CN102533858A - 一种肿瘤特异复制型腺病毒抗肿瘤制剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种肿瘤特异复制型腺病毒抗肿瘤制剂。本发明通过有效构建病毒载体，获得的溶瘤性腺病毒可特异性地识别肿瘤细胞，对于其它细胞则没有杀伤能力，因此是高效且安全的，具有良好的应用价值。

Description

一种肿瘤特异复制型腺病毒抗肿瘤制剂

技术领域

本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种肿瘤特异复制型腺病毒抗肿瘤制剂。

背景技术

恶性肿瘤是当今世界严重威胁人类健康的疾病，在工业化国家，每五个人中就有一个死于和癌症相关的疾病。在中国，癌症已经占死亡原因的首位，接近发达国家水平。流行病学研究提示肿瘤正在成为威胁人类安全的头号杀手。传统治疗肿瘤的方法包括：手术治疗、放射治疗和化学治疗，然而，这些传统的治疗方法都存在着局限性，对很多中晚期肿瘤患者往往缺少合适的治疗手段，开发安全高效的生物治疗方法已成为肿瘤治疗领域关注的热点。

随着分子生物学技术的进步和人类对肿瘤免疫、肿瘤病因及分子机制等研究的深入，肿瘤基因治疗取得了突飞猛进的发展，截止2008年7月，全世界肿瘤生物治疗临床研究共1373项，基因治疗占62.86％，共计863项。基因治疗是指将一段外源性功能基因导入到靶细胞内，以纠正先天性代谢异常、补偿基因缺失或提供新的功能，抑制和杀伤肿瘤细胞为目的的治疗方式，构建高效安全的基因运输载体是肿瘤基因治疗的关键，常用的载体分为病毒载体和非病毒载体，其中腺病毒载体是目前应用最广泛的病毒载体。

腺病毒载体与其他病毒载体相比较具有许多独特的优点，如宿主细胞广泛，能感染分裂期和非分裂期细胞；转导效率高，表达水平高；病毒扩增和纯化相对简单，病毒滴度高；适合于在体内使用，不整合到宿主细胞基因组；腺病毒颗粒比较稳定，基因组较少重排，所携带的治疗基因在体内非常稳定。目前用于肿瘤基因治疗的主要是由2型和5型，并且绝大多数编码有潜在治疗作用的基因载体是用5型构建的(参见Volpers C，Kochanek S.Adenoviral vectors for gene transfer and therapy.J Gene Med.2004；Suppl 1：s164-171；St George JA.Gene therapy progress and prospects：adenoviralvectors.Gene Ther.2003；10：1135-1141；Vorburger，S.A.and K.K.Hunt，Adenoviralgene therapy.Oncologist，2002.7(1)：p.46-59；Imperiale，M.J Top Microbiol and S.Kochanek，Adenovirus vectors：biology，design，and production.Curr Immunol，2004.273：p.335-57；Hallden，G.，et al.，Replication-selective oncolytic adenoviruses.MethodsMol Med，2004.90：p.71-90)。比如世界首个获准上市的基因治疗药物“今又生”就是利用复制缺陷性腺病毒携带治疗基因p53，达到抗肿瘤效果。然而这种复制缺陷性腺病毒载体本身存在一些缺陷，比如在瘤体分布效率很低，外源基因不能持续表达，缺乏对肿瘤细胞的特异靶向性等，另外腺病毒载体对一些缺乏其相应受体的细胞感染效率很低，重组腺病毒的构建过程易产生野生病毒污染，易产生免疫反应等也制约了“今又生”的临床治疗效果和安全性。为了克服上述的缺点，增强腺病毒感染肿瘤细胞的特异性和感染效率，研究人员又对腺病毒基因的结构进行了有效改造。改造后的病毒能够特异性在肿瘤细胞中复制并裂解肿瘤细胞，进而释放子代病毒，再感染周围的肿瘤细胞，通过级联放大效应最终消灭肿瘤却对正常体细胞没有杀伤作用，这种病毒即肿瘤特异性增殖型病毒。特异性增殖型病毒又称条件增殖型腺病毒(conditionally replicative adenovirus，CRAB)或溶瘤腺病毒(oncolytic adenovirus，OAd)。

目前常用的条件增殖型腺病毒的改造方法主要有以下三种。第一种是缺失突变腺病毒在正常细胞内复制所必需的基因。由于正常细胞及肿瘤细胞存在一些基因表达的差异，某些病毒在正常细胞内复制及增殖所必需的基因，在肿瘤细胞内并不需要，通过去除这些基因可以获得病毒在肿瘤细胞内特异性复制，而对正常的细胞没有作用。腺病毒E1A蛋白在转录调节中可以结合并抑制pRB家族成员中调控细胞周期的基因，E1B-55kd蛋白与p53N端作用，可抑制p53诱导的细胞凋亡。经典的两种重组腺病毒d1922-947和ONYX-015就是分别去除E1A-CR2基因和E1B-55kd构建的(Johnson L，Shen A，Boyle L，et al.Selectively replicating adenoviruses targeting deregμlated E2Factivity are potent，systemic antitumor agents.Cancer Cell.2002；1：325-337；Khuri F，Nemunaitis J，Ganly I，et al.A controlled trial of intratumoral ONYX-015 aselectively-replicating adenovirus，in combination with cisplatin and 5-fluorouracil inpatients with recurrent head and neck cancer.Nat Med.2000；6，879-885；Bischoff JR，Kirn DH，Williams A，et al.An adenovirus mutant that replicates selectively inp53-deficient human tumor cells.Science.1996；274：373-376)，使其只能在pRB或p53缺失的肿瘤细胞内增殖，最终裂解细胞，达到治疗目的。H101是中国自行构建的，利用基因工程技术对人5型腺病毒(Ads)进行基因重组得到的一种溶瘤腺病毒，主要是删除了人5型腺病毒的E1B-55kD和E3区19kD基因片段，具有在肿瘤细胞中特异性复制而最终导致溶瘤的特性。已完成的联合化疗治疗头颈部及食管鳞癌的III期临床研究，表明H101瘤内注射对于头颈、食管鳞癌具有明确的治疗作用，且具有较高的安全性(夏忠军，常建华，张力，等.基因工程腺病毒(H101)瘤内注射联合化疗治疗头颈部及食管鳞癌的III期临床研究。癌症，2004，23(12)：1666-1670)，但仍然存在病毒载体本身所致毒副作用，病毒非特异性感染正常细胞，病毒体内残留等不安全因素，因此仍需加强载体的特异性和安全性研究。另一种方法是利用肿瘤特异性启动子调控病毒复制所必需的基因(Antonio Chiocca E.Oncolytic viruses.Nat Rev Cancer.2002；2：938-950)，如EIA.E1B，使这些基因只能在肿瘤细胞中表达，而在正常细胞中不表达，从而使病毒只能在肿瘤细胞中复制增殖。目前，许多已被用来构建肿瘤特异性条件增殖型腺病毒，包括甲胎蛋白AFP启动子(Li Y，Yu DC，Chen Y，et al.A hepatocellμlarcarcinoma-specific adenovirus variant，CV 890，eliminates distant human liver tumors incombination with doxorubicin.Cancer Res.2001；61：6428-6436)，环氧化酶-2(cox-2)启动子(Shirakawa T，Hamada K，Zhang Z，et aLA cox-2promoter-based repli-ration-selectiveadenoviral vector to target the cox-2-expressing human bladder cancer ceIIs.Clin CancerRes，2004，10(13)：4342-4348)，前列腺特异抗原PSA启动子(Chen Y，DeWeese T，DilleyJ，et al.CV706，a prostate cancer-specific adenovirus variant，in combination withradiotherapy produces synergistic antitumor efficacy without increasing toxicity.CancerRes.2001；61：5453-5460)，癌胚抗原CEA启动子(Li Y，Dilley J，Yu DC.Replicationcompetent oncolytic adenovirus for colon cancer therapy.Proc Am Assoc Cancer Res.2002；43：Abs 4251)，端粒酶催化亚基hTERT启动子(Wang Z，Powell S，Cardoza L，et al.hTERT promoter-driven conditionally replicative adenovirus mediated gene therapyinduces efficacious tumor regression in Vivo.Proc Am Assoc Cancer Res.2002；3：Abs418；Zou W，Luo C，Zhang Z，et al.A novel oncolytic adenovirus targeting to telomeraseactivity in tumor cells with potent.Oncogene.2004；23：457-464)等，但这些启动子的效果参差不齐，对于不同的构建方式需要具体选择合适的启动子。第三种方法是通过修饰腺病毒的纤维蛋白结构，使病毒能够不依赖于细胞表面的柯萨奇病毒-腺病毒受体(Coxsackie B virus-adenovirus reptor，CAR)而感染肿瘤细胞，达到特异性结合从而杀伤肿瘤细胞(Hemminki A，Drmitriev 1，Liu B，et al.Targeting oncolytic adenoviralagents to the epidermal growth factor pathway with a secretory fusioin molecule.CancerRes，2001；61：6377-6381)。

