CN1274290A - 局部应用基因载体的疫苗接种 - Google Patents

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Abstract

本发明提供以非侵袭方式诱导免疫应答的方法,包括以下步骤:通过给所述皮肤局部应用免疫有效浓度的基因载体,从而使其接触需要这种治疗的个体的皮肤,其中所述基因载体编码目的基因。也提供在需要这种治疗的动物中诱导抗肿瘤免疫应答的方法,包括以下步骤:通过给所述皮肤局部应用免疫有效浓度的编码基因的载体,从而使其接触所述动物的皮肤,其中所述基因编码抗原,所述抗原给予后在所述动物中诱导抗肿瘤效应。所述基因载体可包括腺病毒重组体,DNA/腺病毒复合体,DNA/脂质体复合体或能够表达转基因的任何其它载体。基因载体的局部应用优选包括本文设计的装置。

Description

局部应用基因载体的疫苗接种
本申请要求1997年8月13日提交的美国临时申请第60/055,520号和1998年2月11日提交的美国临时申请第60/075,113号的优先权。
                         发明背景
发明领域
本发明一般涉及免疫学和疫苗技术学领域。更具体地讲，本发明涉及皮肤定向的非侵袭性基因传递以引发免疫应答的技术及其用途。
相关领域的描述
脊椎动物免疫系统的激活是保护动物抗病原体和恶性肿瘤的重要机理。免疫系统由包括体液和细胞分枝的许多互作组分组成。体液免疫涉及直接结合抗原的抗体。B淋巴细胞分泌作为体液免疫效应物的抗体分子。细胞免疫涉及识别并杀伤产生非自身抗原的其它细胞的特化的细胞毒T淋巴细胞(CTL)。CTL对降解的肽片段产生应答，所述肽片断出现于结合MHC(主要组织相容性复合体)I类分子的靶细胞表面。当然，在所述细胞中产生的蛋白作为细胞代谢的组成部分不断降解成为肽。这些片段结合到所述MHC分子并转运到所述细胞表面。因此，细胞免疫系统恒定地监测在机体细胞中产生的蛋白谱，并准备着消除任何产生非自身抗原的细胞。
疫苗接种是引发动物对抗原产生应答的方法。给予的抗原可以是蛋白质(经典型)或随后表达所述抗原的基因(基因免疫)。所述方法涉及T和B淋巴细胞、其它类型的淋巴样细胞以及特异性抗原提呈细胞(APC)，所述抗原提呈细胞可以加工所述抗原并以可激活免疫系统的形式提呈该抗原。给予基因疫苗的现有方式集中于侵袭性方法，所述侵袭性方法包括针注射、划痕和基因枪介导的穿透。以侵袭性方式接种疫苗需要设备和经特殊医疗训练的人员，并且常常伴随不舒适和潜在危害(出血、感染)。目前有证据显示，以侵袭性方式接种疫苗可能是非必要的(Tang等，1997；Glenn等，1998)。因为所述皮肤直接与外界环境接触并不断与潜在病菌原体接触，所以，免疫系统必须恒定地沿所述皮肤边缘保持一个流动生物部队以防止潜在感染。因此，所述皮肤外表层本质上是免疫活性组织。存在于皮肤以引发体液和细胞毒性细胞免疫应答的免疫组分，包括表皮朗格汉斯细胞(它是MHC II类阳性的抗原提呈细胞)、角质细胞以及CD4+和CD8+T淋巴细胞。这些组分使得所述皮肤成为给予疫苗的理想部位。皮肤的大量可用面积和其持久性是将疫苗应用于该组织的其它优势。在皮肤外表层表达小量抗原而不需要物理穿刺由此使所述免疫监视机制警戒，从而引发有效的免疫应答。
用随后对肿瘤或病原体攻击的保护程度测定疫苗的效力。有效疫苗是在最小量接种后可诱导高滴度和持久免疫的免疫原，以用于定向干预疾病。例如，基因免疫是通过在动物自身细胞中表达编码所述蛋白的基因从而引发针对特定蛋白的免疫应答的方法。大量抗原的扩增和体内持续抗原提呈产生的免疫刺激可以诱导抗所述抗原的稳固免疫。基因免疫使针对特定蛋白产生免疫应答的接种方案简化，因为它去除了疫苗研制均常规需要而通常麻烦的蛋白纯化和与佐剂结合的步骤。因为基因免疫不需要分离蛋白质，所以它对生化纯化时可能丧失构象表位的蛋白质特别重要。基因疫苗也可以组合给予而不产生干扰或影响效力(Tang等，1992；Barry等，1995)，它可以使针对多种抗原的接种方案简化。如本申请所介绍的一样，已经证实，基因疫苗可以以皮肤定向非侵袭性疫苗的新方式接种。基因疫苗与非侵袭性传送方式结合，可以产生新类型的不需要特殊使用技能和装置给予的“平民”疫苗。
尽管已经研究了局部应用基于蛋白的疫苗，但是其用途可能是有限的。虽然可以以已经说明(Tang等，1997)的皮肤定向非侵袭性基因疫苗相同的非侵袭方式(Glenn等，1998)，局部应用基于蛋白的疫苗和霍乱毒素也可以免疫动物，但是，这两种类型的疫苗通过不同的机制激活免疫系统。此外，由于类似于自然感染的从新合成抗原，使得基因疫苗的效力一般高于蛋白疫苗(McDonnell和Askari，1996)。尽管美国专利第3,837,340号描述了用干燥的病毒接触皮肤接种动物的方法，但是他们所用的病毒不是能够表达转基因的基因载体。另外，所述免疫原可能是病毒外壳蛋白，而不是由在动物自身细胞中表达病毒基因产生的蛋白。
