CN106053811A

CN106053811A - 一种尿液外泌体elisa的检测方法及其应用

Info

Publication number: CN106053811A
Application number: CN201610387088.6A
Authority: CN
Inventors: 梁利国; 王书崎
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-06-05
Filing date: 2016-06-05
Publication date: 2016-10-26

Abstract

本发明提供一种外泌体检测的ELISA方法，具体步骤包括：样本收集、包被孵育、封闭、加样、终止反应、判定结果、构建标准曲线，进行临床样本测试。本发明还提供一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在膀胱癌疾病的评估和防治方面的应用。本方法具有高度特异性的特点，本发明的检测方法也不需要昂贵且精密的实验仪器，具有很大的应用前景。

Description

一种尿液外泌体ELISA的检测方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种尿液外泌体ELISA检测方法。

背景技术

膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。检查方法包括尿常规检查、尿脱落细胞学、尿肿瘤标记物、腹部和盆腔B超等检查。根据上述检查结果决定是否行膀胱镜、静脉尿路造影、盆腔CT或/和盆腔MRI等检查明确诊断。其中，膀胱镜检查是诊断膀胱癌的最主要方法。然而膀胱镜检测费用高，并不适用于基层医疗单位或者贫困地区的普及应用，临床上亟待寻找一种针对膀胱癌检测的生物标志物来进行检测。外泌体（exosomes）是一种直径约为40-120nm，具有双层质膜结构的囊泡，由细胞通过胞吐作用释放至细胞外隙或生物学体液中。近年来，外泌体成为新的研究热点，因其内包含来源细胞所特有的mRNAs、microRNAs及蛋白等多种信号分子，在信号传导和免疫系统中起重要作用，并由完整的膜性结构包裹而减少微环境干扰，这使其在疾病诊断方面具有独特的优越性，是研究生物标志物和进行肿瘤免疫的新的生物材料，同时也具有治疗潜力。

目前针对外泌体的研究主要分为分离技术和检测技术。分离技术包括超速离心法、过滤离心法、密度梯度超速离心法、免疫磁珠结合超速离心法和色谱法等。检测技术主要包括：扫描电子显微镜观察形态（但SEM对样品的预处理和制备上面要求较高，样品的准备阶段比较复杂，不适合对外泌体进行大量快速的测量，而且由于外泌体经过了预处理和制备过程，无法准确的进行外泌体浓度的测量）、动态光散射技术（但由于动态光散射技术是测量光强的波动数据，所以大颗粒的光强波动信号会掩盖较小颗粒的光强波动信号，所以动态光散射不适合大小不一的复杂外泌体样本的测量，只适合通过色谱法制备的大小均一的外泌体的尺寸测量，并且无法测量样品中外泌体的浓度。）、流式细胞仪检测技术（流式细胞仪不仅可以检测囊泡的大小、数量，而且通过荧光标记可以检测囊泡的来源，将囊泡进行分类，因此，流式细胞仪是进行囊泡快速、高通量、多参数检测的最优选择。然而，传统流式细胞仪针对的样本主要是细胞，散射光的检测极限通常是300-500nm，而大多数细胞外囊泡的直径都在300nm以下，因此很难进行精确地定量和定性分析。）、纳米微粒追踪分析技术（是一种比较新颖的研究纳米颗粒的方法，可以直接和实时的观测纳米颗粒。由于外泌体表面有标志物CD9、CD63等跨膜分子的存在，在复杂的背景环境下(如血清中)，可以用荧光抗体标记外泌体，再用NTA的荧光测量功能实现在复杂背景下对外泌体的测量，但是需要精密的仪器）、流式细胞仪分析技术（但是流式细胞分析一次只能针对一个标志物进行检测，外泌体太小，由目前的流式细胞仪设备检测，有必要先绑定外来抗体包被的磁珠，需要精密的仪器设备，且操作繁琐、敏感度各异）、免疫印迹检测技术（操作过程复杂）和荧光定量PCR检测分析microRNA（提取核酸步骤复杂，需要昂贵的实验仪器）。因此，发展一种能够可靠、快速、经济地无创检测外泌体尤其是膀胱癌患者来源的外泌体的方法非常必要。

