CN105461806A - 脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法，包括：基因的克隆、基因的表达、重组蛋白的纯化、免疫动物和纯化抗体，本发明采用单拷贝的Kringle？IV？1序列作为免疫原制备脂蛋白(a)多克隆抗体，得到的抗体只针对Kringle？IV？1结构域部分，专一性较高，效果好于用全长脂蛋白(a)来制备的多克隆抗体。

Description

脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法。

背景技术

脂蛋白(a)主要是在肝脏合成，主要的功能是阻止血管内血块溶解，促进动脉粥样硬化形成。脂蛋白水平持续升高与心绞痛、心肌梗死、脑溢血有密切关系。是冠心病的独立危险因子。Lp(a)是一种富含胆固醇的脂蛋白，核心部分为中性脂质和apoB-100分子，其外围包绕着亲水性的apo(a)，二者以二硫键共价连接；其中apo(a)是Lp(a)的特征性糖蛋白成分，主要由一种称为Kringle的特征性结构构成，Kringle由80～114个氨基酸残基组成，依靠三个内部二硫键稳定。

从apo(a)的N-末端到C-末端.所有的Kringle域通过两两之间的大约30个氨基酸的中间序列依次相连。除最靠近C端的Kringle域与纤溶酶原中的Kringle5同源外，其余Kringle域均与纤溶酶原中的Kringle4同源，并依次被命名为KringleIVl-10型。在所有这10型的KringleIV中，不同个体的Kringle2型的串联重复数一般在3-43之间变化，因此Apo(a)的分子量也就在300-800kDa的范围中变化。KringleIV9型中有7个半胱氨酸，其中未参与分子内二硫键的第4057位半胱氨酸(Cys4057)与载脂蛋白B-100中的第4326位半胱氨酸(Cys4326)肜成分子间二硫键，进而组成完整的Lp(a)。

现有技术中制备脂蛋白(a)的多克隆抗体一般是采用全长脂蛋白(a)的重组蛋白来免疫动物，由于脂蛋白(a)的蛋白含较多的重复片段，制得的抗体多是针对这些重复片段上的抗原决定簇，使得多抗的特异性很低，结合能力很不均一，不能用于免疫检测试验。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种特异性好的脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法，包括：基因的克隆、基因的表达、重组蛋白的纯化、免疫动物和纯化抗体，通过KringleIV1片段序列作为免疫原制备脂蛋白(a)多克隆抗体。

进一步地，所述免疫原采用酵母表达系统分泌表达。

进一步地，所述基因的克隆方法为：设计一对含限制性酶切位点的引物，扩增脂蛋白(a)基因的KringleIV1片段，用限制性内切酶切割酵母分泌表达载体的质粒DNA和KringleIV1片段DNA，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，验证正确后提取重组质粒，转化酵母菌感受态细胞。

进一步地，所述重组蛋白的纯化方法为：先浓缩含重组质粒的酵母菌发酵培养液，然后浓缩液按照先疏水，后阴离子交换层析，再分子筛纯化，获得重组蛋白纯品。

进一步地，所述免疫动物的方法为：首次免疫采用弗氏完全佐剂将纯化的蛋白进行乳化，每只小鼠注射一定量纯化的蛋白，然后采用弗氏不完全佐剂乳化纯化的蛋白，以21天为间隔进行第2-3次免疫。

进一步地，所述纯化抗体的方法为：利用饱和硫酸铵法初步纯化血清，然后再用溴化氰活化的琼脂糖4B偶联脂蛋白(a)蛋白做亲和层析。

本发明提供的脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法，采用单拷贝的KringleIV1片段来制备多抗，得到的抗体只针对KringleIV1结构域部分，专一性较高，效果好于用全长脂蛋白(a)来制备的多克隆抗体。

附图说明

图1是本发明实施例提供的使用全长脂蛋白(a)和本发明的脂蛋白(a)片段制备的多抗进行WesternBlot的图。其中泳道1为全长脂蛋白(a)制备的多抗，泳道2为本发明实施例1制备的多抗。

