NO319885B1 - Fremgangsmate for fremstilling av rekombinante, adenoassosierte viruser (AAV), og deres anvendelse. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en ny fremgangsmåte for fremstilling av vektorer som stammer fra adénoassosierte vimser, AAV. Mer spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante AAV ved hjelp av et ikke-humant, animalsk hjelpevirus. Oppfinnelsen angår likeledes anvendelsen av de oppnådde, rekombinante AAV.

Genterapi består i å korrigere defekter eller anomalier (mutasjon, feilaktig ekspresjon og så videre) eller å sikre ekspresjonen av et protein av terapeutisk interesse ved innføring av en genetisk informasjon i de påvirkede celler eller organ. Denne genetiske informasjon kan innføres enten in vitro i en celle som er trukket ut fra organet hvoretter cellen modifiseres og så gjeninnføres i organismen, eller direkte in vivo i det egnede vev. Forskjellige teknikker er beskrevet for overføring av denne genetiske informasjon blant hvilke forskjellige transfeksjonsteknikker implikerer DNA-komplekser og DEAE-dekstran (Pagano et al., "J.Virol." 1 (1967) 891), DNA og nukleære proteiner (Kaneda et al., "Science" 243 (1989) 375), DNA og lipider (Felgner et al., "PNAS" 84 (1987) 7413), DNA og polylysin, anvendelsen av liposomer (Fraley et al., "J.Biol.Chem." 255

(1980) 10431), og så videre. I den senere tid har anvendelsen av vimser som vektorer for overføring av gener vist seg som et lovende alternativ for disse fysikokjemiske transfeksjonsteknikker. I denne forbindelse er forskjellige vimser prøvet med henblikk på deres evne til å infisere visse cellepopulasjoner. Særlig gjelder dette retroviruset (RSV, HMS, MMS, og så videre), HSV-viruset, adenoviruset og de adénoassosierte vimser.

Blant disse vimser oppviser de adénoassosierte vimser (AAV for "adeno-associated vims"), visse attraktive egenskaper med henblikk på en anvendelse for overføring av gener. AAV er DNA-viruset med relativt liten størrelse og som integrerer seg i genomet av cellene de infiserer på stabil og setespesifikk måte. De er i stand til å infisere et stort spektrum av celler uten å indusere virkning på cellulær vekst, morfologi eller differensiering. Videre synes de ikke å være implikert i patologier hos mennesker.

Genomet til AAV har vært klonet, sekvensert ogkarakterisert. Det omfatter ca. 4700 baser og inneholder ved hver ende et repetert, inversert område (HR) på ca. 145 baser og som tjener som vimsets replikeringsopprinnelse. Resten av genomet er delt i to vesentlige områder som bærer enkapsideringsfunksjonen: det venstre genomparti som inneholder rep-genet som er implikert i den virale replikasjon og ekspresjon av virale gener; den høyre genomdel som inneholder cap-<g>enet som koder for vimsets capsid-proteiner. Anvendelsen av vektorer avledet fra AAV for overføring av gener in vivo og in vitro er beskrevet i litteraturen (se særlig WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528). Disse søknader beskriver forskjellige konstruksjoner avledet fra AAV hvori genene rer) og/eller cap_ er utelatt og erstattet av et gen av interesse, og deres anvendelse for overføring in vitro (på celler i kultur) eller in vivo (direkte i en organisme) av de nevnte interessante gener.

Imidlertid er den terapeutiske anvendelse av AAV som vektorer for overføring av gener begrenset, særlig på grunn av kontamineringsrisiki for rekombinant AAV med et vill-hjelpevirus, og anvendelsen, for fremstilling av rekombinante vimser, av potensielt tumorigene humane cellelinjer. Disse AAV har, for replikering, behov for nærvær av et hjelpevirus ("helper"). Uttrykket hjelpevirus angir et hvilket som helst vims som er i stand til å tilveiebringe de nødvendige funksjoner for replikering av AAV. Det kan særlig dreie seg om et adenovims, et herpesvirus eller et vaksinevims. I fravær av et slikt hjelpevirus forblir AAV i latent form i genomet i den infiserte celle, men kan ikke replikere seg og således produsere de virale partikler. Generelt produseres de rekombinante AAV således ved ko-transfeksjon, i en cellelinje som er infisert med et humant hjelpe vims (for eksempel et adenovims), av et plasmid inneholdende det interessante gen omgitt av to repeterende inverse områder (ITR) av AAV og et plasmid som bærer enkapsideirngsgenene f rep- og carj-genene) av AAV. De produserte, rekombinante AAV renses deretter ved klassiske teknikker. Imidlertid er de således oppnådde AAV generelt kontaminert med vill-hjelpevirus, også produsert av produksjonscellen. Nærværet av denne hjelpevirus kan in vivo ha meget alvorlige konsekvenser, for eksempel en patogen eller immunogen effekt. Disse hjelpevimser kan likeledes være ansvarlig for rekombinasjonsevenementer eller indusere replikasjon av rekombinante AAV og derved dennes transmisjon eller disseminasjon.

Foreliggende oppfinnelse gir en fordelaktig løsning på dette problem. Det er nå funnet en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinante AAV som tillater å produsere forråd av rekombinante AAV som er befridd for vill-human-hjelpevirus. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan likeledes unngå anvendelsen av potensielt tumorigene produksjonsceller. Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hviler delvis på den oppdagelse at rekombinante AAV kan fremstilles under anvendelse av et hjelpevims av animalsk opprinnelse. Søkeren har således vist, på meget overraskende måte, at et vims av animalsk opprinnelse er i stand til å trans-komplementere en human AAV og kan, på grunn av dette, benyttes som hjelpevims for fremstilling av human, rekombinant AAV. Dette resultat er meget fordelaktig fordi den animalske vims som benyttes som hjelpevims ikke er i stand til å propagere seg i de humane celler og ingen humanpotologi har vært observert etter en infeksjon med et animalsk hjelpevirus. På grunn av dette vil, selv om de oppnådde preparater av rekombinant AAV er kontaminert med et hjelpevirus, denne ikke forårsake noen uønsket sekundæreffekt in vivo. Videre muliggjør oppfinnelsens fremgangsmåte anvendelse av animalske produksjonscellelinjer som er berøvet for de tumorigene virkninger som i dag er kjent for de disponible humanlinjer. Oppfinnelsen hviler likeledes på anvendelse av cellelinjer og hjelpeviruser som er spesielt fordelaktige for produksjon av rekombinant

AAV.

