JPH10508491A

JPH10508491A - 新規なアデノウイルスベクター、パッケージング細胞系、組換えアデノウイルスおよび方法

Info

Publication number: JPH10508491A
Application number: JP8515542A
Authority: JP
Inventors: ワン，クィン; フィナー，ミッチェル，エイチ．; ジア，ジャオ−チ
Original assignee: セルジェネシス，インコーポレーテッド
Priority date: 1994-11-03
Filing date: 1995-11-03
Publication date: 1998-08-25
Anticipated expiration: 2015-11-03
Also published as: AU4109296A; DE69534878T2; WO1996014061A1; AU756629B2; JP4167725B2; JP2008200043A; AU6557199A; CA2204357C; EP0797436A1; EP0797436A4; ATE320271T1; DE69534878D1; US5872005A; CA2204357A1; EP0797436B1; KR970706806A

Abstract

(57)【要約】本発明は、通常はアデノウイルス初期タンパク質に転写する少なくとも２つの初期領域遺伝子（Ｅ１およびＥ４）の致死的欠失を有する点に特徴がある新規な複製欠損性アデノウイルスベクターに関する。これらの新規な組換えベクターは特にヒト遺伝子治療に用いられ、その際、該ベクターはＥ１またはＥ４領域と置き換わるトランスジーンまたは治療用遺伝子をさらに含有する。本発明はさらに、少なくともアデノウイルスＥ１およびＥ４遺伝子領域により形質転換され、前記の新規な複製欠損性アデノウイルスベクターを増殖させるように働く新規なパッケージング細胞系に関する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なアデノウイルスベクター、パッケージング細胞系、組換えアデノウイルスおよび方法発明の分野本発明は、ヒト遺伝子治療のための新規な複製欠損性アデノウイルスベクター、新規なパッケージング細胞系および組換えアデノウイルスに関する。特に、新規なパッケージング細胞系は、ヒトアデノウイルスの初期遺伝子領域Ｅ１、Ｅ４および場合によりＥ３の欠失のための相補機能を有する。発明の背景遺伝子移入ビヒクルとしての複製欠損性レトロウイルスベクターは、ヒト遺伝子治療のための基礎を提供する。レトロウイルスベクターは、ベクターでの感染を受けた細胞中でいかなるウイルスタンパク質も作られず、かつ更なるウイルス拡散が全く起こらないような形で、全てのウイルス遺伝子を除去するかまたは変性させることによって工学処理される。レトロウイルスベクターの伝播に必要とされるパッケージング細胞系の開発は、ヒト遺伝子治療の現実に向かっての最も重要なステップであった。遺伝子治療のためのレトロウイルスベクターの主要な利点は、高い遺伝子移入効率および細胞ゲノミックＤＮＡ内への移入された遺伝子の精確な組込みにある。しかしながら、主たる欠点も同様にレトロウイルスベクターに付随して存在する。すなわち、非分裂細胞を形質導入する能力がレトロウイルスベクターにないこと、そして潜在的に挿入による変異誘発の可能性があること、である。ヒトアデノウイルスは、生ウイルスワクチンとして開発されてきたものであり、ヒト遺伝子治療のためのin vivo遺伝子送達ビヒクルに対するもう１つの代替物を提供する[Graham & Prevec，「免疫学的問題に対する新たなアプローチ」El lis(編)，Butterworth-Heinemann，Boston，MA，p363〜390(1992)Rosenfoldら， Science 252; 431-434(1991)，Rosenfeldら，Cell 68; 143-155(1992)，およびR agotら，Nature 361; 647-650(1993)]。組換えアデノウイルスを潜在的に強力な遺伝子送達ベクターにしている特長は、広範に再検討された[Berkner，Biotechn iques 6; 616-629(1988)およびKozarsky & Wilson，Curr．Opin．Genet．De v．3; 499-503(1993)]。簡単に言うと、組換えアデノウイルスを大量に成長させ精製することができ、このアデノウイルスは、in vivoで広範な分裂および非分裂哺乳動物細胞を効率よく感染させることができる。その上、アデノウイルスゲノムは比較的容易に操作でき、かなり大きいＤＮＡ挿入に対処することができる。現在利用可能な組換えアデノウイルスベクターの第１世代は、大部分の用途についてトランスジーンによって置換されるウイルス初期遺伝子領域１（本明細書中で遺伝子地図ユニット１．３０〜９．２４からのＥ１ａおよびＥ１ｂ領域を含む、Ｅ１と呼ぶ領域）における欠失を有している。トランスジーンというのは、ウイルスベクターによって運ばれ、宿主細胞中に形質導入される異種または外来性（外因性）の遺伝子である。ウイルスＥ１領域の欠失は、組換えアデノウイルスを複製にとって欠損があり、しかもその後感染された標的細胞の中で感染性ウイルス粒子を産生することのできないものにする[Berkner，Biotechniques 6; 6 16-629(1988)]。Ｅ１欠失アデノウイルスを生成する能力は、２９３と呼ばれるヒト胎芽腎臓パッケージング細胞系の利用可能性に基づいている。この細胞系は、Ｅ１欠失ウイルス内で欠如しているＥ１領域遺伝子産物を提供するアデノウイルスのＥ１領域を含有する［Grahamら，J．Gen Virol，36; 59-72;(1977)]。しかしながら、現在の第１世代の組換えアデノウイルスの固有の欠点は、患者の体内で場合によって利用することに関して増々注目を集めてきている。最近のいくつかの研究は、Ｅ１欠失アデノウイルスが完全に複製不能でないことを示した［ Rich，Hum．Gene．Ther．4; 461-476(1993)およびEngelhardtら，Nature Genet ，4; 27-34(1993)］。一般的な３つの制約条件は、アデノウイルスベクターテクノロジーに付随するものである。まず第１に、高い感染多重度（m.o.iと略する）でのアデノウイルスベクターによるin vivoおよびin vitroの両方の感染の結果、それ自体哺乳動物細胞に対する障害性をもつペントンタンパク質の蓄積による標的細胞に対する細胞障害性がもたらされた［(Kay，Cell Biochem．17E; 207 (1993)］。第２に、ペンタンタンパク質を含むアデノウイルス晩期遺伝子産物に対する宿主免疫応答が、ベクターを受入れた感染組織の炎症性応答および破壊をひき起こす[Yangら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA91; 4407-4411(1994)]。最後に、宿主免疫応答および細胞障害性効果が一緒になってトランスジーンの長期発現を妨げ、その後アデノウイルスベクターを投与した後の遺伝子発現レベルの低下をひきおこす［Mittalら，Virus Res．28; 67-90(1993)］。これらの障害を考えると、晩期ウイルス遺伝子タンパク質を発現するウイルスの能力、宿主細胞障害性応答の低下および宿主免疫応答の低下の見込みを弱めるためには、更にアデノウイルスベクターの設計における変更が必要とされる。En gelhardtらは、最近、in vitroでの非許容的温度で晩期遺伝子産物を発現することのできないＥ１欠失組換えアデノウイルスベクターのＥ２ＡコードされたＤＮＡ結合性タンパク質（ＤＢＰ）領域内で温度感応性（ｔｓ）変異を構築した。[E ngelhardtら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA91; 6196-6200(1994)]。このベクターによる感染を受けた動物の肝臓において、炎症性応答の減少およびトランスジーン発現の延長が報告された（Engelhartら，1994）。しかしながら、ｔｓＤＢＰ変異は、in vivoで完全不活性遺伝子産物を生じさせることができず、したがって、晩期遺伝子発現を完全に遮断することができない。in vivoで完全に晩期遺伝子発現を遮断するためにアデノウイルスＥ１欠失ベクターの中に第２の致死欠失を導入するような更なる技術的進歩が必要とされる。Ｅ１およびＥ４遺伝子領域の欠失により複製欠損性にされた第２（および第３）世代の組換えアデノウイルスの産生に対処できる新規なパッケージング細胞系は、ヒト遺伝子治療のための安全かつ効率のよいベクターの開発に向けての最も有望なものである。本発明はこのようなパッケージング細胞系および結果として得られる変異型ウイルスおよび問題のトランスジーンを担持する組換えウイルスベクター（例えばアデノウイルスベクターまたはＡＡＶ誘導ベクター）を提供する。発明の概要したがって、本発明は一般に、少なくとも２つの初期領域ＤＮＡ配列が欠失し、体細胞に対して外来性の治療的トランスジーンを送達することのできる第２および第３世代のウイルスベクターを提供することによって、現在利用可能な第１世代のアデノウイルスベクターを使用する上で見られる問題点を軽減するための改良されたアデノウイルスベクター系を提供することを目的とする。特に本発明は、少なくとも２つの致死的欠失、すなわちＥ１およびＥ４初期領域遺伝子を宿した第２および第３世代の組換えアデノウイルスベクター（アデノウイルス）を提供する。場合によってはこのベクターは、Ｅ３初期遺伝子領域が欠失していてもよい。より特定的には、この組換えウイルスベクターは、Ｅ１またはＥ４のいずれかの領域内に導入されたトランスジーン、例えばβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を担持する。更に特定的な１つの実施態様においては、組換えアデノウイルスは、Ｅ１またはＥ４領域（または場合によりＥ３領域）に置き換わる治療用遺伝子を含有していてよく、この治療用遺伝子は、標的宿主細胞の中で発現および／または転写される。本発明のもう１つの目的は、Ｅ１、Ｅ４および場合によりＥ３領域が欠失している欠損性アデノウイルスのＥ１、Ｅ４そして場合によりＥ３の遺伝子領域の機能を相補し、かくして、Ｅ１、Ｅ４そして場合によりＥ３のＤＮＡ領域が欠損した上述の第２世代の組換えアデノウイルスベクターの産生を可能にする新規なパッケージング細胞系を提供することにある。ヒト胎芽腎細胞から誘導される好ましいパッケージング細胞系（２９３細胞系）は、そのゲノム内に組込まれたアデノウイルスＥ１およびＥ４遺伝子領域を含有する。特定の一実施態様においては、パッケージング細胞系は、本明細書中で２９３−Ｅ４として同定されており、ブダペスト条約に基づきAmerican Type Culture Collection(ATCC)，12301 Park lawn Drive，Rockville，Marylandに１９９４年８月３０日付けで寄託され、そこでATCC＃CRL11711という呼称を受けている。本発明のもう１つの目的は、Ｅ１、Ｅ４および場合によりＥ３の領域が欠失した欠損性アデノウイルスのＥ１、Ｅ４および場合によりＥ３の遺伝子領域の機能を相補し、かくしてＥ１、Ｅ４および場合によりＥ３のＤＮＡ領域が欠損した上述の第２世代の組換えアデノウイルスベクターの産生を可能にする新規なパッケージング細胞系を提供することにある。ヒト胎芽腎細胞から誘導された好ましいパッケージング細胞系（２９３細胞系）は、２９３細胞ゲノム内に組込まれたＡｄ５Ｅ４遺伝子の最小必須ＯＲＦ６領域およびアデノウイルスＥ１を含有する。特定の実施態様においては、パッケージング細胞系は本明細書で２９３−ＯＲＦ６として同定され、ブダペスト条約に基づいてAmerican Type Culture Collec tion(ATCC)，12301 Parklawn Drive，Rockville，Marylandに１９９５年１０月２５日付けで寄託され、そこでATCC# という呼称を受けている。本発明のもう１つの目的は、Ｅ１、Ｅ２Ａおよび場合によりＥ３領域が欠失している欠損性アデノウイルスのＥ１、Ｅ２Ａそして場合によりＥ３の遺伝子領域の機能を相補し、かくして、Ｅ１、Ｅ２Ａそして場合によりＥ３のＤＮＡ領域が欠損した上述の第２世代の組換えアデノウイルスベクターの産生を可能にする新規なパッケージング細胞系を提供することにある。ヒト胎芽腎細胞から誘導された好ましいパッケージング細胞系（２９３細胞系）は、２９３細胞ゲノム内に組込まれたアデノウイルスＥ１およびＥ２Ａ遺伝子領域を含有する。本発明のもう１つの目的は、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４および場合によりＥ３領域が欠失している欠損性アデノウイルスのＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４そして場合によりＥ３の遺伝子領域の機能を相補し、かくして、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４そして場合によりＥ３のＤＮＡ領域が欠損した上述の第２および第３世代の組換えアデノウイルスベクターの産生を可能にする新規なパッケージング細胞系を提供することにある。ヒト胎芽腎細胞から誘導される好ましいパッケージング細胞系（２９３細胞系）は、２９３細胞ゲノム内に組込まれたアデノウイルスＥ１、Ｅ２ＡおよびＥ４遺伝子領域を含有する。本発明のもう１つの目的は、２９３細胞内にＥ４領域を導入するのに使用されるプラスミドを提供することにある。この細菌プラスミドは、Ｅ４プロモーターが欠如ししかもα−インヒビン、β−インヒビン、α−ゴナドトロフィン、シトクロムＣ、シトクロムＣオキシダーゼ複合体（サブユニットIV）およびグルカゴンといったようなＣＲＥ結合性タンパク質によって調節される細胞誘導ホルモン遺伝子で置換されたアデノウイルスＥ４領域を含んで成る。Ｅ４遺伝子領域は、上述のプラスミド内でＣＲＥＢプロモーターに機能しうる状態で連結されている。特定の一実施態様においては、プラスミドは、上述のアデノウイルス、およびｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−Ｅ４として同定されブダペスト条約に基づいて１９９４年８月３０付けでATCCに寄託され、そこでATCC#75879という呼称を受けたマウスアルファ（α）−インヒビンプロモーターを含んで成る。本発明の更にもう１つの目的は、２９３細胞内に最小必須Ｅ４遺伝子領域、つまりオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ６）領域を導入するプラスミドを提供することにある。細菌プラスミドは、Ｅ４プロモーターが欠如し、しかもα− インヒビン、β−インヒビン、α−ゴナドトロフィン、シトクロムＣ、シトクロムＣオキシダーゼ複合体（サブユニットIV）またはグルコカゴンといったようなＣＲＥ結合性タンパク質によって調節される細胞誘導ホルモン遺伝子プロモーターで置換されたＥ４遺伝子領域のアデノウイルスＯＲＦ６断片を含んで成る。ＯＲＦ遺伝子断片は、上述のプラスミド内のＣＲＥＢプロモーターに機能しうる状態で連結されている。