CN108627653B - 用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒，其分别包括粒径、和/或平均粒径不同的至少两种磁性颗粒，利用本发明的组合物和试剂盒可以提示早期原发性肝癌，具有极高的灵敏度，方法快速简便而且自动化。

Description

用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物和试剂盒

技术领域

本发明涉及一种甲胎蛋白异质体及甲胎蛋白异质体比率的检测方法及应用，同时还涉及了一种甲胎蛋白异质体的分离检测试剂盒，属于医疗器械及体外诊断领域。

背景技术

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范围内第四位常见的恶性肿瘤，每年大约有250 000名患者死于肝细胞癌，肝细胞癌的发病机制至今仍未清楚，其在临床上恶性度较高，死亡率在消化道恶性肿瘤中排第三位，所以早期发现、早期治疗是提高患者生存率的关键，而大多数患者就诊时已届中晚期，失去了最佳治疗时机，危险因素包括由乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒导致的慢性肝炎和肝硬化。要得到有效治疗，筛查和普查的临床效率依赖于早期诊断。HCC是肿瘤病因学中的重要类型，肝硬化、病毒性肝炎、化学致癌物及环境因素等所造成的慢性肝脏损害都可诱发HCC。HCC恶性度高，容易复发及转移，预后差，而且早期诊断较困难，易于延误最佳治疗期。

甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)是一种糖蛋白，检测血液中的AFP含量是目前诊断肝癌最常见的手段。AFP在哺乳动物胚胎期由肝脏实质细胞和卵黄囊细胞合成，来源于内胚层的胃肠道粘膜细胞也可少量合成。正常情况下，AFP主要存在于胎儿循环中，随着胎儿发育成熟，AFP合成逐渐减少。出生时脐血中AFP浓度可达10-100mg/L，出生后一年降至正常成人水平。如果新生儿AFP明显升高提示新生儿肝炎、先天性胆道闭锁或有能分泌AFP 的胚胎性恶性肿瘤。AFP作为早期肝癌诊断指标的缺点是在肝病和肝硬化疾病中也有相当的比例存在阳性结果，AFP轻度增高(20-200ng/m1)见于相当数量的慢性肝病患者，在肝硬化患者中11.7-44％AFP阳性；同时，肝癌早期患者中有约40％的患者AFP检测值在400ng/ml以下，无法确诊为肝癌。因此在分辨良性肝病和恶性肝肿瘤时，AFP作为早期肝癌筛查指标的价值大为降低。

甲胎蛋白(AFP)异质体是甲胎蛋白糖链异常形成的糖蛋白，许多糖链的结构尚未完全明了。目前认为，通常所说的甲胎蛋白异质体实际是指与LCA 结合的AFP-L3，1999年第四届全国肝癌学术会议将其列为原发性肝癌临床诊断标准的肝癌标记物之一。2011年中国肝癌诊疗规范将AFP-L3列为肝癌诊断特异性指标；2017年列入中国肝癌诊断专家共识。多年来，AFP-L3被公认为是比单纯的AFP甲胎蛋白更为特异的原发性肝癌指标，有研究显示甲胎蛋白异质体比率(AFP-L3％)升高(15％以上)的患者，在接下来的21个月中，发生肝细胞癌的危险增加7倍之多。

甲胎蛋白异质体检测的临床意义：

(1)鉴别肝癌与良性肝病。原发性肝癌患者AFP常升高，但许多良性肝脏疾病也可有AFP升高，单凭AFP结果有时很难区分良、恶性病变。此时甲胎蛋白异质体检测就具有良好的临床意义，尤其对于AFP在30-400ng/ml 之间者具有较好的价值。Yozhiaki对361例肝硬化进行了前瞻性研究，在53 例AFP在30ug/L以上的患者中，2年以后21例发展为肝癌，确诊肝癌时 39％的患者AFP在400ug/L以下。对比研究开始时肝细胞肝癌(HCC)组与非 HCC组AFP测定值，未发现差异有显著性，研究发现病变时甲胎蛋白异质体的类型有所不同,对HCC诊断LCA阳性率87.12％假阳性率21.5％，ConA 阳性率89.17％，假阳性率17.15％。目前的研究结果把AFP-L3含量大于10％作为肝癌的阳性指标。

(2)肝癌术后的监测。肝癌切除术后，血清AFP含量随之下降，其下降速度取决于体内残留AFP量及半衰期，一般2月内转阴，转阴时甲胎蛋白异质体随之消失。如果AFP明显下降但不转阴，异质体变化不明显，则提示手术不彻底，可能还存在边缘残留、血管癌栓、卫星结节或转移等。如果异质体下降至25％以下，AFP和异质体浓度相对恒定，则可能是患者有肝炎或肝硬化所致。

(3)胚胎异常发育及胎儿先天性疾患。正常妊娠期母体血清中AFP与胚胎中AFP处于平衡状态，一旦胎儿畸形或胎盘屏障发生异常，可导致胎儿血清渗入羊水中或羊水渗入母体血清，造成母体羊水或血清AFP急剧升高。但仅仅测定AFP总量有一定的局限性。实验表明神经管缺损、无脑儿或脊柱裂等。儿童肝母细胞瘤、胆道闭锁、性腺肿瘤、恶性畸胎瘤等可有AFP和/或甲胎蛋白异质体的阳性。

目前用于甲胎蛋白异质体的检测方法有植物凝集素亲和层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、亲和印迹法、亲和交叉免疫电泳法，化学发光法等，这些方法均可以直接分离出AFP-L3蛋白并且进行定量估算，但上述方法灵敏度较低，最高能达到31ng/ml，无法满足实际检测需求。