具体实施方式

本发明实施例提供一种脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法。由脂蛋白(a)的基因序列分析结果，脂蛋白(a)是高度重复序列，根据序列的特征，采用将KringleIV1部分序列克隆到酵母表达载体pPic9k的方法来得到免疫动物的抗原，采用部分片段进行动物免疫，得到只针对部分片段的多克隆抗体，抗体的针对性很强，只针对部分片段，类似于单抗的效果。具体方案是，构建脂蛋白(a)KringleIV1片段的毕赤酵母表达载体(相关序列见序列1)。转化毕赤酵母，筛选稳定表达的毕赤酵母菌落。采用甲醇诱导毕赤酵母分泌表达脂蛋白(a)的片段，采用蛋白沉淀，疏水层析，阴离子交换层析和分子筛过滤层析等方法浓缩纯化诱导表达的所得到的片段，并分三次加弗氏完全佐剂和不完全佐剂免疫小鼠，检测小鼠抗体效价和特异性，经抗体纯化，最终得到脂蛋白(a)多克隆抗体。

因Lp(a)特有载脂蛋白Apo(a)组成结构单元中KringleIV2的拷贝数多态性存在，大部分抗体直接针对KringleIV2位点，测定结果必然受到Apo(a)大小影响。不管如何选择.校准品、参考物质与待测样本中apo(a)分子的大小、分布不可能完全一致，从而造成不同试剂盒检测结果的差异，引起差异的主要原因就是抗体的识别位点或特异性。本发明采用同源性低的KringleIV1部分片段来免疫小鼠，获得相应抗原决定簇的抗体，克服了apo(a)分子的大小、分布不一致的缺点，抗体针对性强，制备的试剂盒稳定性好。采用毕赤酵母表达载体来构建分泌表达脂蛋白(a)片段KringleIV1结构域的载体，得到人脂蛋白a蛋白的蛋白片段，用于免疫小鼠，得到的抗体稳定性和特异性都较好。

实施例1

实施例1提供一种脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法。具体方法如下：

1、基因的克隆

设计特异性引物，特异性引物序列如下：两端带上的E.coRI，NoTI酶切位点：

CGCGAATCCATGGAACATAAAG(E.coRI)

CGCGCGGCCGCTTAGCGGCCGGTCACG(NoTI)。

以人肝细胞总RNA为模板，先逆转录，后PCR扩增脂蛋白(a)KringleIV1片段。PCR扩增条件：94℃60s，55℃60s，72℃60s，30个循环。PCR产物纯化后得到优化抗原决定簇后的片段，该片段和pPic9k表达载体质粒用E.coRI和NoTI同时进行双酶切，将二者酶切后的片段用T4DNA连接酶连接。用氯化钙转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，通过氨苄青霉素抗性筛选转化子。提取质粒，用PCR、E.coRI和NoTI双酶切鉴定是否有外源基因的插入。验证正确的质粒用于酵母菌感受态细胞的转化。

2、酵母细胞表达基因

pPic9k表达载体质粒酶切线性化后，转化插入毕赤酵母：用BglII酶切重组质粒pPic9k-Lp(a)，使之线性化。将线性化的100ng重组质粒DNA加入10μL经100℃变性的鲑鱼精DNA，混匀。加入100μl感受态酵母，剧烈振荡5s。加入530μLPEG、60μL1.0mol/LLiAc，剧烈振荡5s。30℃，200r/min，温育30min。加入70μLDMSO，颠倒温和混匀，42℃，水浴15min。室温，12000r/min离心10s，吸尽上清。用500μL无菌水重悬细胞，涂RDB平板，30℃培养。从转化平板RDB上挑取His+重组子，将其分别接种到MM和MD固体培养基，将能在MD培养基上正常生长，而在MM培养基上不能生长或生长极其缓慢的转化子定义为阳性转化子。