现有的接种技术通常需要设备(例如注射针或基因枪)和给予疫苗的特殊技能。该领域极其需要和希望通过非医疗训练人员且不需要装置从而接种疫苗。因为所述方法是简单、有效、经济、无痛和潜在安全的，所以，通过非侵袭性接种到所述皮肤(NIVS)的发展可潜在地针对许多疾病进行免疫。因此，NIVS可以在医疗资源短缺的发展中国家以及由于病人舒适性从而在发达国家增加疫苗覆盖范围。可以用不需要特殊的装置和医疗人员的皮肤定向非侵袭性疫苗，预防或治疗所有由病毒(包括AIDS和流感)、细菌(包括破伤风和TB)、寄生虫(包括疟疾)引起的传染病和恶性肿瘤(包括各种癌症类型)。本发明满足所述领域中长期存在的需要和希望。
                       发明概述
因为皮肤是免疫活性组织并且该非侵袭性方法不需要特殊训练的人员，所以非侵袭性接种到所述皮肤(NIVS)可以改善接种方法。皮肤定向非侵袭性基因传递可以达到在所述皮肤中定位的转基因表达并引发免疫应答(Tang等，1997)。这些结果表明，NIVS是一种传送疫苗的新的有效方法。本发明简单、有效、经济和无痛的免疫方案应该使得接种较少依赖医疗资源，并由此增加接种的年使用率。
本发明提供免疫动物的方法，包括以下步骤：皮肤定向非侵袭性传递包含基因载体的制剂，因此所述载体被表皮细胞摄取，并对脊椎动物具有免疫效应。也提供通过传递装置免疫动物的方法，包括以下步骤：将基因载体配置在所述传递装置中，并用限定在所述装置中的均匀剂量的遗传物质接触脊椎动物的裸露皮肤，由此所述载体被表皮细胞摄取用于在所述免疫活性皮肤组织中表达特定抗原。所述基因载体可以是腺病毒重组体、DNA/腺病毒复合体、DNA/脂质体复合体或能够在脊椎动物皮肤中表达抗原的任何其它基因载体。
在本发明的一个实施例方案中，提供了诱导免疫应答的方法，包括以下步骤：通过局给予所述皮肤免疫有效浓度的编码目的基因的基因载体，从而接触需要这种治疗的个体或动物的皮肤。
在本发明的另一个实施方案中，提供了在需要这种治疗的个体或动物中诱导保护性免疫应答的方法，包括以下步骤：通过局部给予所述皮肤免疫有效浓度的编码基因的基因载体，从而接触所述动物的皮肤，所述基因编码在给予后在所述个体或动物中诱导保护性免疫效应的抗原。
在又一实施方案中，本发明提供通过用DNA/腺病毒复合体接触裸露皮肤从而在同一细胞中共表达转基因的方法。该方案使得可以通过在相同细胞环境中与抗原一起共同产生细胞因子、共同刺激分子或其它免疫调节剂，从而操纵免疫系统。
本发明还包括传递皮肤定向非侵袭性疫苗的传递装置(绷带、粘性敷料等)的应用。
本发明包括在本文所述方法中设想的所有用途的所有基因载体。从以说明为目的本发明现有优选实施方案的以下描述，可明显看出本发明的其它以及另外的方面、特征和优势。
                       附图简述
为了实现并详细了解本发明上述特征、优势和目的以及清楚明显的其它方面，参照在附图中说明的某些实施方案，可以更具体描述以上简要概述的本发明。这些附图组成本说明书的一部分。然而，值得注意的是，所述附图说明本发明的优选实施方案，而不应认为是限制其范围。
图1显示在局部应用所述载体的皮肤中腺病毒重组体的转基因表达；
图2a和2b显示由局部应用的腺病毒重组体转导的潜在靶细胞的特征鉴定；
图3a和3b显示在腺病毒介导的NIVS免疫小鼠血清中的特异性抗体的检测；
图4显示用致死剂量的肿瘤细胞攻击的对照小鼠与免疫小鼠的百分存活率；
图5显示肿瘤浸润的T淋巴细胞的特征鉴定；
图6显示肿瘤浸润的CTL的特征鉴定；
图7显示抗体与用疫苗绷带局部应用免疫小鼠中的人CEA蛋白的蛋白质印迹分析；
图8a显示DNA/腺病毒介导的NIVS免疫小鼠血清中的特异性抗体的检测；
图8b显示DNA/脂质体介导的NIVS免疫小鼠血清中的特异性抗体的检测；
图9显示DNA编码的转基因和腺病毒编码的转基因在靶细胞中的共表达；
图10显示局部应用的腺病毒重组体、DNA/腺病毒复合体和DNA/脂质体复合体的相对的转基因表达；
图11显示给予皮肤定向非侵袭性疫苗的装置。
                       发明详述
本发明涉及诱导免疫应答的方法，包括以下步骤：用免疫有效浓度的包含目的基因的基因载体与需要这种治疗的个体或动物皮肤外表层发生非物理侵袭的接触，所述接触时间适合对其引发免疫应答。采用本发明方法，可以用来产生免疫应答的抗原的典型实例包括人癌胚抗原、HIVgp120、破伤风毒素C片段和流感HA和NP等。最优选的是，所述免疫应答产生抗肿瘤或感染性病原体的保护效应。
实施本发明需要用非侵袭性方法将操作性编码多肽的基因载体传递到脊椎动物皮肤外表层，以用于免疫所述动物。这些基因载体可以通过直接将遗传物质转移到所述皮肤而不用任何装置，或者采用绷带或绷带样装置接触裸露的皮肤，从而给予所述脊椎动物。在优选应用中，所述基因载体为水溶液。由冻干粉重新配制的载体也是可接受的。所述载体可以编码表达所必需的转录/翻译信号一起、与免疫调节序列(诸如遍在蛋白或富含CpG的合成DNA)融合的完整基因、基因片段或者几种基因、几种基因片段。