特定の実施態様においては、プラスミドは、アデノウイルスＯＲＦ６断片および、ｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−ＯＲＦ６として同定され、ブダペスト条約に基づき１９９５年１０月２５日付けでATCCに寄託され、そこで ATCC#.. という呼称を受けたマウスα−インヒビンプロモーターを含んで成る。本発明の更にもう１つの目的は、２９３細胞内にアデノウイルスＤＮＡ結合性タンパク質（ＤＢＰ）をコードするアデノウイルス５Ｅ２Ａ遺伝子を導入するプラスミドを提供することにある。細菌プラスミドは、Ｅ２Ａプロモーターが欠如し、しかもα−インヒビン、β−インヒビン、α−ゴナドトロフィン、シトクロムＣ、シトクロムＣオキシダーゼ複合体（サブユニットIV）またはグルカゴンといったようなＣＲＥ結合性タンパク質によって調節される細胞誘導ホルモン遺伝子プロモーターで置換されたアデノウイルスＥ２Ａ遺伝子領域を含んで成る。Ｅ２Ａ遺伝子断片は、上述のプラスミド内のＣＲＥＢプロモーターに機能しうる状態で連結されている。特定の実施態様においては、プラスミドは、アデノウイルスＥ２Ａ遺伝子および、ｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−Ｅ２Ａとして同定され、ブダペスト条約に基づき１９９５年１０月２５日付けでＡＴＣＣに寄託されそこで ATCC#.. という呼称を受けたマウスα−インヒビンプロモーターを含んで成る。本発明の更にもう１つの目的は、in vivoおよびex vivo遺伝子治療のためのトランスジーンを担持する、上記で同定された第２または第３世代の組換え型ウイルスベクターで哺乳動物標的細胞を感染させる方法を提供することにある。図面の簡単な説明図１は、以下の実施例１に記述した通りのｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−Ｅ４プラスミドの構築を示す。図２は、以下の実施例１に記述した通りのＡＤＶ−β−ｇａｌプラスミドの構築を示す。図３（Ａ）−（Ｅ）は、以下の実施例３で記述される通りの２９３−Ｅ４細胞系の例示およびサザン分析である。（Ａ）導入されたＭＩＰ（α）−Ｅ４の制限パターンおよびサザンブロットで使用されるプローブがこの例示において示されている。実線の矢印は、マウスα−インヒビンプロモーター領域を表わす。白抜きのバーはＥ４領域の全長を表わす。マウスインヒビンプローブは、実施例１で記述されている２８３bpのＰＣＲ産物である。Ｅ４プローブはSmaIH断片（m.u. ９２〜９８．４）である。制限酵素部位は、以下のように略記される：ＨはHind IIIを示し；ＳはSfiIを示し；ＮはNcoIを示す。（Ｂ）ＤＮＡはHindIIIおよびSf iIで消化され、Ｅ４プローブにハイブリッド形成された。（Ｃ）ＤＮＡはNcoIで消化され、Ｅ４プローブにハイブリッド形成された。（Ｄ）Ｅ４プローブは、Hi ndIIIおよびSfiI消化ブロットから剥ぎ取られ、ＤＮＡはインヒビンプロモータープローブで再度プローブ探査された。（Ｅ）インヒビンプローブはHindIIIおよびSfiI消化ブロットから洗い流され、ＤＮＡは、m.u.７．７〜m.u.１７．１の HindIII Ｅ断片であるＥ１プローブで再度プローブ探査された。図４Ａ−Ｊは、以下の実施例１０で記述される通り、ｃＡＭＰの存在下または不在下でのＷ１６２、２９３および２９３−Ｅ４細胞系に対するH5d11014の細胞変性効果を示す写真である。親２９３細胞はパネルＡ−Ｄ内に表わされている；２９３−Ｅ４細胞はパネルＥ−Ｇに表わされ、Ｗ１６２細胞はパネルＨ−Ｊ内に表わされている。感染していない細胞はパネルＡ、ＥおよびＨの中に示されている。ｃＡＭＰの添加なしでH5d11014の感染を受けた細胞は、パネルＣ、ＦおよびＩに示され、１mMのｃＡＭＰ添加を伴うH5d11014の感染を受けた細胞は、パネルＤ、ＧおよびＪに示されている。パネルＢは、擬似感染および１mMのｃＡＭＰ添加を伴う２９３細胞を表わす。図５は、以下の実施例５で記述する通りの組換えウイルスＡｄ５／△Ｅ１（β −ｇａｌ）△Ｅ４およびＡｄ５／△Ｅａ（β−ｇａｌ）△Ｅ３の構築および構造を表わしている。図６は、以下の実施例５で記述する通りの組換えウイルスの制限酵素分析を例示する。図７は、組換えアデノウイルスベクターでの感染を受けたＨｅｌａ細胞内の転写産物のノーザン分析を表わす。全ＲＮＡは、感染後４、２４および４８時間で分離された。パネルＡは、32Ｐで標識付けされたβ−ｇａｌＤＮＡプローブに対するハイブリッド形成によって同定された転写産物である。パネルＢは、Ａｄ５Ｅ４プローブでハイブリッド形成された転写産物である。パネルＣは、Ａｄ５Ｌ３領域ＤＮＡプローブに対しハイブリッド形成させることによって検出された転写産物である。パネルＤは、放射性標識付けされたＬ５領域ＰＣＲ産物でプローブ探査された転写産物である。図８は、以下の実施例１５で記述された通りのＲＴ−ＰＣＲ産物の臭化エチジウムで染色されたアガロースゲルを表わす。図９は、Ｌ３逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）産物のサザンブロット分析を表わす。＋ＲＴ反応混合物からのＲＴ産物をアガロースゲルにかけ、ナイロン膜に移し、次にＬ３ＲＴ−ＰＣＲ産物の内部配列に対しハイブリッド形成する、末端標識付けされたオリゴマーでプローブ探査した。図１０は、以下の実施例１８に記述された通りのＯＲＦ−６Ｅ４プラスミドの構築を例示する。図１１（Ａ）は、ｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−ＯＲＦ６プラスミドの概略的制限パターンである。プラスミドｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−ＯＲＦ６は、マウス αインヒビンプロモーターの制御下にあるウイルスゲノムの右端から１８７６〜２７５６のヌクレオチド配列からのアデノウイルス５Ｅ４−ＯＲＦ６コーディング配列の９１０bpのＰＣＲ産物を含有している。白抜き矢印は、マウスαインヒビンプロモーター領域を表わす。斜線入りのバーはＯＲＦ６コーディング領域を表わす。ＯＲＦ６プローブはＰＣＲ産物である。制限酵素部位は次のように略記される；ＨはHindIIIであり；ＸはXmnIである。図１１（Ｂ）は、ＯＲＦ６プローブで探査された２９３−ＯＲＦ６細胞系のサザンブロットを表わす（下の写真）。同じブロットは、m.u.７．７〜m.u.１７．１のHindIIIE断片であるＥ１プローブ（上の写真）で再度ハイブリッド形成された。図１２は、ｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−Ｅ２Ａプラスミドの構築を例示している。図１３は、ウイルス関連ＲＮＡ遺伝子領域を転写するＤＮＡ配列を含むプラスミドの構築を示している。発明の詳細な説明現行の初期領域欠失アデノウイルスベクターに付随する問題を避けるように設計された１つの戦略は、アデノウイルスベクター内に第２の必須遺伝子領域欠失を導入することにある。それぞれＥ１、Ｅ２ＡまたはＥ４の突然変異体ウイルスの増殖を支持する複数のアデノウイルス初期遺伝子領域で形質転換された細胞系が立証されてきた[Grahanら，J．Gen Virol．36; 59-72(1977)，Weinburgら，Pr oc．Natl．Acad．Sci．USA80; 5383-5386(1983)およびBroughら，Virology 190; 624-634(1992)]。しかしながら、いかなる細胞系も、２つの遺伝子領域の機能を同時にかつ許容的温度で提供することはない。トランスでの第２の必須遺伝子領域機能（例えばＥ４）およびＥ１を相補する能力、およびこのような２重（またはできれば３重または４重）の欠失を含有する組換えウイルスベクターの伝播のためのパッケージング細胞系として機能する能力を有するこのような細胞系を樹立することにより、現在利用可能な第１世代のアデノウイルスベクターの欠点を削除することができる。アデノウイルス初期領域（ＥＲ）遺伝子機能の研究により、Ｅ４領域の欠失の結果、ウイルス後期転写産物を蓄積することができなくなり、ウイルス後期タンパク質合成の低減がもたらされ、ウイルス粒子組立ての欠陥がみられ、後期感染段階において宿主タンパク質合成を阻害することができなくなる、ということがわかった[Sandlerら，J．Virol．63; 624-630(1989)，Bridge & Kether，Virolo gy 174; 345-353(1990)，Rose & Ziff，J．Virol，66; 3110-3117(1992)，Bridg eら，Virology 193; 794-801(1993)およびBettら，J．Virol，67; 5911-5921(19 93)]。したがって、組換え型アデノウイルスベクターからのＥ１およびＥ４遺伝子領域の２重の除去により、標的細胞に対する直接的細胞障害性の病原性効果およびヒトの体内における炎症性応答を劇的に最小限におさえるかまたは除去することができる。第２世代の組換え型アデノウイルスベクター内のＥ４欠失は、１０kbという大きいヒト遺伝子インサートを収容するこのベクター系の容量を増大させるという付加的な利点を提供することになる。本発明の一つの局面においては、Ｅ１およびＥ４欠損性アデノウイルス内のＥ１およびＥ４の両方の欠失の成長を支持する新規なパッケージング細胞系の樹立の成功が立証された。Ｅ１ｂ遺伝子産物（４９６Ｒタンパク質）と結びつけられた状態におけるＥ４遺伝子産物［オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）６の２９４Ｒタンパク質］の１つは細胞ｍＲＮＡ輸送を阻害する機能を持ち、その結果、細胞タンパク質合成が停止するため(Bridge & Ketner，1990)、Ｅ４遺伝子領域の過剰発現は究極的に細胞の死枯を結果としてもたらすものと予想される。２９３細胞内へのＥ４遺伝子領域の導入に対する主要な障害、すなわち、そうでなければ細胞の死枯を結果としてもたらしたと思われるＥ４遺伝子の過剰発現をひき起こす親２９３細胞内のＥ１ａ遺伝子産物のトランス活性化が克服されてきた。本発明においては、Ｅ４プロモーターを、細胞誘導ホルモン遺伝子プロモーター、すなわちＣＲＥ結合性タンパク質（ＣＲＥＢ）と呼ばれる核因子により調節される遺伝子で置換する。特に、Ｅ４プロモーターに置き換わるプロモーターは、KimらのJ．Biol．Chem.，268; 15689-15695(1993)の中の１５６９５頁にある表Ｉにリストアップされたα−インヒビン、ベータ(β）−インヒビン、α− ゴナドトロピン、シトクロムＣ、シトクロムＣオキシダーゼ複合体（サブユニットIV）、グルカゴンなどといったＣＲＥＢで調節された遺伝子ファミリーの中から選ばれる。好ましい実施態様においては、ＣＲＥＢで調節された遺伝子プロモーターは、哺乳動物α−インヒビン、最も好ましくはマウスα−インヒビンである。この場合、マウスインヒビンプロモーター領域の１６５塩基対配列が、低い塩基性レベルで異種遺伝子発現を駆動し、ｃＡＭＰまたはアデニルシクラーゼ活性化体の誘導に応答して異種遺伝子発現のレベルを増大させることが示された[S u & Hsueg，Biochem．and Biophys．Res．Common，186，293-300(1992)]。ｃＡＭＰ応答要素（ＣＲＥ）と呼ばれる８bpのパリンドローム配列がこの誘導効果を担当しており、インヒビンプロモーター領域内で同定された。実際には、全てのアデノウイルス初期遺伝子プロモーターは、これらの初期遺伝子をｃＡＭＰの誘導に対する応答性をもつものにするＣＲＥ様の要素を含有している［Jonesら， Genes Dev．2; 267-281(1988)]。Ｅ１ａトランス活性化およびｃＡＭＰ増強が、独立したメカニズムを介してアデノウイルス初期遺伝子に対し作用を及ぼすことは明白である[Leza & Hearing，J．Virol．63; 3057-3064(1989)およびLeeら，M ol．Cell．Biol．9; 4390-4397(1989)]。マウスα−インヒビンプロモーターでのＥ４プロモーターの置換は、Ｅ４遺伝子上のｃＡＭＰ誘導からＥ１ａトランス活性化を切り離す。本発明においては、２９３細胞内にＥ４領域の全長配列が導入され、かくしてｃＡＭＰの誘導は形質転換された細胞内での制御された形でのＥ４遺伝子発現においてなお有効である。同様に、この新規な２９３−Ｅ４パッケージング細胞系は、Ｅ３領域の欠失がウイルスの生存可能性に影響を及ぼさないことから、Ｅ１およびＥ４欠失に加えてＥ３の欠失を含有するアデノウイルスを救済することもできる（その増殖を支持する）、ということにも留意すべきである。本発明によると、Finerら，1994およびFinerらWO94/29438の中で記述されている標準的クローニング手順および出発物質を用いて、細菌プラスミドが調製される。親プラスミドｐＩＫ６．１ＭＭＳＶ−Ｅ４（△Ｅ４ｐｒｏ）はｐＩＫ６．１．ＭＭＳＶＮｈｅ（FinerらWO94/29438）から誘導され、ＭＭＳＶプロモーターで置き換えられてＥ４プロモーターが存在しないことを除いてアデノウイルスＥ４領域の全長配列を含む。当該技術分野において周知のものであるクローニング技術を用いて、ＭＭＳＶプロモーターは、上述のＣＲＥＢで調節されたプロモーターの１つと置換される。好ましい実施態様においては、アデノウイルスのプロモーターなしのＥ４遺伝子領域に機能しうる状態で連結されたプロモーターは、最も好ましくはマウスから誘導されたものである哺乳動物のアルファインヒビンである。結果として得られる好ましいプラスミドは、ｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α） −Ｅ４と呼称され、ブダベスト条約の条項に基づいてATCC，Rockville，MDにATC C#75879として寄託されている。ＣＲＥＢで調節され、アデノウイルスＥ４遺伝子断片、ＯＲＦ６またはアデノウイルスＥ２Ａ遺伝子に対して機能しうる状態で連結されたプロモーターを含むプラスミドは、出発物質として上述のｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−Ｅ４プラスミドを用いて構築された。プロモーターなしのＥ４領域は、α−インヒビンプロモーターに機能しうる状態で連結されるｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−ＯＲＦ６およびｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−Ｅ２Ａプラスミドを構築するべく、Ｅ４遺伝子またはＥ２Ａ遺伝子領域のＯＲＦ６断片のＰＣＲ産物と置換した。それぞれATCC# およびATCC# をもつマウス（α）−インヒビンに機能しうる状態で連結された上述のＯＲＦ６およびＥ２Ａのプラスミドの特徴的特性をもつプラスミドが、ATCC，Rockville，MDに寄託された。本発明によると、インヒビンプロモーターの置換においてＣＲＥＢで調節されたプロモーターのいずれかを使用し、プラスミドが以下で記述するパッケージング細胞系内にトランスフェクションされた時点で類似の結果を達成することができる。新規な２９３−Ｅ４パッケージング細胞系はＥ４領域により安定した形で形質転換され、親２９３細胞と同じ形態および増殖速度を示した。このことはすなわち、マウスα−インヒビンプロモーターの制御下での低レベルのＥ４遺伝子発現が宿主細胞タンパク質合成の広範な阻害をひき起こさないということを表わす。