端粒是真核细胞保护染色体末端的结构，正常细胞每分裂一次，端粒就会缩短，即端粒减少50-200个核苷酸，当端粒缩短至一定程度，会导致细胞死亡。而当细胞发生恶变时，其端粒酶被激活，端粒酶便可以以自身RNA为模板通过逆转录合成染色体末端端粒序列，维持染色体末端完整性而使肿瘤细胞具有无限复制能力，处于永生状态，最终导致肿瘤细胞不断增殖，因此端粒酶激活在肿瘤细胞发生及发展过程中起关键作用。端粒酶是一种广谱的肿瘤标志物，约90％的肿瘤中端粒酶的活性显著增高而正常组织中没有活性。以端粒酶为靶点进行肿瘤基因治疗具有广阔的应用前景。端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)是端粒酶重要的组成成分，只在肿瘤细胞中特异表达。人的端粒酶由三部分组成：端粒酶RNA(human telomerase RNA，hTR)、端粒酶相关蛋白(telomerase associate protein，TAP)、端粒酶催化亚基(humantelomerase reverse transcriptase，hTERT)，hTR起模板作用，TAP功能尚未确定，hTERT起逆转录酶的活性。hTERT是端粒酶的核心部分，直接决定了端粒酶的活性，在极大多数肿瘤细胞或肿瘤细胞株中hTERT呈高水平表达，而正常细胞中不表达或低水平表达(Ducrest AL，Amacker M，Mathieu YD，et al.Regμlation of human telomerase activity：Repression by normal chromosome 3 abolishes nuclear telomerase reverse transcriptasetranscripts but does not affect c-Myc activity.Cancer Res.2001；61：7594-7602)。

腺病毒载体在肿瘤基因治疗过程中，还可以携带外源基因以增强其抗肿瘤作用或发挥外源基因功能达到治疗目的。自杀基因是常用的外源基因，自杀基因疗法在肿瘤治疗中已取得一定疗效，HSV1-TK/GCV系统的自杀基因疗法在国外已进入III期临床实验阶段。TK基因能特异性地将无毒的更昔洛韦(ganciclovir，GCV)等前体药物磷酸化为细胞毒性产物，阻止增殖活跃的肿瘤细胞DNA合成，达到杀伤肿瘤细胞的目的而杀伤肿瘤细胞，且具有使邻近肿瘤细胞也被杀伤的“旁观者效应”，自杀基因疗法在肿瘤治疗中已取得一定疗效。同时携带TK基因的病毒如单纯疱疹病毒(HSV)对阿昔洛韦等抗病毒药物敏感，原因就在于宿主细胞的死亡导致病毒复制被抑制。

腺病毒载体感染性，体内分布情况和体内病毒残留等安全问题越来越受到研究者们重视。例如上海交大的研究人员利用hTERT启动子和TK基因研制了一种新型溶瘤性腺病毒载体，hTERT启动子特异调控E1A基因，TK基因在CMV调控下独立表达。结果显示可以有效地在肺癌，视网膜母细胞瘤中复制，同时GCV可以增强腺病毒载体的肿瘤细胞杀伤作用，此研究表明采用肿瘤特异性启动子策略构建的溶瘤腺病毒可以高效表达外源自杀基因，并达到协同肿瘤杀伤作用。但因为TK基因在CMV调控下表达的，因此当腺病毒非特异性感染正常细胞后，TK基因也会非特异性的表达，因此在进行“自杀疗法”的时候，必然会对正常细胞产生毒性作用。同时此课题也未对携带TK基因的腺病毒载体对阿昔洛韦等抗病毒药物敏感性作用做进一步研究。

当前国内外对肿瘤基因治疗的研究已逐渐步入规范化和理性化的正常轨道，新的治疗方法和临床试验方案也正在不断涌现，如何进一步提高基因治疗有效性和安全性，仍是基因治疗中存在的重大难题。

发明内容

本发明的目的在于提供及一种肿瘤特异复制型腺病毒抗肿瘤制剂。

在本发明的第一方面，提供一种重组腺病毒载体，所述腺病毒载体从5’→3’依次包括以下可操作性相连的元件：单纯疱疹病毒(如HSV1(HF))TK基因，内部核糖体进入位点(IRES)的序列，腺病毒E1A基因，端粒酶催化亚基hTERT启动子(hTERTp)，缺失E1基因和E3基因的腺病毒基因组。

在一个优选例中，所述的重组腺病毒载体的骨架质粒是腺病毒载体。

在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体的骨架质粒为DEST。

在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体从5’→3’依次包括以下可操作性相连的元件：5’ITR；SV40polyA；单纯疱疹病毒TK基因；内部核糖体进入位点；腺病毒E1A基因；端粒酶催化亚基hTERT启动子；腺病毒基因组(较佳地，缺失E1基因和E3基因)；3’ITR。

在另一优选例中，所述的单纯疱疹病毒TK基因的DNA序列如GenBank登录号NC_001806.1中第46608-47911位所示；或

所述的腺病毒内部核糖体进入位点IRES的DNA序列如GenBank登录号U89673.1中第1300-1802位所示；或

所述的腺病毒E1A基因的DNA序列如GenBank登录号：AY339865.1中第560-1545位所示；或

所述的端粒酶催化亚基hTERT启动子的DNA序列如GenBank登录号NT_006576.16中第1285124-1285525位所示。

在另一优选例中，所述的单纯疱疹病毒TK基因的DNA序列来源于单纯疱疹病毒；更佳地以5’GAAACTCCCGCACCTCTT3’为上游引物，以5’TTTTTATTGCCGTCATAG3’为下游引物从单纯疱疹病毒基因组扩增获得。

在另一优选例中，所述的腺病毒内部核糖体进入位点的DNA序列来源于pIRES；更佳地来源于pIRES的先后经PvuI酶切和PstI酶切后的产物，且长度约为1.238Kb。

在另一优选例中，所述的腺病毒E1A基因的DNA序列来源于腺病毒；较佳地是以5’ATGGGCAGTGGGTGATAG3’为上游引物，以5’CAGGCTCGTTAAGCAAGT3’为下游引物从H101病毒基因组扩增获得。

在另一优选例中，所述的端粒酶催化亚基hTERT启动子的DNA序列是以5’TTTGGATCCCGATTCGACCTCTCTCCGCTGGGGC3’为上游引物，以5’TTTCTCGAGCAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCAG3’为下游引物从293A细胞基因组扩增获得。

在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体是环状的或线性化的。

在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒载体的用途，用于肿瘤特异复制型的腺病毒。

在本发明的另一方面，提供一种用于制备重组腺病毒的系统，所述系统包括：

(a)一种重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体从5’→3’依次包括以下可操作性相连的元件：