在本发明另一实施方案中，所述载体还包含选自共同刺激基因和细胞因子基因的基因。在该方法中，所述基因选自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和干扰素基因。
在需要使用腺病毒重组体的本发明实施方案中，它可包括E1-缺陷型、E3-缺陷型和/或E4-缺陷型腺病毒载体，或其中所有病毒基因缺失的“无内容的”腺病毒载体。因为E1缺陷型腺病毒突变体不能在非容许细胞中复制，所以E1突变提高了所述载体的安全范围。所述E3突变通过破坏腺病毒向下调节MHC I类分子的机制而提高所述抗原的免疫原性。所述E4突变通过抑制所述晚期基因表达从而降低所述腺病毒载体的免疫原性，由此使得可以用同一载体重复再接种。所述“无内容的”腺病毒载体是腺病毒载体家族中的最新模式。其复制需要辅助病毒和表达Ela和Cre两者的特殊人293细胞系、天然环境中不存在的条件；所述载体失去了所有病毒基因，因此所述载体作为疫苗载体是无免疫原性并可以接种以用于多次再接种。所述“无内容的”腺病毒载体还含有36kb的空间用于容纳转基因，由此使得可以将大量抗原基因共同传递入细胞。可以将诸如RGD基元的特殊序列基元插入腺病毒载体的H-I环，以增强其感染性。将特定转基因或转基因片段克隆入任何诸如上述的腺病毒载体中从而构建腺病毒重组体。所述腺病毒重组体用来以非侵袭方式转导脊椎动物的表皮细胞，以用作免疫剂。
在需要使用DNA/腺病毒复合体的本发明实施方案中，它需要利用或者PEI(聚乙烯亚胺)或聚赖氨酸与腺病毒载体复合的质粒DNA。在所述复合体中的腺病毒载体可以是“活的”或用UV辐射“杀死的”。作为受体结合配体和用于促进DNA介导的转染的内渗剂(Cotton等，1992)的UV失活的腺病毒载体，可以提高所述疫苗载体的安全范围。所述DNA/腺病毒复合体用来以非侵袭方式转染脊椎动物的表皮细胞，以用作免疫剂。
在需要使用DNA/脂质体复合体的本发明实施方案中，它需要形成脂质体的材料，并由需要这些材料制备DNA/脂质体复合体。所述DNA/脂质体复合体用来以非侵袭方式转染脊椎动物的表皮细胞，以用作免疫剂。
本发明提供的基因载体也可以编码免疫调节分子，所述分子可以用作佐剂以诱发体液和/或细胞免疫应答。这类分子包括细胞因子、共同刺激分子或可以改变免疫应答过程的任何分子。人们可以设想其中该技术可以修改以进一步增强抗原的免疫性的途径。
用于NIVS的基因载体可以采取任何数目的形式，而本发明不限于任何编码任何特定多肽的特定基因材料。包括病毒载体、细菌载体、原生动物载体和DNA载体的所有形式的基因载体，当这些基因载体用作皮肤定向非侵袭性疫苗的载体时，均在本发明设想的方法以内。
所述基因可以用各种方法传递，所述方法包括不用装置的局部应用或用诸如垫片或绷带(例如粘性绷带)的装置将所述基因涂抹在所述皮肤表面。参照图11，显示用于非侵袭性接种的装置。该疫苗传递装置包括其中配置小泡的非过敏性皮肤粘性贴剂。在一个实施方案中，所述贴剂还包含约1cm直径的塑料。所述疫苗配置在所述泡中。在另一实施方案中，所述泡含有约1mL的疫苗(为液体、带有重新配制的冻干粉、和其变异体)。在一个优选实施方案中，与所述皮肤接触的泡表面强度有意地较其相对面弱，使得当施加压力到所述相对面时，强度较弱的一面破裂并释放出所述泡内的疫苗内容物到所述皮肤。所述塑料贴剂将所述疫苗贴于皮肤表面。
局部给予本发明基因载体和目的基因的剂型包括液体、软膏剂、粉剂和喷雾剂。所述活性组分可以在无菌条件下与生理可接受载体和任何防腐剂、缓冲剂、喷射剂或可能需要的吸收增强剂混合。
按照本文所用的术语学，免疫有效量为编码所述目的基因的基因载体当给予动物时、对所述目的基因产物产生免疫应答的量或浓度。
各种抗原可以以不同浓度局部给予。一般而言，腺病毒载体的用量至少约100pfu，而质粒DNA至少约1ngDNA。
本发明方法可适当地用于预防接种以预防疾病或用于治疗接种以治疗疾病。
本发明的疫苗可以单独或者作为免疫组合物的一部分给予动物。
除了上述人用疫苗外，本发明方法可用来免疫动物牲畜。术语动物是指包括人类的所有动物。动物实例包括人类、乳牛、狗、猫、山羊、绵羊和猪等。因为所有脊椎动物的免疫系统运行相似，所以所述应用可以在所有脊椎动物系统中实施。
给出以下实例为的是说明本发明各种实施方案，而不是以任何方式限制本发明。方法 小鼠和细胞培养物
近交小鼠保持在Birmingham的Alabama大学。细胞培养在含2％胎牛血清和6％小牛血清的RPMI 1640或DMEM培养基中。基因载体的局部应用
麻醉小鼠，并用脱毛剂(例如NAIR)去除腹部或颈部有限范围皮肤上覆盖的毛和角质化上皮。将基因载体吸取到预先剃刮并用NAIR处理的皮肤上，使其与裸露皮肤接触不同时间(例如1-8小时)。载体可以直接吸取到裸露皮肤上或吸入粘附到所述皮肤上的圆筒中。腺病毒载体的制备
从特定腺病毒重组体感染的人293细胞制备高滴度的腺病毒母液。裂解液通过氯化铯梯度进行超速离心。取出病毒带并对10mMTris(pH7.5)/135mM NaCl/5mM KCl/1mM MgCl2进行透析。纯化的病毒与加至10％的甘油一起过滤除菌，并等份贮藏于-80℃。用噬菌斑测定检测腺病毒母液的滴度。荧光素酶测定