外泌体在尿液中可以稳定存在，尤其是尿液样品可以在非创伤性损伤的前提下大量获得。因此，如果能够检测尿液外泌体中的癌症信息，则有望将其用于癌症的无创诊断、监控等临床应用。然而，实际上，由于单位体积尿液中的外泌体含量非常低，采用一般方法单次提取得到的外泌体，根本无法满足后续检测的要求，所以目前针对外泌体的检测主要是先对样本中的外泌体进行浓缩处理，之后再采取一定的表征测量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种外泌体检测的ELISA方法，该方法可有效检测膀胱癌患者体内外泌体的量，检测结果特异性强，实用性强。在膀胱癌患者外泌体检测、监测等方面具有一定的应用前景。

为了实现本发明的目的，本发明采用以下技术方案：

一种外泌体ELISA检测技术方案，具体步骤如下：

（1）样本收集：收集健康志愿者/膀胱癌患者尿液样本100 ml，采用2, 000 g室温离心10-15分钟。去除细胞及其残片，将上清液100, 000g 4℃离心60-70分钟，收集外泌体沉淀并用PBS （pH 7.0）重悬外泌体，形成外泌体重悬液，保存备用。

（2）包被孵育：按每孔100 μL将外泌体重悬液包被到96孔酶标板孔，4 ℃孵育1-2小时一定时间后，小心移除上清液。

（3）封闭：按每孔100 μL加入 1% 的BSA封闭液，清清摇匀，4 ℃过夜或者37 ℃温育1-2小时；一定时间后小心移除孔内液体，用排枪按每孔200μL添加PBS洗涤缓冲液（pH7.4），静置2-3分钟，小心后移除孔内液体，重复洗涤2-4数次后拍干；

每次检测同时设定空白对照、阴性对照和阳性对照，每个样本重复封闭2-3次。

（4）加样：对封闭后的样本进行依次进行添加抗体和添加酶标反应物，之后加底物显色.

（5）终止反应：按每孔50 μL加入2mol/L H₂SO₄终止反应液，在酶标仪内测OD₄₅₀值，并记录结果。

（6）判定结果：试验组OD₄₅₀/阴性对照组OD₄₅₀值大于或等于2.1为阳性。

（7）构建标准曲线，根据判定结果和标准曲线的对比进行临床样本测试。

在采用上述技术方案的同时，本发明还可以采用或者组合采用以下进一步的技术方案：

所述添加抗体的步骤具体包括：按每孔100 μL加入1：200-1:500的anti-CD63（biotin-labeled）抗体（即浓度为2-5 μg/mL），清清摇匀，37 ℃并温育1-2小时。小心后移除孔内液体，用排枪按每孔200 μL添加PBS洗涤缓冲液（pH 7.4的），静置2-3分钟，小心后移除孔内液体，重复洗涤2-4数次后拍干。

按每孔100 μL加入1：2000-1:5000的HRP（streptavidin-labeled）（即浓度为0.2-0.5 μg/mL），，清清摇匀，37 ℃并温育1-2小时。小心后移除孔内液体，用排枪按每孔200 μL添加PBS洗涤缓冲液（pH 7.4的），静置2-3分钟，小心后移除孔内液体，重复洗涤2-4数次后拍干。