En første gjenstand for oppfinnelsen ligger således i en fremgangsmåte for fremstilling av rekombinant AAV i henhold til hvilken produksjonen realiseres i nærvær av et ikke-humant, animalsk hjelpevirus.

Fortrinnsvis gjennomføres fremstillingen i en animalcellelinje som er infisert med et anim alhj elpe virus.

Oppfinnelsen angår likeledes generelt anvendelsen av et animal hjelpevirus for fremstilling av rekombinant AAV.

Som antydet ovenfor angir uttrykket "hjelpevirus", innenfor oppfinnelsens ramme, enhver virus som er i stand til i trans å tilveiebringe de funksjoner som er nødvendige for replikering av AAV. Hjelpeviruset som kan benyttes innenfor oppfinnelsens ramme kan være et virus av kanin-, bovin-, murin-, ovin-, porcin-, aviar- eller også simienne-opprinnelse. Den velges fortrinnsvis blant adenovirusete, herpesvirusete eller vaksine-viruset.

Det er spesielt fordelaktig hvis man innenfor rammen av oppfinnelsen benytter et adenovims av animalsk opprinnelse. Adenoviruset av animalsk opprinnelse som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen kan være av forskjellig opprinnelse og særlig av kanin-, bovin-, murin- (for eksempel Mavl, se Beard et al., "Virology" 75 (1990) 81), ovin-, porcin-, aviar- eller også simienne (for eksempel: SAV)-opprinnelse.

Mer spesielt kan man blant de aviare adenoviruser angi sérotypene 1 til 10 som er tilgjengelige fra ATCC, som for eksempels stammene Phelps (ATCC VR-432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-l 1 (ATCC VR-921) eller også stammene angitt som ATCC VR-831 til 835.

Blant de bovine adenoviruser kan man benytte de forskjellige kjente sérotyper og særlig de som er disponible fra ATCC (typene 1 til 8) under referansene (ATCC VR-313, 314, 639-642, 768 og 769.

Man kan likeledes benytte murin-adenoviruset FL (ATCC VR-550) og E20308 (ATCC VR-528), adenovims ovin type 5 (ATCC VR-1343), eller type 6 (ATCC VR-1340); adenovims porcin 5359), eller simien-adenovimset som særlig de adenoviruser som betegnes av ATCC under numrene VR-591-594, 941-943,195-203, og så videre.

Fortrinnsvis benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen og som hjelpevims, adenoviruser av kanin opprinnelse og aller helst alle adenovirus-stammene CAV1 og CAV2 [for eksempel stamme manhattan eller A26/61 (ATCC VR-800)]. Kanin-adenovimsete har vært gjort til gjenstand for tallrike stmktur-studier. Således er de komplette restriksjonskart for adenovirusete CAV1 og CAV2 beskrevet i (Spibey et al., "J.Gen.Virol." 70 (1989) 165), og genene Ela, E3 samt sekvensene ITR er klonet og sekvensert (se særlig Spibey et al. i "Vims Res." 14 (1989) 241; Linné i "Vims Res." 23

(1992) 119, WO 91/11525). Slik eksemplene nedenfor viser, er kanin-adenovimset i stand til å transkomplementere AAV for deres replikering med en særlig høy effektivitet.

De forskjellige vimser av animalsk opprinnelse kan for eksempel oppnås fra stammer som er deponert i samlinger og som forsterkes i kompetente cellelinjer og eventuelt modifiseres. Teknikker for produksjon, isolering og modifisering av adenovimser eller herpesviruser er beskrevet i litteraturen og kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen [Akli et al., "Nature Gnetics" 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet et al., "Human Gene Therapy" 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero et al., "Gene" 101 (1991) 195; Le Gal la Salle et al., "Science" 259 (1993) 988; Roemer et Friedmann, "Eur.J.Biochem." 208 (1992) 211; Dobson et al., "Neuron" 5 (1990) 353; Chiocca et al., "New Biol." 2 (1990) 739; Miyanohara et al., "New Biol." 4 (1992) 238; WO91/18088, WO90/09441, WO88/10311, W091/11525]. Disse forskjellige vimser kan deretter modifiseres, for eksempel ved delesjon, substitusjon, addisjon og så videre. Videre kan vimset i visse tilfelle modifiseres for å gjøre defektive med henblikk på replikering.

Som antydet ovenfor blir produksjonen av rekombinante AAV ifølge oppfinnelsens fremgangsmåte fortrinnsvis gjennomført i en animalsk cellelinje som er infisert med hjelpeviruset.

Generelt er cellelinjen og den benyttede hjelpevirus fra samme art. I denne forbindelse er forskjellige animalske cellelinjer som kan benyttes innenfor rammen av oppfinnelsen, beskrevet i litteraturen. Blant kanin-linjene kan man således med fordel nevne den renale myndecellelinje GHK (Flow laboratories) eller cellelinjen MDCK (ATCC nr. CRL6253). Dyrkningsbetingelsene for disse celler og preparering av vimsete eller viral-DNA er beskrevet i litteraturen (se særlig Macatney et al., "Science" 44 (1988) 9; Fowlkes et al., "J.Mol.Biol." 132 (1979) 163). Andre animalske cellelinjer (for eksempel tilgjengelige fra samlinger) kan likeledes benyttes.