如前所述(Tang，1994)测定所述皮肤中的荧光素酶的量。简而言之，用Kontes玻璃组织研磨器在裂解缓冲液中匀浆切取的皮肤片。在离心去除组织碎片后，在存在过量ATP和荧光素的情况下用发光计通过测量总光发射，检测所述皮肤提取物中的荧光素酶活性。β-半乳糖苷酶测定
将切取的皮肤片快速冷冻于液氮中的Tissue-Tek O.C.T.化合物(Miles Laboratories Inc.)中并贮存于-80℃待用。所述冷冻组织以4μm横切切片，固定于4％低聚甲醛中，如前所述(Tang，1994)通过在X-gal染色液中温育染色以检测β半乳糖苷酶活性。切片用苏木精和伊红复染。DNA/腺病毒复合体的制备
在存在凝聚剂聚赖氨酸的情况下混合100μg质粒DNA和1×1011腺病毒颗粒，制备DNA/腺病毒复合体用于各种用途。用吸光度检测定腺病毒的滴度。DNA/脂质体复合物的制备
通过混合100μg质粒DNA和100μg DOTAP/DOPE(1∶1；Avanti)，从而制备DNA/脂质体复合体以用于各种用途。用QiagenPlasmid Maxi试剂盒制备质粒。蛋白质印迹分析
将鼠尾血的血清1∶250至1∶500稀释，与已经在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离的纯化蛋白反应，并转移到Immobilon-P膜(Millipore)。用ECL试剂盒(Amersham)进行显色反应。
实施例1
本发明证实，不用复杂的设备，通过皮肤定向非侵袭性传递基因载体，可以使抗原基因以简化的形式传递到小鼠皮肤中。图1表明，传递有限量的AdCMV-luc(编码荧火虫荧光素酶的腺病毒载体)(Tang等，1994)到所述皮肤后产生大量荧光素酶。Ad，腺病毒；pfu，蚀斑形成单位；LU，光单位。结果为平均值log[LU/cm2皮肤]±SE(n标示于每个柱顶端)。用不编码荧光素酶的腺病毒载体模拟使用或涂抹的小鼠，在所述皮肤中不产生可检测的荧光素酶活性。腺病毒载体在所述皮肤中的转基因表达水平看来与所述病毒滴度无关。有可能的是，仅皮肤有限亚群中的少量细胞被所述病毒转导，而108蚀斑形成单位(pfu)的腺病毒重组体可能已经饱和了所述靶细胞。该变异性也可能部分是由各个小鼠的变异引起的。另外，某些变异性可能是由仍未标准化的去除角质上皮的方法(Johnston和Tang，1994)引起的。通过将更多的载体接种到更大面积皮肤，可以潜在增加所产生的抗原量。
实施例2
正如皮肤定向非侵袭性传递编码大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因(AdCMV-βgal)的腺病毒载体(Tang等，1994)后，用X-gal底物染色的冷冻切片所示，看来非侵袭性接种到所述皮肤的主要靶细胞是毛囊中的毛母质细胞(图2a)和表皮最外层的角质细胞(图2b)。在经受所述处理的皮肤组织中未发现物理性擦伤，并没有诱发的炎症。吸取108pfu AdCMV-βgal到所述皮肤后1天，从动物切取经受非侵袭性基因传递的皮肤组织，横向切片，固定，并如所述用X-gal底物染色(Tang等，1994)。图2a显示毛囊中的腺病毒转导的毛母质细胞(×150)。图2b显示表皮最外层中腺病毒转导的角质细胞(×150)。在用AdCMV-luc或者模拟使用或者涂抹的对照动物中未发现蓝色细胞。
实施例3 腺病毒介导的NIVS诱发体液免疫应答
NIVS是一种接种动物的新方法。为了证实所述方法可以对所述载体编码的抗原诱发特异性免疫应答，将AdCMV-hcea[编码人癌胚抗原(CEA)的腺病毒载体]吸取到C57BL/6株小鼠的皮肤上。将皮肤定向非侵袭性传递108pfu AdCMV-hcea后1个月的接种小鼠的血清1∶500稀释，与已经在5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离的纯化人CEA蛋白(T.Strong提供)和腺病毒蛋白反应，并转移到Immobilon-P膜(Millipore)上。参照图3a，泳道1，0.5μg人CEA；泳道2，0.5μg BSA；泳道3，107pfu腺病毒。图3a显示，接种动物的测试血清在蛋白质印迹分析中与纯化人CEA蛋白反应，但是不与牛血清白蛋白(BSA)反应，它支持这样的结论：由于皮肤定向非侵袭性基因传递的结果，已经产生抗腺病毒载体编码的外源蛋白的特异性抗体。
为了测试该技术是否可以普遍应用，把AdCMV-hgmcsf[编码人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)的腺病毒载体]接种到所述皮肤。为了检测抗人GM-CSF蛋白的抗体，皮肤定向非侵袭性传递108pfu AdCMV-hgmcsf从而接种所述动物。将在15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离的纯化人GM-CSF蛋白(CalBiochem)转移到膜，并让其与稀释的血清反应。如图3a中所述进行其它处理。参照图3b，泳道1，0.25μg人GM-CSF；泳道2，0.25μg BSA；泳道3，107pfu腺病毒。在人293细胞中产生复制缺陷型人腺病毒血清型5衍生的AdCMV-hcea和AdCMV-hgmcsf。插入含有人CEA基因或人GM-CSF基因、由所述巨细胞病毒(CMV)早期增强子-启动子元件驱动的盒以替代所述Ela缺失。因为所述Ela区中的序列缺失，所以这些病毒在非容许细胞中的自主复制能力受损。