所述加底物显色的步骤具体包括：按每孔100 μL加入显色液，37 ℃一定温度下避光显色，10-30分钟后观察结果。

所述步骤（2）中包被于酶标板上的包被液为0.1M的NaHCO₃，使用前于4℃冰箱放置1-2小时。

洗涤所用的洗涤液为磷酸盐缓冲液PBS（pH 7.4 ± 0.2），洗涤次数为2-4次。

静置过程中的静置反应为生物素和链霉亲合素结合，其反应温度为35-37℃，反应时间为1-2小时。

所述显色液为四甲基联苯胺（TMB），为HRP和TMB结合反应，显色反应时间一般为10-30分钟，反应温度一般为35-37℃；所述的终止反应液为2M浓硫酸。

所述构建标准曲线的步骤具体包括：将分离自尿液中的外泌体连读系列倍比稀释成不同的浓度，根据浓度不同的外泌体构建外泌体ELISA检测标准曲线；即将所获得的外泌体悬液，按照10倍系列稀释法，即原液、1:10、1:100、1:1,000、1:10,000和1:100,000这6个梯度分别稀释，之后对每个梯度的稀释液分别进行ELISA检测，并根据检测结果的吸光度值建立对应的曲线，即为ELISA检测标准曲线。

本发明所要解决的另一个问题是提供一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在膀胱癌疾病的评估和防治方面的应用。

本发明首先进行构建外泌体ELISA检测标准曲线，即将分离自尿液中的外泌体连读系列倍比稀释成不同的浓度，之后构建标准曲线。后续，样本收集测定结果与已知的标准曲线进行对比，来判定患者体内外泌体的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1）本发明利用外泌体跨膜蛋白CD63这一特有的标志物，建立了一种ELISA反应体系和快速检测方法，该反应体系与检测方法，可用于检测膀胱癌患者尿液样本或膀胱癌细胞系培养液上清中外泌体的含量，本方法具有高度特异性的特点。

2）本发明的检测对象是从人体中排出的尿液，容易获得，而且不会对人体造成任何负担和创伤，本发明的检测方法也不需要昂贵且精密的实验仪器，具有很大的应用前景。

附图说明

附图用于和具体实施案例结合对本发明作进一步说明。

图1是exosomes扫描电子显微镜图片。

图2 是外泌体ELISA检测原理图。

图3是外泌体检测标准曲线。

图4是ELISA检测方法临床检测箱线图。

图5是ROC曲线分析结果。

具体实施方式

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应注意，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施案例中未注明具体试验条件和试验方法的按照常规条件和方法或者制造商所建议的条件予以实施。

本发明中未特别说明的各种仪器和试剂均为本领域熟知的市售产品，可通过商业途径采购获得。

实施案例：参见图1、图2、图3，一种尿液外泌体ELISA检测方法，包括如下步骤：

1）在患者知情及伦理委员会同意的前提下，收集膀胱癌患者（临床活检已证实为膀胱癌）尿液样本16份，每份100ml，在室温2, 000g的离心条件下去除细胞及大的碎片，然后得到上层清液。

2）将1）得到的上层清夜，于4℃条件下，100, 000g超速离心60分钟，弃掉上清取沉淀，并用1mL pH 7.4的PBS缓冲液重悬外泌体，得到外泌体重悬液（exosomes）（如图1）。

3）将2）所得外泌体悬液，按照10倍倍比进行系列稀释，分别保存，以备后续构建标准曲线。

4）将3）所备外泌体进行ELISA检测（原理如图2），首先进行样本包被孵育，每孔取100 μL外泌体悬液添加到96孔酶标板中，4 ℃孵育1-2小时，小心移除上清液体。

5）向4）酶标板每孔加入100 μL 1% 的BSA封闭液，清清摇匀，4 ℃过夜或者37 ℃温育1-2小时；小心移除孔内液体，用排枪每孔添加200 μL pH 7.4的 PBS洗涤缓冲液，静置2-3分钟，小心移除孔内液体，重复洗涤2-4次后拍干；每次检测同时设定空白对照、阴性对照和阳性对照，每个样本重复2-3次。

6）向5）酶标板添加抗体，每孔加入1：200-1: 500稀释的100 μL的anti-CD63（biotin-labeled）抗体（即浓度为2-5 μg/mL），清清摇匀，37 ℃温育1-2小时。小心移除孔内液体，用排枪每孔添加200 μL pH 7.4的 PBS洗涤缓冲液，静置2-3分钟，小心移除孔内液体，重复洗涤2-4次后拍干。