Fortrinnsvis benytter oppfinnelsens fremgangsmåte en kanin-cellelinje som er infisert med en kanin-adenovirus.

Aller helst gjennomføres oppfinnelsens fremgangsmåte med linjen MDCK eller GHK, eller en linje avledet fra denne, som kanin-cellelinje. Med avledet linje menes enhver linje som oppnås fra linjene og som bevarer sin evne til å produsere rekombinante AAV når de dyrkes, infekteres og/eller transfekteres under de riktige betingelser. De avledede linjer kan særlig oppnås ved innskyting av eksogene gener, mutagenese og/eller seleksjon av subkloner, alt etter som.

I en foretrukket metode for gjennomføring av oppfinnelsen har den benyttede cellelinje videre enkapsideringsfunksjoner for AAV.

Som antydet ovenfor blir rekombinant AAV generelt fremstilt ved ko-transfeksjon i en cellelinje som er infisert med et hjelpevims, et plasmid inneholdende det interessante gen omgitt av to inverse repeterte områder (ITR) av AAV og et plasmid som bærer enkapsideringsfunksjonene for AAV. Å utelate disse enkapsideringsfunksjoner for rekombinant AAV og å tilveiebringe disse i trans på et plasmid tillater å fremstille defekte, rekombinante AAV, det vil si som ikke er i stand til å produsere infeksiøse, virale partikler etter infeksjon i en målcelle. Enkapsideringsfunksjonene for AAV består i det vesentlige av rep.- og cap-genene eller et hvilket som helst funksjonelt, homologt gen. Rep-genet er implikert i den virale replikasjon samt ekspresjonen av virale gener, og cap-<g>enet koder for kappe-proteinene for virus (VP1, VP2 og VP3). Disse gener erkarakterisertog deres sekvens er beskrevet i litteraturen (Srivastava et al., "J.Virol." 45

(1983) 555). En funksjonell homolog tilsvarer et hvilket som helst gen, oppnådd ved modifisering (mutasjon, supresjon, addisjon og så videre) av rep- eller cap-genene og oppviser en aktivitet av samme type. De funksjonelle, homologe gener kan likeledes være gener som oppnås ved hybridisering fra nukleinsyrebanker ved hjelp av tilsvarende sonder for rep- og/eller cap-genene.

For å tillate produksjon av defekte, rekombinante AAV har således cellelinjen ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis AAV erikapsideringsfunksjoner. Mer spesielt har den benyttede cellelinje en eller flere kopier av rep- og cap-genene av AAV, eller funksjonelle, homologe gener.

Ifølge oppfinnelsen kan enkapsideringsfunksjonene for AAV tilveiebringes av et enkapsideirngsplasmid og/eller ved det benyttede, animalske hjelpevirus og/eller integreres i genomet av cellelinjen.

I en særlig utførelsesform av oppfinnelsen blir alle disse funksjoner tilveiebragt av et plasmid kalt enkapsidasjon. I dette tilfellet omfatter fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis ko-transfeksjon av en infisert, animalsk cellelinje med en animalsk hjelpevirus, med en vektor som bærer et gen av interesse og minst en ITR av AAV og med enkapsideringsplasmidet av AAV. Aller helst bærer enkapsideringsplasmidet av AAV minst rep-og cap<-g>enene av AAV eller deres funksjonelle homologer.

I en annen særlig fordelaktig utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes enkapsideringsfunksjonene av den benyttede, animalske hjelpevirus og/eller er integrert i genomet i cellelinjen. I dette tilfellet omfatter oppfinnelsens fremgangsmåte transfeksjon av en vektor som bærer et gen av interesse og minst en ITR av AAV i en cellelinje som er infisert med et animalsk hjelpevirus og inneholder enkapsideringsfunksjonene (integrert i genomet og/eller tilveiebragt av hjelpeviruset). Denne utførelsesform er særlig fordelaktig fordi den tillater å unngå anvendelsen av et enkapsideringsplasmid.

Mer spesielt blir, i oppfinnelsens fremgangsmåte, rep-genet av AAV eller en funksjonell homolog av dette, integrert i genomet til cellelinjen og cap-genet av AAV eller en funksjonell homolog av dette, bæres av den animalske hjelpevirus. I en annen foretrukket variant av oppfinnelsens gjennomføring benytter man en cellelinje som, innskutt i sitt genom, bærer rep- og cap-genene av AAV eller funksjonelle homologer av genene. I denne foretrukne arbeidsmåte kan rep_-og cap-genene av AAV eller deres funksjonelle homologer innføres på en unik konstruksjon eller sekvensielt på adskilte konstruksjoner. I disse forskjellige utførelsesmåter kan enkapsideringsfunksjonene være plassert under kontroll av deres egentlige promoter, heterologe promotere eller kunstige promotere. Fortrinnvis blir enkapsideringsfunksjonene anbragt under kontroll av elementer for regulering av den induktible transkripsjon som tillater å indusere eller reprimer ekspresjonen av enkapsideringsfunksjonene alt etter betingelsene. På en spesielt fordelaktig måte blir rep-genet av AAV eller en funksjonelle homolog av genet i oppfinnelsens konstruksjoner bragt under kontroll av en induktibel promoter.

I en annen foretrukket variant av oppfinnelsen benyttes en hjelpevirus som, i sitt genom, inneholder rep- og cap-genene av AAV eller funksjonelle homologer av genene.

Foreliggende søkere har vist at det er mulig å skyte inn enkapsideringsfunksjonene eller visse av disse, direkte i genomet av den benyttede hjelpevirus. På samme måte har foreliggende søkere også vist at det er mulig å skyte inn enkapsideringsfunksjonene eller visse av disse på stabil måte og direkte i genomet til den benyttede cellelinje.