结果(Tang等，1997)表明，96％(23/24)的C57BL/6株小鼠在皮肤定向非侵袭性传递AdCMV-hcea后一个月产生抗人CEA蛋白的抗体，43％(6/14)的相同株小鼠在皮肤定向非侵袭性传递AdCMV-hgmcsf后产生抗人GM-CSF蛋白的抗体。在NIVS前收集的免疫前血清和首次用于实验的动物的血清均不能与人CEA和GM-CSF蛋白反应。消除了通过喂食(grooming)经摄食载体的口服接种的可能性，因为：(1)在动物从麻醉状态苏醒前从所述皮肤上冲洗掉载体，(2)将吸取载体到未剃刮皮肤上，和(3)混合同一个笼中的首次用于实验的动物和接种动物。在首次用于实验的小鼠和接种小鼠之间未观察到交叉接种，推测由于沿剃刮路径机械性去除了角质化上皮，因此看来剃刮是NIVS的基本组成部分。因此，腺病毒介导的NIVS能够引发抗所述载体编码的抗原的体液免疫应答。
实施例4
为了证实本发明技术可以引发保护性抗肿瘤免疫应答，把表达人癌胚抗原(CEA)基因(MC38-CEA-2)(Conry等，1995)的同源肿瘤细胞接种到首次用于实验的C57BL/6株小鼠和已经局部应用编码人CEA基因(AdCMV-hcea)的腺病毒载体的相同株的小鼠。观察经受肿瘤攻击的动物存活率(图4)。在对照组中，90％(9/10)动物产生可触知的肿瘤小结并在肿瘤细胞移植后30天内死亡。在接种组中，仅10％(1/10)的所述动物死亡，其中70％(7/10)保持完全无肿瘤。当所述肿瘤直径超过1cm时无痛处死小鼠。注射肿瘤细胞与无痛处死之间的时间用作所述个体的存活时间。参照图4，对照小鼠(未给予疫苗)和NIVS免疫动物(一个月前局部应用107pfu AdCMV-hcea)经受肿瘤攻击。括号内数字表示每个处理组的动物数。结果表明，非侵袭性传递基因疫苗到所述皮肤能够引发抗表达特定抗原的肿瘤细胞的保护性免疫应答。
实施例5 编码细胞因子基因和共同刺激基因的重组腺病毒载体的构建
构建用于共同传递这些免疫调节调节基因和抗原基因到皮肤细胞的编码共同刺激基因和细胞因子基因的腺病毒载体，以试图在接种动物中控制所述免疫分布型。按照产生新腺病毒载体的标准方法(Gomez-Foix等，1992)，通过在人293细胞的两种转染质粒之间的同源重组，构建编码鼠B7-1基因的腺病毒载体AdCMV-mB7.1和构建编码鼠GM-CSF基因的腺病毒载体AdCMV-mgmcsf。在这些载体中的所有转基因均由CMV早期增强子-启动子元件驱动转录。通过用抗CD80抗体(PharMingen)染色转导的人肺癌SCC-5细胞，然后进行流式细胞分析，从而特征鉴定AdCMV-mB7.1。通过用ELISA试剂盒(Amersham)检测转导的SCC-5细胞分泌的鼠GM-CSF，从而特征鉴定AdCMV-mgmcsf。
实施例6 用体内细胞毒性分析检测抗肿瘤免疫
开发了体内细胞毒性分析，其中靶细胞以单层植入到小鼠的肌肉组织上(Tang等，1996)。靶细胞以单层植入使得可以有效重新取出靶细胞，用于评估体内生长数天后的结果。该分析法特别用于检测不足以有效消除靶细胞的弱免疫应答。所述植入床的组织学分析可以特征鉴定免疫应答。如果无免疫应答，靶细胞就会生长。如果是强力免疫应答，在所述植入床存在大量免疫效应细胞的情况下，应该可以消除靶细胞，所述免疫效应细胞可能是迁移到植入床部位和在生长的靶细胞周围原位致敏而产生。如果是弱免疫应答，生长的靶细胞将与所述植入床中的浸润的免疫效应细胞掺杂。以单层植入5×105RM1-luc细胞[表达所述荧光素酶基因的RM1前列腺肿瘤细胞]到首次用于实验的C57BL/6小鼠，使得因体内RM1-luc细胞增殖产生肿瘤层，而无免疫干预的证据。与对照动物相反，在通过皮肤定向非侵袭性传递AdCMV-luc接种的动物中，RM1-luc细胞与所述植入床中的大量免疫效应细胞掺杂。
实施例7 肿瘤细胞募集的免疫效应细胞的特征鉴定
所述体内细胞毒性分析通过以单层植入少量靶细胞到肌肉中，能够在所述植入床部位集中大量免疫效应细胞。在所述植入床的特异性免疫效应细胞的特征鉴定，可以提供是否已经引发杀伤靶细胞的细胞介导的免疫应答的证据。为了特征鉴定在皮肤定向非侵袭性传递AdCMV-luc接种的动物中由荧光素酶表达肿瘤细胞募集的T细胞，用抗CD3单克隆抗体(mAb)染色所述植入床的组织切片。通过脂质转染pHBA-luc DNA入RM1前列腺肿瘤细胞(由Baylor College ofMedicine的T.Thompson提供)，然后在含G418的培养液中选择，从而产生RM1-luc细胞。用荧光素酶分析特征鉴定表达荧光素酶的克隆。以单层植入5×105RM1-luc细胞到小鼠，所述小鼠已经通过皮肤定向非侵袭性传递108pfu AdCMV-luc接种。植入后5天，在O.C.T.中冷冻所述植入床，并以4μm切片，在100％丙酮中干燥，通过用二氨基联苯胺作色原的ABC免疫过氧化物方法，用抗CD3 mAb(克隆F500A2，由UAB的P.Bucy提供)染色。