変異型アデノウイルス、H5d11014（Bridgeら，Virology 193; 794-801(1993)]は、Ｅ４領域内に致死欠失を担持し、Ｗ１６２細胞内でのみ増殖しうることから、上述の２９３−Ｅ４パッケージング細胞系の相補的活性を検査するために用いられた(Bridge & Ketner，1989)。Ｗ１６２細胞系は、アデノウイルスＥ４ＤＮＡによって形質転換されたベロ（サルの腎臓）細胞系であり、Ｅ４欠失アデノウイルスの増殖を相補する。H5d11014ウイルスは、著しく減少したレベルのＤＮＡを産生することが示されており、そのほとんど欠失したＥ４領域内で無傷のＯＲＦ４に起因して後期タンパク質を合成することができなかった[Bridgeら，(1993)] 。Ｗ１６２細胞内で産生されたものに匹敵する力価でH5d11014ウイルスを産生した細胞系が発見された（以下の実施例１１中の表IV、１群および２群を参照のこと）。もう１つの実施態様においては、本発明は、本発明の新規なパッケージング細胞系によって産生される新規な組換えアデノウイルスまたは変異型アデノウイルスに関する。本明細書に記述されている「組換えアデノウイルス」または「組換えアデノ随伴ウイルス」（当該技術分野では組換えウイルスベクターとしても知られている）というのは、ゲノムが単数または複数のヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換を含むウイルスのことを指し、このウイルスは更にトランスジーンを担持している。本明細書では「変異型ウイルス」というのは、ゲノムが単数または複数のヌクレオチドの欠失、挿入および／または置換を含む、例えばアデノウイルスおよびＡＡＶといった特定のウイルスのことを言うが、変異型ウイルスにはいかなるトランスジーンも担持されていない。この実施の１つの特定の局面においては、上述の新規２９３−Ｅ４パッケージング細胞系は、Ａｄ５／ △Ｅ１（β−ｇａｌ）△Ｅ４と呼ばれる組換えウイルスの第２世代を生成するのに用いられる。２９３−Ｅ４パッケージング細胞系は、アデノウイルス血清型５Ｅ１およびＥ４遺伝子領域を内含しているが、アデノウイルス血清型の間での高レベルの構造的および機能的相同性のため、例えば血清型２、７および１２といったその他の血清型の変異型および組換えアデノウイルスも救済することが可能である。更に、血清型５以外の血清型からの変異型および組換えアデノウイルスを、以下に記述する本発明のその他のアデノウイルスパッケージング細胞系から救済することができる。 In vitro研究は、非許容的ヒト細胞内での本発明の新規な組換えアデノウイルスベクターの感染がいかなる細胞変性効果も示さず、トランスジーン発現の効率は従来のＥ１欠失ウイルスに匹敵しうるレベルにある、ということを立証している。本発明の新規な第２世代組換えアデノウイルスの感染を受けた部位での宿主免疫応答および炎症反応は、現在利用可能な第１世代の組換えアデノウイルスに比べて低減するものと予想されている。本発明の２重相補性パッケージング細胞系の樹立は、より安全でかつより効果的な遺伝子移入アデノウイルスベクターの進化において有意義な画期的出来事である。本発明の２９３−Ｅ４細胞系の構築において用いられる方法は、本発明のアデノウイルスベクターの更なる欠失を相補する付加的なアデノウイルス領域を含むその他のパッケージング細胞系の産生およびその他のウイルスベクターの構築において一般に有用なものである。かくして、もう１つの実施態様においては、本発明は、上述の方法によりＥ１、Ｅ４および場合によりＥ３に加えて欠失を救済することのできる新規なアデノウイルスパッケージング細胞系に関する。この例においては、Ｅ１、Ｅ３およびＥ４の欠失に加えてＥ２Ａ変異または欠失を救済することのできるアデノウイルスベクターパッケージング細胞系が、上述の新規なパッケージング細胞系、すなわち２９３−Ｅ４パッケージング細胞系から出発して構築された。Ｅ２Ａ遺伝子産物は、調節タンパク質、具体的にはＤＮＡ結合性タンパク質である。この遺伝子は、上述のような類似の仕方でＥ２Ａ遺伝子に対し機能しうる状態で連結された誘導プロモーターの制御下にＥ２Ａ遺伝子を置くことによって、２９３−Ｅ４パッケージング細胞系内に導入され得る。誘導プロモーターは、Ｅ２遺伝子プロモーターを置換するのに使用される上述のＣＲＥＢ調節された遺伝子と同じファミリーから選択することができる。更にもう１つの実施態様においては、本発明は、最小必須シス要素（逆転した末端反復（ＩＴＲｓ）およびパッケージングシグナル配列）［Heringら，Virol. 61; 2555-2558(1987)］およびタンパク質9.配列［Ghosh-Chouduryら，EMBO J． 6; 1733-1739(1987)］のみを含むアデノウイルス組換えウイルスを救済することのできるアデノウイルスベクターパッケージング細部系に関する。この細胞系は、m.u.１１．２前後から約９９までのアデノウイルスＤＮＡ配列を上述の新規２９３−Ｅ４細胞系内に導入することによって樹立することができる。上述のアデノウイルスＤＮＡ配列を担持するプラスミドを構築し、２９３細胞内にトランスフェクションすることができる。このＤＮＡ配列は、Ｅ１ｂ遺伝子の後からウイルス構造遺伝子の３´末端までの配列を表わす[Sanbrookら，Cold Spring Harbo r Symp．Quant．Biol．39; 615-632(1974); Ziff & Evans，Cell 15; 1463-1476 (1978)]。導入されたアデノウイルス配列はウイルス構造遺伝子および、Ｅ１ａおよびＥ１ｂを除くほぼ全ての機能的遺伝子領域を含む。ウイルス遺伝子産物の構成的発現または過剰発現は細胞にとって非常に障害性があることから、異種プロモーターとアデノウイルス未変性プロモーターを置換させるべく、導入されたアデノウイルスＤＮＡを操作することができる。例えば、ウイルス調節タンパク質をコードする初期遺伝子領域を、約２〜１０倍の誘導効率をもつＣＲＥＢ調節されたプロモーターの制御下に置くことができる。ウイルス構造タンパク質をコードする遺伝子領域の場合、未変性主要後期プロモーターを、テトラサイクリンの存在下で最高約１０⁵倍の誘導レベルをもつテトラサイクリン応答性プロモーターといったような密に制御された外因性プロモーターにより置換させることができる［Manfred & Hermann，PNAS89; 5547-5551(1992)］。もう１つの実施態様においては、本発明は、以下の仕方で調製された新規のアデノウイルス随伴（ＡＡＶ）パッケージング細胞系に関する。新規な相補性細胞系は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２Ａ、およびＥ４遺伝子領域およびウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含む。この細胞系は、ウイルス関連ＲＮＡをコードするアデノウイルスＤＮＡ配列（m.u.２８〜３０からの６００NTs前後）［Mathe ws，Cell 6; 223-229(1975)およびPetterson & Philipson，Cell 6; 1-4(1975) ］を、Ｅ１およびＥ４欠失、アデノウイルスのＥ２Ａ変異、並びに場合によりＥ３を救済する上述の通り構築した新規の２９３−Ｅ４パッケージング細胞系の中へ導入することによって構築できる。このパッケージング細胞系から産生される野生型ＡＡＶは、ヘルパーアデノウイルスを伴っていない。組換えアデノ随伴ウイルスまたは変異型ＡＡＶは最小必須シス要素を含んでいるにすぎず、パッケージングについては欠損性であるものの野生型ＡＡＶ遺伝子産物を供給する非パッケージング相補性ＡＡＶプラスミドを同時トランスフェクションすることによって生成されることになる。[Samulskiら，J．Virol．61; 3096-3101(1987)]。更に、この細胞系から救済された組換えアデノ随伴ウイルスのベクターまたは変異型ＡＡＶは、ヘルパーウイルス、すなわちアデノウイルスを伴わない。もう１つの実施態様においては、本発明は、上述のＡＡＣパッケージング細胞系から出発して構築された、更にもう１つの新規のＡＡＶパッケージング細胞系に関する。このパッケージング細胞系は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ＡおよびＥ４遺伝子領域、ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡそして付加的にＡＡＶウイルス複製（ｒｅｐ）遺伝子領域を内含する。このｒｅｐ遺伝子領域は、ＡＡＶ遺伝子発現のトランス調節およびＡＡＶＤＮＡ複製にとって必須の少なくとも４つの複製（Ｒｅｐ）タンパク質をコードする。［（概要についてはBervis & Bolie nzsky，Adv．Virus Res．32; 243-306(1987)を参照のこと］。これは、Ｐ５プロモーター[（Yangら，J．Virol．68; 4847-4856(1994)]を前述のＣＲＥＢ調節された遺伝子ファミリーから選ばれた誘導プロモーターで置換する仕方で、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４遺伝子領域およびウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列をすでに含んでいる上述のＡＡＶパッケージング系の中にＡＡＶｒｅｐ遺伝子領域を導入することによって構築される。新規ＡＡＶウイルスおよび細胞系から救済されたその組換えウイルスはヘルパーウイルス（アデノウイルス）を伴わず、Ｒｅｐ−である［Muzyczka，Curr．Top．Microbiol，Immunol，158; 97-129(1992)］。もう１つの実施態様においては、本発明は、前の段落で記述したＡＡＶパッケージング細胞系から出発して構築されるもう１つの新規なＡＡＶパッケージング細胞系に関する。このパッケージング細胞系は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２Ａ、Ｅ４遺伝子領域、ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ、ＡＡＶウイルス複製（ｒｅｐ）遺伝子領域、そして付加的にはＡＡＶキャップ遺伝子領域を含む。キャップ遺伝子領域は、キャプシドタンパク質ファミリー、すなわちＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする[Janikら，J．Virol．52; 591-597(1984)]。３つのｍＲＮＡ全ての合成はｐ４０と呼ばれる単一のプロモーターから開始される［Janik ら，(1984)］。この遺伝子領域は、ＣＲＥＢで調節されたプロモーターまたはテトラサイクリン応答プロモーターのいずれかから選択された誘導プロモーターでｐ４０プロモーターを置換することによって上述のＡＡＶパッケージング細胞系内に導入されることになる。新規なＡＡＣウイルスおよび細胞系から救済されたその組換えウイルスはヘルパーウイルス（アデノウイルス）を伴わず、最小必須シス要素を含んでいるにすぎない[Muzyczka，Curr．Top．Microbiol．Immunol， 158;97-129(1992)]。更にもう１つの実施態様においては、本発明は、Ｅ１およびＥ４の両方が欠失したベクターおよびウイルスの伝播のための特定の２世代パッケージング細胞系を提供する。この系は、マウスα−インヒビンプロモーターによって駆動される最小必須Ｅ４遺伝子領域、すなわちオープンリーディングフレーム６（ＯＲＦ６）領域の導入によって樹立され、上述の２９３−Ｅ４と呼称される細胞系と同じ機能を提供する。Ｅ１、Ｅ４および２重欠失組換えアデノウイルスベクターの産生のためにこのパッケージング細胞系を使用することによって、Ｅ４領域内で考えられるあらゆる相同な組換え事象の問題が削除されるものと予想される。かくして、例えばＥ１／Ｅ４欠失組換えアデノウイルスの精製された系統の拡張および継代は、複製応答能もあるアデノウイルス（ＲＣＡ）粒子によるいかなる汚染も全く伴わないものでなくてはならない。このより安全な２重パッケージング細胞系を作り出す戦略は、Ｅ４遺伝子領域の全長の代わりに２９３細胞内に、ＯＲＦ６コーディング領域（ゲノムの右端からＡｄ５ヌクレオチド１８７６−２７５６）のみを含む９１０bpのＤＮＡフラグメントを導入することにあった。既存のＥ４欠失変異ウイルスは数多くある。重大な欠損性表現型を示すものは全て、ＯＲＦ６の領域を超えて実質的に延びるＥ４欠失を伴っている。例えば、これらの欠失のうちのいくつかは以下の通りである。すなわち、H5d11014のＥ４領域内の２つの欠失の境界としてのＮＴｓ５７５〜２８４５；Ｈ５ｄ１３６６内の欠失の同じ終点；Ｈ２ｄ１８０８の縦列反復配列内の９３２／９３７から２９４２／２９４５；およびＨ５ｄ１１００４内の９８１から２８４５。組込まれたＯＲＦ６ＤＮＡ断片と、大きなＥ４領域欠失を担持する組換えアデノウイルスベクターの間に重複する配列が欠如していることから、相同組換えを通してのＥ４欠失の修復は本質的にゼロとなる。以前の報告書は、ＯＲＦ３またはＯＲＦ６遺伝子断片のいずれかは単独で、正常なアデノウイルスの生活環に必要なＥ４機能を提供するのに充分である、ということを示していた。ＯＲＦ３およびＯＲＦ６遺伝子セグメントは、ウイルスのＤＮＡ複製、後期ウイルスｍＲＮＡの輸送および蓄積そして宿主細胞の締め出しに関与する多重複機能をもつものと考えられている。Ｅ４領域のその他のＯＲＦはウイルスの増殖において重要な調節の役割を有するが、これらはなくても済むものである。本発明の、提供された２９３−ＯＲＦ６細胞系が無傷のＥ１およびＯＲＦ６ＤＮＡ配列を含んでいるのみならずＥ１およびＥ４機能の相補活性も有することを確認するため、Ｅ１欠失変異ウイルス、Ｅ４欠失変異ウイルス並びにＥ１／Ｅ４欠失組換えウイルスを用いて２９３−ＯＲＦ６細胞系を感染させた。個々の２９３−ＯＲＦ６単層上で測定されたこれらのウイルスの力価は、各ウイルスの許容的細胞系上で測定された力価に対し相容性あるものであることが示された。したがって、本発明の２９３−Ｅ１／ＯＲＦ６パッケージング細胞系は、人間の患者に使用するための安全性の必要条件を満たすのみならず、Ｅ１またはＥ４欠失変異ウイルスおよび２重欠失Ｅ１／Ｅ４ウイルスおよびベクターを効果的に産生する。この細胞系は、１９５５年１０月２５日付けでRockville，MDのＡＴＣＣに寄託され、ATCC#.. という呼称が与えられた。もう１つの実施態様においては、本発明は、同時にトランスでＥ１およびＥ２Ａ遺伝子の両方の機能を相補する２９３−Ｅ２Ａパッケージング細胞系を提供する。ヒトアデノウイルスの７２KdＤＮＡ結合性タンパク質（ＤＢＰ）は、ウイルスの感染サイクルにおいて重要である。非許容的温度では、ＤＢＰコーディング領域（Ｅ２Ａ領域）内のｔｓ変異はウイルスＤＮＡ複製を阻害して[Friefeldら，Virology 124; 380-389(1983)]、ウイルスの生活環の晩期段階において初期遺伝子発現を調節することができない[Carterら，J．Virol．25; 664-674(1978)] 。Ｅ１欠失しＥ２Ａが変異した（ｔｓ変異）アデノウイルスベクターの生成は特殊なパッケージング細胞系を必要としないが、ｔｓＤＢＰ変異は、温度許容的in vivo条件下で完全不活性遺伝子産物を生み出し得ない[Engelhardtら，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，91; 6196-6200(1994)]。