I denne forbindelse kan det benyttes enhver animalsk cellelinje som kan infiseres av en hjelpevirus for fremstilling av rekombinante AAV og som helt eller delvis inneholder enkapsideringsfunksjonene av AAV integrert i sitt genom. Fortrinnsvis benyttes enhver animalsk cellelinje som omfatter re<p-g>enet av AAV eller en funksjonell homolog av genet, integrert i sitt genom. I en annen foretrukken arbeidsmåte benyttes enhver animalsk cellelinje som bærer rep- og cap-genene av AAV eller funksjonelle homologer av genene, integrert i sitt genom.

På spesielt fordelaktig måte dreier det seg om en kanin cellelinje som for eksempel en linje oppnådd fra MDCK eller GHK.

Cellelinjene kan oppnås ved transfeksjon av et DNA-fragment som bærer enkapsideringsfunksjonen eller funksjonene av AAV under kontroll av ekspresjonssignaler. Transfeksjonen kan gjennomføres ved en hvilken som helst for fagmannen kjent teknikk (presipitering med kalsiumfosfat, lipofektering, elektroporering, anvendelse av liposomer og så videre). Fortrinnsvis blir transfekteringen gjennomført i nærvær av kalsiumfosfat (se eksempel 5). For å kontrollere ekspresjonen av enkapsideringsfunksjonene kan det benyttes forskjellige ekspresjonssignaler. Det kan særlig dreie seg om de egentlige promotere for rep- eller cap-genene. heterologe og sågar syntetiske promotere. I en utførelsesform som er av spesiell interesse er enkapsideringsfunksjonene av AAV plassert under kontroll av induktible promotere (LTR-MMTV, Tc), i cellelinjene. Anvendelsen av slike promotere er spesielt fordelaktig fordi de tillater å modulere virkningen av rep-genet særlig på den benyttede hjelpevirus. Oppfinnelsen benytter også enhver cellelinje som er infiserbar med hjelpevirus for fremstilling av rekombinant AAV og som bærer hele eller en del av enkapsideringsfunksjonene av AAV integrert i sitt genom, under kontroll av en eller flere induktible promotere.

I det tilfellet der en linje bærer rep- og cap-genene av AAV (eller funksjonelle homologer derav) kan disse gener transfekteres enten på en enkelt konstruksjon eller sekvensielt på to separate konstruksjoner. Denne andre fremstillingsmetode er spesielt fordelaktig fordi den maksimalt begrenser rekombineringshendelsene. De således oppnådde linjer er således særlig stabile. Videre bærer konstruksjonen som benyttes for transfeksjonen fortrinnsvis likeledes et gen som tillater seleksjon av de transformerte celler, for eksempel genet for motstandsevne mot genetisin. Resistensgenet kan likeledes bæres av et annet DNA-fragment som ko-transfekteres med det første.

Etter transfeksjon blir de transformerte celler selektert (for eksempel ved hjelp av deres motstandsevne mot genetisin) og deres DNA analyseres ved Northén blot for å verifisere integreringen av DNA-fragmentet eller -fragmentene (i det tilfellet det benyttes to separerte konstruksjoner) i genomet. Kapasiteten for de oppnådde celler til å enkapsidere AAV kan deretter prøves ved infeksjon ved hjelp av en rekombinant AAV som er berøvet disse funksjoner.

Oppfinnelsen kan benytte ethvert hjelpevirus for fremstilling av rekombinant AAV som, innskutt i sitt genom, bærer heller eller en del av enkapsideringsfunksjonene for AAV. Mer spesielt kan oppfinnelsen benytte seg av et hvilket som helst hjelpevirus for fremstilling av rekombinante AAV som, innskutt i sitt genom, bærer rep-genet av AAV eller en funksjonell homolog. Fremdeles foretrukket benytter oppfinnelsen et hvilket som helst hjelpevirus for fremstilling av rekombinant AAV som, innskutt i sitt genom, bærer rep- og cap-genene av AAV eller funksjonelle homologer av genene.

Fortrinnsvis er hjelpeviruset for fremstilling av rekombinant AAV et adenovims. Adenovimset som omfatter enkapsideringsfunksjonene for AAV kan fremstilles ved homolog rekombinering mellom et adenovims og et plasmid som blant annet bærer disse enkapsideringsfunksjoner. Den homologe rekombinering skjer etter ko-transfeksjon av adenovimset og plasmidet i en egnet cellelinje. Som et eksempel på linjen kan man nevne den humane embryonyrelinje 293 (Graham et al., "J.Gen.Virol." 36 (1977) 59) som særlig, integrert i sitt genom, inneholder den venstre del av genomet av et adenovims Ad5 (12 %), eller linjen MDCK. Deretter blir de multipliserte vektorer gjenvunnet og renset i henhold til klassiske teknikker i molekylbiologien.

Det er også mulig med adenovims av human opprinnelse og fortrinnsvis valgt blant adenovimset Ad2 og Ad5; eller animalsk, fortrinnsvis valgt blant kanin-adenoviruser (CAV1 og CAV2). Enkapsideringsfunksjonene for AAV kan innføres i forskjellige områder av genomet av hjelpevimset. Fortrinnsvis blir enkapsideringsfunksjonene innskutt i et område som ikke forstyrrer vimsets evne til transkomplementering av AAV. Det er likeledes mulig å innskyte enkapsideringsfunksjonene i et funksjonelt område av genomet av hjelpevimset, hvilket område så bringes i trans, enten ved hjelp av et plasmid eller ved hjelp av den benyttede cellelinje. Når det gjelder de humane adenoviruser Ad2 elle AdS er det således mulig for eksempel å skyte inn rep-<g>enet. cap-genet eller rep- og cap-genene som erstatning for genet El. Den oppnådde adenovims kan benyttes som hjelpevims for fremstilling av rekombinant AAV i cellelinjen 293 som bærer genet El i sitt genom (se eksempel 6).

