CN101440126B - 一种特异性靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽的获得及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种特异性靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽的序列，以及该导向性多肽在肿瘤和肿瘤转移灶早期诊断和靶向治疗中的具体用途，属于肿瘤的生物治疗领域。利用细菌鞭毛随机肽库筛选、免疫荧光法体外验证、荷瘤小鼠模型体内验证等技术，获得靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽，其技术特征在于：导向肽核心序列为一段5肽：NVVRQ，命名TMP1。该导向性多肽具有以下突出的技术优势：能特异性识别肿瘤及其转移灶；能选择性被肿瘤细胞内吞，可作为靶向工具；对肿瘤细胞有特异性细胞毒效应。该导向性多肽在肿瘤及其转移灶的早期诊断中具有独特的实用价值，同时也为肿瘤治疗提供了理想的靶向与强效杀伤兼具的治疗应用途径。

Description

一种特异性靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽的获得及用途

一、技术领域

本发明涉及一种特异性靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽的获得，其技术特征在于利用细菌鞭毛随机肽库技术体外对两株具有高转移和不转移潜能的前列腺癌细胞进行四轮正负筛选，通过化学合成多肽进行体外和体内验证，获得了一段特异性靶向肿瘤及其转移灶的五肽“TMP1”。发明内容属于肿瘤的生物治疗领域。 

二、背景资料 

恶性肿瘤已成为危害人类健康的首要疾病。据国内最新流行病学调查资料显示：我国现有癌症病人300多万人，每年死于恶性肿瘤的患者约为130万人，每年有160万到200万新发的恶性肿瘤病例，并以3％的速度递增，给我国人民的生活和健康造成巨大威胁，一定程度上制约了我国经济的可持续发展。确切证据表明，90％以上的恶性肿瘤患者最终死于肿瘤转移或复发。肿瘤通过血道、淋巴道发生全身转移，这些遍布全身的转移灶无法通过传统的手术、放射治疗一一清除，全身化疗对其亦难以根治，且往往伴随明显的毒副作用，严重者甚至导致患者死亡。虽然新的检测方法和治疗手段不断面市，但肿瘤转移的诊断和治疗仍没有得到很好的改善，患者生存率也没有明显提高。因而针对肿瘤及其转移灶的早期诊断和靶向性治疗方法的革新面临国家非常迫切的重大需求。 

研究已经证实，肿瘤在其演进过程中分化为不同转移潜能的亚克隆，其中高转移潜能的亚克隆易于离开原发瘤部位，到达局部或身体远隔器官，形成转移瘤。这些高转移的肿瘤组织、细胞表面存在特殊分子标记，若能找到与之特异性结合的配体，即可以此进行肿瘤及其转移灶的早期诊断和靶向阻遏，其中最为关键的环节就是寻找肿瘤，尤其是具有高转移潜能的亚克隆所表达的特异性分子，实施分子靶向诊断和治疗。在肿瘤转移内在分子机制逐渐明了的新的历史条件下，肿瘤分子医学理论和方法学的突破引发了一系列发展新型肿瘤及其转移灶诊断治疗模式的尝试。 

目前分子靶向治疗的手段主要有两类：单克隆抗体和导向性多肽(Homing peptide)。其中，单克隆抗体是研究较早的肿瘤靶向分子，作为近年医学领域发展中最具有生命活力的部分之一，已广泛应用于多种肿瘤的临床试验性治疗。但值得注意的是，尽管以往应用单克隆抗体在肿瘤的影像学诊断及治疗方面获得一定的成功，这些单克隆抗体的种类却非常有限，并且在实际应用中还存在以下缺点：①体积较大，在肿瘤组织、细胞中穿透力较弱，并可被 肝脏及网状内皮系统非特异性摄取、吞噬；②对肝脏、骨髓的剂量相关毒性作用；③免疫原性强。上述缺点限制了单克隆抗体在临床的应用。 

导向性多肽以其在肿瘤诊断和靶向性治疗领域的独特优势而备受关注，他们具有：①血浆清除速度快、高亲和力、高特异性；②良好的组织穿透性，能被肿瘤细胞摄取；③易于化学合成并且低免疫原性的特点，可减少、避免上述单克隆抗体的不足。因而近年来，寻找能与肿瘤组织特异性结合的短肽，进行肿瘤靶向成为新的研究热点。 

