CN109212190A - 一种检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒 - Google Patents

一种检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，包括固相化有SCCA抗体的聚苯乙烯包被板，标记有SCCA抗体的酶结合物1和标记有SCCA‑2抗体的酶结合物2，样品稀释液和校准品。本发明试剂盒属于双抗体夹心法，操作简单方便，利用抗原抗体反应的特异性和强吸附性，通过ELISA技术在同一个反应条件下进行测定同一种抗原（SCCA）在机体发生良性或恶性肿瘤时所表达的不同组分，且灵敏度高，特异性强。

Description

一种检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒
技术领域
本发明涉及生物检测领域，尤其是涉及一种检测鳞状细胞癌抗原（SCCA与SCCA-2）的试剂盒。
背景技术
鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma）检测鳞癌，常发生在身体原有鳞状上皮覆盖的部位，如皮肤、口腔、唇、子宫颈、阴道、食管、喉、阴茎等处，也可发生在有鳞状上皮化生的其他非鳞状上皮覆盖部位，如支气管、胆囊、肾盂等处，肉眼看多呈菜花状，此类肿瘤恶性程度较基底细胞深，发展快，破坏大，既可破坏眼部组织，侵入副鼻窦或颅内，又可以通过淋巴管转移至耳前或颌下淋巴结，甚至引起全身性转移。口腔鳞状细胞癌是人类十大肿瘤之一，其发病呈逐年上升趋势。
鳞状细胞癌抗原（squamous cell carcinoma antigen,SCC）是肿瘤相关抗原TA-4（Tumor Associated-Antigen 4）的亚片段，最初于1977年Kato等人从宫颈鳞癌组织中取出，分子量约为48KB。SCCA作为鳞状细胞癌肿瘤标志物，具有较好的特异性。在癌症患者体内，鳞状细胞癌的癌细胞释放SCCA增多，故SCCA在鳞状细胞癌患者血清中的浓度升高。SCCA升高可见于宫颈癌、肺癌、食管癌等。
目前，临床上对于鳞状细胞癌的辅助诊断大多是通过测定血清中鳞状细胞癌抗原（SCCA）的浓度，同时对于癌症患者，可通过对于血清SCCA浓度的动态监测，来辅助判断疾病进程、治疗效果和复发，但不能作为恶性肿瘤早期诊断或确切的依据。而鳞状细胞癌抗原（SCCA）由两个相类似的蛋白质组成，即SCCA-1和SCCA-2，它们具有特异的蛋白酶抑制剂的特性。根据其等电点的不同可以分为两类：PI≥6.25的中性SCCA和PI＜6.25的酸性SCCA-2。中性SCCA一般分布在鳞状细胞内部，而酸性SCCA-2则大量表达于鳞状细胞癌并分泌出细胞。SCCA-1抑制糜蛋白酶和组织蛋白酶L的活性，发挥抗凋亡效应；SCCA-2能够抑制组织蛋白酶G和巨细胞糜酶的活性，因而使得上皮细胞免受这些蛋白酶所导致的炎症损伤。
对于SCCA-1和SCCA-2的生物学角色，人们还没有完全了解。它们被认为是有抑制作用的丝氨酸蛋白酶抑制剂。在正常的鳞状上皮细胞的细胞质里发现了SCCA-1和SCCA-2，出现在病人血清中的抗原可能是由肿瘤细胞核它们的正常更新引起SCCA过渡生产的作用。已有报道，利用抗体放射免疫学测定或RT-PCR方法，在血清中发现的SCCA主要是SCCA-2。相关文献表示，SCCA-2在监测病情复发时，相对于SCCA-1，反应出血清浓度的提高要更早，且对于指示复发迹象显示出更高的水平。因此将SCCA-2与SCCA合并于同一个试剂盒中，并且在检测病人血清时，仅需同时做一个复孔实验就能够分别检测出体内SCCA总量和SCCA-2所表达的浓度值。同时最大限度的提升了SCCA试剂盒检测的临床检测敏感度，从而来更准确有效的判断良性或恶性肿瘤的发生发展进程。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测更加快速、方便、敏感度更高的试剂盒，可将鳞状细胞癌抗原（SCCA与SCCA-2）的浓度分别检测出来，进而通过两者比较而达到临床所需要的分别对于良、恶性鳞状上皮细胞癌的准确预测、分期和判断预后。
为实现上述目的，本发明可采取下述技术方案：
本发明所述的检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，包括固相化有SCCA抗体的聚苯乙烯包被板，标记有SCCA抗体的酶结合物1和标记有SCCA-2抗体的酶结合物2，样品稀释液和校准品。
所述固相化有SCCA抗体的聚苯乙烯包被板的制备方法为：取洁净的聚苯乙烯包被板清洗后，取含有SCCA抗体的包被液加入，待包被结束抽去板内液体，加入适量的封闭保护液；封闭保护结束，按包被的先后顺序进行抽干，抽去包被板内液体后，将板块在台面上拍打，除去孔内残液；干燥后加干燥剂装袋封存，2～8℃存放待用。
所述酶结合物的制备方法为：将含有TAPS和NaCl的缓冲液，加入1/2000的SCCA酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，酶结合物1制备完成，2～8℃保存待用；将含有TAPS和NaCl的缓冲液，加入1/2000的SCCA-2酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，酶结合物2制备完成，2～8℃保存待用。
所述样品稀释液的制备方法为：在含有NaCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.12H2O和EDTA-Na2的缓冲液中加入Casein混合均匀后，样品稀释液制备完成，2-8℃保存待用。
所述校准品选用pH为8.18的硼酸缓冲液，加入适量的BSA后2～8℃保存待用。
本发明试剂盒的使用方法如下：
1、标本要求：
采集：采用正确医用技术收集全血样本，离心分离后，提取血清用于检测。试验中血清样本勿加防腐剂等添加剂。
储存：待测血清存放于2~8℃冰箱，采血后24小时内测定。若长时间保存，则应冻存于-20℃以下，避免反复冻融；使用前恢复到室温，轻轻摇动混匀；若样本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用，严重溶血脂血、或浑浊的样本不能使用。
2、检验方法：