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen tillater således fremstilling av rekombinante AAV som kan benytte terapautisk. De oppnådde rekombinante AAV kan være et hvilket som helst AAV hvis genom i det minste er modifisert ved innskyting av et gen av interesse. Som antydet ovenfor er forskjellige typer rekombinante AAV beskrevet i teknikken (WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368; US 5,139,941; EP 488 528).

Generelt omfatter disse AAV partielle eller totale utelatelser i rep- og/eller cap-genene og der i stedet et gen av interesse er innskutt. Disse rekombinante AAV kan fremstilles fra forskjellige AAV som AAV1, AAV2, AAV3 og AAV4, og fortrinnsvis fra stammene AAV2. Når det gjelder det interessante gen kan det særlig dreie seg om et terapeutisk gen.

Innenfor oppfinnelsens ramme menes med terapeutisk gen særlig ethvert gen som koder for et proteinprodukt med terapeutisk effekt. Proteinproduktet det således kodes for kan være et protein, et peptid og så videre. Proteinproduktet kan være homologt vis-å-vis målcellen (det vil si et produkt som særlig uttrykkes i målcellen, når denne ikke viser noen patologi. I dette tilfellet tillater ekspresjonen av et protein for eksempel å bøte på en utilstrekkelig ekspresjon i cellen eller ekspresjon av et protein som er inaktivt eller lite aktivt på grunn av en modifikasjon, eller også overeksprimer proteinet. Det terapeutiske gen kan således kode for en mutant av et cellulært protein med øket stabilitet, modifisert aktivitet og så videre. Proteinproduktet kan likeledes være heterologt vis-å-vis målcellen. I dette tilfellet kan et uttrykt protein for eksempel komplettere eller tilveiebringe en mangelfull aktivitet i cellen og derved tillate den å kjempe mot en patologi, eller stimulere en immunrespons.

Blant de terapeutiske produkter innenfor rammen av oppfinnelsen kan særlig nevnes enzymer, blodderivater, hormoner, lymfokiner som interleukiner, interferoner, TNF og så videre (FR 9203120), vekstfaktorer som erytropoiétin, G-CSF, M-CSF, GM-CSF og så videre), neurotransmettorer eller deres forløpere eller synteseenzymer, trofiske faktorer som BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, NT3, NT5, HARP/pleiotrofin, og så videre, apolipoproteinene som ApoAI, ApoAIV, ApoE og så videre (FR 93 05125), Hpoprotein lipase (LPL), dystrofin eller et minidystrofin (FR 9111947), proteinet CFTR forbunder med mucoviscidose, suppressorgenene for tumorer som p53, Rb, Rapi A, DCC, k-rev, etc. (FR 93 04745), gener som koder for faktorer implikert i koaguleringen som faktorene VII, VIII, IX og videre gener som intervenerer i fordelingen av DNA, drepergener (tymidin kinase, cytosin deaminase), og så videre.

Det terapeutiske gen kan likeledes være et antiretningsgen eller en -sekvens hvis ekspresjon i målcellen tillater å kontrollere ekspresjonen av genene eller transkriberingen av den cellulære mRNA. Slike sekvenser kan for eksempel transkriberes i målcellen til RNA som er komplementær den cellulære mRNA og derved blokkere dennes translasjon til protein, i henhold til den teknikk som er beskrevet i EP 140 308. Anti-retningene omfatter likeledes sekvenser som koder for ribozymer og som er i stand til selektivt å destruere mål-RNA (EP 321 201).

Det interessante gen kan likeledes omfatte en eller flere sekvenser som koder for et antigenisk peptid som i mennesker eller dyr kan generere en immun respons. Ved denne spesielle utførelsesform av oppfinnelsen kan de rekombinante AAV benyttes for å realisere enten vaksiner eller immunoterapeutiske behandlinger som anvendes på mennesker eller dyr, særlig mot mikroorganismer, vimser eller cancere. Det kan særlig dreie seg om peptider som spesifikt er antigeniske for Epstein Barr-viruset, HIV-viruset, hepatitt B-viruset (EP 185 573), hundegalskapsviruset eller også spesifikk for tumorer (EP 259 212).

Fortrinnsvis omfatter det interessante gen likeledes sekvenser som tillater dets ekspresjon i den ønskede celle eller organ. Det kan dreie seg om sekvenser som naturlig er ansvarlig for ekspresjon av det angjeldende gen når sekvensene er i stand til å funksjonere i den infiserte celle. Det kan likeledes dreie seg om sekvenser av annen opprinnelse (ansvarlige for ekspresjonen av andre proteiner, eller også syntetiske). Særlig kan det dreie seg om promotersekvenser for eucaryotiske eller virale gener. For eksempel kan det dreie seg om promotersekvenser fra genomet av cellen man ønsker å infektere. På samme måte kan det dreie seg om promoterceller fra genomet av et virus. I denne forbindelse kan man for eksempel nevne promoteme av genene EIA, MLP, CMV, LTR-RSV og så videre. Videre kan ekspresjonssekvensene modifiseres ved addisjon av sekvenser for aktivering, regulering eller som gir det angjeldende gen en ve v-ekspresj ons spesi fisitet.

Videre kan det angjeldende gen likeledes omfatte en signalsekvens som styrer det syntetiserte, terapeutiske produkt inn i målcellenes sekresjons veier. Denne signalsekvens kan være den naturlige signalsekvens for det terapeutiske produkt men det kan likeledes dreie seg om en hvilken som helst annen funksjonell signalsekvens eller en kunstig signalsekvens.