单纯疱疹病毒(如HSV1(HF))TK基因，内部核糖体进入位点(IRES)，腺病毒E1A基因，端粒酶催化亚基hTERT启动子(hTERTp)；

(b)一种生产病毒的细胞。

在另一优选例中，所述的生产病毒的细胞是293细胞。

在本发明的另一方面，提供一种重组的肿瘤特异复制型的腺病毒，其由所述的重组腺病毒载体包装获得。

在本发明的另一方面，提供一种抗肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物含有：

有效量(如MOI＝10，或如10¹⁴～10¹²PFU/ml)的所述的肿瘤特异复制型的腺病毒；和

药学上可接受的载体。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自(但不限于)：鼻咽癌，肺癌，骨肉瘤，胰腺癌，食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。

在本发明的另一方面，提供一种抗肿瘤的药盒，所述的药盒中含有：

所述的组合物，或

所述的重组的肿瘤特异复制型的腺病毒。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明的溶瘤性腺病毒Ad-TIEH的总体构建技术路线示意图。

图2、从左到右的泳道依次为：用BamHI和XhoI酶切pENTR-hTERTp①，pENTR-hTERTp②，pENTR-hTERTp③，pENTR-hTERTp④，5000bp DNA Marker，pENTR-hTERTp⑤，pENTR-hTERTp⑥，pENTR-hTERTp⑦和pENTR-hTERTp⑧。说明八个样品都有片段加入。

图3、用BamHI酶切质粒电泳：从左到右依次为5000bp的Marker，pENTR-IRES-hTERTp①，pENTR-IRES-hTERTp②，pENTR-IRES-hTERTp③，pENTR-IRES-hTERTp⑤，pENTR-IRES-hTERTp⑥，如果切出来的片段为1.3K为正确，可知pENTR-IRES-hTERTp②正确。

图4、用XbaI酶切酶切电泳结果，从左到右依次为：5000bp Marker，XbaI酶切pENTR-IRES-E1A-hTERTp①，②，③，④，⑤，⑥，图中可知pENTR-IRES-E1A-hTERTp⑥正确。

图5、用SphI酶切电泳结果，从左到右依次为：SphI酶切pENTR-TK-IRES-E1A-hTERTp①，②，③，④，⑤，⑥，5000bp DNA Marker①，②，③，⑤，⑥正确。

图6、用BamHI酶切电泳结果，从左到右依次为：5000bp(s)Marker，BamHI酶切DEST，Ad-TK-IRES-E1A-hTERTp①，②。鉴定结果正确。

图7、病毒转染细胞后4天，出现早期CPE。

图8、病毒转染细胞后8天，出现完全CPE。

图9、不同重组病毒在不同细胞中的复制情况。

图10、不同重组病毒对阿昔洛韦敏感性。

图11、不同重组病毒对细胞的杀伤作用。

图12、重组腺病毒载体上的一些主要元件。其中，A：5’ITR；B：SV40polyA；C：TK基因；D：IRES；E：腺病毒E1A基因；F：hTERT启动子；G：腺病毒基因组(缺失E1基因和E3基因)；H：3’ITR。

具体实施方式

本发明人选择腺病毒作为基因治疗载体，利用肿瘤特异hTERT启动子和内部核糖体进入位点序列(IRES)，同时表达腺病毒复制必须基因E1A和HSV-1-TK基因，构建高效安全的重组溶瘤性腺病毒Ad-TIEH。所述的溶瘤性腺病毒可特异性地识别肿瘤细胞，对于其它细胞则没有杀伤能力，因此是高效且安全的，具有良好的应用价值。

术语

如本文所用，“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上由......构成”和“由......构成”属于“含有”，“具有”或“包括”的下位概念。

如本文所用，所述的“线性DNA”是指有游离5’和3’端的DNA分子，其是非环状DNA分子。线性DNA能够通过对闭合的环状DNA分子如质粒进行酶切获得，或通过PCR反应进行的DNA合成获得。

如本文所用，所述的“启动子”或“启动子区域”，是指一种核酸序列，其通常存在于目的基因编码序列的上游(5’端)，能够引导核酸序列转录为mRNA。一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体，其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。组织或器官特异型启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中。

如本文所用，所述“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，所述“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染试剂。对于疫苗，所述的药学上可接受的载体例如可包括佐剂。

腺病毒载体

本发明提供了一种重组腺病毒载体，所述腺病毒载体从5’→3’依次包括以下可操作性相连的元件：单纯疱疹病毒(如HSV1(HF))TK基因，内部核糖体进入位点(IRES)，腺病毒E1A基因，端粒酶催化亚基hTERT启动子(hTERTp)。

以上各个元件所指向的基因均是本领域技术人员已知的基因，可以从例如GenBank等公开信息库中获得。在本发明的提示下，本领域人员容易获得这些基因并作出如本发明所述的组装。

根据所公开的信息，进行了适当的变化且仍然保留其原有功能的上述元件的变异体也包括在本发明中。例如，在严格条件下与本发明限定的序列杂交且具有相同功能序列变异体。如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列也可为这些所限定序列的互补序列。

本发明的各元件所指向的基因的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

应理解，本发明的部分元件所指向的基因获自优选一些腺病毒或HIV病毒，然而获自其它病毒的与这些基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。

本发明构建的腺病毒载体，一方面，由于突变了E1B-55kd基因，溶瘤性腺病毒Ad-TIEH选择性的在P53突变或缺失的肿瘤细胞中复制(如在实施例中用到的一些细胞株，其中HFL-1和U2OS是p53正常，CNE，A549，panc-1均为p53突变)；同时复制必须基因E1A由hTERT启动子调控，溶瘤性腺病毒Ad-TIEH只能在hTERT高表达的肿瘤细胞中复制，hTERT不表达的正常细胞中不能复制，从而大大加强了包装后的腺病毒肿瘤杀伤作用的特异性。另一方面由于IRES元件的存在，TK基因和E1A基因在hTERT启动子调控下协调高效表达。TK基因的表达，不但可以作为自杀基因提高重组溶瘤性腺病毒Ad-TIEH的抗肿瘤作用，还使得Ad-TIEH对于传统抗病毒药物阿昔洛韦具有敏感性。

腺病毒

本发明还提供了一种重组的肿瘤特异复制型的腺病毒，其由所述的重组腺病毒载体包装获得。

病毒的包装是本领域技术人员已知的技术。在本发明提供了独特构建的腺病毒载体以及实施例的教导下，本领域人员易于获得所述的肿瘤特异复制型的腺病毒。通常，病毒的包装包括：将所构建的病毒载体转染用于生产病毒的细胞，从而病毒载体在细胞内包装、复制，最终获得大量的病毒。

生产病毒的细胞也是本领域技术人员熟悉的，例如昆虫细胞，哺乳动物细胞(如293细胞)等。

作为本发明的一种实施方案，通过Lipofectamine 2000转染将病毒载体转入293细胞中，完成重组腺病毒的生产后，收集所述的重组腺病毒。293细胞可以适应悬浮培养，从而可使病毒大量扩增。293细胞可在规模生产的生物反应器(如1～20L体积)中表达重组蛋白，因而也可以大规模生产病毒。

本发明获得的Ad-TIEH具有肿瘤杀伤作用的特异性，安全性良好。所述的Ad-TIEH对于传统抗病毒药物阿昔洛韦具有敏感性，临床应用时，可以利用阿昔洛韦清除体内残留病毒，因为TK基因的表达与E1A基因表达同步进行，腺病毒复制只在肿瘤细胞中进行，所以不论在利用自杀基因系统抗肿瘤治疗还是利用阿昔洛韦等抗病毒药物清除残留病毒时，均不会对正常细胞产生影响，从而极大提高了Ad-TIEH体内应用的安全性。