取出一定量的包被板，编号；每孔分别加入50uL样本稀释液；前6孔依次加入50uL校准品，其余孔按照每两孔一组，每组的每孔各加入50uL相同样本。混合均匀，37℃条件下反应30min后洗涤，然后在每孔中依次分别加入100ul（SCCA/SCCA-2）酶结合物1、酶结合物2，37℃条件下反应30min后洗涤，最后在两孔中分别加入100ul发光底物（鲁米诺＋H2O2），避光5分钟测发光值，通过校准品拟合两条不同的曲线，将测得的样本发光值分别回算出患者血清SCCA和SCCA-2的浓度。在临床应用中通过比较总SCCA与SCCA-2浓度含量来做出相应的疾病辅助诊断。
3、注意事项：
3.1 样本中的嗜异性抗体或类风湿因子可能会干扰检测结果，需结合患者病史，临床检查和其他临床资料来综合评估检测结果。
3.2 SCCA广泛存在于正常人的皮肤、汗液及唾液等体液当中，整个实验过程中，应严格规范操作，佩戴口罩、帽子，避免使用到的试剂、枪头、反应容器等被污染而导致假性升高结果。
3.3 部分良性疾病患者，如皮肤病（牛皮癣、湿疹、红皮病等）患者、慢性肾部疾病患者、肺部疾病（肺炎、肺结核等）患者等，也会出现SCCA浓度升高，应结合患者病史，临床检查和其他临床资料来综合评估检测结果。
化学发光标准曲线的绘制方法为：
本实验采用六点定标法，首先取6个不同浓度梯度的SCCA校准品，测定不同浓度梯度的校准品的发光值，求均值，分别以浓度为X轴，发光值以Lg值为Y轴，（Lin-Log）四参数拟合两条曲线。关于校准品赋值：本发明试剂盒采用同一套校准品进行两种不同检测物的赋值，使其具有能够分别回算待测血清中SCCA和SCCA-2抗原浓度的能力。
本发明试剂盒属于双抗体夹心法，操作简单方便，利用抗原抗体反应的特异性和强吸附性，通过ELISA技术在同一个反应条件下进行测定同一种抗原（SCCA）在机体发生良性或恶性肿瘤时所表达的不同组分，且灵敏度高，特异性强。
在使用时，首先对病人进行简单分类（对于患有恶性肿瘤和未知样本类型分开处理），对于已知患有恶性肿瘤（包含术后复查）病人可直接检查SCCA-2来反映SCCA在体内含量；对于未知患者类型，可先进行SCCA的初筛，若结果在灰区范围内或结果为阳性，可进而更深一步检查SCCA-2血清水平。
附图说明
图1、图2为本发明试剂盒与现有试剂盒的临床相关性比较。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做更加详细的说明，以便于本领域技术人员的理解。如无特殊说明，本发明中所用的试剂和仪器均为本领域的市售产品，本发明中的试验方法也均为本领域常规的方法。
实施例1 制备鳞状细胞癌抗原（SCCA和SCCA-2）检测试剂盒
1、制备包被板：取洁净的聚苯乙烯微孔包被板。在清洗微孔板后，取含有SCCA抗体的包被液加入，2～8℃过夜包被，排干洗涤后，取合格的封保液，将包被板按照包被顺序传递入包被间，按要求加入适量的封保液，室温放置3小时保护后，按包被的先后顺序进行抽干，抽去包被板内液体后，将板块在台面上拍打（保证孔内残液拍干净），按照顺序将板块整齐的摆放在干燥架上，干燥后加干燥剂封袋，存放于2～8℃环境保存待用。
2、制备酶结合物：
将含有4.886gTAPS和8.200gNaCl的缓冲液1000ml作为酶结合物缓冲液，加入1/2000的SCCA酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白（BSA）20g混合均匀，得到酶结合物1，2～8℃保存待用；
将含有4.886gTAPS和8.200gNaCl的缓冲液，加入1/2000的SCCA-2酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白（BSA）20g混合均匀，得到酶结合物2，2～8℃保存待用。
3、制备样品稀释液：取1000ml纯化水，加入所需量的8.119gNaCl、0.382gNaH2PO4.2H2O、1.911g Na2HPO4.12H2O和 19.802gEDTA-Na2，充分搅拌溶解后，加入9.901gCasein混合均匀，2～8℃保存待用。
4、校准品选用pH8.18的缓冲液，添加1%的BSA保护蛋白。
实施例2 本发明试剂盒的性能检测
1、灵敏度检测
LoB（配方为纯化水1000mL、Na2B4O7·10H2O6.002g、H3BO38.128g）准备5份接近0值的临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；LoD（校准品S3以LoB为稀释液稀释）准备5份浓度范围为1-4倍LoB的系列临床样本，每个样本重复3次，总共做4天，得到60个数据；FS：采用LoD实验中的数据，5个浓度样本每天测3次，总共测4天，每个样本得到12个结果，计算每个样本的均值、SD和CV%，最接近20%的浓度为功能灵敏度；灵敏度检测结果见下表1。
表1
从表1检测结果可以看出：第1批试剂盒能够准确检测出SCCA和SCCA-2的最低浓度分别为0.38ng/ml和0.32ng/ml；第2批试剂盒能够准确检测出SCCA和SCCA-2的最低浓度分别为0.37ng/ml和0.26ng/ml；第3批试剂盒能够准确检测出SCCA和SCCA-2的最低浓度分别为0.42ng/ml和0.36ng/ml。可以看出本试剂盒的灵敏度能够满足临床检测需求。
2、HOOK风险检验
表2
如表2结果所示，考核10000ng/mL的高值，未出现HOOK。
3、正常参考区间
检测710例正常人群样本，采用百分位数法确定SCCA正常参考区间为＜1.5ng/mL，SCCA-2正常参考区间为＜1.2 ng/mL。建议各实验室根据自己条件及接触人群建立正常参考区间。本试剂盒仅作为诊断的辅助手段之一，供临床医生参考。
实施例3 本发明试剂盒的临床验证
为了判断本发明试剂盒SCCA-2检测鳞状上皮细胞癌与临床上鳞癌患者检测的符合率，取来自A06医院血清宫颈鳞癌和肺鳞癌样本共213例，正常人血清320例，银屑病、牛皮癣患者血清235例，分别用本发明试剂盒与上海匹拓生物科技有限公司生产的SCCA-2试剂盒进行检测，检测结果见下表3。
表3
验证结果表明，本发明试剂盒对于鳞状上皮细胞癌的符合率高达82%，良性病患者阳性率为10%，说明本发明试剂盒可以突出对鳞状上皮细胞癌的鉴别诊断。
将本发明试剂盒与上海匹拓生物科技有限公司生产的SCCA-2试剂盒做临床相关性比较，结果如图1；将本发明试剂盒与雅培SCCA试剂盒做临床相关性比较，结果如图2。
图1、图2的验证结果表明：本发明试剂盒具有很好的临床应用价值，且双测定法更为有效便利。
注：本申请中所用的化学发光免疫分析仪（Lumo）由郑州安图生物工程股份有限公司提供。