Ｅ２Ａ遺伝子の不可欠領域（ＤＢＰのカルボキシ末端部分をコードする遺伝子領域）内に１つでも欠失があれば、それはアデノウイルスにとってin vitroおよびin vivoの両方において致死的である[Vosら，Virology 172; 634-642(1989)]。Ｅ１およびＥ２Ａ遺伝子領域の両方の欠失を含む組換えベクターを生成するためには、相補細胞系の樹立が絶対に必要となる。本発明は、組換えアデノウイルスベクターおよび変異型アデノウイルスが作り出されるアデノウイルスパッケージングシステムを提供する。組換えアデノウイルスベクターのＥ１欠失およびＥ２Ａ欠失の組合せの結果、完全な複製機能不全および人体内での使用のための更なる安全性がもたらされるものと予想される。更にもう１つの実施態様においては、本発明は更に、同時にトランスでアデノウイルスＥ１、Ｅ２ＡおよびＥ４遺伝子領域の機能を相補することのできる３重パッケージング細胞系を提供している。このパッケージング細胞系から生成された組換えアデノウイルスベクターは、より大きいサイズのトランスジーン挿入のための広範な容量という付加的な利点を伴って、パッケージングされたアデノウイルスベクターを全てのヒト利用分野にとって絶対的に安全なものにする３つの初期遺伝子領域欠失を収容している。本発明は更に、標的細胞内で発現されることになるトランスジーンを含む新規の組換えアデノウイルスおよびＡＡＶ（本明細書では組換えアデノウイルス誘導ベクターおよびＡＡＶ誘導ベクターとも呼ばれている）および新規な変異型ウイルス（特にアデノウイルスおよびＡＶＶ）の産生をも提供する。組換えアデノウイルス誘導およびＡＡＶウイルスベクターは、新規な組換えアデノウイルス誘導およびＡＡＶ誘導ベクター内に存在せずウイルスの複製にとって必須であるアデノウイルスまたはＡＡＶゲノムの部分を相補することのできる単数または複数の全く異なるヌクレオチド配列を含む上述のパッケージング細胞系を用いて調製される。組換えアデノウイルス誘導およびＡＡＶ誘導ベクターはもはや、感染した標的細胞内でのウイルス複製のために必要とされる遺伝子を内含しなくなる。より特定的に言うと、組換えアデノウイルスベクターは最小必須シス要素（すなわちＩＴＲおよびパッケージングシグナル配列）およびタンパク質9.配列のみを含むことになり、Ｅ１（具体的にはＥ１ａおよびＥ１ｂ）およびＥ４領域を伴わず、付加的には、Ｅ３およびＥ２Ａ領域およびウイルス構造遺伝子を伴わない可能性がある。組換えＡＡＶベクターの場合、これらのベクターは、ＡＡＶウイルスＲｅｐタンパク質コーディング領域の欠失を含むことになるか、または、最小必須シス要素のみを含むことになる。後者は、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ＡおよびＥ４遺伝子領域およびウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡから、パッケージングについて欠損性であるものの野生型ＡＡＶ遺伝子産物を供給する非パッケージング相補性ＡＡＶプラスミドを同時トランスフェクションすることによって生成される［Samulskiら，(1987)］。組換えアデノウイルス誘導またはＡＡＶ誘導ベクターは同様に、標的細胞内での選択されたトランスジーン産物の発現および産生を導くことができるというこを特徴とする。かくして、組換えベクターは、標的細胞の感染のため物理的構造および包膜にとって必須のアデノウイルスまたはＡＡＶのＤＮＡ配列の全ての配列、並びに標的細胞内で発現されることになる選択されたトランスジーンを少なくとも含んでいる。このトランスジーンは、当該技術分野において周知の遺伝子移入技術方法を用いることによって標的細胞内にて発現した遺伝病または後天性疾患を改善する治療用遺伝子であってよい。１つの特定の局面においては、治療用遺伝子は、以下の表Ｉに示されている欠損性遺伝子に対応する正常なＤＮＡ配列、例えば、ＬＤＬ受容体およびα１−アンチトリプシンに対応する正常なＤＮＡ配列である。もう１つの局面においては、トランスジーンは、サイトカイン遺伝子、自殺遺伝子、腫瘍抑制遺伝子または防御遺伝子、あるいは表IIに示されているリストから選択されたこれらの組合せをコードすることができる。サイトカイン遺伝子が選択された場合、標的細胞内の遺伝子の発現は、腫瘍の成長の抑制および／または腫瘍細胞の死滅を結果としてもたらす細胞免疫応答を刺激することによって悪性に対する治療を提供することができる。自殺細胞が選ばれた場合、遺伝子は腫瘍細胞内で発現された時点で、腫瘍細胞を特定の薬物の存在下で破壊することができるようにする。例えば、チミジンキナーゼ遺伝子は、腫瘍細胞内で発現された時点で、ガンシクロビルの存在下で腫瘍を破壊できるようにする。更にもう１つの実施態様においては、トランスジーンは、感染性疾患（表III 参照）の予防のためのワクチンとして利用されるウイルス免疫原タンパク質をコードすることができる。このようなワクチンの調製および投与方法は、当該技術分野において既知のものである（例えば、Estinら，Proc．Nat．Acad．Sci．85; 1052(1988)参照）。本発明は更に、遺伝病および後天的疾患の治療法、ガン遺伝子治療および感染性疾患の予防のためのワクチンにも関する。トランスジーンは、組織特異的プロモーターの制御下で発現され得る。例えば、チロシナーゼプロモーターまたはチロシナーゼ関連タンパク質−１プロモーターの制御下で自殺遺伝子は、黒色腫についてのガン治療の場合においてメラノサイト内でのみ発現されることになる［ Vile & Hart，Cancer Res．53; 962-967(1993)およびLowingsら，Mol．Cell．Bi ol．12; 3653-3663(1992)］。ex vivoおよびin vivoで標的細胞内へトランスジーンを担持するアデノウイルスまたはＡＡＶベクターを導入するさまざまな方法がこれまでに記述されてきており、当該技術分野において周知のものである[例えば、Brody & Crystal，N.Y．Acad．Sci.会報716; 90-103，1993]。本発明は、問題のトランスジーンを含有する組換えアデノウイルスまたはＡＡＶベクターで標的細胞を感染させ、標的細胞内で選択されたトランスジーンを発現することによる治療方法、ワクチンおよびガン治療を提供する。例えば、本発明のトランスジーンを含む組換えアデノウイルスまたはＡＡＶベクターのin vivo送達を、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺および皮膚を含む広範なさまざまな器官タイプに対しターゲティングさせることができる。本発明の組換えベクターを導入するための送達経路には、ほんのいくつかを挙げるだけでも、静脈内、筋肉、脈管内および経皮的注射がある（Brody & Crystalの論文中の表Ｉおよび引用参考文献も参照のこと）。 ex vivo遺伝子移入の場合、標的細胞は宿主から除去され、本発明のＡＡＶベクターおよび当該技術分野において周知の方法を用いて実験室内で遺伝的に修飾される［Walshら，PNAS89; 7257-7261)，(1992)およびWalshら，Proc．Soc．Exp ．Bio．Med．204; 289-300(1993)］。かくして、本発明の組換えアデノウイルスまたはＡＡＶベクターは、上述の様式を含む従来の投与様式を用いて投与できるが、これらに制限されるわけではない。本発明の組換えアデノウイルスまたはＡＡＶベクターは、液体溶液および懸濁液、微小嚢、リポゾームおよび注射可能なまたは輸注可能な溶液を含むが、これらに限られるわけではなく、さまざまな用量の形をしていてもよい。好ましい形状は、投与形態および治療的利用分野によって異なる。以下の実施例は、本発明を例示する目的で示されるものであって、本発明の範囲をその他の形で制限することを意図したものでは全くない。実施例実施例１プラスミドの構築この実施例では、２９３細胞の中へＥ４遺伝子領域を導入するのに用いられるプラスミドの構築について記述する。構築されたプラスミドを、図１に概略的に表わす。ｐＩＫ６．１ＭＭＳＶｅｎｐｏＮｈｅ（Ｈｐａ）から誘導された親プラスミドpＩＫ６．１ＭＭＳＶ−Ｅ４（△Ｅ４ｐｒｏ．）[Finerら，Blood 83; 43- 50，(1994)]は、転写開始部位の上流１５bpからＥ４ポリアデニル化部位の下流８１０bpまでのプロモーターなしのＥ４領域を含んでいる。Ｅ４遺伝子はモロニーマウス肉腫ウイルスＵ３断片に連結している。ｐＩＫ６．１．ＭＩＰ（α）− Ｅ４は、マウスのアルファインヒビンプロモーター［ＭＩＰ（α）］のHindIII- XbaIＰＣＲ産物（Su．& Hsueh，BiochemおよびBiophys．Res．Common．186; 293 -300，1992）の２３８bp断片と、ＰＩＫ６．１ＭＭＳＶ−Ｅ４（Ｅ４ｐｒｏ．）の２．９kbのXbaI-StuI断片および３．９kbのStuI-HindIII断片の連結によって構築した。ＭＩＰ（α）のＰＣＲのために使用されるプライマは５´−ｇｃｇｃａａｇｃｔｔｃＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＡＴＡＡＧＧＣＴＣ−３´（配列番号１）および５´−ｇｇｃｃｔｃｔａｇａＡＧＴＴＣＡＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＡ−３´（配列番号２）であった。小文字で表わしたHindIII部位またはXbaI 部位のいずれかを含む配列は、クローニングを容易にするために存在している。クローニングされたα−インヒビンプロモーターは、配列の精確さを確認するために配列決定された。組換えアデノウイルスを生成するのに使用されるプラスミドＡＤＶ−β−ｇａｌを、図２に示すように構築した。出発プラスミドＡＤＶ−１は、ＰＣＲIIの骨格上にヌクレオチド４６９−３３２６（m.u.１．３〜９．２４）からの欠失を伴うアデノウイルス5XhoIC断片（m.u.０〜１５．８）の左末端を含んでいる（In V itrogen，San Diego，CA）。欠失部位にはポリリンカーカセットを挿入した。アデノウイルス配列の左末端にある複数の制限部位を好都合に用いてプラスミドを直鎖状にすることができる。結果として得られるＡＤＶ−β−ｇａｌプラスミドは、Ｅ１領域内のＡＤＶ−１相容性部位SpeIおよびClaIの中にマウスのｐｇｋプロモーターによって駆動されたE．coli β−ガラクトシダーゼ遺伝子のBstBI-Xb aI断片を挿入することによって構築され、これを後に、組換えウイルスを生成するのに使用した。実施例２２９３−Ｅ４細胞系のトランスフェクションおよび選択この実施例では、２９３−Ｅ４細胞系を樹立するために利用するトランスフェンクションおよび選択プロセスについて記述する。American Type Culture Coll ection，ATCC#RL1573から得た２９３の細胞を、ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１g/Lのグルコース(JRH Biosciences)、１０％の供与体仔ウシ血清（Tissue Culture Biologics）の中で増殖させた。細胞をトランスフェクション実験の４８時間前に１０cmの平板１枚につき５×１０⁵の割合で播種した。１０μgのｐＩＫ．ＭＩＰ（α）−Ｅ４および、Ｎｅｏ⁷遺伝子を含む１μgのｐＧＥＭ−ｐｇｋＮｅｏ−ｐｇｋｐｏｌｙＡをリン酸カルシウム共沈によって２９３細胞の中に同時トランスフェクションした［Wiglerら，Cell 57; 777-785(1979) ］。トランスフェクションを受けた細胞を、トランスフェクションの２４時間後に標準培地の中で１：２０に分裂させた。細胞を平板に固着させた後、培地を、１mg/mlのＧ４１８（Sigma，St．Louis，MO）を含む選択培地に交換した。約２〜３週間の間、３日毎に新鮮な選択培地を細胞に再補給した。分離したクローンを取り出し、増殖させ、５〜６継代の間、選択培地内に維持した。樹立された２９３−Ｅ４細胞系を日常的に標準培地内に維持した。実施例３サザン移入およびハイブリダイゼーション２９３−Ｅ４細胞系からのゲノミックＤＮＡを所望の制限酵素で消化させ、フェノール／クロロホルムで精製した。消化したＤＮＡ１０μgを０．８％〜１％のアガロースゲル上に走らせ、ナイロン膜(Zetabind，America Bioanalytical， Natick，MA)に移した。２９３−Ｅ４細胞系からのＤＮＡを制限酵素で消化させ、分析した。野生型アデノウイルス５、ｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）−Ｅ４プラスミドおよび親２９３細胞からのＤＮＡも同様に同じ酵素で消化させ、対照として用いた。Ｅ４領域の制限断片、α−インヒビンプロモーター配列およびＥ１領域を、適切な³²Ｐ標識付けされたプローブに対するハイブリダイゼーションとそれに続くオートラジオグラフィによって検出した。実施例４ウイルス系統の調製Ｗ１６２細胞をＤＭＥＭ、４．５g/Lのグルコースおよび１０％のＣＳの中で増殖させた。Ｗ１６２細胞系は、アデノウイルスＥ４ＤＮＡによって形質転換されたベロサル腎臓細胞系であり、Ｅ４欠失アデノウイルス変異体の増殖を支持する［Weinberg & Ketner，Proc．Natl．Acad．Sci．USA80; 5383-5386(1983)］。 H5d11014ウイルスについては、Bridge & Ketner J．Virol 63; 631-638(1989)の中で既に記述されている。このアデノウイルス５ウイルス菌株はＥ４領域内に２つの欠失を有し、Ｗ１６２細胞内でのみ増殖できる（Bridg & Ketner，1989）。 H5d11014ウイルスの伝播および滴定をＷ１６２細胞上で行なった。本発明の２９３−Ｅ４細胞系統からのH5d11014ウイルスの産生を評価するため、Ｗ１６２、２９３および２９３−Ｅ４細胞系を、６ウェルの平板内にウェル１つあたり１×１０５の割合で計数して平板固定し、細胞１個あたり５０のプラーク形成単位（p. f.u.）の感染多重度(m.o.i)でH5d11014に感染させた。感染から４８時間後に細胞を収集し、ウイルス系統を調製した。細胞を沈降させ、２００μlの無血清培地内で再懸濁させた。細胞懸濁液を３回凍結サイクルに付し、解凍して細胞からウイルス粒子を放出させた。細胞破片を遠心分離によって廃棄した。感染を受けた細胞から産生されたウイルスの力価を、Ｗ１６２細胞の単層上のプラーク形成によって決定した。実施例５組換えウイルスの構築実験の４８時間前に１０cmの平板内に平板１枚あたり２．５×１０６の割合で２９３細胞系および２９３−Ｅ４細胞系を平板固定した。同時トランスフェクションの１時間前に、細胞に１０mlの新鮮な培地を供給した。ClaIで消化された４ μgのＨ５ｄ１３２７(Thimmappayaら，Cell 31; 543-551 1982)と、BstBIにより直鎖状化された１０μgのＡＤＶ−β−ｇａｌの同時トランスフェクションによりＡｄ５／△Ｅ１（β−ｇａｌ）△Ｅ３ウイルスを作成した。リン酸カルシウム沈降技術により２９３−Ｅ４細胞系上で、BstBIで直鎖状化したＡＤＶ−β−ｇａｌ１０μgとClaIで消化したH5d11014 ４μgを同時トランスフェクションすることによって、Ａｄ５／△Ｅ１（β−ｇａｌ）△Ｅ４ウイルスを生成した。同時トランスフェクションの２４時間後に、培地を除去し、培養の単層の上に、２０mMのＭｇＣ１２、５％のＣＳおよび０．５％の不活性寒天（DIFCO Lab. Detro it，MI）を置いた。プラークを採取し、１００μlのＰＢＳ中で再懸濁させた。希釈したプラークサンプルを直ちに２〜３回の青色プラーク精製に付した。