在本发明的实施例中，本发明人用已用于临床治疗的特异溶瘤性腺病毒H101作为阳性对照，以复制缺陷性腺病毒作为阴性对照，通过病毒复制实验，病毒杀伤肿瘤细胞实验，阿昔洛韦敏感试验评价了Ad-TIEH在鼻咽癌、胰腺癌、肺癌和骨肉瘤细胞中的增殖能力、特异性、溶肿瘤能力和TK功能等特性。实验结果显示，本发明的溶瘤病毒Ad-TIEH可以高效的杀伤hTERT阳性的鼻咽癌细胞，对于胰腺癌和肺癌也具有一定的肿瘤杀伤作用，同时与已用于临床治疗的特异溶瘤性腺病毒H101相比，Ad-TIEH在hTERT低表达或不表达的骨肉瘤细胞和正常细胞中，复制能力大大降低，另外，Ad-TIEH的复制还可以一定程度的被抗病毒药物阿昔洛韦抑制。总之，Ad-TIEH复制特异性较传统的溶肿瘤病毒H101大大提高，溶肿瘤作用却无明显减弱；与其他未上市的新型溶肿瘤腺病毒相比，由于TK和E1A基因在同一肿瘤启动子调控下，使得Ad-TIEH在临床肿瘤治疗中对正常细胞的影响降低至最小程度；另外本发明人还首次证实TK基因的表达使Ad-TIEH对于抗病毒药物敏感，因此在未来临床应用中可以用于清除体内残留病毒或抑制病毒载体所致毒副作用。总之溶瘤病毒Ad-TIEH为肿瘤治疗提供了一种新的手段，具有可观的临床应用价值。

组合物

本发明还提供一种抗肿瘤的组合物，所述组合物是指将本发明的重组腺病毒和药学上可接受的载体混合后获得的可用于抗肿瘤的组合物。本发明的重组腺病毒的有效量通常是MOI＝10。

在用于给药时，活性成分(重组腺病毒)通常在1×10⁵-1×10¹²病毒颗粒(vp)/kg动物体重，较佳地在5×10⁶-5×10¹¹病毒颗粒(vp)/kg动物体重。优选的可进行多次给药，以产生良好的抗肿瘤效果，例如可间隔1-3周进行重复给药。

较佳地，在用于给药时，活性成分(重组腺病毒)以局部给药的方式给予，例如肿瘤内给药。这有利于在局部位置富集较高浓度的药物，且更加提高药物的安全有效性。

在进行给药时，多种给药方式都是可用的。例如，所述的重组腺病毒或其组合物可以通过肌肉注射，皮内或皮下注射，胚内注射的方式给予；或者可进行滴鼻免疫。

本发明还提供了一种抗肿瘤的药盒，其中含有所述的组合物，或所述的重组载体。

此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。

本发明的主要优点在于：

首次构建了由肿瘤启动子hTERT同时调控E1A基因和TK基因表达的溶肿瘤腺病毒Ad-TIEH。

Ad-TIEH可以有效地杀伤鼻咽癌、胰腺癌和肺癌细胞，杀伤作用与已上市的溶瘤腺病毒H101相似，但复制特异性明显高于H101，安全性优于H101。

hTERT启动子同时调控E1A基因和TK基因的条件增殖型腺病毒Ad-TIEH不仅能使病毒有效地感染hTERT阳性肿瘤细胞并在细胞内不断增殖，并利用TK基因的自杀基因作用提高抗肿瘤效果，同时还可以使重组腺病毒对抗病毒药物阿昔洛韦等敏感，在将来的临床应用中可以利用抗病毒药物清除体内残留治疗病毒，控制病毒载体本身的毒副作用，从而大大提高了药物安全性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

材料和方法

材料

质粒：分别携带有hTERT启动子，E1A复制必须基因，TK基因的克隆载体pMD-T-hTERTp，pGM-T-TK，pGM-T-E1A，腺病毒重组入门质粒pENTR-MCS由本发明人构建保存；腺病毒骨架质粒DEST购于Invitrogen公司；pIRES质粒购于Clontech公司。

入门质粒pENTR-MCS的构建方法：pENTR/U6购买自Invitrogen公司，经SalI和XbaI酶切后加入以下多克隆位点MCS(多克隆位点MCS由博尚生物技术有限公司合成)：

5’TCGACTGATCACCGCGGCCCGGGAATTCGCGGCCGCAAATCTAGACTCGAGAAAGGATCC 3’(SEQ ID NO：1)；

3’GACTAGTGGCGCCGGGCCCTTAAGCGCCGGCGTTTAGATCTGAGCTCTTTCCTAGGCTAG 5’(SEQ ID NO：2)。

pGM-T-E1A的构建方法：pGM-T载体试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，E1A基因是以H101病毒(购自上海三维生物技术有限公司)基因组DNA为模板，以5’ATGGGCAGTGGGTGATAG3’(SEQ ID NO：3)为上游引物，以5’CAGGCTCGTTAAGCAAGT3’(SEQ ID NO：4)为下游引物扩增获得，通过TA克隆获得pGM-T-E1A载体。

pMD-T-hTERTp的构建方法：pGM-T载体试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，E1A基因是以293A细胞基因组DNA为模板，以5’TTTGGATCCCGATTCGACCTCTCTCCGCTGGGGC3’(SEQ ID NO：5)为上游引物，以5’TTTCTCGAG CAGGGCTTCCCACGTGCGCAGCAG3’(SEQ ID NO：6)为下游引物扩增获得，通过TA克隆获得pGM-T-E1A载体。

pGM-T-TK的构建方法：pGM-T载体试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司，TK基因是以HSV1(HF株)基因组DNA为模板，以5’GAAACTCCCGCACCTCTT3’(SEQ ID NO：7)为上游引物，以5’TTTTTATTGCCGTCATAG3’(SEQ ID NO：8)为下游引物扩增获得，通过TA克隆获得pGM-T-TK载体。

细胞株：293A细胞(人肾胚细胞)株购于Invitrogen公司；hTERT阳性表达的人鼻咽癌CNE细胞，肺癌细胞A549，胰腺癌细胞panc-1，hTERT阴性表达的人骨肉瘤U-20S细胞以及正常人肺胚成纤维细胞HFL-I细胞购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

菌株：为常规的感受态大肠杆菌DH5α，Top10。

工具酶

限制性内切酶BamHI，XhoI，SacII，PvuI，XbaI，PstI，EcoRI，NotI，PacI购于Takara公司，Promega公司，MBI公司；蛋白酶K，LR重组酶购于Invitrogen公司；DNA连接试剂盒，去磷试剂盒购于Promega公司；Klenow，T4DNA polymerase购于Takara公司。

主要试剂

谷氨酰胺                          美国Invitrogen公司

硫酸链霉素                      华北制药股份有限公司

磷酸盐缓冲液            北京中衫金桥生物技术有限公司

高糖DMEM                               美国Gibco公司

非必须氨基酸                        美国Invitrogen公司

青霉素钠                          华北制药股份有限公司

胎牛血清(FBS)                           杭州四季青公司

胰蛋白酶(trypsin)                        美国Gibco公司

EDTA(乙二胺四乙酸)                       美国sigma公司

嘌呤霉素盐酸盐                         美国Amresco公司

脂质体2000                          美国Invitrogen公司

琼脂粉                                 美国Amresco公司

胰蛋白胨                                 英国OXOID公司

酵母提取物                               英国OXOID公司

琼脂糖                                   英国OXOID公司

DNA Marker                              日本Takara公司

DNA纯化回收试剂盒                       美国Axygen公司

质粒小量提取试剂盒                      美国Axygen公司

方法

溶瘤性腺病毒Ad-TIEH，总体构建技术路线如图1。

1、构建pENTR-hTERTp质粒

a、用BamHI和XhoI酶切质粒pENTR-MCS和pMD-T-hTERTp，分别回收2.6kb的pENTR-MCS载体和409bp hTERT启动子片段。将所述的启动子片段链接到经酶切的pENTR-MCS载体中，获得pENTR-hTERTp质粒。