近十余年，国内外研究者应用肽库技术针对不同的靶点进行不同的肿瘤导向肽筛选，例如Arap W等对乳腺癌荷瘤小鼠进行肽库筛选后获得一系列与肿瘤血管特异性结合的短肽，其中的RGD序列被证实可与α_V整合素结合，可特异性靶向多种肿瘤。将RGD序列与阿霉素交联后应用于荷瘤小鼠，发现药物的抗肿瘤疗效显著增加而毒性作用明显减少。此后，关于RGD肽的多项临床应用基础研究显示RGD肽可偶联放射性核素等造影剂进行肿瘤影像学诊断；可偶联腺病毒等基因治疗载体进行肿瘤靶向性治疗；还可作为其他肿瘤靶向药物运输的良好载体，显示了导向肽技术在肿瘤诊断和治疗领域中广阔的应用前景。此外，还有许多肿瘤相关抗原/肿瘤细胞、肿瘤血管、肿瘤淋巴管导向肽筛选等方面的研究。作为一类新兴的生物技术药物，目前已有数种多肽药物通过FDA审批，投入临床应用。而在巨大的医疗需求的推动下，利用导向肽制备用于肿瘤诊断、治疗的造影剂、药物和制备基因治疗载体制剂将有可能在近年内正式上市成为临床治疗药物，成为肿瘤现有治疗体系的一个不可缺少的组成部分，为肿瘤问题的最终解决带来了新的希望。 

另一方面，尽管已经有许多导向肽的研究结果，但是针对肿瘤转移灶的导向性多肽筛选却鲜有报道。肿瘤转移的早期，往往先在转移部位形成亚临床状态微小病灶，这些病灶直径小于2mm，现有的CT、PET/CT、超声影像学等检测手段无法对其进行定位。一部分逃避了机体的免疫杀伤作用的微小病灶最后发展成为临床可检测的转移灶。如何利用肽库技术筛选靶向肿瘤转移灶的导向性多肽，早期发现处于亚临床状态的微小肿瘤转移灶，实现靶向药物运输，将肿瘤转移消灭在早期阶段仍然是目前医学面临和亟待解决的关键问题。 

三、发明内容

基于以上技术背景和重大的医疗需求，本发明将公开一种特异性靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽的筛选方法和序列。通过该方案获得的导向性多肽TMP1具有靶向高转移潜能肿瘤、早期识别肿瘤亚临床微小转移灶病灶、可选择性被肿瘤细胞内吞并具备较强的肿瘤细胞 毒效应等明显优势，适于作为载体工具携带造影剂和药物进行肿瘤转移的早期诊断和靶向治疗，可以解决目前肿瘤转移诊断和治疗技术中关键的不足之处。 

本发明的理论基础基于现有研究对肿瘤转移内在分子机制的深入认识。肿瘤在其演进过程中分化为不同转移潜能的亚克隆，其中高转移潜能的亚克隆易于离开原发瘤部位，到达局部或身体远隔器官，形成转移瘤。这些高转移的肿瘤组织、细胞表面存在特殊分子标记。这些分子标记可能是我们已知的肿瘤转移相关抗原，也可能是未知抗原。若能找到与之特异性结合的配体，即可以此进行肿瘤及其转移灶的早期诊断和靶向阻遏。而导向性多肽是目前认为比较理想的一种肿瘤诊断和靶向性治疗的载体工具。尽管已经有许多导向肽的研究结果，其中部分已经进入临床试验，取得较好疗效，但是针对肿瘤转移灶的导向性多肽筛选却鲜有报道。 

利用细菌鞭毛随机肽库技术筛选肿瘤导向性多肽有以下几个优点：1、库容量大，可达到10⁸～10⁹，属于高通量筛选；2、可事先不必知道筛选物质的结构等信息；3、操作简单，可重复性强，不似噬菌体肽库易发生污染。因此，在本发明中采用了细菌鞭毛随机肽库技术，体外对两株具有高转移和不转移潜能的前列腺癌细胞进行四轮正负筛选，通过化学合成多肽进行体外和体内验证，获得了一段特异性靶向肿瘤及其转移灶的五肽序列：NVVRQ，命名为“TMP1”。 

与现有的导向性多肽相比，本发明达到了以下效果： 

1、TMP1对已检测的所有高转移潜能肿瘤均能特异性识别，包括前列腺癌、肺癌、乳腺癌和胃癌；而正常组织基本无信号。 

2、对于上述肿瘤的亚临床微小转移病灶，即使直径仅为1mm，TMP1亦有很好的识别作用； 

3、TMP1可直接穿透细胞膜，进入胞浆和胞核，有利于其作为载体工具携带药物进行抗肿瘤治疗；以改善现有化疗药物缺乏选择性，毒、副作用强，宿主与肿瘤之间治疗窗小的缺点，提升临床疗效的发挥。 