7）向6）酶标板加酶标反应物，每孔加入1：2000-1: 5000稀释的100 μL的HRP（streptavidin-labeled）（即浓度为0.2-0.5 μg/mL），清清摇匀，37 ℃温育1-2小时。小心移除孔内液体，用排枪每孔添加200 μL pH 7.4的 PBS洗涤缓冲液，静置2-3分钟，小心移除孔内液体，重复洗涤2-4次后拍干。

8）向7）酶标板加底物显色，每孔加入四甲基联苯胺TMB显色液100 μL，37 ℃避光显色10-30分钟。

9）向8）酶标板加终止反应液，每孔加入2 mol/L H2SO4终止反应液50 μL，在酶标仪内测OD450值，并记录结果。

10）将9）所得数据构建标准曲线（如图3），同时采用上述1）-9）步骤进行膀胱癌患者外泌体含量检测，并进行ROC曲线分析和构建箱线图。检测结果如图4。

Claims

1.一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，包括如下具体步骤：

（1）样本收集：收集健康志愿者/膀胱癌患者尿液样本室温离心后，上清液离心收集外泌体沉淀并用PBS （pH 7.0）重悬外泌体，形成外泌体重悬液，保存备用；

（2）包被孵育：按每孔100 μL将外泌体重悬液包被到酶标板孔，孵育一定时间后，移除上清液；

（3）封闭：按每孔100 μL加入封闭液，一定时间后移除孔内液体，按每孔200μL添加PBS洗涤缓冲液（pH 7.4），静置后移除孔内液体，重复洗涤数次后拍干；

每次检测同时设定空白对照、阴性对照和阳性对照，每个样本重复封闭2-3次；

（4）加样：对封闭后的样本进行依次进行添加抗体和添加酶标反应物，之后加底物显色；

（5）终止反应：按每孔50 μL加入终止反应液，在酶标仪内测OD₄₅₀值，并记录结果；

（6）判定结果：试验组OD₄₅₀/阴性对照组OD₄₅₀值大于或等于2.1为阳性；

（7）构建标准曲线，根据判定结果和标准曲线的对比进行检测。

2.如权利要求1所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述添加抗体的步骤具体包括：按每孔100 μL加入1：200-1:500的anti-CD63（biotin-labeled）抗体（即浓度为2-5 μg/mL）并温育后移除孔内液体，按每孔200 μL添加PBS洗涤缓冲液（pH 7.4的），静置后移除孔内液体，重复洗涤数次后拍干。

3.如权利要求1所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述添加酶标反应物的步骤具体包括：按每孔100 μL加入1：2000-1:5000的HRP（streptavidin-labeled）（即浓度为0.2-0.5 μg/mL），并温育后移除孔内液体，按每孔200 μL添加PBS洗涤缓冲液（pH 7.4的），静置后移除孔内液体，重复洗涤数次后拍干。

4.如权利要求1所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述加底物显色的步骤具体包括：按每孔100 μL加入显色液，一定温度下避光显色，10-30分钟后观察结果。

5.如权利要求1所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤（2）中包被于酶标板上的包被液为0.1M的NaHCO₃，使用前于4℃冰箱放置1-2小时。

6.如权利要求1所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，洗涤所用的洗涤液为磷酸盐缓冲液PBS（pH 7.4 ± 0.2），洗涤次数为2-4次。

7.如权利要求1、2或3所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，静置过程中的静置反应为生物素和链霉亲合素结合，其反应温度为35-37℃，反应时间为1-2小时。

8.如权利要求1所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述显色液为四甲基联苯胺（TMB），为HRP和TMB结合反应，显色反应时间一般为10-30分钟，反应温度一般为35-37℃；所述的终止反应液为2M浓硫酸。

9.如权利要求1所述的一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法，其特征在于，所述构建标准曲线的步骤具体包括：将分离自尿液中的外泌体连读系列倍比稀释成不同的浓度，根据浓度不同的外泌体构建外泌体ELISA检测标准曲线。

10.一种检测尿液外泌体的ELISA检测方法在膀胱癌疾病的评估和防治方面的应用。