如图5所示，在RM1-luc细胞在皮肤定向非侵袭性传递AdCMV-luc(x150)接种的小鼠中体内生长5天后，大量T细胞浸润入所述植入床，而在首次用于实验的动物仅发现少量T细胞。看来相同数目的RM1-luc靶细胞在接种动物中较在首次用于实验的动物中可以募集更多的T淋巴细胞到所述植入床。
为了特征鉴定由靶细胞募集的CTL，用反义粒酶A RNA分子作探针使所述植入床的冰冻切片经受原位杂交。以单层植入5×105RM1-luc细胞到或者首次用于实验的C57BL/6小鼠或者已经通过皮肤定向非侵袭性传递108pfu AdCMV-luc接种的小鼠。植入后5天，将所述植入床在O.C.T.中冷冻，并以4μm切片。冷冻切片在3％低聚甲醛中固定，在0.2M HCl中温育以抑制内源性碱性磷酸酶活性，并与热变性的反义粒酶A RNA探针杂交。原位杂交的探针是从含噬菌体启动子的质粒转录产生的单链RNA分子。在转录期间，洋地黄毒苷-UTP直接掺入所述序列。有义序列探针用作阴性对照。与探针杂交后，洗涤切片并与碱性磷酶缀合的抗洋地黄毒苷抗体温育，然后在NBT/BCIP酶底物溶液中温育。
表达粒酶A的CTL是活化的CTL并已经用作移植期间的组织排斥的预测标记。仅在已经通过皮肤定向非侵袭性传递AdCMV-luc接种的动物中的RM1-luc植入床中发现粒酶阳性的CTL(图6)。它们在所植入述床的存在提示，已经由NIVS诱导了抗表达特定抗原的肿瘤细胞的细胞介导的免疫应答。
实施例8 用粘性绷带局部应用基因疫苗
首次证实，绷带可以用于给予疫苗。该研制使得未经医疗训练的人可以传递均一剂量的非侵袭性疫苗到所述皮肤。为了由绷带转导皮肤，吸取50μl的实施例7中所述AdCMV-luc载体到粘性绷带的垫片(Johnson & Johnson)。随后将含载体的绷带粘着到预先剃刮的小鼠皮肤。所述载体与裸露皮肤接触18小时。为检测绷带传递的基因载体的转基因表达，检测所述皮肤的荧光素酶(表1)。尽管所述结果显示相当大的变异，但是用粘性绷带可以达到在所述皮肤中的转基因表达。
为了证实可以用非侵袭性粘性绷带接种动物，将含AdCMV-hcea的绷带粘到所述小鼠皮肤后2个月，检测尾血血清的抗CEA抗体。如图7所示，在100％通过粘性绷带接受非侵袭疫苗的小鼠中检测到抗CEA抗体。
实施例9 DNA/腺病毒介导的NIVS
通过将质粒DNA结合到腺病毒的外部，可以制备更多用途的基于腺病毒的载体。所产生的载体系统介导更高效地将基因传递到各种靶细胞。该方法使得在外源基因的大小和设计方面的适应性大大增加。因此DNA/腺病毒复合体能够通过具有更高适应性的相同腺病毒受体介导的胞吞途径将抗原基因传递到所述皮肤。
为了证实DNA/腺病毒介导的NIVS的可行性，将编码人生长激素(pCMV-GH)(Tang等，1992)的质粒DNA与E4缺陷型腺病毒复合。通过使DNA/腺病毒复合体与裸露的皮肤接触1天从而接种小鼠(C57BL/6株)。随后通过分析尾血血清，监测免疫动物的抗人生长激素蛋白(hGH)的抗体的产生。如图8a所示，泳道1，hGH(0.5μg)；泳道2，BSA(0.5μg)，在蛋白质印迹分析中所述测试血清与纯化的hGH反应，但是不与无关蛋白反应。在接种DNA/腺病毒复合体的10只小鼠中，8只(80％)在3个月内产生抗hGH抗体，表明能够产生抗质粒DNA编码的外源蛋白的特异性抗体，所述质粒DNA与腺病毒复合并以非侵袭性方式给予。处理前收集的免疫前血清、未处理动物血清和用无关载体接种的动物血清均不能与hGH反应。因此，DNA/腺病毒复合体象腺病毒重组体一样，是用于NIVS的合理载体系统。实施例10 DNA/脂质体介导的NIVS
除了研制包含作为非侵袭性疫苗载体的腺病毒的基因载体外，也已经证实局部应用无病毒元件的DNA/脂质体复合体可以接种小鼠。显而易见的是，许多不同的载体可以以创造性方式用于给予皮肤定向非侵袭性疫苗。如图8b所示，泳道1，hGH(0.5μg)；泳道2，BSA(0.5μg)，局部应用编码hGH的DNA/脂质体复合体免疫的小鼠的测试血清与hGH反应，但是不与BSA反应。在接种DNA/脂质体复合体的10只小鼠中，在5个月内其中9只(90％)处理动物的试验血清与纯化的hGH反应。因此，所述DNA/脂质体复合体象所述腺病毒和DNA/腺病毒复合体一样，是用于NIVS的另一个合理的载体系统。
实施例11 DNA编码的转基因和腺病毒编码的转基因的共表达
增强免疫系统的应答的策略可能潜在地改善疫苗的临床结果。局部产生涉及淋巴细胞群的活化和扩增的免疫调节分子，可以显著改善所述接种的效果。已经制备了编码鼠B7-1和GM-CSF基因的腺病毒载体。因此，局部应用DNA/腺病毒复合体可以在各个皮肤细胞中共表达DNA编码的抗原或免疫调节分子和腺病毒编码的抗原或免疫调节分子，以增强抗所述抗原的免疫应答。