4、TMP1还有较强的肿瘤直接杀伤效应，较低剂量即可引起肿瘤细胞凋亡，而对正常组织、细胞无明显毒副作用。使其作为一种兼具肿瘤靶向和杀伤效应的载体工具，可发挥抗肿瘤的协同作用。 

5、对肿瘤动物模型的体内研究证实，通过肿瘤局部注射用药途径，该导向性多肽对受试的所有肿瘤动物模型均具显著的治疗作用，且对动物无明显的治疗相关毒性。 

四、附图 

附图1：TMP1的氨基酸序列及其空间构象计算机模拟图。在TMP1的核心序列的N端和C端分别加上一个甘氨酸和一个半胱氨酸，并利用两个半胱氨酸氧化成二硫键，形成环肽结构，使TMP1具有稳定的空间构象。 

附图2：TMP1体外对各种高转移潜能肿瘤细胞的特异性靶向识别。图中显示，TMP1能特异性识别高转移潜能前列腺癌细胞PC-3M-1E8，肺癌细胞PG-BE1，乳腺癌细胞MDA-MB-435S、MDA-MB-231，显示为强膜荧光染色。而DAPI染核后利用激光共聚焦显微镜高倍镜下观察发现，胞浆及核内也有TMP1的荧光信号，提示有TMP1穿过细胞膜进入胞浆、胞核；而TMP1的5个氨基酸序列随意重新排列后的错序肽与PC-3M-1E8细胞无结合，仅显示为背景染色；TMP1不识别低转移潜能PC-3M-2B4细胞，仅显示为背景染色。 

附图3：TMP1体内在PC-3M-1E8荷瘤小鼠模型肿瘤及正常组织中的分布。图中显示：7.1mg/ml FITC-TMP1 50μl在荷瘤小鼠体内循环24h后，在肿瘤部位聚集，肿瘤组织切片可见强荧光信号；而肝脏可见少量荧光信号，为网状内皮系统的非特异性摄取；肾脏可见模糊的荧光信号，可能为多肽的代谢通道；肠腔亦可见较强荧光信号，考虑为多肽经肝脏代谢后由胆管系统排泄所致；其余正常脏器均未见荧光信号。 

附图4：TMP1体内对各种转移潜能肿瘤的靶向识别。图中显示：TMP1在体内对源于PC-3M-1E8的高转移前列腺癌、MDA-MB-435S的高转移乳腺癌和MKN-45sci高转移胃癌肿瘤有很好的靶向性；且利用DAPI对冰冻组织切片细胞核染色，激光共聚焦显微镜观察，也可见TMP1荧光信号主要位于切片标本的细胞浆和核内，同样说明TMP1靶向肿瘤后可穿透肿瘤细胞膜而进入胞浆、胞核；而TMP1对源于PC-3M-2B4不转移前列腺癌无识别，符合实验设计的正负筛选原则，错序肽对PC-3M-1E8肿瘤无靶向，证明TMP1对肿瘤靶向的特异性。 

附图5：TMP1体内对肿瘤转移灶的靶向识别。图中显示：小鼠胃癌模型肝实质内转移灶可见强FITC荧光信号，明显强于周围正常肝组织，且转移灶直径仅为1mm，处于亚临床状态。 

附图6：TMP1体内外抗肿瘤效应。实验结束时，TMP1治疗组肿瘤大小明显小于对照组，肿瘤抑制率超过80％， 

五、具体实施方式

例1、TMP1的筛选 

1、细菌鞭毛肽库体外正负筛选高低转移潜能前列腺癌配对细胞(FliTrx^TM Random Peptide Display Library，FliTrx^TM Panning Kit，鼠抗Thio均购自Invitrogen公司) 

①高低转移潜能前列腺癌配对细胞PC-3M-1E8、PC-3M-2B4接种10cm平皿，过夜培养，待细胞贴壁良好，90％融合； 

②取一支肽库原液，室温融化后置无菌锥形瓶中，加入IMC培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)50ml，250rpm 25℃摇菌过夜约16小时； 

③取部分过夜培养的菌液测OD₆₀₀，根据1 OD₆₀₀≈1×10⁹cells，取含1×10¹⁰细胞的菌液，加入50ml IMC培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)中，加入色氨酸500μl，250rpm 25℃摇菌6小时，以诱导细菌鞭毛肽库表达； 