酶切反应体系如下：

b、凝胶回收DNA，采用美国Axygen公司DNA纯化回收试剂盒。

流程如下：

(1)在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。

(2)加入500μl凝胶体积的Buffer DE-A，混合均匀后于75℃加热8min，间断混合至凝胶块完全熔化。

(3)加250μl Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。

(4)吸取(3)中的混合液，转移到DNA制备管(置于2ml离心管)中，12,000×g离心1min。弃滤液。

(5)将制备管置回离心管，加0.5ml Buffer W1，12,000×g离心30s，弃滤液。

(6)将制备管置回离心管，加0.7ml Buffer W2，12,000×g离心30s，弃滤液。以同样的方法再用0.7ml Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1min。

(7)将制备管置于2ml离心管中，12,000×g离心1min。

(8)将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在DNA制备膜正中央加25μl水或Eluent，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

c、常规方法对pENTR-MCS(经过BamHI和XhoI酶切的胶回收产物)去磷。

d、去磷产物清洁过柱，采用采用美国Axygen公司PCR清洁回收试剂盒，流程如下：

(1)加120μl buffer PCR-A；混匀后，转移到制备管中，将制备管置于2ml离心管(试剂盒内提供)中，12,000×g离心1min，弃滤液。

(2)将制备管置回2ml离心管，加700μl Buffer W2，12,000×g离心1min，弃滤液。

(3)可选步骤)将制备管置于离心管中，将制备管置回2ml离心管，加400μl BufferW2，12,000×g离心1min。

(4)将制备管置于洁净的1.5ml离心管，在制备管膜中央加25μl Eluent，室温静置1min。12,000×g离心1min洗脱DNA。

e、hTERT启动子DNA片段和pENTR-MCS载体连接

连接体系如下：

f、化学转化DH5α感受态细胞

(1)将连接体系放入70℃水浴灭活10min。

(2)加入100μl感受态、冰浴30min。

(3)放入42℃水浴90S(热休克)。

(4)再次冰浴5min。(冷休克)。

(5)加入700μlLB液体培养基放入37℃水浴摇培养1h。

(6)以3000rpm离心5min。

(7)弃去上清500μl，剩余吹打混匀涂含有相应抗生素的LB固体培养基。

(8)放入37℃培养箱培养过夜(16-18h)。

g、挑克隆摇菌，提质粒，BamH I和Xho I酶切鉴定

2、构建pENTR-IRES-hTERTp质粒

a、用SacII和XbaI酶切鉴定正确的pENTR-hTERTp。

酶切体系如下：

用PvuI酶切pIRES质粒酶切体系如下：

b、胶回收SacII和XbaI酶切的pENTR-hTERTp片段(3.1Kb)和PvuI酶切的pIRES(1.4kb)，

胶回收采用采用美国Axygen公司DNA纯化回收试剂盒，常规方法回收。

c、PstI酶切经PvuI酶切pIRES胶回收得到的1.4K的片段

酶切体系如下：

d、胶回收经PvuI和PstI分步酶切的DNA片段(1.238k)

胶回收采用采用美国Axygen公司DNA纯化回收试剂盒，常规方法回收。

e、补平前述获得的片段pENTR-hTERTp和IRES片段：

e、补平体系清洁过柱

清洁过柱采用采用美国Axygen公司PCR清洁回收试剂盒，常规方法清洁。

f、补平后的两DNA片段连接

g、转化pENTR-IRES-hTERTp到DH5α感受态细胞中，转化为常规方法进行。

h、挑克隆摇菌，提质粒，BamH I酶切鉴定。

3、构建pENTR-IRES-E1A-hTERTp载体

a、EcoRI酶切质粒pENTR-IRES-hTERTp和pGM-T-E1A

酶切体系如下：

b、胶回收EcoRI酶切的pENTR-IRES-hTERTp片段(4.1Kb)和E1A片段(1.0kb)胶回收采用采用美国Axygen公司DNA纯化回收试剂盒。

c、EcoRI酶切的pENTR-IRES-hTERTp去磷

去磷体系如下：

d、pENTR-IRES-hTERTp片段和E1A片段连接

连接体系如下：

e、连接产物pENTR-IRES-E1A-hTERTp转化DH5α感受态细胞。

f、挑克隆摇菌，抽提质粒，XbaI酶切鉴定。

4、构建pENTR-TK-IRES-E1A-hTERTp载体

a、用NotI酶切pENTR-IRES-E1A-hTERTp，pGM-T-TK

酶切体系如下：

b、胶回收NotI酶切pENTR-IRES-E1A-hTERTp(5.3Kb)和TK片段(1.3kb)胶回收采用采用美国Axygen公司DNA纯化回收试剂盒。

c、NotI酶切的pENTR-IRES-E1A-hTERTp去磷

去磷体系如下：

d、pENTR-IRES-E1A-hTERTp片段和TK片段连接

连接体系如下：

e、在DH5α感受态细胞中转化pENTR-TK-IRES-E1A-hTERTp。

f、挑克隆摇菌，提质粒，SphI酶切鉴定。

5、构建重组腺病毒表达载体

按照Invitrogen公司的LR重组试剂盒说明书，将pENTR-TK-IRES-E1A-hTERTp质粒与腺病毒骨架质粒DEST进行重组反应。反应体系为：

步骤如下：

A、将上述过夜重组体系中加入1ul蛋白酶K，37℃水浴10min；

B、各加入100μl Top10化学感受态，冰浴30min；

C、放入42℃，水浴90sec；

D、立冰上冰浴5min；

E、加入LB培养基700μl，放入摇床中1h；

F、3000rpm10min，弃去500μl上清，剩余重悬后涂板(含有100ug/ml氨苄青霉素的LB固体平板)；

G、37℃培养过夜；

H、挑克隆摇菌，提质粒Ad-TK-IRES-E1A-hTERTp，BamHI酶切鉴定。

I、Panc-I酶切Ad-TK-IRES-E1A-hTERTp(Ad-TIEH)，酶切体系为：

酶切后获得线性化的Ad-TIEH。

质粒Ad-TK-IRES-E1A-hTERTp中包括的主要元件如图12所示。

6、包装重组腺病毒Ad-TIEH

(1)转染前一天，用0.5％(w/v)胰酶消化293A细胞并计数。

(2)取六孔板，每孔加5×10⁵细胞，每孔补足2mL 10％(v/v)血清完全DMEM培养基。

(2)转染当天，移除六孔板中细胞生长培养液并更换为1.5mL含10％血清不含双抗(青霉素/链霉素)的完全DMEM培养基。

(3)准备转染液，包括：

a.用250微升无血清培养液稀释1μg用Pac-I消化的Ad-TK-IRES-E1A-hTERTp，轻轻混匀。

b.Lipofectamine 2000使用前轻轻的混匀，取出6μl用250微升无血清培养液稀释，轻轻混匀，室温放置5分钟。

c.5分钟后，把稀释的DNA和稀释的Lipofectamine 2000混合，轻轻混匀。

d.室温孵育20分钟，使DNA-Lipofectamine 2000复合物形成。

(4)把DNA-Lipofectamine 2000复合物逐滴加入六孔板每孔中，前后轻轻晃动板子混匀，37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。