De rekombinante AAV som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan benyttes for overføring av interessante gener in vitro, ex vivo eller in vivo. In vitro tillater dette overføring av et gen til en cellulær linje, for eksempel med henblikk på å produsere et rekombinant protein. Ex vivo kan de benyttes for å overføre et gen på en cellepopulasjon som er hentet fra en organisme, eventuelt seleksjonert og forsterket, med det formål å gi cellene ønskede egenskaper med henblikk på deres re-administrering til en organisme. In vivo kan de benyttes for overføring av gener ved direkte administrering av en renset oppløsning, eventuelt i forbindelse med en eller flere farmasøytiske bærere. I dette sistnevnte tilfellet kan de rekombinante AAV formuleres med henblikk på administrering ad topisk, kutan, oral, rektal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenøs, intramuskulær, subkutan, intraokkulær eller transdermisk vei. Fortrinnvis er de assosiert med en farmasøytisk akseptabel bærer for en injiserbar formulering, særlig for en injeksjon direkte til det ønskede organ. Det kan særlig dreie seg om sterile, isotoniske oppløsninger eller tørkede preparater, særlig lyofiliserte slike som ved tilsetning av sterilisert vann eller fysiologiske serum tillater konstituering av injiserbare oppløsninger. De benyttede AAV doser for injeksjon samt antallet administreringer kan tilpasses som en funksjon av forskjellige parametere og særlig som en funksjon av den benyttede administreringsmåte, den angjeldende patologi, genet som skal uttrykkes eller også varigheten av den ønskede behandling.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en særlig fordelaktig metode for fremstilling av rekombinant AAV som kan benyttes terapeutisk, særlig i en metode for behandling av sykdommer, og som omfatter admirristrering in vivo av en rekombinant AAV inneholdende et gen egnet til å korrigere sykdommen. Mer spesielt kan metoden anvendes på sykdommer som skyldes en defekt i et protein- eller nukleinprodukt og det angjeldende gen koder for dette proteinprodukt eller inneholder dette nukleinprodukt.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av rekombiant human AAV virus, kjennetegnet ved at den omfatter transfektering av en cellelinje med et ikke-humant, animalsk hjelpevirus.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av et animalsk hjelpervirus som ikke kan propagere i humanceller, for fremstilling av rekombinant AAV.

Foreliggende oppfinnelse skal illustreres nærmer nedenfor ved hjelp av eksempler.

Generelle teknikker i molekylærbiolo<g>ien.

De klassiske metoder som benyttes i molekylbiologien som preparativ ekstrahering av plasmidisk DNA, sentrifugering av plasmidisk DNA i ceciumkloirdgradient, elektroforese på agarose- eller akrylamidgel, rensing av DNA-fragmenter ved elektro-eluering, ekstrahering av proteiner med fenol-kloroform, presipitering av DNA i saltmedium med etanol eller isopropanol, transformering i Eschirichia coli, og så videre, er alt velkjent for fagmannen og rikelig beskrevet i litteraturen [Maniatis T. et al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1982; Ausubel F.M. et al., (eds.), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1987].

Plasmidene av type pBR322, pUC og fagene i serie Ml3 er av kommersiell opprinnelse (Bethesda Research Laboratories).

For ligaturene kan DNA-fragmentene separeres i henhold til størrelse ved elektroforese på agaraose- eller akrylamidgel, ekstraheres med fenol eller med fenohkloroform, presipiteres med etanol og deretter inkuberes i nærvær av DNA-ligase av fagen T4 (Biolabs) i henhold til leverandørens anbefalinger.

Oppfyllingen av de pro-eminente 5'-ender kan gjennomføres med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I av E.coli (Biolabs) i henhold til leverandørens spesifikasjoner. Destrueringen av de pro-eminente 3'-ender gjennomføres i nærvær av DNA-polymerase av fagen T4 (Biolabs), benyttet i henhold til fabrikkantens anbefalinger. Destrueringen

av de pro-eminente 5'-ender gjennomføres ved en behandling med nuklease Sl.

Den rettede mutagenese in vivo med syntetiske oligodeoksynukleotider kan gjennomføres i henhold til den metode som er utviklet av Taylor et al. ["Nucleic Acids Res." 13 (1985) 8749-8764] under anvendelse av det kit som markedsføres av Amersham.

Den enzymatiske forsterkning av DNA-fragmentene med den teknikk som kalles PCR [Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., "Science" 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. et FaloonaF.A., "Meth.Enzym." 155, (1987) 335-350] kan gjennomføres under anvendelse av en "DNA therma cycler" (Perkin Eimer Cetus) i henhold til fabrikkantens spesifikasjoner.

Verifiseringen av nukleotidsekvensene kan gjennomføres ved den metode som er utviklet av Sanger et al., ["Proc.Natl. AcadSci. USA", 74 (1977) 5463-5467] under anvendelse av den kit som markedsføres av Amersham.

Figurforklarine

Figur 1: Representasjon av plasmidet pREP-CAP

Figur 2: Representasjon av plasmidet pAAV-EPO-NEO

Figur 3: Representasjon av plasmidet pAd-RepCap.

Eksempel 1 - Konstruksjon av enkapsideringsplasmidet pREP-CAP

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av et plasmid som kalles enkapsidering og som bærer de funksjoner som er nødvendige for enkapsidering av en rekombinant AAV. Mer nøyaktig bærer plasmidet, kalt pREP-CAP, genene rep og cap. av AAV2.

Plasmidet pREP-CAP konstrueres på følgende måte. Genomet av AAV2, deletert for sin ITR, isoleres fra plasmid p201 ved fermentering ved hjelp av enzymet XbaL Plasmidet p201 inneholder totaliteten av genomet AAV2, klonet på setet PvuII av plasmidet pEMBL8 (Samulski et al., "J.Virol." 61 (1987) 3096). Det således oppnådde fragment som bærer genene rep og cap. klones deretter til setet Xbal av plasmidet Bluescript (Stratagene). Konstruksjonen av dette plasmid er vist i figur 1.