青色プラーク精製は、プラークが現われた時点で１mg/mlのＸ−ｇａｌを含む軟寒天の第２層を培養の上に置いた点を除いて、正規のプラーク検定の通りに行なった。２時間のインキュベーションの後、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を担持する組換えウイルスを含んでいたプラークは青色に染色された。組換えウイルスの純度を、白色プラークの無汚染によって決定した。精製したプラークを増殖させ、ライゼートのＤＮＡを以前に記述されたように分析した（図６）[Graham & Prevec (1992)]。SmaIでアデノウイルスＤＮＡを消化し、０．８％のアガロースゲル上で分画化した。ＣｓＣｌ勾配精製したウイルス系統から、Ｈ５ｄ１１０１４およびＡｄ５／△Ｅ１（β−ｇａｌ）△Ｅ３ウイルスのＤＮＡサンプルを抽出した。ウイルス感染した細胞から、Ａｄ５／△Ｅ１（β−ｇａｌ）△Ｅ４のＤＮＡを抽出した。実施例６組織化学的染色組換えウイルスAd5/ΔE1（β-gal）ΔE3ウイルス（E1およびE3欠失ウイルス）およびAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルス（E1およびE4欠失ウイルス）を用いて、 20m.o.iで（感染多重度20で）ウイルス感染を48時間行わせた後、細胞の単層をP BSで一度洗い、PBS中0.5％のグルタルアルデヒド(Sigma，St.Louis，MO)により室温で１０分間固定する。細胞は1mM MgCl₂を含むPBSで三度洗い、既述の方法に従って(Thimmappayaら，1982)５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β，Ｄ−ガラクトシダーゼ（X-gal，Sigma）で染色した。ジメチルホルムアミド中の 40mg／mlのX-galの溶液はＫＣ溶液（5mM K₃Fe(CN)₆，5mM K₄Fe(CN)₆・３H₂Oを含むPBS）中１mg／mlに希釈した。２〜４時間染色後、細胞をH₂Oで洗い、光学顕微鏡で検鏡した。実施例７ β−ガラクトシダーゼ活性アッセイ細胞をAd5/ΔE1（β-gal）ΔE3ウイルスおよびAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルスによって感染多重度20で感染し、酵素活性をMacGregorら，Somatic Cell Mol．G enetic．13:253-264,(1987)によって述べられた方法に以下の改変を施して測定した。６ウェルプレート中の細胞をPBSで二度洗い、200μlの２×Ｚバッファー（１×Ｚバッファー：60mM Na₂PO₄・7H₂O、40mM NaH₂PO₄・H₂O，10mM KCl，１m M MgSO₄・7H₂O）および200μlの0.2％Triton X-100を加えて溶解した。室温で５〜10分インキュベーション後、各サンプルの100μlを96ウェルマイクロタイタープレートに移した。50μlの２−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２mg／ml）を加えた後、反応を室温で５分間進行させ、50μlの停止溶液（１M Na₂CO₃）を加えて停止させた。蛍光はマイクロタイタープレートリーダー（Mol ecular Devices Co．Menlo Park，CA）を用い、420nmで測定した。実施例８ 293-E4 細胞系の構築 Ad5 E4遺伝子領域を293細胞に導入する目的は、導入した細胞系が、二つの致死的な欠失（E1およびE4）を含む組換えアデノウイルスをパッケージすることができるからである。プラスミドpIK.MIP(α)-E4は、Ad5 E4領域の転写開始部位の上流15塩基対から、ポリアデニル化部位の下流810塩基対までの全長領域（図１）をもつ。E4遺伝子領域（m.u.88.9−98.8）はプロモーター領域の最初の159塩基対および5'非翻訳領域を含むマウスα-インヒビンプロモーターの238塩基対と直接に連結している。このプロモーター配列は基礎発現に必要とされる(Su & Hs euh(1992))。このプロモーター領域内にサイクリックアデノシン3'，5'−モノリン酸（cAMP）応答要素(CRE)があり、これはcAMPまたはアデニルシクラーゼ活性化因子によって誘導される、高レベルの遺伝子発現を可能にする（Paeiら，Mol ．Endocrinol．5:521-534(1991)）。pIK.MIP(α)-E4はネオマイシン耐性遺伝子を持つpGEM-pgkNeo．pghpolyAとともに10：１に相当するモル比のリン酸カルシウム共沈によって293細胞に導入された。全部で66のG418耐性クローンをさらに解析するためにとりあげた。実施例９ E4 トランスフェクタントの同定導入したアデノウイルスE4領域の組込みを調べるために、各クローンのゲノムＤＮＡをHindIIIおよびSfiI、またはNcoI制限酵素で消化し、サザントランスファーで解析した。図３Ａは導入したα-インヒビン-E4領域ならびにE4プローブ(A d5のSmaIH断片）およびインヒビンのプロモータープローブの対応する領域の制限マップを示す。全66中17クローンは、両方の消化のスクリーンブロットにおいて全長のE4領域ＤＮＡの組込まれた場合に予想される正しいＤＮＡパターンを示した。他のクローンは組込みを示さないか、あるいはE4領域のさまざまな長さの組込みを示した。図３Ｂ−３Ｅは最初のスクリーニングブロットにおいて全長の組込みをもつ17クローンおよび異なる長さのE4領域の組込みを含む２クローンから抽出したゲノムＤＮＡのサザンブロットを示す。ＤＮＡは非選択的な培地中でこれらの細胞系を30回以上継代維持したのち抽出された。図３Ｂおよび３Ｃに示されるように、15の細胞系がHindIII/SfiI消化における特徴的な0.9kbおよび3.2 kbの断片およびNcoI消化における1.6kbおよび2.1kbの断片を示す。スクリーニングブロットで他の15細胞系と同一の組込みパターンをもつ二つの細胞系（細胞系13および29）にはE4領域の配列が検出されなかった。このことは、これらの二細胞系に於ける組込みが不安定であることを示す。細胞系16および19は変化した制限パターンをもつE4遺伝子領域を保持する細胞系の例である。HindIII/Sf i消化における15細胞系すべての0.9kbバンドはマウスインヒビンプロモーター配列とハイブリッド形成を行う（図３Ｄ）。NcoI消化ブロットに於いて、2.1kb断片とともに3.1kb断片はインヒビンプロモータープローブとハイブリッドを形成した。これらの結果はE4領域の遺伝子の全長がこれら15の細胞系に安定に組込まれたことを示している。これらの細胞系が生き残り、E4領域の全長を保持しているのはE1遺伝子領域を欠失したためである可能性を排除するため、ブロットをAd 5 HindIII E断片(m.u.7.7−17.1)によって再度検索した。19の細胞系のすべては、E1プローブによって検出される、親株の293細胞系における場合と同じ大きさの断片をもつ（図３ｅ）。ゆえに、E1遺伝子は293-E4細胞系では変化していない。実施例10 293-E4 細胞系の生物活性のスクリーンこれらの細胞系がE4欠失ウイルスの増殖を支持するかどうかをしらべるために、各細胞系をアデノウイルスE4欠失変異型ウイルスH5dl1014（Bridge & Ketner （1989)）によって感染させた。E4欠失株H5dl1014はm.u.92から93.8およびm.u.9 6.4から98.4までの二つの欠失を含む。これら欠失はORF4を除きE4のあらゆるオープンリーディングフレームを破壊する。このウイルスはH2d1808およびH5d1366 による感染をうけた細胞において見られるのと同様に、Hela細胞において、かなり少量のウイルスＤＮＡおよび後期ウイルスタンパク質を生成する（Halbertら，J.Virol．56:250-256(1985)）。H5dl1014の増殖を許す唯一の細胞系はW162である(Weinberg & Ketner(1983))。親の293細胞、W162細胞およびすべての15細胞系を1mMのcAMP添加または不添加のもとに感染多重度25でH5dl1014により感染させると、感染後３〜４日で６細胞系がW162細胞について観察されたものと、同程度の細胞毒性(CPE)を示した（図４）。CPEはW162および一部の293-E4細胞系の両方において、cAMPの存在下でよりすみやかに出現した。親の293細胞が示したCPE のレベルはより温和だった（図４）。この結果は、293-E4細胞系（E1およびE4遺伝子領域のいずれをも含む）は、E4遺伝子領域のみを含む細胞系（たとえばW162細胞系）と同程度に効率よくE4欠失ウイルス（たとえばH5dl1014ウイルス）の増殖を支持する。実施例11 293-E4 細胞系におけるH5dl1014生産の誘導 293-E4細胞系がH5dl1014変異型ウイルスを生産する能力を定量的に試験し、かつ293-E4細胞系におけるE4遺伝子発現の特異的な誘導があるかを調べるために、 cAMPの存在または非存在下における、293-E4細胞系から生産されるH5dl1014の力価を測定した。ウイルスのストックは各細胞の同数を感染多重度50で、H51014により感染することによって調製した。感染の48時間後、各細胞系の上清をとり除き、細胞を最初の1/10の容量の無血清培地に再懸濁した。ウイルスストックの力価検定はW162細胞を用いたプラークアッセイによって行った。表１に示されるように、これら15細胞系からのウイルス生産の現象は、一般に三つのグループに分類される。細胞系８，50および51を含むグループ１は293細胞によって得られる力価に比較して４から６桁高いウイルス力価の上昇を示した。細胞系８および51 はcAMPの存在下、ウイルス力価の10倍の上昇を示した。細胞系12，27および61を含むグループ２はW162細胞から得られるウイルス力価と同程度の力価を生みだした。ウイルス生産のレベルがcAMPの存在のもとに７桁増大した細胞系12を例外として、力価は1,000〜10,000倍増大した。これらの結果は、これらの三つの細胞系中ではE4遺伝子発現が誘導されていることを示す。グループ３は、cAMPの存在下または非存在下で、ウイルスの力価が基本的に親の293細胞で生産されるものと類似のレベルである残りの細胞系を含む。このグループのいくつかの細胞系でもE4遺伝子発現の誘導が認められた。細胞をcAMPによって処理するとW162および親の239細胞においても10倍の誘導が観察された。ウイルスの生産量におけるこの10倍増加は、これまたウイルスＤＮＡ合成の増大をひきおこすＣＲＥを含んでいる他のアデノウイルス初期遺伝子の発現に対するcAMPの増強効果（Leza & Hearing，J．Virol．63：3057-3064(19 89)）によるものである可能性がある。実施例12 Ad5/ ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルスの作成 E1領域およびE4領域の両方に致死的な欠失をもつ組換えウイルスの救出のために、二つの最も効率のよい細胞系、細胞系８および細胞系61が用いられた。ADV- β-galプラスミドをBstB1によって直鎖化し、ClaIで消化したH5dl1014と共に293 -E4細胞系の単層に同時トランスフェクションした（図５）。組換えウイルスはA DV-β-galとH5dl1014の大型ClaI断片(m.u.2.55−100)との重複するアデノウイルス配列の間のin vivo組換えによって生成した。トランスフェクション後７〜10 日に現れたプラークを単離し、青色プラークアッセイによって精製した。最終的に精製した青色プラークおよびウイルスＤＮＡを分析した（図６）。以下の二重欠失組換えウイルスの比較研究のために、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE3ウイルスを作成した。このウイルスはBstB1によって直鎖化したADV-β-galプラスミドをClaI で消化したH5dl327（Thimmappayaら，(1982)）と共に293細胞に同時トランスフェクトすることによって生じさせた（図５）。実施例13 Ad5/ ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルスのin vitro評価この二度目に生成した組換えウイルスの感染性を評価するために、感染性をHe la，293，W162および細胞系61の細胞中における二重致死欠失ウイルスおよび単一致死欠失ウイルスのβ-gal遺伝子の発現と比較した。これら二株の組換えウイルスにより、感染多重度20で48時間細胞を感染させた。両感染における発現を組織化学的染色および上述のβ−ガラクトシダーゼ活性アッセイを共に用いて観察した。Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルスの細胞障害作用の消失はプラークアッセイによって試験した。293-E4はこれら三株のウイルス(Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4 ，Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE3およびH5dl1014)のすべての増殖を許す唯一の細胞系である。293細胞はAd5/ΔE1（β-gal）ΔE3ウイルスの増殖を許し、H5dl1014ウイルスについては半許容的（低レベルのウイルス生産）であるが、Ad5/ΔE1（β -gal）ΔE4ウイルスの増殖を許さない。W162細胞系はH5dl1014ウイルスの増殖を許すが、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE3ウイルスおよびAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルスの増殖を許さない。Hela細胞はウイルスの三株すべての増殖を許さない。これらの結果は、二重欠失ウイルスはテストしたヒト細胞系にはいかなる細胞障害作用をも持たなかったことを示している。二重欠失ウイルスの感染多重度20での感染後に細胞障害作用をもたなかったことは、これらのウイルスはin vivoでは後期遺伝子産物を発現しないことを示唆する。これは組換えウイルスに感染した細胞に対する免疫応答を排除し、これによってトランスジーンの発現を長期にわたらせる。実施例14 in vitro におけるトランスジーンおよび末端切断型E4遺伝子の効率よい発現 Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4によって媒介されるトランスジーンの転写レベルでの発現を測定し、そしてAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルスからのE4の転写を物理的に視覚化するために、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4ウイルスＲＮＡをノーザンブロットにより分析した。Hela細胞を組換えアデノウイルスにより細胞あたり20pfuで感染させた４、24および48時間後に全ＲＮＡを抽出した。H5dl327およびAd5/ΔE 1（β-gal）によって感染したHela細胞から抽出された全ＲＮＡを対照として用いた。ＲＮＡzol Ｂ試薬（Tel-Test．Inc．Friendswood，TX）を全ＲＮＡの抽出のために用いた。