(5)第二天，移除六孔板每孔的转染液，替换为10％血清完全DMEM培养基。

(6)转染后48小时，把六孔板每孔内细胞传至含10mL完全培养液的10cm平皿中。

(7)每2-3天补加新鲜的完全培养液直到出现明显可见的细胞病变(CPE)。

(8)当出现80％以上CPE时，收获细胞和上清。

(9)置离心管于-80℃/37℃水浴冻/融3次。

(10)5000rpm，15min，收获上清。

(11)0.22微米过滤后，收集滤液，其中包括重组腺病毒，每支1.5ml EP管中100ul分装保存于-80℃。

7、扩增重组腺病毒，滴度测定

(1)以MOI＝10感染293A细胞，至完全CPE时收获，扩增重组腺病毒。

(2)病毒滴度测定采用TCID50法，流程如下：

A、细胞准备

收集一瓶293A细胞，计数。在含2％胎牛血清的DMEM完全培养基中准备细胞，使其细胞终浓度为10⁵个/ml。用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液，使每孔细胞数为10⁴个。

B、稀释病毒液

第1管中加入0.9ml DMEM 2％，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。上下吸打5次混匀。换用新枪头，从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。反复稀释至最高稀释度。用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml含2％胎牛血清的DMEM完全培养基而不加入病毒以监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。37℃培养10天。10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。计算每一排中出现阳性的孔数。如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100％阳性而最高稀释度100％阴性，则本测试即为有效。

按照下述公式计算滴度：T＝10^1+d(S-0.5)IU/ml，其中d＝Log10稀释倍数，S＝从第一次稀释起的阳性比率之和，2次平行实验得到的滴度值应相差≤10^0.7。

8、重组腺病毒复制实验

为评价重组腺病毒Ad-TIEH靶向复制能力，本发明人选用已上市的上海三维生物技术有限公司溶瘤病毒H101做阳性对照，复制缺陷型腺病毒DEST做阴性对照，分别在hTERT阳性表达的人鼻咽癌CNE细胞(购自中国科学院上海细胞库)，hTERT阴性表达的人骨肉瘤U-20S细胞(购自中国科学院上海细胞库)以及正常人肺胚成纤维细胞HFL-I细胞(购自中国科学院上海细胞库)进行复制实验。具体流程如下：

将对数生长期的CNE，U-20S以及HFL-I细胞消化，以含各细胞的完全培养基调细胞密度为1x10⁵细胞/孔，接种于24孔板，500μl/孔。

次日以MOI＝10感染病毒Ad-TIEH，H101以及DEST，吸弃原培养基，每孔加入500μl病毒稀释液，37℃，5％C0₂培养，2小时后弃病毒液，并用PBS洗2遍，每孔加入500μl新鲜的细胞完全培养基，继续培养。

在感染48h后收获细胞和培养上清，反复冻融3次释放病毒，5000rpm、离心15min去细胞碎片得到含病毒的上清液，TCID50测定病毒滴度。

9、重组腺病毒特异性肿瘤杀伤实验

本实施例利用MTT法检测溶瘤腺病毒的特异性肿瘤杀伤效应，流程如下：

(1)将对数生长期的细胞消化计数后重悬于各细胞的完全培养基中，接种于平底96孔培养板，100μl/孔，接种量CNE 1×10⁴细胞/孔，U-2OS 3×10⁴细胞/孔，HFL-I 5×10⁴细胞/孔，中间孔接种细胞，四周孔及间隙加无菌PBS 100μl保湿。

(2)次日分别以MOI＝1感染病毒Ad-TEIK，H101以及DEST，每个条件设三个复孔，设空白对照。

(3)感染第5天，加入MTT液(5mg/ml)20μl/孔，继续孵育4小时，终止培养，小心弃去孔内上清，每孔加入150μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。

(4)在全自动酶标仪上490nm波长测定各孔吸光值(A值)，记录结果。杀伤率(％)＝(对照孔A值一实验孔A值)/对照孔A值。

10、阿昔洛韦敏感实验

本实施例采用阿昔洛韦敏感实验评价TK基因功能，流程如下：

(1)将安昔洛维(ACV)(湖北省潜江制药厂)以10μg/ml浓度溶于无血清DMEM培养基。

(2)用重组腺病毒Ad-TIEH，H101，DEST分别感染293A细胞，37℃，5％CO₂ 1.5小时。

(3)PBS洗细胞，于ACV溶液中孵育24小时。

(4)4小时后，收集细胞和培养基，收获病毒，TCID50测定病毒滴度。

实施例

实施例1、载体构建

pENTR-hTERTp构建结果及鉴定

用BamHI和XhoI双酶切pENTR-hTERTp，正确样本可以切下409bp和2.6kb两个片段，电泳显示转化所得八个克隆均正确，如图2。

pENTR-IRES-hTERTp构建结果及鉴定

用BamHI酶切pENTR-hTERTp，正确样本可以切下1.3kb片段，电泳显示转化所得第二个克隆正确，如图3。

pENTR-IRES-E1A-hTERTp构建结果及鉴定

用XbaI酶切pENTR-IRES-E1A-hTERTp，正确样本可以切下870bp片段，电泳显示转化所得第六个克隆正确，如图4。

pENTR-TK-IRES-E1A-hTERTp构建结果及鉴定

用SphI酶切pENTR-TK-IRES-E1A-hTERTp，正确样本可以切下821bp片段，电泳显示转化所得有五个克隆正确，如图5。

Ad-TK-IRES-E1A-hTERTp(Ad-TIEH)构建结果及鉴定

用BamHI酶切Ad-TK-IRES-E1A-hTERTp，正确样本可以切下516bp，1.5kb，2.6kb片段，电泳显示转化所得两个克隆正确，如图6。

实施例2、病毒的产生和增殖

293A细胞转染Ad-TIEH线性化DNA后4-6天开始出现少量早期CPE(图7)，6-8天时CPE逐渐扩大，至完全CPE(图8)。细胞病变效应表现为细胞肿胀，形成葡萄状或岛屿状堆聚，有合胞体出现。至80-100％CPE时收获病毒。

实施例3、重组腺病毒复制试验和阿昔洛韦敏感试验

将病毒以MOI＝10感染hTERT阳性表达的人鼻咽癌CNE细胞，肺癌细胞A549，胰腺癌细胞panc-1，hTERT阴性表达的人骨肉瘤U-20S细胞以及正常人肺胚成纤维细胞HFL-I细胞，设立加阿昔洛韦孔和不加阿昔洛韦孔，48h后收获病毒，滴度测定后计算病毒总量(单位PFU)。如图9显示Ad-TIEH在hTERT阳性表达的人鼻咽癌CNE细胞，肺癌细胞A549，胰腺癌细胞panc-1中具有很好的复制能力，而在hTERT阴性表达的人骨肉瘤U-20S细胞以及正常人肺胚成纤维细胞HFL-I细胞复制能力很弱，特别是在骨肉瘤U-20S细胞中，复制能力较H101更弱，因此，Ad-TIEH肿瘤复制特异性明显优于H101。加入阿昔洛韦后，Ad-TIEH在CNE细胞中的增殖明显受到抑制，相比未加阿昔洛韦组，在48h时间内复制被抑制了近5倍，在A549和panc-1细胞中，Ad-TIEH的复制也一定程度的受到抑制。而H101增殖未受阿昔洛韦影响，如图10所示。

结果显示，Ad-TIEH在hTERT阳性肿瘤细胞的复制能力与H101近似，但在hTERT阴性肿瘤细胞和正常细胞的复制能力大大减弱；在阿昔洛韦存在下，Ad-TIEH的复制被明显抑制，而H101复制不受影响。