Eksempel 2 - Konstruksjon av plasmidet AAV pAAV-EPO-NEO

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av et AAV plasmid som bærer cDNA som koder for erytropoietin, en genemarkør og to ITR av AAV2. Dette plasmid kalles pAAV-EPO-NEO (figur 2).

For konstruksjonen av dette plasmid fremstilles en ekspresjonskassett inneholdende cDNA som koder for erytropoietin (cynomolgus) under kontroll av LTR av viruset av rouse sarcome (RSV), fulgt av neogenet som tilveiebringer motstandsevne mot neomycin under kontroll av den tidlige promoter av viruset SV40. Denne kassett skytes deretter inn på setene SacII-Kpnl av plasmidet p201 og erstatter det tilsvarende fragment inneholdende rep. og cap_ (figur 2).

Eksempel 3 - Fremstilling av kanin adenovims CAV2 i cellelinje MDCK

Dette eksemple beskriver produksjonen av kanin adenovims CAV3 i en kanin cellelinje

MDCK.

MDCK cellene dyrkes i et DMEM-medium som er supplementert med 10 % kalveserum (se også Mcatney et al., "Science" 44 (1988) 9 for dyrkningsbetingelsene). Cellene i konfluens infekteres deretter med en suspensjon av vims CAV2 (ca. 5 pfu/celle). 30 til 48 timer etter infeksjon blir de infekterte celler samlet og konsentrert ved sentrifugering. Den oppnådde masse kan benyttes for å rense adenovimset CAV2 på ceciumklorid. Hvis mengdene er for lave blir produktet fortrinnsvis underkastet en frys-tin-cyklus hvoretter den oppnådde supematant benyttes for å forsterke CAV2 vimset. For dette formål blir supernatanten benyttet for re-infeksjon under de samme betingelser av MDCK-cellene og deretter blir den ovenfor beskrevne protokoll for gjenvinning av vimset, repetert. Denne prosess tillater å oppnå en renset oppløsning av adenovims CAV2 som kan benyttes som hjelpevims for fremstilling av rekombinant

AAV.

Eksempel 4 - Fremstilling av rekombinant AAV som bærer genet av erytropoietin i cellelinjen MDCK som er infektert med en kanin hjelpe-adenovirus.

Dette eksempel beskriver fremstillingen av en rekombinant AAV som bærer genet av erytropoietin i cellelinjen MDCK som er infektert med kanin adenovims CAV2. MDCK-cellene (50 % konfluens) infekteres med 5 til 10 pfu/celle adenovims CAV2 som er fremstilt under de samme betingelser som i eksempel 3.4 til 6 timer etter infeksjon blir cellene ko-transfektert ved lipo-feksjon ("PNAS" 84 (1987) 7413) med 5 ug plasmid pAAV-EPO-NEO og 5 ug plasmid pREP-CAP. 48 til 72 timer deretter blir cellene samlet og underkastet flere frys-tin-cykler. Den oppnådde suspensjon blir deretter sentrifugert (15 minutter ved 4000 omdr./min.) hvoretter supematanten inneholdende de rekombinante AAV gjenvinnes og oppvarmes til 56°C i 30 minutter.

For å verifisere infeksjonskraften og ekspresjonen av erytropoietin blir supematant-prøver benyttet for å infektere Hela-celler. Hela-cellene stammer fra en human epiteliumcarcinom. Denne linje er tilgjengelig fra ATCC (ref. CCL2) på samme måte som betingelsene som tillater dyrkingen. 24 timer etter infeksjon blir cellene og supematanten samlet. Nærværet av genomet av rekombinant AAV-EPO i disse celler bekreftes derved ved hybridiseirngsforsøk ved "southem blot" på cellulær DNA-ekstrakt i henhold til Hirtteknikken (Gluzman et Van Doren, "J.Virol." 45 (1983) 91). I tillegg blir nærværet av erytropoietin i supematanten påvist ved biologiske prøver.

Disse resultater viser klart at de rekombinante AAV kan fremstilles å effektiv måte i et animalsk system (cellelinje og hjelpevims).

Eksempel 5 - Konstruksjon av cellelinjer inneholdende enkapsideringsfunksjoene av

AAV.

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av cellelinjen inneholdende alle eller en del av enkapsideringsfunksjonene av AAV. Disse linjer tillater konstruksjon av rekombinante AAV som er deletert for disse områder uten å ha tilgang til et enkapsideringsplasmid. Disse vimser oppnås ved rekombinering in vitro og kan omfatte vesentlige, heterologe sekvenser.

Linjene konstrueres ved transfeksjon av de tilsvarende celler med et DNA-fragment som bærer de antydede gener under kontroll av en promoter for transkripsjonen og en terminator (polyadenyleringssete).

Transfeksjonene kan gjennomføres på forskjellige måter og særlig i nærvær av kalsiumfosfat, ved lipofeksjon, elektroporering og så videre. I dette eksempel gjennomføres transfeksjonen i nærvær av kalsiumfosfat.

Terminatoren kan være den naturlige terminator for det transfekterte gen eller en annen terminator, for eksempel en tidlig meddeler-terminator av viruset SV40.

I de beskrevne cellelinjer er genene rep_ og/eller cap plassert under kontroll av en induktibel promoter: LTR av MMTV (Pharmacia), som induseres med dexametason. Det er tilsiktet at også andre promotere kan benyttes og særlig variantene av LTR av MMTV som for eksempel bærer det heterologe reguleringsområder (særlig "enhancer" området eller tetracyklinpromoteren (Tc). Som videre antydet ovenfor kan promoteren også være den egentlige promoter for det benyttede gen.