重组质粒与酵母细胞发生同源重组后可将外源基因整合到酵母染色体AOXl基因位点上去，该外源基因的表达受甲醇的严格调控和诱导。选取重组毕赤酵母中的阳性转化子，经5mlBMGY培养基30℃培养48h，离心取菌体，换5mLBMMY培养基，继续30℃培养，并每24h补加甲醇连续诱导48h。获得诱导表达的培养液，用于下一步的蛋白纯化。

3、从培养液纯化脂蛋白(a)片段

重组酵母的诱导培养的上清液浓缩过程：加入含0.4％脱氧胆酸钠的三氯乙酸溶液于培养基上清液，至三氯乙酸的终浓度为20％(W/W)，震荡混合，冰上孵育20～30min。离心15min，去上清。加3倍体积的丙酮，静置约10min。离心15min，去上清，沉淀物置冰上干燥10min。用含2-巯基乙醇的样品缓冲液(1×)溶解沉淀物。

浓缩液按照先疏水，后阴离子交换层析，再分子筛纯化，获得纯品。疏水亲和层析步骤如下：预先用缓冲液(50mmol/LTrisHClpH7.5，1mmol/LEDTA.1mol/L硫酸铵)平衡层析柱，将上步浓缩后的溶液(已加固体硫酸铵至终浓度lmol/L)上样(流速2ml/min)，再用平衡柱的缓冲液洗涤至无蛋白质流出为止(纯化仪检测)，最后用缓冲液(50mmol/LTris-HCIpH7.5，lmMEDTA)洗脱，收集洗脱峰，15％聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。

阴离子交换层析步骤如下：Q柱(1cm×20cm)预先用缓冲液(50mmol/LTrisHClpH7.5，lmmol/LEDTA)平衡，将疏水层析后的样品上样(流速2ml/min)，再用上述缓冲液洗涤至无蛋白质流出为止(纯化仪检测)，最后进行线性梯度洗脱(缓冲液50mmol/LTrisHClpH7.5，lmmol/LEDTA，含0～0.3mol/LNaCl.洗脱总体积300ml，分部收集洗脱液，15％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，考马斯亮兰染色。合并收集目的蛋白所在管，准备下一步纯化。

分子筛纯化步骤：用Superdex200填料装柱46mm×70cm。用0.05mol/L磷酸缓冲液0.15mol/LNaClpH7.0的溶液平衡。收集A280≥0.1的组分。将洗脱液对1mmol/LNH₄HCO₃(pH7.5)、4℃透析过夜(中间更换缓冲液2～3次)。

4、免疫动物

用制备的Lp(a)片段抗原免疫4只6周龄雌性BALB/c小鼠，首次免疫采用弗氏完全佐剂将抗原进行乳化，每只小鼠注射40μg抗原，然后采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，以21天为间隔进行第2-3次免疫。完成3次免疫后眼眶采血检测血清抗体效价，采用间接ELISA法对血清进行筛选.检测抗原为Lp(a)和APOB。用0.05mol/LpH9.6Na₂CO₃-NaHCO₃，缓冲液将Lp(a)和APOB稀释至1μg/ml，两种抗原按列间隔包被，每孔100μl加到酶标板中，4℃放置过夜，用PBST洗涤酶标板1次，完成抗原包被：将培养上清加到酶标板中，每个培养孔取样2次，分别加到Lp(a)和APOB包被孔中，每孔100μl，37℃温育30min，用PBST洗板2次；将HRP-羊抗小鼠IgG稀释至工作浓度，每孔100μl加到酶标板中，37℃温育30min，用PBST洗板3次；加入TMB-H₂O₂底物，37℃避光显色10min；每孔加入50μl2mol/LH₂SO₄。终止显色，在酶标仪上读取OD。如值。选取与Lp(a)呈强阳性反应，但与APOB呈阴性反应的小鼠血清。采全血纯化抗体。