实施例4、重组腺病毒特异性肿瘤杀伤实验

为进一步评价特异性肿瘤杀伤效应，将病毒感染细胞5天后，采用MTT法测定了不同重组病毒对细胞的杀伤作用。如图11所示，在MOI＝1的感染条件下，Ad-TIEH病毒和H101病毒杀死了约50％的鼻咽癌CNE细胞，对于肺癌细胞A549和胰腺癌细胞panc-1，Ad-TIEH病毒和H101病毒杀伤作用基本相同，较CNE细胞稍弱，而对于骨肉瘤U-2OS和成纤维细胞HFL-I生长没有影响。复制缺陷性病毒DEST由于不能在细胞中复制，对于细胞的杀伤作用可以看做非特异的毒性反应，因此可以看出，Ad-TIEH对正常细胞的非特异毒性反应很小，与复制缺陷性病毒近似；Ad-TIEH对于骨肉瘤的非特异性毒性反应较H101更低，因而可以说明其肿瘤杀伤特异性更优于H101。

结果显示Ad-TIEH病毒和H101病毒均能高效杀伤鼻咽癌CNE细胞，一定程度的杀伤肺癌细胞A549和胰腺癌细胞panc-1，对于骨肉瘤U-2Os细胞和正常细胞HFL-I影响不大；较H101病毒，Ad-TIEH病毒对于骨肉瘤U-2Os细胞和正常细胞HFL-I的毒性作用更小。

讨论

目前肿瘤基因治疗中的一个难题是如何提高病毒载体的高效肿瘤杀伤作用和特异性，已达到更好的治疗效果和安全性。传统的复制缺陷型病毒载体如“今又生”由于不能在肿瘤组织中增殖，从而大大降低了其在肿瘤组织中的分布效率，使得外源基因不能高效表达，加上机体内免疫系统的清除作用，严重制约了其在肿瘤治疗研究中的应用。条件增殖型腺病毒载体能靶向性地在肿瘤细胞内复制增殖，最终使肿瘤细胞裂解，与此同时使抗肿瘤的外源基因能够长时期有效的表达，从而克服复制缺陷型腺病毒载体在感染细胞时需要重复多次感染、有一定的毒副作用等缺点。目前构建条件增殖型腺病毒载体主要策略包括部分或全部删除腺病毒在肿瘤细胞中复制时多余的基因以及利用肿瘤/组织特异启动子控制复制必须基因基因在肿瘤组织中特异性表达。前者研究已经入临床应用阶段，这些基因在正常细胞中却必不可少，如美国ONYX公司生产的ONYX-015(dl1520)现已进入III期临床试验，中国上海三维公司的H101现已在中国上市；第二种策略目前应用也非常多，科学家利用各种肿瘤启动子开展相关研究，如CEA，AFP，hTERT等，已取得令人鼓舞的成果，进入临床应用指日可待。

目前，重组腺病毒的获得通常是通过转染腺病毒载体至腺病毒包装细胞293细胞(原代人胚肾细胞转染5型腺病毒DNA的永生化细胞)来获得的。制备重组腺病毒载体的方法有很多种：一种是将DNA片段与腺病毒基因组利用相同的酶切位点直接用连接酶进行连接，但是由于大片段连接效率很低，可利用的酶切位点也稀少，在技术上很难进行操作(He TC，Zhou S，Costa da LT，et al.A simplified system for generationrecombinant adenoviruses.Proc Natl Acad Sci USA.1998；95：2509-2514。另一种方法是目前广泛应用的，即通过质粒间同源重组的方法产生重组腺病毒(Luo J，Deng ZL，LuoX，et al.A protocol for rapid generation of recombinant adenoviruses using the AdEasysystem.Nat Protoc.2007；2：1236-1247)。本发明首先构建了含有hTERT启动子调控E1A基因和TK基因的入门载体pENTR-TK-IRES-E1A-hTERTp，然后将入门载体与腺病毒骨架质粒进行LR同源重组，从而获得重组腺病毒表达质粒。再将其线性化并转染293A细胞，包装出重组溶瘤性腺病毒Ad-TIEH。机理上讲，本发明构建的溶瘤性腺病毒Ad-TIEH有以下优势：首先hTERT在肿瘤细胞中的特异表达，在正常细胞低表达或不表达；同时Ad-TIEH只保留了E1A基因，缺失的腺病毒早期基因编码的E1B-55kd蛋白使得Ad-TIEH只能在p53变异或p53功能缺陷的肿瘤细胞中复制，因此hTERT启动子调控E1A基因使得重组溶瘤腺病毒Ad-TIEH兼顾了条件复制性腺病毒构建的两种策略，具有双重调控能力，因而特异性更强。

为了评价重组溶瘤性腺病毒Ad-TIEH在肿瘤细胞的复制能力和靶向性，本发明人选择用H101作为对照，分别在hTERT阳性表达的人鼻咽癌CNE细胞，肺癌细胞A549，胰腺癌细胞panc-1，hTERT阴性表达的人骨肉瘤U-20S细胞以及正常人肺胚成纤维细胞HFL-I细胞中进行了复制能力实验。结果显示同样感染量，48h后，Ad-TIEH在CNE细胞，A549细胞，panc-1细胞中的增殖能力与H101近似。在U-20S和HFL-I细胞中均未增殖，而H101在正常细胞和骨肉瘤细胞中仍有少量复制。因此，Ad-TIEH不仅可以高效的在肿瘤细胞中增殖，而且在正常细胞中的复制能力被进一步削弱，复制特异性明显优于H101。在肿瘤杀伤实验中，本发明人采用经典的MTT法测定溶瘤病毒对细胞的杀伤作用。结果显示，Ad-TIEH可以不同程度的杀伤hTERT阳性表达的人鼻咽癌CNE细胞，肺癌细胞A549和胰腺癌细胞panc-1，杀伤作用与H101相似；相比H101，Ad-TIEH对于hTERT阴性表达的人骨肉瘤U-20S细胞以及正常人肺胚成纤维细胞HFL-I毒性作用很小；H101对于骨肉瘤U-20S细胞也具有一定的杀伤作用，可能是非特异性的杀伤作用，因为U-20S细胞是P53正常的肿瘤细胞，理论上讲H101对于骨肉瘤U-20S细胞不应有特异的杀伤作用，这也反映了Ad-TIEH的肿瘤杀伤特异性要优于H101。因此不论是复制性还是杀伤作用，Ad-TIEH的特异性均优于H101，同时对于靶向肿瘤的杀伤效应还具有高效性。

作为腺病毒载体的一种形式，条件增殖型腺病毒不仅可以通过复制增殖裂解肿瘤细胞，而且也可以发挥载体的作用，携带外源基因进入细胞内，从而增强抗肿瘤的效果。一方面病毒载体本身能特异在肿瘤细胞内复制，从而靶向地杀死肿瘤细胞，另一方面它所携带的外源基因的表达量能随病毒的复制和增殖而大大提高(Liu XY.Targeting gene-virotherapy of cancer and its prosperity.Cell Res.2006；16：879-886)。可用于抗肿瘤的外源基因包括：抑癌基因、细胞凋亡诱导基因、免疫调节因子、血管生成抑制因子、自杀基因等等(Zhang Q，Nie M，Sham J，er al.Effective gene-viral therapyfor telomerase-positive cancers by selective replicative-competent adenovirus combiningwith endostatin gene.Cancer Res.2004；64：5390-5397；Ahn M，Lee SJ，Li X，et al.Enhanced combined tumor-specific oncolysis and suicide gene therapy for prostate cancerusing M6 promoter.Cancer Gene Ther.2009；16：73-82；Choi KJ，Kim JH，Lee YS，et al.Concurrent delivery of GM-CSF and B7-1 using an oncolytic adenovirus elicits potentantitumor effect.Gene Ther.2006；13：1010-1020.31)。TK基因作为一种“自杀基因”，它可将无毒性的前体药物更昔洛韦(ganciclovir，GCV)磷酸化为三磷酸更昔洛韦(GCV-TP)，抑制细胞DNA聚合酶，从而阻断核酸代谢途径，导致细胞死亡(Freeman SM，Whartenby KA，Freeman JL，Abboud CN，Marrogi AJ.In situ use of suicide genes forcancer therapy.Semin Oncol 1996；23：31-45)。应用HSV1-TK/GCV系统的基因疗法在国外已进入III期临床实验阶段(Hadaczek P，Mirek H，Berger MS，Bankiewicz K.Limitedefficacy of gene transfer in herpes simplex virus-thymidine kinase/ganciclovir genetherapy for brain tumors.J Neurosurg 2005；102：328-335)，然而与其他肿瘤基因治疗方案一样，自杀基因疗法也存在缺乏高效转染载体的问题。HSV1-TK/GCV的抗肿瘤作用已得到公认，但另一方面TK基因磷酸化阿昔洛韦(aciclovir，ACV)或更昔洛韦杀伤宿主细胞的同时，也使得病毒本身对于阿昔洛韦等抗病毒药物敏感，在以后的体内应用中，可以依靠重组病毒的这种特性清楚体内残留的治疗用病毒，控制治疗过程中可能出现因病毒引起的各种毒副作用。上海交大的研究人员构建了携带TK基因的溶瘤病毒“Ad.hTERT-E1A-TK”，并针对视网膜母细胞瘤和肺癌进行了体内外研究，结果证明可以特异在肿瘤细胞中复制增殖，同时与GCV联用可以增强载体的肿瘤杀伤作用。但研究结果并未显示与GCV联用时对于正常细胞的影响，考虑到载体的TK基因是由CMV启动子调控的，因此TK基因可能会在非靶细胞中表达，可能会导致在利用自杀基因疗法时，病毒载体对正常细胞造成非特异性毒性作用。