Fortrinnsvis bærer DNA-fragmentet likeledes et gen som tillater seleksjon av de transformerte celler. Det kan dreie seg om et gen for resistens mot et antibiotikum som for eksempel genet for resistens mot genetisin. Denne genmarkør kan likeledes bæres av et annet DNA-fragment som er ko-transfektert med det første.

Etter transfeksjon blir de transformerte celler seleksjonert (resistens mot genetisin) og deres DNA analyseres ved Northern blot for å verifisere integreringen av DNA-fragmentet (eller fragmentene) når det gjelder anvendelsen av to separate konstruksjoner) i genomet. Cellene blir så prøvet på sine evner til enkapsidering av rekombinant AAV etter infeksjon med hjelpeviruset og transfeksjon med et egnet AAV-plasmid.

Denne teknikk tillater å oppnå de følgende cellelinjer:

1. MDCK-celler som har reg-genet under kontroll av LTR av MMTV; 2. MDCK-celler som bærer rep- og cap<-g>enene. på et og samme DNA-fragment, under kontroll av LTR av MMTV; og 3. MDCK-celler som bærer genene rep. og can., på 2 adskilte DNA-fragmenter, under kontroll av LTR av MMTV.

Eksempel 6 - Konstruksjon av en adenovims inneholdende enkapsideringsfunksjonene av AAV.

Dette eksempel beskriver konstruksjonen av en adenovims inneholdende rep- og cap-genene av AAV, innskutt i sitt genom. Adenovimset Ad-RSV.Rep-Cap oppnås ved homolog rekombinering in vivo mellom den mutante adenovims Ad.dll324 [Thimmappaya et al.,"CeH" 31 (1992) 543] og vektoren pAd.RSV.Rep.Cap.

6.1. Konstruksjon av plasmidet pAd.RSV.Rep-Cap. (figur 3)

Plasmidet pAd.RSV.Rep-Cap konstrueres fra plasmidet pAd.RSV.fiGal [Stratford-Perricaudet et al., "J.Clin.Invest." (1992) 626] ved substitusjon av J3-gal-genet med et DNA-fragment som bærer rep- og cap-genene av AAV.

For dette formål blir fragmentet Xbal inneholdende genomet av AAV2 deletert for sitt ITR, isolert fra plasmid p201 (se eksempel 1). Dette fragment blir deretter subklonet på setet Xbal av plasmidet Bluescript. Dette trinn tillater så å isolere fragmentet som bærer rep- og cap<-g>enene av AAV i form av et Notl-Clal-fragment. Dette fragment klones deretter på setene Xbal (anordnet etter det venstre ITR) og Clal (anordnet før PDC av Ad5) av vektoren pAd.RSV.IJGal, noe som resulterer i substitusjon av figal-genet med rep- og cap-genene.

6.2. Konstruksjon av den defektive, rekombinante adenovims Ad.RSV.Rep-Cap.

Plasmidet pAd.RSV.Rep-Cap og adenovimset Ad.dll324, Iinearisert med enzymet Clal, ko-transfekteres i linje 293 i nærvær av kalsiumfosfat for derved å tillate homolog rekombinering. De rekombinante adenoviruser som dannes på denne måte seleksjoneres ved rensing på plaque. Etter isolering blir de rekombinante adenovirusets DNA forsterket i cellelinjen 293.

De virale partikler blir generelt renset ved sentrifugering i en cesiuklorid-graduent i henhold til kjente teknikker (se særlig Graham et al., "Virology" 52 (1973) 456). Adenovimset Ad.RSV.Rep-Cap kan bevares ved -80°C i 20 % glycerol.

Den samme strategi kan gjentas ved kun å innskyte et av genene rep. eller cap. Videre kan innskytingen realiseres på andre steder i adenovirusets genom.

Claims (16)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av rekombiant human AAV virus,karakterisert vedat den omfatter transfektering av en cellelinje med et ikke-humant, animalsk hjelpevirus.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat produksjonen gjennomføres i en animalsk cellelinje som er infektert med et ikke-humant, animalsk hjelpevirus.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2,karakterisertv e d at det ikke-humane, animalske hjelpevirus er et virus av kanin-, bovin-, murin-, ovin-, porcin-, aviar- eller simienne-opprinnelse.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert vedat hjelpevimset er valgt blant adenoviruser, herpesviruser og vaksineviruser.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisert vedat det animalske hjelpevims er et adenovims.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat det animalske hjelpevims er et kanin adenovims.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 6,karakterisert vedat det animalske hjelpevims velges blant stammene CAV-1 og CAV-2.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 6 eller 7,karakterisertv e d at produksjonen gjennomføres i en kanin-cellelinje.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8,karakterisert vedat cellelinjen er linjen MDCK eller GHK eller er avledet derav.

10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av de foregående krav,karakterisert vedat cellelinjen videre har enkapsideringsfunksjonene til AAV.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 10,karakterisert vedat enkapsideringsfunksjonene til AAV består av genene rep og cap_ av AAV eller funksjonelle homologer derav, eventuelt plassert under kontroll av reguleringselementer for den heterologe transkripsjon.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 10 eller 11,karakterisertved at enkapsideringsfunksjonene til AAV tilveiebringes av et enkapsideringsplasmid og/eller av den animalske hjelpevirus og/eller er integrert i genomet til cellelinjen.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat rep-genet av AAV eller en funksjonell homolog derav, er integrert i genomet til linjen og genet cap_ av AAV, eller en funksjonell homolog derav, bæres av den animalske hjelpevirus.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat genene rep. og cap_ av AAV eller funksjonelle homologe gener, er integrert i genomet til cellelinjen.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 12,karakterisert vedat genene rep. og cap_ av AAV eller funksjonelle homologe gener bæres av hjelpevimset.

16. Anvendelse av et animalsk hjelpervirus som ikke kan propagere i humanceller, for fremstilling av rekombinant AAV.