5、纯化抗体

利用饱和硫酸铵法初步纯化血清，然后再用溴化氰活化的琼脂糖4B做亲和层析。其步骤简述如下：用1mol/LHCl溶解并洗涤1克溴化氰活化的琼脂糖4B冻干粉剂，用偶联缓冲液(0.1mol/LNaHCO₃，0.5mol/LNaCl，pH8.3)将其与重组脂蛋白(a)片段混合于4℃偶联过夜，洗涤后转入阻断缓冲液(0.1mol/LTris-HCI，pH8.0)以封阻残留活性基团。再依次用偶联缓冲液和乙酸盐缓冲液(0.1mol/LNaAc，0.5mol/LNaCl，pH4.0)循环洗涤偶联介质4次。将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，以0.2mol/LpH9.0NaHCO₃(含0.1mol/LNaCl)洗涤至洗出液的OD280<0.02，缓慢加入待纯化的经初步提纯的多克隆抗体，用0.01mol/LpH7.4PBS液洗脱至洗出液OD280<0.02。缓慢加入0.1mol/LpH2.4甘氨酸-HCI缓冲液，收集解吸附下来的成分，立即以lmol/LNaHCO₃中和，以免蛋白变性。

制备出的脂蛋白a多克隆抗体的性能评价。

采用Westernblot实验评价脂蛋白(a)多克隆抗体。Westernblot实验步骤：首先组织块称重，利用液氮、研钵粉碎组织块。加入RIPA缓冲液(每克组织3mlRIPA)，PMSF(每克组织30μl，10mg/mlPMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃。加入PMSF(每克组织30μl，10mg/mlPMSF)，冰上孵育30分钟。移入离心管4℃约20,000g(约15,000转)15分钟。上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存。

进行Bradford比色法测定蛋白质浓度。取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液。沸水浴中3分钟。上样电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA)。电转膜仪转膜(100mA40分钟)。膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色。转膜完毕后，立即把蛋白膜放置Western洗涤液中，漂洗1-2分钟，吸尽洗涤液，加入Western封闭液，室温封闭60分钟。按照适当比例用Western一抗稀释液稀释两种制备的多抗。用微型台式真空泵吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。参考二抗的说明书，按照适当比例用Western二抗稀释液稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗。用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。加入Western洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5-10分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5-10分钟。共洗涤3次。Westernblot试剂盒显色。分析比较记录，实验结果见图1，从图1可见采用本发明制备的抗体特异性和效价要好于采用全长脂蛋白(a)制备的抗体。

最后所应说明的是，以上具体实施方式仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照实例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.脂蛋白(a)多克隆抗体的制备方法，包括：基因的克隆、基因的表达、重组蛋白的纯化、免疫动物和纯化抗体，其特征在于：通过KringleIV1片段序列作为免疫原制备脂蛋白(a)多克隆抗体。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述免疫原采用酵母表达系统分泌表达。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述基因的克隆方法为：设计一对含限制性酶切位点的引物，扩增脂蛋白(a)基因的KringleIV1片段，用限制性内切酶切割酵母分泌表达载体的质粒DNA和KringleIV1片段DNA，然后体外使两者相连接，再用所得到重组质粒转化细菌，验证正确后提取重组质粒，转化酵母菌感受态细胞。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述重组蛋白的纯化方法为：先浓缩含重组质粒的酵母菌发酵培养液，然后浓缩液按照先疏水，后阴离子交换层析，再分子筛纯化，获得重组蛋白纯品。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述免疫动物的方法为：首次免疫采用弗氏完全佐剂将纯化的蛋白进行乳化，每只小鼠注射一定量纯化的蛋白，然后采用弗氏不完全佐剂乳化纯化的蛋白，以21天为间隔进行第2-3次免疫。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述纯化抗体的方法为：利用饱和硫酸铵法初步纯化血清，然后再用溴化氰活化的琼脂糖4B偶联脂蛋白(a)蛋白做亲和层析。