图9表明，在靶细胞中的质粒DNA的转基因的表达取决于腺病毒的存在，因此使得质粒编码的转基因和腺病毒编码的转基因可以在相同细胞中共表达。如所述图中所示，以特定比率混合pVR-1216质粒DNA(Vical提供)、AdCMV-βgal颗粒和聚赖氨酸。所述复合体施加于孔中的2×105SCC-5细胞并温育2小时。然后去除所述复合体，第二天收集细胞用于荧光素酶和β-半乳糖苷酶分析。空心柱：荧光素酶活性；实心柱：β-半乳糖苷酶活性。结果表明，DNA编码的转基因在缺乏腺病毒的情况下不能在靶细胞中表达，而腺病毒编码的转基因可以在DNA存在的情况下表达。也可能的是，DNA可以凝聚在其它病毒表面以用于靶向不同细胞类型。因此，该方法提供简单但是通用的基因传递系统，该系统使得可以同时表达来自病毒重组体和外部结合的质粒的转基因。
实施例12 局部应用的不同基因载体在所述皮肤中的相对的转基因表达
已经表明，腺病毒重组体、DNA/腺病毒复合体、DNA/脂质体复合体和许多其它可能的基因载体均可用作非侵袭性疫苗的载体。可以想象的是，转基因表达的效率越高，所述载体的效能越大。为了确定所用载体的相对效率，使腺病毒重组体、DNA/腺病毒复合体或DNA/脂质复合体通过局部应用与小鼠皮肤接触18小时。随后从所述动物取出所述处理的皮肤，通过用Promega荧光素酶分析系统检测2分钟总的光发射，用发光计测定荧光素酶活性，并从所述读数减去本底。如图10所示，发现腺病毒重组体是用于皮肤定向非侵袭性基因传递的最高效载体系统。模拟处理小鼠在所述皮肤中未产生可检测的荧光素酶活性。LU，光单位；Ad，AdCMV-luc；DNA/Ad，与Ad d11014复合的pVR-1216 DNA；DNA/脂质体，与DOTAP/DOPE复合的pVR-1216 DNA。结果为平均log[LU/cm2皮肤]±SE(n标示于每个柱的顶部)。尽管DNA/腺病毒复合体的效率低于腺病毒重组体，但是它显著高于DNA/脂质体复合物。此外，在与DNA复合之前可用UV辐射使腺病毒失活，以防止活的病毒颗粒传播。因此，当在配制新一代疫苗中把效力和安全因素均考虑在其中时，DNA/腺病毒复合体可能是最有希望用于传递非侵袭性疫苗的载体系统。
在本说明书中提及的任何专利或出版物是说明本发明涉及领域技术人员的水平。这些专利和出版物通过引用结合到本文中，其引用程度与每个出版物具体、单独表明的引用结合程度相同。
所述领域技术人员应该容易认识到，可以很好修改本发明以实施所述目标，并实现所述的以及其固有目的和优势。所述实施例与本文所述方法、步骤、处理、分子和特定化合物是当前典型的优选实施方案，是典型的实施方案，其目的不是限制本发明范围。按所述权利要求书的范围限定，对于本领域技术人员对其进行的修改和其它应用均包括在本发明的精神范围内。
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                 表1
    温育时间(小时)     LU/cm2皮肤
    1     0
    1     2,100
    2     0
    2     0
    2     6,200
    2     7,300
    2     13,000
    2     48,000
    2     1,800
    2     13,000
    18     830
    18     2,400
    18     260
    18     630
    18     1,300,000
    18     24,000
    18     2,700
    18     280

Claims (56)

1.一种非侵袭性诱导免疫应答的方法，包括以下步骤：通过将免疫有效量的编码目的转基因的基因载体局部应用到所述皮肤，从而使其接触需要这种治疗的动物的皮肤。
2.权利要求1的方法，其中所述基因载体包括能够表达转基因的基因载体。
3.权利要求2的方法，其中所述基因载体选自病毒载体和质粒DNA。
4.权利要求2的方法，其中所述基因载体是腺病毒。
5.权利要求1的方法，其中所述转基因编码抗原或其片段。
6.权利要求5的方法，其中所述抗原或其片段可用来产生抗病原体或肿瘤的免疫应答。
7.权利要求5的方法，其中所述抗原基本上选自人癌胚抗原、HIV gp120抗原、破伤风毒素C片段和流感NP抗原和HA抗原。
8.权利要求1的方法，其中所述基因载体的免疫有效量对于腺病毒载体至少约100个蚀斑形成单位(pfu)，而对于质粒至少为1ngDNA。
9.权利要求2的方法，其中所述载体编码免疫调节基因。
10.权利要求9的方法，其中所述载体还编码共同刺激基因和细胞因子基因。
11.权利要求9的方法，其中所述免疫调节基因选自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和干扰素基因。
12.权利要求4的方法，其中所述腺病毒载体是其E1区缺陷型。