④封闭PC-3M-1E8、PC-3M-2B4：在加入肽库前1小时，去除细胞培养基，加入新鲜配置的封闭液，含：IMC培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)9.2ml，脱脂奶0.1g，5M NaCl 300μl，20％α-甲酰甘露糖甙500μl，置于水平摇床，室温封闭1小时； 

⑤在肽库诱导即将结束时，取一支试管，加入脱脂奶0.1g，5M NaCl 300μl，20％α-甲酰甘露糖甙500μl，取出10ml诱导后肽库菌液，加入上管，漩涡混匀； 

⑥去除PC-3M-2B4平皿中封闭液，加入上述肽库菌液，水平摇床50rpm轻柔混匀1分钟，室温1小时； 

⑦1小时后，弃去PC-3M-1E8平皿中封闭液，吸出PC-3M-2B4平皿中菌液(此即为未与PC-3M-2B4结合的肽库菌液)加入，水平摇床50rpm轻柔混匀1分钟，室温1小时； 

⑧弃去PC-3M-1E8平皿中肽库菌液(此即为未与PC-3M-1E8结合的肽库菌液)，加入洗涤液10ml，水平摇床50rpm轻柔洗涤5分钟，重复洗涤共5次，以去除未与PC-3M-1E8结合的肽库菌液； 

⑨最后一次洗涤后去除洗液，平皿置于漩涡振荡器上振荡30秒，加入IMC培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)10ml涮洗，吸出培养基，置于50ml离心管中250rpm 25℃摇菌过夜； 

⑩重复上述正负筛选共4次，最后一轮筛选后的摇菌过夜培养产物倍比稀释，涂于RMG平板，25℃倒置培养； 

观察平板，稀释至10⁴之平板克隆数量多，大小适中，易于挑取，从中随机挑取100个克隆，摇菌扩增，保种后送测序。 

2、计算机分析测序结果 

将测序结果中编码多肽的核苷酸序列翻译成氨基酸序列，利用计算机分析获得重复2～3次以上的三肽以上多肽序列。 

3、免疫荧光法验证含重复序列的细菌克隆与PC-3M-1E8细胞的亲和力 

①PC-3M-1E8细胞种六孔板细胞爬片，过夜培养，待细胞贴壁，50％融合； 

②取含重复序列的单克隆菌液，加入IMC培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)3ml中，小量摇菌扩增，25℃，250rpm过夜培养； 

③次日，取300μl过夜培养的菌液，加入3ml IMC培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)中，加入色氨酸30μl，250rpm 25℃摇菌6小时，以诱导细菌鞭毛肽库表达； 

④封闭PC-3M-1E8：在加入肽库前1小时，去除细胞培养基，加入新鲜配置的封闭液，每孔2ml，含：IMC培养基(含100μg/ml氨卞青霉素)1.84ml，脱脂奶0.02g，5M NaCl 60μl，20％α-甲酰甘露糖甙100μl，置于水平摇床，室温封闭1小时； 

⑤诱导6小时后，取部分菌液测OD₆₀₀，取含2×10⁹细胞的菌液，加入终浓度为1％脱脂奶，150mM NaCl，1％α-甲酰甘露糖甙； 

⑥弃去PC-3M-1E8孔板中封闭液，加入上述菌液，水平摇床50rpm轻柔混匀1分钟，室温1小时； 

⑦去除菌液，洗涤5次，每次洗液2ml； 

⑧从孔板中取出细胞爬片，晾干，固定于载玻片上，冰无水乙醇∶丙酮(1∶1)固定，PBS洗3次； 

⑨鼠抗thio 1∶4000，4℃湿盒孵育过夜； 

⑩PBS洗3次，加入FITC-抗鼠二抗1∶100，37℃蔽光孵育1小时； 

 PBS洗3次，碳酸钠甘油封片，荧光显微镜观察拍照。 

此实验中肽库原液作为阴性对照克隆，PC-3M-2B4作为阴性对照细胞。相同的实验重复3次。由上述实验获得对PC-3M-1E8具有最强亲和力的27#和50#克隆，其共同具有一段5肽重复序列：NVVRQ，命名“TMP1” 

例2、体外验证TMP1对高转移潜能肿瘤细胞的亲和力 

1、设计一段多肽，在TMP1的N端和C端分别加上一个甘氨酸和一个半胱氨酸，并利用两个半胱氨酸氧化成二硫键，形成环肽结构，序列如下：GCGNVVRQGC。使TMP1具有稳定的空间构象； 