重组溶瘤病毒Ad-TIEH是由hTERT启动子同时调控E1A和TK基因，因此，提示Ad-TIEH不仅可以应用于HSV1-TK/GCV自杀基因系统，还应对于抗病毒药物阿昔洛韦有一定程度敏感性，这样Ad-TIEH就具备了另一优势，即在将来的临床应用中，可以用抗病毒药物对病毒载体本身进行有效的控制，防止病毒载体对机体的毒副作用和清除体内残留病毒载体。为验证这种推论，本发明人进行了阿昔洛韦敏感实验。实验结果证明阿昔洛韦可以应用于一定程度的抑制Ad-TIEH病毒的复制。在阿昔洛韦10μg/ml浓度下，Ad-TIEH增殖能力较无阿昔洛韦存在情况下大大减弱，而H101无此特性。

条件增殖型腺病毒作为一种新兴的肿瘤生物治疗疗法，还是存在一些亟待解决的问题，如机体的免疫反应，感染非靶向细胞，非特异性毒性反应等，因此在加强改造条件增殖型腺病毒肿瘤杀伤效应的同时，应兼顾对于条件增殖型腺病毒安全性控制，例如研究人员成功构建了一种缺失E3区(2.7kb)和E4区(2.8kb)的重组腺病毒，与第一代载体相比引起的宿主抗病毒免疫反应要弱很多，但同时产生的细胞毒性大大减弱；也有研究者认为机体免疫反应的存在可以发挥“旁观者效应”，即进入体内的腺病毒可以激活针对病毒抗原的MHC I类限制性CTL反应，而且足以杀伤病毒感染的靶细胞，这种效应对基因治疗杀伤肿瘤细胞是有利的(Muruve DA.The innate immuneresponse to adenovirus vectors.Hum Gene Ther.2004；15：1157-1166)。因此本发明构建的重组腺病毒的E3E4区保持完整，从而尽可能保留载体的正常毒力。而本发明人采用hTERT调控E1A基因和TK基因表达，使得重组腺病毒Ad-TIEH不仅具备高效肿瘤杀伤效应，还拥有更好的复制特异性和肿瘤杀伤特异性，极大提高了安全性；另外载体本身还具有阿昔洛韦敏感性，可以有效控制病毒载体的复制，防止病毒载体本身对于机体的损害，更加适合临床应用。

当前国内外的肿瘤基因治疗研究日趋成熟，腺病毒载体的应用越来越来多，新的研究成果和方法也层出不穷，但基因治疗的载体问题仍是关键所在。上海交大研究人员构建的“Ad.hTERT-E1A-TK”证实可以有效杀伤多种肿瘤细胞，但由于TK基因没有受特异性启动子调控，所以在自杀基因治疗过程中会对正常细胞产生影响。因此如何让进一步提高腺病毒载体的有效性和安全性，仍是基因治疗中存在的重大难题。本发明中所构建的由hTERT启动子同时调控E1A基因和TK基因的条件增殖型腺病毒Ad-TIEH不仅能使病毒有效地感染hTERT阳性肿瘤细胞并在细胞内不断增殖，并利用TK基因的自杀基因作用提高抗肿瘤效果，同时还可以使重组腺病毒对抗病毒药物阿昔洛韦等敏感，在将来的临床应用中可以利用抗病毒药物清除体内残留治疗病毒，控制病毒载体本身的毒副作用，从而大大提高了药物安全性，同时本发明的Ad-TIEH作为良好的病毒载体平台，还可以用于携带外源抗肿瘤元件。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种重组腺病毒载体，所述腺病毒载体从5’→3’依次包括以下可操作性相连的元件：

单纯疱疹病毒TK基因，内部核糖体进入位点，腺病毒E1A基因，端粒酶催化亚基hTERT启动子，缺失E1基因和E3基因的腺病毒基因组。

2.如权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述的重组腺病毒载体的骨架质粒是腺病毒载体。

3.如权利要求1所述的重组腺病毒载体，其特征在于，

所述的单纯疱疹病毒TK基因的DNA序列如GenBank登录号NC_001806.1中第46608-47911位所示；或

所述的腺病毒内部核糖体进入位点IRES的DNA序列如GenBank登录号U89673.1中第1300-1802位所示；或

所述的腺病毒E1A基因的DNA序列如GenBank登录号：AY339865.1中第560-1545位所示；或

所述的端粒酶催化亚基hTERT启动子的DNA序列如GenBank登录号NT_006576.16中第1285124-1285525位所示。

4.权利要求1所述的重组腺病毒载体的用途，用于肿瘤特异复制型的腺病毒。

5.一种用于制备重组腺病毒的系统，所述系统包括：

(a)一种重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体从5’→3’依次包括以下可操作性相连的元件：

单纯疱疹病毒TK基因，内部核糖体进入位点，腺病毒E1A基因，端粒酶催化亚基hTERT启动子；

(b)一种生产病毒的细胞。

6.如权利要求5所述的系统，其特征在于，所述的生产病毒的细胞是293细胞。

7.一种重组的肿瘤特异复制型的腺病毒，其由权利要求1-3任一所述的重组腺病毒载体包装获得。

8.一种抗肿瘤的药物组合物，所述的药物组合物含有：

有效量的权利要求7所述的肿瘤特异复制型的腺病毒；和

药学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述的肿瘤选自：鼻咽癌，肺癌，骨肉瘤，胰腺癌，食管癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、大肠癌、前列腺癌、宫颈癌、白血病、口腔癌、唾液腺肿瘤、鼻腔与鼻旁窦恶性肿瘤、喉癌、耳部肿瘤、眼部肿瘤、甲状腺肿瘤、纵隔肿瘤、胸壁、胸膜肿瘤、小肠肿瘤、胆道肿瘤、胰腺与壶腹周围肿瘤、肠系膜与腹膜后肿瘤、肾脏肿瘤、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、前列腺癌、睾丸肿瘤、阴茎癌、子宫内膜癌、卵巢恶性肿瘤、恶性滋养细胞肿瘤、外阴癌与阴道癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、软组织肿瘤、骨肿瘤、皮肤及附件肿瘤、恶性黑色素瘤、神经系统肿瘤、小儿肿瘤。

10.一种抗肿瘤的药盒，所述的药盒中含有：

权利要求8所述的组合物，或

权利要求7所述的重组的肿瘤特异复制型的腺病毒。

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