Claims (5)

1.一种检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，其特征在于：包括固相化有SCCA抗体的聚苯乙烯包被板，标记有SCCA抗体的酶结合物1和标记有SCCA-2抗体的酶结合物2，样品稀释液和校准品。
2.根据权利要求1所述的检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，其特征在于：所述固相化有SCCA抗体的聚苯乙烯包被板的制备方法为：
取洁净的聚苯乙烯包被板清洗后，取含有SCCA抗体的包被液加入，待包被结束抽去板内液体，加入适量的封闭保护液；封闭保护结束，按包被的先后顺序进行抽干，抽去包被板内液体后，将板块在台面上拍打，除去孔内残液；干燥后加干燥剂装袋封存，2～8℃存放待用。
3.根据权利要求1所述的检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，其特征在于：所述酶结合物的制备方法为：
将含有TAPS和NaCl的缓冲液，加入1/2000的SCCA酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，酶结合物1制备完成，2～8℃保存待用；
将含有TAPS和NaCl的缓冲液，加入1/2000的SCCA-2酶标抗体，然后再加入牛血清白蛋白混合均匀，酶结合物2制备完成，2～8℃保存待用。
4.根据权利要求1所述的检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，其特征在于：所述
样品稀释液的制备方法为：在含有NaCl、NaH2PO4.2H2O、Na2HPO4.12H2O和 EDTA-Na2的缓冲液中加入Casein混合均匀后，样品稀释液制备完成，2-8℃保存待用。
5.根据权利要求1所述的检测鳞状细胞癌抗原的试剂盒，其特征在于：所述
校准品选用pH为8.18的硼酸缓冲液，加入适量的BSA后2～8℃保存待用。
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