2、化学合成TMP1肽，并在N端修饰FITC，序列如下：FITC-GCGNVVRQGC(以下简称“FITC-TMP1”)。此外，将TMP1的5个氨基酸序列随意重新排列，加上同样空间结构，并在N端修饰FITC，序列如下：FITC-GCGVNQRVGC(以下简称“FITC-错序肽”)作为阴性对照肽； 

3、用无菌水溶解合成的FITC-TMP1和FITC-错序肽，浓度为7.1mg/ml，分装后-20℃保存； 

4、细胞种六孔板细胞爬片，过夜培养，待细胞贴壁，50％融合； 

5、更换培养基，每孔加入1640培养基2ml，多肽溶液1μl，37C蔽光继续培养2小时； 

6、吸尽培养基，PBS轻柔漂洗5次，取出细胞爬片，晾干，冰无水乙醇∶丙酮(1∶1)固定，PBS洗3次； 

7、碳酸钠甘油封片，荧光显微镜观察拍照。 

以上实验组细胞包括高转移前列腺癌细胞PC-3M-1E8，肺癌细胞PG-BE1，乳腺癌细胞MDA-MB-435S、MDA-MB-231，低转移潜能的前列腺癌细胞PC-3M-2B4、乳腺癌细胞MCF-7作为阴性对照细胞。相同的实验重复3次。结果TMP1均能特异性识别高转移潜能肿瘤细胞，显示强膜荧光染色；而TMP1的5个氨基酸序列随意重新排列后的错序肽与PC-3M-1E8细胞无结合，仅显示为背景染色；TMP1不识别低转移潜能PC-3M-2B4、MCF-7细胞，仅显示为背景染色。 

例3、体内验证TMP1对不同肿瘤及肿瘤转移灶的靶向性 

1、建立PC-3M-1E8、PC-3M-2B4前列腺癌皮下瘤荷瘤小鼠模型，MDA-MB-435S乳腺癌原位移植模型和皮下瘤模型；建立MKN-45sci胃癌原位移植肝转移模型；建立PC-3M-1E8皮下瘤自发肝转移模型； 

2、荷瘤小鼠尾静脉注入7.1mg/ml FITC-TMP1 20μl～150μl，并于不同时段处死小鼠，左心室注射5ml PBS冲洗后，取心、肝、脾、肺、肾、脑、脊髓、胃、小肠、大肠、肌肉、前列腺、睾丸、附睾、肿瘤组织，行冰冻切片，冰无水乙醇∶丙酮(1∶1)固定，荧光显微镜 观察拍照； 

3、竞争性拮抗试验验证TMP1对肿瘤靶向的特异性：PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤荷瘤小鼠分别尾静脉注入7.1mg/ml FITC-TMP1 50μl和7.1mg/ml FITC-TMP1 50μl与2.4mg/ml TMP1150μl混合液，24小时后处死小鼠，取肿瘤组织进行冰冻切片，冰无水乙醇∶丙酮(1∶1)固定，荧光显微镜高倍镜下随机选取切片中不同部位荧光集中部位共10处观察拍照，图像分析系统进行荧光强度分析。 