10μgの全ＲＮＡを１％の変性ゲルで電気泳動し、メンブレンフィルターに移行し、放射性のＤＮＡプローブにハイブリッド形成させた。ノーザンブロットは放射性標識を行ったβ-galの1.65kbのEcoRV-AccI断片、Ad5 E4領域の2.30kbのSmaI H断片（m.u.92.0−98.4）、Ｌ５領域の765塩基対のPCR断片、Ｌ３領域の1.45kbのSmaII断片（m.u.52.6−56.6）によって順次釣り上げた。アデノウイルスＬ５領域の増幅のためのPCRプライマーは5'-GAGGACTAAGGATTGATT-3 '(NTs 31811−31828)（配列番号）および5'-CGTGAGATTTTGGATAAG-3'(NTs 32549 −32566)（配列番号）であった。 Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4またはAd5/ΔE1（β-gal）によって感染をうけた細胞は、感染後４時間で同じレベルのβ-galｍＲＮＡを蓄積した（図７、パネルＡ）。しかし、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4の感染をうけた細胞は、Ad5/ΔE1（β-gal）の感染をうけた細胞にくらべ、感染後24および48時間でより低レベルのβ-galを徐々に蓄積した。Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4を介したβ-gal転写産物のレベルの若干の低下は、さきに述べた感染後24時間で検定した感染Hela細胞中のβ−ガラクトシダーゼ酵素活性の若干の低下と合致している。同一のブロットを、92.0から 98.4m.u.までの長さをもち、Ｌ５領域の3'末端と重なり合わないアデノウイルス E4プローブ(Fraserら，J.Mol．Biol．155:207-233(1982))で再ハイブリッド形成を行わせると、E4転写産物のレベルはAd5/ΔE1（β-gal）感染細胞中で劇的に低下している一方で、ポリソームｍＲＮＡの特徴的なパターン(Tiggsら，J.Virol ．50:106-117(1984))がH5dl327およびAd5/ΔE1（β-gal）によって感染されたサンプルに見られる。しかし、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4によって感染をうけた細胞中では、1.5kbに相当する大きさの唯一のE4転写産物しか存在しない（図７、パネルＢ）。この観察はおそらく、ORF4を除くE4領域内のすべてのオープンリーディングフレームを破壊し、ORF4タンパク質をコードする末端切断型の転写産物を生成させる、このE1/E4欠失ベクター中の二つの大きな欠失によるものである。この実施例は、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4組換えアデノウイルスベクターによって運ばれるトランスジーンは有効に発現するという、実施例13で述べられた結果を支持する。実施例15 in vitro におけるアデノウイルス後期遺伝子の発現の低下または欠如組換えアデノウイルスベクタ−Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4を生成させるために用いた親の変異型アデノウイルスH5dl1014は後期遺伝子の発現に重大な欠損があることが報告されている(Bridge and Ketner，J．Virol，63:631-638，(1989))。A d5/ΔE1（β-gal）ΔE4中のE1およびE4領域の欠失の組合わせが後期遺伝子の発現の重大な欠陥または完全な阻害をもたらすかどうかを決定するために、増殖を支持しないHela細胞中におけるAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4の後期ｍＲＮＡの蓄積をノーザンブロットおよび逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）法によって測定した。ノーザンブロット（実施例14および図７で述べた）を、繊維タンパク質コード領域（Ｌ５領域）内のNTs 31811から32566までのAd5 配列のPCR産物であるＬ５プローブ、およびヘキソンタンパク質のコード領域内のm.u.52.6−56.6のSm aII断片であるＬ３プローブに対して再ハイブリッド形成させた。E1−欠失ベクターを感染させた細胞中に、感染後48時間でＬ５転写産物の低レベルの蓄積および検出しうるレベルのＬ３ｍＲＮＡが存在した（図７、パネルＣおよびＤ）。しかし、両後期転写産物はE1/E4−欠失アデノウイルスベクターによる感染をうけた細胞では検出されなかった。アデノウイルス後期遺伝子転写産物がAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4組換えベクター中で発現しているかどうかを決定するために、本発明者らはより検出感度の高い RT-PCR法を採用した。全ＲＮＡを１単位／μgのRNaseを含まないDNase(Promega Corp.,Madison WI）により37℃60分間処理した。ｃＤＮＡの第一鎖はpd(N)₆をプライマーとして(Pharmacia，Alameda CA)合成した。同一セットの対照反応を逆転写酵素を抜いて行った。次いで両調製物（RT⁺およびRT^-）をさきに述べた（実施例14参照）と同一のＬ５プライマーを用いて増幅した。Ｌ３領域に対するプライマーは5'-CCTACGCACGAC-3'(配列番号５)(NTs 18996−19007); 5'-TGTTTGGGTTA T-3'（配列番号６）(NTs 20318−20329)である。増幅後、ＲＴ産物は１％アガロースゲル電気泳動にかけ、エチジウムブロミド染色によっで可視化した。Ｌ５ｍＲＮＡはAd5/ΔE1（β-gal）およびAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4による感染をうけた細胞の両方に同定された（図８）。Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4による感染をうけた細胞では、Ｌ３ｍＲＮＡ転写産物は検出されなかった（図８）。β−アクチンプライマーを用いたRT-PCR反応を内部対照として用いた。RT-PCRに用いたβ− アクチンプライマーはFraserら，J.Virol．63，631-638（1989）に述べられているように、ラットおよびヒトの共通配列である。ヘキソンタンパク質配列（Ｌ３領域内）の検出の感度を上げるために、RT-PCR 産物をさらにヘキソンタンパク質のコード領域のRT-PCR産物の内部領域とハイブリッド形成するオリゴマー5'-GACCGTGAGGATACT-3'（配列番号７）をプローブとしてサザンブロットによって解析した（図９）。Ｌ３転写産物は二重欠失をもつ Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4アデノウイルスベクターによる感染をうけた細胞中には検出されず、上述および図８に述べた研究の結果を確認するものである。これらの結果は、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4ベクター中のE1およびE4の欠失の組合わせが、アデノウイルスキャプシドタンパク質- ヘキソンをコードするＬ３ｍＲＮＡの完全な欠如をもたらすことを示している。実施例16 in vivo におけるトランスジーンの持続的発現 E1/E4欠失アデノウイルスベクターのアデノウイルス後期遺伝子発現の低下または欠如がトランスジーンの発現を長引かせることができるかどうかを決定するために、E1欠失あるいはE1/E4欠失ベクターによる感染をうけた細胞におけるβ- gal遺伝子発現を検討した。以下のin vivo実験には二重欠失Ad5/ΔE1（β-gal） ΔE4組換えウイルスおよびAd5/ΔE1（β-gal）組換えウイルスを用いた。ウイルスストックは補償(complementing)パッケージング細胞の懸濁液から得、Graham およびPrevec，Methods Mol．Biol．7:109-128,（1991）に述べられているように二度のCsCl遠心分離のバンド形成により精製した。用いたすべてのストックは、Lochmullerら，Hum．Gene Ther．5:1485-1491,(1994)に述べられている、E1領域(NTs 13-1338)プライマーおよびE2領域（NTs 5053−5072）プライマーを用いたPCR分析によって測定して、E1含有ウイルスの混在はなかった。各組換えウイルス株による感染をうけた５匹の動物を感染後３，７，14，21，28，35および77 日目に殺した。さきに述べたX-galの組織化学的染色を上記感染動物の肝臓の凍結切片について実施した。染色は、E1欠失およびE1/E4欠失アデノウイルスベクターのいずれによる感染をうけた３および７日目の肝臓においても、ほぼ100％の組織がβ−ガラクトシダーゼを発現したことを示した。E1-欠失ベクターによる感染をうけた肝臓では、14日（75〜85％）から35日（15〜25％）にかけてX-ga l染色の急激な低下がみられた。77日目にはE1欠失のアデノウイルスによる感染をうけた動物において１〜２％の肝臓のみが青く染色された。これとは対照的に、E1/E4欠失ウイルスによる感染をうけた肝臓では、β−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現は28日間にわたって85％というレベルが維持された。さらに77日目には E1/E4欠失アデノウイルスの感染をうけた動物の肝臓のほぼ65−75％がβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を発現した。この実施例は、E1/E4二重欠失アデノウイルスベクター（アデノウイルス）におけるアデノウイルス後期遺伝子発現の欠如が、単一欠失のアデノウイルス、たとえばE1欠失アデノウイルスにくらべ、ウイルスベクター中に組入れられたトランスジーンの発現を著しく持続させることを実証している。実施例17 細胞障害作用の低下およびin vivoにおける宿主の免疫応答 E1/E4−欠失アデノウイルスによる感染をうけた動物において、トランスジーンの発現の延長と細胞障害作用の低下との間に逆相関があるかどうかを決定するために、各実験グループの５匹の動物から得られたランダムな肝臓のヘマトキシリン／エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片について検討した。凍結肝臓切片（６μm）を0.5％グルタルアルデヒド中で固定し、X-gal溶液で染色することによりβ-gal 活性を染色した。形態学的な研究のためには、パラフィン肝臓切片をＨ＆Ｅによって染色した。ランダム切片について検討した。細胞の膨満、組織の壊死、小葉構造(lobular structure)の減少および炎症性浸潤などの病理学的変化を、E1-欠失アデノウイルスベクターによる感染をうけた動物において３日から７日にかけて観察し、さらに35日目まで続いた。77日目までには同じ感染をうけた動物のほとんどはこれらの形態学的な損傷から回復した。しかし、またE1/E4-欠失アデノウイルスによる感染をうけた動物では、14日目を過ぎて軽微な炎症性浸潤が出現したことを除けば、３日から７日にかけては、上記の病理学的な変化のいずれも認められなかった。77日目までにはこの二重欠失ウイルスベクターによる感染をうけた動物のすべては、形態学的に正常へと回復した。この実施例は、細胞障害作用の低下は二重欠失のAd5/ΔE1(β- gal)ΔE4組換えアデノウイルスベクターによって媒介されていることを示す。二重欠失アデノウイルスベクターによる感染をうけた動物におけるトランスジーンの持続的発現は、Ad5/ΔE1（β-gal）ベクターによる感染をうけた動物の肝臓に比較して、肝臓における組織再生活性が低下していることによるのかもしれない。実施例18 E4-ORF-6 プラスミドの構築この実施例はpIK6.1MIP(α)-ORF6プラスミドの構築を扱う。E4-ORF6領域の発現ベクターは図10に示されたように構築された。pIK6.1.MMSVNhe（Finerら，Blo od, 1994およびFinerら，国際特許出願WO 94/29438中ではpIK6.1MMSVenpoNhe(Hp a)またはpkat1とも呼ばれる）に由来する親のpIK6.1MMSV-E4(ΔE4 pro.)はプロモーター領域を除くE4領域の全長の配列を含んでいる。pIK6.1MIP(α)-E4はマウスのαインヒビンプロモーター［MIP(α)］のHindIII-XbaI PCR産物の238bp断片をpIK6.1MMSV-E4(ΔE4 pro.)の2.9kbのXbaI−StuI断片および3. 9kbのStuI−HindIII断片とライゲートすることによって構築した。 pIK6.1MIP( α)-ORF6プラスミドはプロモーターのないE4領域をORF6断片のPCR産物によって置き換えることによって構築した。E4-ORF6のコード領域に対するPCRプライマーは5'-gccaatctagaGCTTCAGGAAATATGACT-3'(Ad5 NTs 34072から34089)（配列番号８）および5'-catctctcgagGGAGAAGTCCACGCCTAC-3'(Ad5 NTs 33179から33196まで )（配列番号９）である。小文字中のXhoI部位またはXbaI部位を含む配列はクローニングを容易にするために存在する。ORF6の転与はマウスのインヒビンプロモーターによって駆動され、またORF6領域の下流のプラスミド骨格上の異種ポリアデニル化シグナル(SV40 polA)が利用される。クローン化されたORF6ＤＮＡ断片は、この配列の正確さを確認するために配列決定した。pIK6.1MIP(α)-ORF6は以下に述べるようにパッケージング細胞系を作成するために用いた。実施例19 293-ORF6 細胞系の構築以下の実施例は293-ORF6細胞系の構築について述べたものである。E4含有ウイルスを生成する潜在的可能性を排除するため、この新規なパッケージング細胞系は293細胞に最小不可欠なAd5 E4 ORF6コード領域を導入することによって確立したものである。プラスミドpIK.MIP(α)-ORF6は、ゲノムの右端から番号をつけて、ヌクレオチド1846から2756にかけての、Ad5 E4-ORF6のコード領域の910bpのPC R断片を含む。ORF6領域はさきに述べたようにマウスαインヒビンプロモーター領域の下流にクローニングされた。pIK6.1MIP(α)-ORF6は293細胞中に、Neor遺伝子を含むプラスミドと共に同時トランスフェクトされた。54のG418耐性クローンを単離し、増殖させ、サザンブロットによってE4-ORF6配列の組込みについてスクリーニングを行った（図11）。各クローンからのゲノムＤＮＡをHindIIIおよびXmnIで消化し、ORF6のPCR断片とハイブリッド形成を行った（図11、パネルＡ）。合計54のスクリーニングを行ったクローン中、８クローンが無傷のORF6領域について予想される1.7kb断片の少なくとも１コピーを保持していた。ブロットをAd5 HindIII E断片（m.u.7.7−17.1）であるE1プローブと再ハイブリッド形成させた（図11、パネルＢ）。８つの293-ORF6細胞系のすべてはE1プローブによって検出される、親の293細胞中に存在するのと同一の大きさの断片を示した（図11）。