13.权利要求4的方法，其中所述腺病毒载体是其E4区缺陷型。
14.权利要求4的方法，其中所述腺病毒载体是其E3区缺陷型。
15.权利要求4的方法，其中所述载体缺失所有病毒基因。
16.权利要求3的方法，其中所述载体包括DNA/病毒复合体。
17.权利要求16的方法，其中所述DNA是质粒形式的DNA。
18.权利要求3的方法，其中所述载体包括DNA/脂质体复合体。
19.权利要求3的方法，其中所述载体包括编码抗原或其片段的重组腺病毒。
20.权利要求1的方法，其中所述免疫应答产生抗感染性病原体或肿瘤的保护性效应。
21.权利要求1的方法，其中所述接触步骤还包括在传递装置中配置含有目的基因的基因载体，并将其中具有含所述目的基因的基因载体的装置用于所述动物皮肤。
22.权利要求21的方法，其中所述装置包括垫片。
23.权利要求21的方法，其中所述装置包括粘性绷带样装置。
24.在需要这种治疗的动物中非侵袭性诱导抗肿瘤免疫应答的方法，包括以下步骤：
通过局部应用免疫有效浓度的含转基因的载体到所述皮肤，从而使其接触所述动物的皮肤，所述转基因编码抗原或其片段，所述抗原或其片段给予后在所述动物中诱导抗肿瘤效应。
25.权利要求24的方法，其中所述基因载体包括能够表达转基因的基因载体。
26.权利要求25的方法，其中所述基因载体选自病毒载体和质粒DNA。
27.权利要求25的方法，其中所述基因载体是腺病毒。
28.权利要求24的方法，其中所述转基因编码抗原或其片段。
29.权利要求28的方法，其中所述抗原或其片段可以用来产生抗肿瘤的免疫应答。
30.权利要求28的方法，其中编码所述抗原的转基因包括癌基因、肿瘤抑制基因和肿瘤相关基因。
31.权利要求24的方法，其中所述基因载体的免疫有效量对于腺病毒载体来说，至少约100个蚀斑形成单位(pfu)，而对于质粒至少为1ng DNA。
32.权利要求25的方法，其中所述载体编码免疫调节基因。
33.权利要求32的方法，其中所述载体还编码共同刺激基因和细胞因子基因。
34.权利要求32的方法，其中所述免疫调节基因选自GM-CSF基因、B7-1基因、B7-2基因、白介素-2基因、白介素-12基因和干扰素基因。
35.权利要求27的方法，其中所述腺病毒载体是其E1区缺陷型。
36.权利要求27的方法，其中所述腺病毒载体是其E4区缺陷型。
37.权利要求27的方法，其中所述腺病毒载体是其E3区缺陷型。
38.权利要求27的方法，其中所述载体缺失所有病毒基因。
39.权利要求26的方法，其中所述载体包括DNA/病毒复合体。
40.权利要求39的方法，其中所述DNA是质粒形式的DNA。
41.权利要求26的方法，其中所述载体包括DNA/脂质体复合体。
42.权利要求27的方法，其中所述载体包括编码抗原或其片段的重组腺病毒。
43.权利要求24的方法，其中所述免疫应答产生抗肿瘤效应。
44.权利要求24的方法，其中所述接触步骤还包括在传递装置中配置含有目的基因的基因载体，并将其中具有含所述目的基因的基因载体的装置用于所述动物皮肤。
45.权利要求44的方法，其中所述装置包括垫片。
46.权利要求44的方法，其中所述装置包括粘性绷带样装置。
47.形成DNA/病毒复合体的方法，所述方法包括以下步骤：
提供合适的病毒载体；
提供待与所述病毒载体复合的DNA样品；和
在存在聚赖氨酸的情况下一起混合所述病毒载体和DNA样品。
48.权利要求47的方法，其中所述病毒载体是腺病毒。
49.权利要求47的方法，其中所述DNA样品包括目的基因。
50.权利要求49的方法，其中所述基因编码抗原或其片段。
51.权利要求47的方法，其中所述聚-L-赖氨酸(PLL)与DNA样品的比率范围为约0.9μgPLL：1.0μg DNA至9.0μg PLL：1ug DNA
52.权利要求47的方法，其中所述聚-L-赖氨酸(PLL)与腺病毒载体的比率范围为约6.0μg PLL：108pfu腺病毒至6.0μg PLL：1010pfu腺病毒。
53.传递基因载体到动物皮肤表面的装置，所述装置包括：
皮肤接触装置包括具有第一面和第二面的第一片材料，将所述第一面用于接触所述动物皮肤表面；和第一面置于所述第一片材料的所述第一面对面的第二片材料；
所述第一片材料和所述第二片材料在其外缘部分周围结合在一起，以其间限定一个密封的中央空间，用于在其中装置基因载体；和
构成所述第一片的材料在结构上弱于构成所述第二片的材料，由此当所述基因载体放置于所述空间中，并施加外力于所述第二片的第一面时，所述第一片在所述第二片之前破裂，使得所述基因载体接触所述动物的皮肤。
54.按照权利要求53的装置，其中所述第一片材料的所述第一面包括沿其外周配置的胶粘剂，以将所述装置固定于所述动物皮肤的表面，其中叠于所述空间的所述第一片材料的部分基本上无胶粘剂。
55.按照权利要求53的装置，其中所述材料片由不渗透载体的材料构成。
56.按照权利要求53的装置，其中所述材料片由高分子材料构成。
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