada de adenovirus CAV2, utilizable como virus auxiliar para la producción de AAV recombinantes.

Ejemplo 4 Producción de AAV recombinante que porta el gen de la eritropoyetina en la línea celular MDCK, infectada por un adenovirus auxiliar canino

Este ejemplo, describe la producción de un AAV recombinante que porta el gen de la eritropoyetina en la línea celular MDCK infectada por el adenovirus canino CAV2.

Se procedió a infectar las células MDCK (50% de la confluencia), con 5 - 10 pfu / célula de adenonvirus CAV2, preparado según las condiciones del ejemplo 3. Después de un transcurso de tiempo de cuatro a seis horas a partir de la infección, las células, se co-transfectaron mediante lipofección (Fegner et al., PNAS 84 (1987) 7413), con 5 \mug del plásmido pAAV-EPO-NEO y 5 \mug de plásmido pREP-CAP. Después de un transcurso de tiempo de 48 a 72 horas, las células, se recolectaron y se sometieron a varios ciclos de
congelación - descongelación. A continuación, se procedió a centrifugar la suspensión obtenida (15 minutos a 4000 revoluciones por minuto) y, después, se recuperó el sobrenadante que contenía las AAV recombinantes, y se calentó a una temperatura de 56ºC, durante un transcurso de tiempo de 30 minutos.

Para verificar el poder infeccioso y la expresión de la eritropoyetina, se utilizaron muestras de sobrenadante, para infectar las células Hela. Las células Hela, nacen de un carcinoma del hepitelio humano. Esta línea, es accesible en la ATCC (ref. CCL2), así como las condiciones que permiten su cultivo. 24 horas después de la infección, se recolectaron las células y el sobrenadante. La presencia del genoma del AAV-EPO recombinante, en las células, se confirmó, a continuación, mediante experiencias de hibridación en "southern blot" (transferencia de Southern), sobre el ADN celular, extraído según la técnica de Hirt (Gluzman et Van Doren, J. Virol 45 (1983) 91). Además, la presencia de eritropoyetina en el sobrenadante, se demostró, mediante test de ensayo biológico.

Estos resultados, muestran claramente el hecho de que, los AAV recombinantes, pueden prepararse, de una forma eficaz, en un sistema animal (línea celular y virus auxiliar).

Ejemplo 5 Construcción de líneas celulares que contienen funciones de encapsidación de AAV

Este ejemplo, describe la construcción de líneas celulares que contienen la totalidad, o parte, de las funciones de encapsidación de AAV. Estas líneas, permiten la construcción de AAV recombinantes según la invención, suprimidas para estas regiones, sin recurrir a un plásmido de encapsidación. Estos virus, se obtienen mediante recombinación in vivo, y pueden comportar secuencias heterólogas importantes.

Las líneas de la invención, se construyen mediante transfección de las células correspondientes, mediante un fragmento de ADN, el cual porta los genes indicados bajo el control de un promotor de la transcripción y de un terminador (sitio de poliadenilación).

La transfección, puede realizarse de diferentes formas y, especialmente, en presencia de fosfato cálcico, mediante lipofección, electroporación, etc. En este ejemplo, la transfección, se realiza en presencia de fosfato cálcico.

El terminador, puede ser, o bien el terminador natural del gen transfectado, o bien un terminador diferente como, por ejemplo, el terminador del mensajero precoz del virus SV40.

En las líneas celulares descritas, los genes rep y / o cap, se emplazan bajo el control de un promotor inducible: el LTR de MMTV (Pharmacia), el cual se induce mediante la dexametasona. Se entenderá el hecho de que, pueden también utilizarse otros promotores y, de una forma especial, variantes del LTR de MMTV, que porten, por ejemplo, regiones heterólogas de regulación (región "enhancer" - intensificadora -, especialmente), o el promotor tetraciclina (Tc). Además, tal y como se indica en la descripción, el promotor, puede igualmente ser el propio promotor del gen utilizado.