この実施例はE1遺伝子の構造がこの細胞系中で変化していないことを示している。上記の細胞系は無傷のE1遺伝子を持つだけでなく、また少なくとも１コピーのE4 ORF6領域を保持する。実施例20 293-ORF6 細胞系によるE4機能の補足 293-ORF6細胞系をE4-欠失変更型アデノウイルス、H5dl1014による感染にひきつづくウイルス産生の能力についてスクリーニングを行った。H5dl1014アデノウイルスはORF4を除きE4領域のすべてのオープンリーディングフレームを破壊し、 Hela細胞中のウイルスＤＮＡおよび後期ウイルスタンパク質の生産の大幅な低下を招く、二つの欠失をもつ。無傷のE4領域を含むW162細胞系は、H5dl1014の増殖を支持する細胞系である〔Bridge and Ketner，J．Virol．63:631-638,(1989)〕。親の293，W162，293-E4および293-ORF6細胞をH5dl1014により感染多重度25pfu で感染させると、８つの293-ORF6細胞系のすべては、感染後３〜４日で、W162細胞および293-E4細胞について観察されるのと同様な細胞障害作用(CPE)を示した。H5dl1014の産生の定量的な分析は、293-ORF6および対照細胞系の単層上の限界希釈によるプラークアッセイによって行った。293-ORF6によって産生されるE5d1 1014の力価は、W162および293-E4細胞の双方によって産生されるのと同様の範囲にあった（表Ｖ）。したがって、E4遺伝子領域の小さな必須ＤＮＡ断片を含むにすぎない293-ORF6 細胞系は、E4機能を補足するのに十分であり、E4欠失変異型ウイルスの増殖を支持する。実施例21 293-ORF6 細胞系によるE1機能の補足サザン解析は試験を行った293-ORF6細胞系のすべてが無傷のE1領域のコピーを含むことを示した。この細胞系のE1機能を補足する生物活性について検定した（表Ｖに示されるような補足活性アッセイ）。W162，293，293-E4および293-ORF6 #34細胞系の単層を、E1-欠失変異型ウイルス、H5dl312によって感染させ、ウイルス産生を限界希釈プラークアッセイにより定量した。８つの293-ORF6細胞系の各々は親の293細胞で産生されるのと同様のレベルのE1-欠失ウイルスを産生した（表Ｖ）。したがって、293-ORF6細胞系はE1およびE4遺伝子産物機能のいずれをも補足する能力を有する。実施例22 293-ORF6 細胞系によるE1およびE4両機能の同時的補足この実施例は、293-ORF6細胞系がE1およびE4の両領域に欠失をもつ組換えウイルスを救済する能力をもつことを述べたものである。細胞系34はH5dl1014の最も高い力価を与えた二つの細胞系、すなわち細胞系21および34から、さらにテストを行うために選ばれた。さきに述べたように構築されたE1/E4二重欠失組換えウイルス、Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4は、pgkプロモーターの制御下にある大腸菌の β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む。Ad5/ΔE1（β-gal）ΔE4はさきに述べたようにH5dl1014を親ウイルスとして用い、組換えによって生じさせた。Ad5/ΔE1（ β-gal）ΔE4の産生の定量的な分析は、対照細胞系および293-ORF6-34細胞系の単層上の限界希釈によるプラークアッセイによって実施した。X-gal染色により青く染色されるプラークは293-E4および293-ORF6-34の単層上に感染後７〜10日で出現した。293-ORF6-34細胞系から産生するAd5/ΔE1（β-gal）ΔE4の力価は2 93-E4細胞系から産生する力価と同じであった。この実施例は293-ORF6-34細胞系がE1とE4の二つの致死的欠失をもつウイルスの増殖を支持することを示す。実施例19で述べた新規なパッケージング細胞系は、それらが高い力価のウイルスを産生し、またトランスフェクトした細胞系内に存在するベクター中のE4欠失とE4 -ORF6を発現するプラスミドとの間に重複がないことから複製能力のあるアデノウイルス(RCA)を産生できないので、E1/E4-欠失組換えアデノウイルスの増殖には有利である。実施例23 Ｅ２Ａプラスミドの構築 pIK6.1MIP(α)-E2Aプラスミドは既述のようにpIK6.1MIP(α)-E4から構築した。プロモーターをもたないE4遺伝子を第二のリーダー配列を残した状態で21562 から24627（m.u.59.9から68.3）［Klessigら，Mol．Cell．Biol．4:1354-1362， (1984)］までのAd5 E2A遺伝子で置き換えた。Ad5 E2A遺伝子はアデノウルイスＤＮＡ結合タンパク質(DBP)をコードし、アデノウイルスＤＮＡ複製に必要である［Van er Vliet and Sussenbach，Virology，67:415-426(1975)］。自身のプロモーターおよび第一のリーダー配列を欠く遺伝子(m.u.61.5-68)をマウスのαインヒビンプロモーター領域の下流にクローニングした。m.u.65.2から68.3までの PCR産物をプライマ−5'-tccatttctagaTCGGCTGCGGTTG-3'（配列番号10）(Ad5 NTs 24615から24627)および5'-ACGTGGTACTTGTCCATC-3'（配列番号11）(Ad5 NTs 234 43から23460)を用いて得た。小文字のXbaI部位を含む配列が存在するのはライゲーションおよびクローニングを容易にするためである。PCR産物をXbaIおよびPvu Iの両方で消化し、NTs 21562から23501（m.u.59.9から65.2）までのAd５のBamHI およびPvuI ＤＮＡ断片とライゲートさせた。次いでプロモーターを欠くE2A ＤＮＡ配列を用いてpIK6.1MIP(α)-E4プラスミドのプロモーターを欠くE4領域を置換した。クローン化したE2A遺伝子の転写はマウスαインヒビンプロモーターによって駆動され、またE2A領域の下流にあるプラスミド骨格上の異種のポリアデニル化シグナル（SV40 polA）が利用される。クローン化されたE2A遺伝子は配列決定を行い、配列の正確さを確認した。pIK6.1MIP(α)-E2Aプラスミドを用いて以下に述べるようにパッケージング細胞系を作成した。実施例24 293-E2A 細胞系の構築以下の実施例は293-E2A細胞系の構築について述べる。E1およびE2A両遺伝子機能を同時にトランスで補足する能力をもつパッケージング細胞系を構築するために、プラスミドpIK.MIP(α)-E2AをNeo^r遺伝子を含むプラスミドと共に293細胞にトランスフェクトした。293細胞（ATCC CRL1573）はダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、１g/l グルコース(JRH Biosciences，Denver，PA)、10％ドナーウシ血清（Tissue Cultare Biologics，Tulare，CA）で培養した。細胞はトランスフェクションの48時間前に10cmのプレートあたり５×10⁵個をまいた。10mgのpIK 6.1MIP(α)-ORF6およびマウスホスホグリセレートキナーゼプロモーターの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子をコードするpGEM-pgk Neo．pgk polyAの１mg をリン酸カルシウム共沈により、293細胞に同時トランスフェクトした［Wigler ら，Cell 16:777-785,(1979)］。 50のG418耐性クローンを単離し、増殖させ、サザンブロットによりE2A配列の組込みについてスクリーニングを行った。各クローンからのゲノムＤＮＡはXbaI およびAflIIにより消化し、E2Aプローブに対しハイブリッド形成させた。スクリーンした全50クローン中12が無傷のE2A領域に対して予想される1.44kb断片の少なくも１コピーを保持した。ブロットはE1プローブ（m.u.7.7から17.1のAd5 Hin dIIIE断片）によって再度検索した。12のすべての293-E2A細胞系は親の293細胞と同一の大きさの断片を持つ。この実施例はE1遺伝子の構造はこれらの細胞系で変化しておらず、また細胞系が少なくも１コピーのE2A遺伝子をもつことを示す。実施例25 293-E4/E2A 細胞系の構築以下の実施例は293-E4/E2A細胞系の構造について述べる。E1，E2AおよびE4遺伝子機能を同時にトランスで補足する能力をもつパッケージング細胞系を構築するために、プラスミドpIK.MIP(α)-E2AをNeo^r遺伝子を含むプラスミドと共に293 -E4細胞に同時トランスフェクトした。293-E4細胞はダルベッコ改良イーグル培地（DMEM）、１g/l グルコース(JRH Biosciences，Denver，PA)、10％ドナーウシ血清(Tissue Calture Biologics，Tulare CA)で培養した。細胞はトランスフェクションの48時間前に10cmのプレートあたり５×10⁵個をまいた。10mgの pIK6.1MIP(α)-PRF6およびマウスホスホグリセレートキナーゼプロモーターの制御下にあるネオマイシン耐性遺伝子をコードする、pGEM-pgk Neo.pgk polyAの１ mgをリン酸カルシウム共沈により293細胞に同時トランスフェクトした（Wigler ら，1979）。50のG418耐性クローンを単離し、増殖させ、サザンブロットにより E2A配列の組込みについてスクリーニングを行った。各クローンからのゲノムＤＮＡはXbaIおよびAflIIにより消化し、E2Aプローブに対しハイブリッド形成させた。スクリーンした全50クローン中21が無傷のE2A領域に対し予想される1.44kb 断片の少なくとも１コピーを保持した。ブロットはE1プローブ（m.u.7.7から17. 1までのAd5 HindIIIＥ断片およびE4プローブ（m.u．92から98.4までのSmaI H断片）で再プローブを行った。21のすべての293-E2A細胞系は親の293-E4細胞系と同一の組込んだE1およびE4ＤＮＡのパターンを示した。この実施例はE1およびE4 遺伝子の構造はこれらの細胞系で変化しておらず、さらにまたこれらの細胞系のすべてに１コピーのE2A遺伝子が保持されていることを示す。実施例26 ウイルス関連ＲＮＡ(VARNA)プラスミドの構築この実施例はpIK6.1-VARNAプラスミドの構築について述べる。pIK6.1-VARNAプラスミドはFinerらによってWO 94/29438中で述べられたpIK6.1から誘導された。 m.u.29から30.1までの、ＲＮＡポリメラーゼIIIに対する内在性のプロモーターとともにAd5 VARNA1およびVARNA2遺伝子を含むPCR産物をpIK6.1プラスミドにクローン化した。PCR産物はプライマー、5'-tactaacctaggACGCGGTCCCAGATGTTG-3' （Ad5 NTs 10504から10521）（配列番号12）および5'-tactaacactacCCGCTGCTCTT GCTCTTG-3'（Ad5 NTs 11095から11112）（配列番号13）を用いて得た。小文字部分のAvrIIまたはDralII部位を含む配列はクローニングを容易にするために存在させた（図13）。クローン化されたウイルス関連ＲＮＡ遺伝子は配列決定を行い配列の正確さを確認した。本明細書に引用されたすべの刊行物は、それぞれの刊行物が参考として組み込むために特定的かつ個別的に示されたかのように、全体が参考としてここに組み入れられる。本発明に関連する分野の専門家には明らかなように、本発明は本発明の精神または本質的な性格から逸脱することなしに、これまでに特定的に開示した以外の形態で具体化することができる。したがって、上に述べた本発明の特定の具体化例は、説明のためのものであって限定するのものではないと考えるべきである。本発明の範囲はこれまでの記述に含まれている実施例に限られるのではなく、むしろ添付の請求の範囲で明らかにされている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ジア，ジャオ−チアメリカ合衆国 94403 カリフォルニア州，サンマテオ，バーバンクアベニュー 64

Claims

【特許請求の範囲】１．誘導プロモーターに機能しうる状態で連結された、細胞障害性タンパク質をコードするアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域を含んでなるＤＮＡプラスミド。２．前記のアデノウイルス遺伝子または遺伝子領域がＥ２Ａ遺伝子またはＥ４遺伝子領域から選択される、請求項１に記載のＤＮＡプラスミド。３．誘導プロモーターに機能しうる状態で連結された、タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルス遺伝子を含んでなるＤＮＡプラスミド。４．前記のアデノ随伴ウイルス遺伝子がｒｅｐ遺伝子領域およびｃａｐ遺伝子領域から選択される、請求項３に記載のＤＮＡプラスミド。５．アデノ随伴ウイルスのＲｅｐタンパク質の１つをコードし、かつ誘導プロモーターに機能しうる状態で連結されたアデノ随伴ウイルス遺伝子を含んでなるＤＮＡプラスミド。６．前記の誘導プロモーターがｃＡＭＰ応答要素結合性タンパク質により調節される遺伝子からのプロモーターである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。７．前記の誘導プロモーターが哺乳動物αインヒビンをコードする遺伝子から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。８．前記の誘導プロモーターがマウスαインヒビンをコードする遺伝子から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。９．前記の誘導プロモーターがテトラサイクリン応答プロモーターをコードする遺伝子から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＤＮＡプラスミド。 10．ＡＴＣＣ＃７５８７９を指定されたプラスミドｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α）− Ｅ４。 11．ウイルス構造遺伝子、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失、少なくとも２つの変異、または少なくとも１つの変異と１つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい複製欠損性の変異型アデノウイルスの増殖を支持するパッケージング細胞系。 12．ウイルス構造遺伝子、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失、２つの変異、または１つの欠失と１つの変異を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよく、さらに前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンを含有する組換えアデノウイルスベクターの増殖を支持するパッケージング細胞系。 13．