FITC作为阴性对照，FITC-错序肽作为阴性对照肽。每实验组设小鼠3只。 

结果：①7.1mg/ml FITC-TMP1 20μl在荷瘤小鼠体内循环24h后，在肿瘤部位聚集，肿瘤组织切片可见较强荧光信号；而肝脏可见少量荧光信号，为网状内皮系统的非特异性摄取；肾脏可见模糊的荧光信号，可能为多肽的代谢通道；肠腔亦可见较强荧光信号，考虑为多肽经肝脏代谢后由胆管系统排泄所致；其余正常脏器均未见荧光信号。实验结果说明：TMP1在体内有很好的肿瘤导向性，可靶向高转移潜能的PC-3M-1E8前列腺癌。在实验中，进一步降低FITC-TMP1的用量或降低循环时间，肿瘤部位的荧光信号都会显著减弱消失，说明此浓度已为FITC-TMP1体内导向肿瘤的最低有效浓度。②增加FITC-TMP1用量至50μl，荷瘤小鼠体内循环3小时，亦可见肿瘤部位富集的荧光信号；而即使增加FITC-TMP1用量至150μl，体内循环时间降低至2小时，肿瘤部位亦无信号。说明3小时的体内循环时间可以让TMP1有效的导向肿瘤细胞，这与文献报道相似，但进一步延长循环时间至24小时使这种肿瘤靶向更为有效，肿瘤部位富集更强的荧光信号，而同时其他正常组织中荧光信号强弱无明显改变。③TMP1在体内对源于PC-3M-2B4的不转移前列腺癌无识别，符合实验设计的正负筛选原则。④TMP1在体内对源于MDA-MB-435S的高转移乳腺癌和MKN-45sci高转移胃癌肿瘤有很好的靶向性，50μl FITC-TMP1体内循环3小时或更长时间后，在肿瘤部位可以看到强荧光信号，原位肿瘤的信号与皮下肿瘤的信号强度无显著差异。⑤PC-3M-1E8皮下瘤自发肝转移小鼠和MKN-45sci胃癌肝转移小鼠模型，在尾静脉注入7.1mg/ml FITC-TMP1 50μl，体内循环4小时后，取肝脏行冰冻切片，观察发现：小鼠肝被膜、实质内多个大小不等转移灶，这些转移灶均可见强FITC荧光信号，明显强于周围正常肝组织，其中最小的转移灶直径仅为1mm，处于亚临床状态。说明TMP1在体内能很好的识别肿瘤微小转移灶，有可能作为肿瘤早期诊断和早期治疗的载体工具。⑥DAPI进行冰冻组织切片细胞核染色，激光共聚焦显微镜观察，可见 TMP1在体内循环4小时后，其荧光信号主要位于细胞浆和核内，说明TMP1靶向肿瘤后可穿透肿瘤细胞膜，这个特性使其更适合作为药物载体进行肿瘤靶向治疗。⑦竞争性拮抗实验中，由于无FITC标记的TMP1与FITC-TMP1可竞争结合PC-3M-1E8肿瘤细胞上的受体，导致肿瘤组织荧光信号较FITC-TMP1组明显减弱一倍以上，差异具有极显著性(P＜0.01)。实验说明TMP1对PC-3M-1E8肿瘤细胞的识别具有特异性。⑧由TMP1的5肽核心序列顺序改变后获得的错序肽作为实验的阴性对照，其在体内对肿瘤无靶向，说明TMP1在体内对肿瘤的靶向性是具有特异性的。 

例4、TMP1体内抗肿瘤特性的鉴定 

肿瘤细胞动物模型：选择PC-3M-1E8前列腺癌皮下瘤生长良好，全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成1mm直径的瘤块，接种于裸小鼠双侧背部皮下，约二周后实验动物肿瘤生长至1～2mm，每组4只动物，用100μg TMP1直接肿瘤内注射，隔日一次，治疗后每周用游标卡尺测量肿瘤长、宽径，共治疗4周。用公式：v＝width² ×length/2计算肿瘤的体积大小。对照组用生理盐水或错序肽进行治疗。 

实验结果表明：实验结束时，TMP1治疗组肿瘤大小明显小于对照组，肿瘤抑制率超过80％，取各组小鼠肿瘤及正常组织石蜡切片，HE染色显示治疗组肿瘤组织内大片坏死，而正常组织无明显病理改变；TUNEL染色也证明治疗组肿瘤组织内凋亡细胞明显多于对照组。实验说明TMP1体内有良好的抗肿瘤效应，且对正常组织无明显毒副作用，其作为一种有效的抗肿瘤药物和基因治疗载体，可发挥抗肿瘤的协同作用。 

附件                   氨基酸序列表 

<110>深圳市奥尼克斯基因技术有限公司 

<110>马丁 王世宣 周剑峰 卢运萍 杨婉华 

<120>一种特异性靶向肿瘤及其转移灶的导向性多肽的获得及用途 

<140> 

<141> 

<160>1 

<170> 

<210>1 

<211> 

<212>氨基酸 

<213>人工序列 

<220> 

<223> 

<400> 

一段特异性靶向肿瘤及其转移灶的五肽序列TMP1：NVVRQ。 

Claims (2)

1.一种肿瘤及其转移灶导向性多肽，其序列为GCGNVVRQGC，其中两个半胱氨酸氧化成二硫键，形成环肽结构。

2.权利要求1所述的多肽在制备用于高转移潜能肿瘤及其转移灶的诊断标记物中的应用，其中所述高转移潜能肿瘤为高转移潜能前列腺癌、高转移潜能肺癌或高转移潜能乳腺癌。

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