De una forma ventajosa, el fragmento de ADN, porta igualmente un gen que permite la selección de las células transformadas. Éste puede tratarse, de una forma particular, de un gen de resistencia a un antibiótico, tal como, por ejemplo, el gen de la resistencia a la geneticina. Este gen marcador, puede igualmente portarse mediante un fragmento de ADN diferente, co-transfectado con el primero.

Después de la transfección, las células transformadas, se seleccionan (resistencia a la geneticina) y, su ADN, se analiza mediante procedimiento de Northen blot (transferencia de Northen), para verificar la integración del fragmento o de los fragmentos de ADN (en este caso, la utilización de 2 construcciones separadas), en el genoma. Se procede, a continuación, a someter a las células, a test de ensayo, para ensayar su capacidad para encapsidar AAV recombinantes, después de la infección, mediante el virus auxiliar y transfección, con un plásmido AAV apropiado.

Esta técnica, permite obtener las líneas celulares siguientes:

1.- Células MDCK, que poseen el gen rep, bajo control del LTR de MMTV;

2.- Células MDCK, que poseen los genes rep, y cap, sobre un mismo fragmento de ADN, bajo control del LTR de MMTV;

3.- Células MDCK, que poseen los genes rep, y cap, sobre 2 fragmentos de ADN, distintos, bajo control del LTR de MMTV.

Ejemplo 6 Construcción de un adenovirus que contiene las funciones de encapsidación de AAV

Este ejemplo, describe la construcción de un adenovirus que contiene los genes rep y cap de AAV, insertados en su genoma. El adenovirus Ad-RSV-Rep-Cap, se obtuvo mediante recombinación homóloga, in vivo, entre el adenovirus mutante Ad.d11324 [Thimmappaya et al., Cell 32 (1982) 543], y el vector pAd.RSV-Rep-Cap.

6.1 Construcción de un plásmido pAd.RSV.Rep-Cap (figura 3)

El plásmido pAd.RSV.Rep-Cap, se construyó a partir del plásmido pAd.RSV.\betaGal [Stratford - Perricaudet et al., J. Clin. Invest. (1992) 626], mediante la sustitución del gen \beta-gal, por un fragmento de ADN que porta los genes rep y cap de AAV.

Para realizar este cometido, se procedió a aislar el fragmento XbaI, que contiene el genoma del AAV2, del cual se han suprimido sus ITR, aislamiento éste que se realizó a partir del plásmido p201 (véase el ejemplo 1, anterior). Se procedió, a continuación, a sub-clonar este fragmento, en el sitio XbaI del plásmido Bluescript. Esta etapa, permite aislar, a continuación, el fragmento que comporta los genes rep y cap de AAV, en forma de un fragmento NotI-ClaI. Este fragmento, se clonó, a continuación, en los sitios XbaI (situado después de la ITR izquierda) y ClaI (situado antes de PIX, del Ad5) del vector pAd.RSV\betaGal, resultando en la sustitución del gen \betagal, por los genes rep y cap.

6.2 Construcción del adenovirus recombinante defectivo Ad.RSV.Rep-Cap

Se procedió a co-transfectar el plásmido pAd.RSV.Rep-Cap y el adenovirus Ad.d11324, linealizado mediante la encima ClaI, a la línea 293, en presencia de fosfato de calcio, para permitir la recombinación homóloga. Los adenovirus recombinantes de esta forma generados, se seleccionaron mediante purificación sobre placa. Después del aislamiento, el ADN del adenovirus recombinante, se amplificó en la línea celular 293.

Las partículas virales, se purifican, generalmente, mediante centrifugación sobre gradiente de cloruro de cesio, según las técnicas conocidas (véase, especialmente, Graham et al., Virology 52 (1973) 456). El adenovirus Ad.RSV.Rep-Cap, puede conservarse, a una temperatura de -80ºC, en un 20% de glicerol.

Puede procederse a repetir la misma estrategia, insertando solamente uno de los genes rep o cap. Además, la inserción, puede realizarse en sitios diferentes del genoma del adenovirus.

Claims

1. Procedimiento de producción de virus adeno-asociados (AAV) humanos, recombinantes, caracterizado por el hecho de que, la producción, se realiza en una línea celular, en presencia de un virus auxiliar animal, no humano.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que, la producción, se realiza en una línea celular animal, infectada por un virus auxiliar animal, no humano.