ヘルパーアデノウイルスを伴っていない複製欠損性の変異型アデノ随伴ウイルスの増殖を支持するパッケージング細胞系であって、ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ４初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系。 14．ヘルパーアデノウイルスを伴っていない複製欠損性の組換えアデノ随伴ウイルスの増殖を支持するパッケージング細胞系であって、ウイルス関連ＲＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ４初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系。 15．ヘルパーアデノウイルスを伴っていない、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有する複製欠損性の変異型アデノ随伴ウイルスの増殖を支持するパッケージング細胞系であって、ウイルス関連ＲＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系。 16．ヘルパーアデノウイルスを伴っていない、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有する複製欠損性の組換えアデノ随伴ウイルスを産生するパッケージング細胞系であって、ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期領域を含んでなるパッケージング細胞系。 17．ヘルパーアデノウイルスを伴っていない、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有する複製欠損性の変異型アデノ随伴ウイルスの増殖を支持するパッケージング細胞系であって、ウイルス関連ＲＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｃａｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系。 18．ヘルパーアデノウイルスを伴っていない、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有する複製欠損性の組換えアデノ随伴ウイルスを産生するパッケージング細胞系であって、ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｃａｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系。 19．ウイルス構造遺伝子、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失、少なくとも２つの変異、または少なくとも１つの変異と１つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、請求項１１に記載のパッケージング細胞系において産生される複製欠損性の変異型アデノウイルス。 20．ウイルス構造遺伝子、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失、少なくとも２つの変異、または少なくとも１つの変異と１つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、複製欠損性の変異型アデノウイルス。 21．ウイルス構造遺伝子配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失、少なくとも２つの変異、または少なくとも１つの変異と１つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい組換えアデノウイルスベクターであって、前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンをさらに含有し、請求項１２に記載のパッケージング細胞系から産生される組換えアデノウイルスベクター。 22．ウイルス構造遺伝子、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失、少なくとも２つの変異、または少なくとも１つの変異と１つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい組換えアデノウイルスベクターであって、前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンをさらに含有する組換えアデノウイルスベクター。 23．Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、およびウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列を含んでなるパッケージング細胞系において増殖する、ヘルパーアデノウイルスを伴っていない複製欠損性の変異型アデノ随伴ウイルス。 24．ウイルス関連ＲＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系において増殖する、ヘルパーアデノウイルスを伴っていない複製欠損性の組換えアデノウイルスベクター。 25．ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系において増殖する複製欠損性の変異型アデノ随伴ウイルスであって、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有し、かつヘルパーアデノウイルスを伴っていない変異型アデノ随伴ウイルス。 26．ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系において増殖する複製欠損性の組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有し、かつヘルパーアデノウイルスを伴わず、さらに前記の欠失と置き換わるトランスジーンを含有する組換えアデノ随伴ウイルスベクター。 27．ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｃａｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系において増殖する複製欠損性の変異型アデノ随伴ウイルスであって、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有し、かつヘルパーアデノウイルスを伴っていない変異型アデノ随伴ウイルス。 28．ウイルス関連ＲＮＡをコードするＤＮＡ配列、Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４初期遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域、アデノ随伴ウイルスｃａｐ遺伝子領域、および場合によりＥ３初期遺伝子領域を含んでなるパッケージング細胞系において増殖する複製欠損性の組換えアデノ随伴ウイルスベクターであって、アデノ随伴ウイルスｒｅｐ遺伝子領域の欠失を有し、かつヘルパーアデノウイルスを伴わず、さらに前記の欠失と置き換わるトランスジーンを含有する組換えアデノ随伴ウイルスベクター。 29．哺乳動物の標的細胞に、トランスジーンを含有する組換えアデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスを感染させる方法であって、ｉ．該標的細胞に、所定のトランスジーンを担う請求項２１、２２、２４、２６または２８に記載の組換えウイルスベクターを感染させ、そして ii．該標的細胞において該トランスジーンを発現させる、各工程を含んでなる方法。 30．請求項２９に記載の方法により生産されるトランスジーンを感染させた哺乳動物標的細胞。 31．前記の細胞が複製ヒト細胞、遅延複製ヒト細胞または非複製ヒト細胞よりなる群から選択される、請求項３０に記載の標的細胞。 32．ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ１１７１１を指定されたヒト胚腎細胞由来のパッケージング細胞系。 33．遺伝病または後天性疾患の治療方法であって、ｉ．治療用遺伝子からなるトランスジーンを含有する請求項２１、２２、２４、２６または２８に記載のアデノウイルス由来またはアデノ随伴ウイルス由来の組換えベクターを医薬として許容される用量で標的細胞に投与し、そして ii．該標的細胞において該治療用遺伝子を発現させて、遺伝病または後天性疾患を軽減させる、各工程を含んでなる方法。 34．請求項２１、２２、２４、２６、２８、３６、５５、５７、５９、６０または６２に記載のアデノウイルス由来またはアデノ随伴ウイルス由来の組換えベクター、および製剤学的に許容される担体を含有するワクチン。 35．Ｅ１およびＥ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよく、さらに前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンを含有するアデノウイルスベクターの増殖を支持するパッケージング細胞系。 36．Ｅ１およびＥ４初期遺伝子領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよく、さらに前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンを含有する組換えアデノウイルスベクター。 37．誘導プロモーターに機能しうる状態で連結されたアデノウイルス遺伝子断片Ｅ４オープンリーディングフレームＯＲＦ６を含んでなるＤＮＡプラスミド。 38．前記の誘導プロモーターがｃＡＭＰ応答要素結合性タンパク質により調節される遺伝子から選択されたプロモーターである、請求項３７に記載のＤＮＡプラスミド。 39．前記の誘導プロモーターが哺乳動物αインヒビンをコードする遺伝子から選択される、請求項３８に記載のＤＮＡプラスミド。 40．前記の誘導プロモーターがマウスαインヒビンに由来するものである、請求項３９に記載のＤＮＡプラスミド。 41．前記の誘導プロモーターが薬剤誘導可能なテトラサイクリン応答プロモーターである、請求項３７に記載のＤＮＡプラスミド。 42．ＡＴＣＣ＃を指定されたプラスミドｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α） −Ｅ４ＯＲＦ６。 43．誘導プロモーターに機能しうる状態で連結されたアデノウイルス遺伝子Ｅ２Ａを含んでなるＤＮＡプラスミド。 44．前記の誘導プロモーターがｃＡＭＰ応答要素結合性タンパク質により調節される遺伝子から選択されたプロモーターである、請求項４３に記載のＤＮＡプラスミド。 45．前記の誘導プロモーターが哺乳動物αインヒビンをコードする遺伝子から選択される、請求項４４に記載のＤＮＡプラスミド。 46．前記の誘導プロモーターがマウスαインヒビンに由来するものである、請求項４５に記載のＤＮＡプラスミド。 47．前記の誘導プロモーターが薬剤誘導可能なテトラサイクリン応答プロモーターである、請求項４５に記載のＤＮＡプラスミド。 48．ＡＴＣＣ＃を指定されたプラスミドｐＩＫ６．１ＭＩＰ（α） −Ｅ２Ａ。 49．Ｅ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４−ＯＲＦ６初期領域よりなる群から選択される少なくとも２つの欠失、少なくとも２つの変異、または少なくとも１つの変異と１つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、複製欠損性の変異型アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスベクター（該組換えアデノウイルスベクターはさらに前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンを含有する）の増殖を支持するパッケージング細胞系。 50．Ｅ１およびＥ４−ＯＲＦ６初期遺伝子領域からの２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、複製欠損性の変異型アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスベクター（該組換えアデノウイルスベクターはさらに前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンを含有する）の増殖を支持するパッケージング細胞系。 51．＃ＣＲＬを指定された、アデノウイルス５Ｅ４ＯＲＦ６ＤＮＡ遺伝子断片でトランスフェクトされたヒト胚腎細胞由来のパッケージング細胞系。 52．Ｅ１およびＥ２Ａ初期遺伝子領域からの２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、複製欠損性の変異型アデノウイルスまたは組換えアデノウイルスベクター（該組換えアデノウイルスベクターはさらに前記の欠失のいずれか１つと置き換わるトランスジーンを含有する）の増殖を支持するパッケージング細胞系。 53．テトラサイクリン応答プロモーターに機能しうる状態で連結された１以上のアデノウイルス後期遺伝子領域を含んでなるＤＮＡプラスミド。 54．前記のアデノウイルス後期遺伝子領域がＬ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４またはＬ５から選択される、請求項５３に記載のＤＮＡプラスミド。 55．Ｅ１およびＥ４初期遺伝子領域からの２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよく、さらに前記の欠失のいずれかと置き換わるトランスジーンを含有する、組換えアデノウイルスベクター。 56．Ｅ１およびＥ４初期遺伝子領域からの２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、複製欠損性の変異型アデノウイルス。 57．Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ４初期遺伝子領域からの３つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよく、さらに前記の欠失のいずれかと置き換わるトランスジーンを含有する、組換えアデノウイルスベクター。 58．Ｅ１、Ｅ２ＡおよびＥ４初期遺伝子領域からの３つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、複製欠損性の変異型アデノウイルス。 59．Ｅ１およびＥ２Ａ初期遺伝子領域からの２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよく、さらに前記の欠失のいずれかと置き換わるトランスジーンを含有する、組換えアデノウイルスベクター。 60．Ｅ１およびＥ２Ａ初期遺伝子領域からの２つの欠失を有し、場合によりＥ３遺伝子領域の欠失を含んでいてもよい、複製欠損性の変異型アデノウイルス。 61．前記のトランスジーンがヒト・ホスホグリセレートキナーゼプロモーターの制御下で発現される、請求項２１、２２、３６、５５、５７または５９に記載の組換えアデノウイルスベクター。 62．前記のトランスジーンがヒト・ホスホグリセレートキナーゼプロモーターの制御下で発現される、請求項２６または２８に記載の組換えアデノ随伴ウイルスベクター。