3. Procedimiento, según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado por el hecho de que, el virus auxiliar animal, no humano, es un virus de origen canino, bovino, murino, ovino, porcino, aviar o símico.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que, el virus auxiliar animal, no humano, se elige de entre los adenovirus, el virus del herpes, y los virus vacunales.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, caracterizado por el hecho de que, el virus auxiliar animal, no humano, es un adenovirus.

6. Procedimiento, según la reivindicación 5, caracterizado por el hecho de que, el virus auxiliar animal, no humano, es un adenovirus canino.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, caracterizado por el hecho de que, el virus auxiliar animal, no humano, se elige de entre las cepas CAV-1 y CAV-2.

8. Procedimiento, según las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado por el hecho de que, la producción, se realiza en una línea celular canina.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, caracterizado por el hecho de que, la línea celular, es la línea MDCK ó GHK, o un derivado de éstas.

10. Procedimiento, según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizado por el hecho de que, la línea celular, posee, además, las funciones de encapsidación de AAV.

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, caracterizado por el hecho de que, las funciones de encapsidación de AAV, se encuentran constituidas por los genes rep y cap de AAV, o por homólogos funcionales, eventualmente emplazados sobre el control de elementos heterólogos de regulación de la transcripción.

12. Procedimiento, según la reivindicación 10 u 11, caracterizado por el hecho de que, las funciones de encapsidación de AAV, se aportan por un plásmido de encapsidación y / o por el virus auxiliar animal, no humano y / o se integran al genoma de la línea celular.

13. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que, el gen rep de AAV, o un homólogo funcional de éste, se integra al genoma de la línea y el gen cap de AAV, o un homólogo funcional de éste, se porta mediante el virus auxiliar animal no humano.

14. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que, los genes rep y cap de AAV, o genes homólogos funcionales, se integran en el genoma de la línea celular.

15. Procedimiento, según la reivindicación 12, caracterizado por el hecho de que, los genes rep y cap de AAV, o genes homólogos funcionales, se portan mediante el virus auxiliar.

16. Línea celular infectable mediante un virus auxiliar animal, no humano, para la producción de AAV recombinantes, humanos, que comporta las funciones de encapsidación de AAV, integradas en su genoma.

17. Línea celular infectable mediante un virus auxiliar animal, no humano, para la producción de AAV recombinantes, humanos, que comporta las funciones de encapsidación de AAV, integradas en su genoma, bajo el control de uno o varios promotores inducibles.

18. Línea celular, según la reivindicación 16 ó 17, caracterizada por el hecho de que, ésta, comporta el gen rep de AAV, o un gen homólogo funcional, integrado en su genoma.

19. Línea celular, según la reivindicación 16 ó 17, caracterizada por el hecho de que, ésta, comporta el gen rep o cap de AAV, o genes homólogos funcionales, integrados en su genoma.

20. Línea celular, según la reivindicación 17, caracterizada por el hecho de que, el promotor inducible, se elige de entre el LTR de MMTV ó el promotor Tc.

21. Línea celular, según la reivindicación 16, caracterizada por el hecho de que, ésta, se obtiene a partir de las líneas MDCK ó GHK.

22. Virus auxiliar, no humano, para la producción de AAV humanos recombinantes, que comprende, insertadas en su genoma, las funciones de encapsidación de AAV.

23. Virus auxiliar, según la reivindicación 22, caracterizado por el hecho de que, éste comprende, insertado en su genoma, el gen rep de AAV, o un gen homólogo funcional.

24. Virus auxiliar, según la reivindicación 22, caracterizado por el hecho de que, éste comprende, insertados en su genoma, los genes rep y cap de AAV, o genes homólogos funcionales.

25. Virus auxiliar, según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, caracterizado por el hecho de que, éste, se trata de un adenovirus animal, no humano.

26. Virus auxiliar, según la reivindicación 25, caracterizado por el hecho de que, éste, se trata de un adenovirus canino, elegido, de una forma preferente, de entre los adenovirus CAV1 y CAV2.