目前国内AFP-L3检测方法主要采用离心管分离方法，该方法采用琼脂糖偶联LCA，采用离心方法分离AFP-L3，然后再用其他AFP检测试剂进行检测，北京热景生物技术股份有限公司的离心管法是目前国内最早获得药监局批准适用于AFP-L3％检测的方法，也是国内最早授权的AFP-L3发明专利技术(参见，CN100588942C)，该方法手工操作程序多，步骤繁琐，需要配套设备多，耗时长，且不能实现自动化，无法实现高通量的样本检测，且该方法分离AFP-L3后需要配套相应的AFP检测试剂才能获得完整的检测结果。

另外，北京热景生物技术股份有限公司在CN201510002936.2的专利申请中公开了一种甲胎蛋白异质体的分离检测组合物、试剂盒、系统、方法及应用，实现了甲胎蛋白异质体的自动化检测，未对相应磁珠使用及其性能作进一步优化。

同昕生物技术(北京)有限公司在CN 102879567 B中公开了用于肝癌诊断的甲胎蛋白异质体分离试剂盒及其组成试剂，该试剂盒仅可用于甲胎蛋白的分离，且分离效率和精度偏低，且未对免疫磁珠做进一步研究，甲胎蛋白异质体的检测需要和其他甲胎蛋白检测试剂一起使用才能完成检测，限制了该试剂盒的进一步应用。

上海良润生物医药科技有限公司在CN 105785043 A3中公开了用于定量检测AFP-L3％的试剂盒，其中甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体检测使用相同的磁珠，且大小均为0.1-10μm，该试剂的最低检测限：AFP最低检测限不大于1.5ng/mL。AFP-L3最低检测限不大于0.8ng/mL；.线性：AFP试剂盒 2ng/mL-500ng/mL区间内，其线性相关系数(r)应不低于0.990，AFP-L3试剂盒1ng/mL-250ng/mL区间内，其线性相关系数(r)应不低于0.990。但是，由于磁颗粒本身的大小、均一性、表面疏水性、张力以及表面包被蛋白等特性，在实际应用过程中会产生聚集沉降和不易分离等特性，对AFP-L3的分离和检测影响很大，导致AFP-L3灵敏度和线性范围较小。

深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司在专利公布文献CN 106198998 A 中公开了人甲胎蛋白异质体3化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，该专利公开了使用人甲胎蛋白异质体3单克隆抗体包被的羧基化的磁微粒的检测方法，由于甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体3之间仅糖基化基团不一致，且二者的单克隆抗体同源性高度一致，在实际检测和应用中很难区分甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体，易出现假阳性，使检测结果不准确。

因此，针对上述问题和技术不足，发明一种高特异性、高灵敏度的甲胎蛋白异质体比率的检测的检测方法和组合物，对肝癌早诊早治是必须的，且有着重要的应用价值和社会效益。

发明内容

为了克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种甲胎蛋白异质比率的检测的检测方法和组合物，首先通过特异性的分离磁珠对样本中AFP-L3的精准分离，然后通过包被甲胎蛋白抗体的检测磁珠对血液样本中AFP-L3进行检测，得到AFP-L3的准确含量，通过采用同样方法检测的血液样本中AFP 含量计算得到甲胎蛋白异质体的比率。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供用于甲胎蛋白异质体分离检测的组合物，其包括至少两种磁珠，所述磁珠中的至少一种磁珠用于分离甲胎蛋白异质体，为甲胎蛋白异质体分离磁珠；至少一种磁珠用于检测甲胎蛋白异质体，为甲胎蛋白异质体检测磁珠。

在某些实施方式中，所述甲胎蛋白异质体分离磁珠和糖甲胎蛋白异质体检测磁珠的粒径、和/或平均粒径不同，优选甲胎蛋白异质体分离磁珠粒径、和/或平均粒径与甲胎蛋白异质体检测磁珠粒径、和/或平均粒径比值大于1。优选地，第一磁珠的粒径、和/或平均粒径与第二磁珠的粒径、和/或平均粒径比为2:1-200:1，优选10:1-100:1，更优选10:1-50:1。第一磁珠的粒径、和 /或平均粒径一般为1μm-1000μm，优选10μm-500μm，更优选20μm-300μm。上述粒径、和/或平均粒径范围非常有利于糖链异常蛋白的分离。如果直径过小或过大，均不利于分离，原因可能在于粒径、和/或平均粒径过小磁性颗粒容易聚集，从而影响分离效果，另一方面，当直径过大时磁珠上活性基团的数量变少，同样不利于分离。

优选地，第二磁珠的粒径、和/或平均粒径一般为0.01μm-100μm，优选 0.1μm-50μm，更优选0.1μm-20μm；粒径、和/或平均粒径过大或过小均不利于检测，且第一磁珠和第二磁珠的粒径、和/或平均粒径不同，且磁珠处理方式不同，如：第一磁珠经高分子材料包埋处理、第二磁珠经表面活性集团处理，对样本中AFP-L3的分离、和检测的不同处理具有不同意义，能大幅提高检测的灵敏度和线性范围。

在某些实施方式中，所述甲胎蛋白异质体分离磁珠经包埋材料处理，形成复合包埋磁珠。所述包埋材料选自由硅化物、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、树脂、环氧树脂、牛血清白蛋白、生物素和纤维素组成的组中的任意一种。优选上述物质中的两种以上的组合。例如，硅化物和聚苯乙烯等。本发明中硅化物包括二氧化硅和TEOS等。

在某些实施方式中，所述复合包埋磁珠与凝集素偶联形成磁珠-凝集素偶联复合物，用于样本中甲胎蛋白异质体的准确、高效分离。

在某些实施方式中，所述凝集素包括小扁豆凝集素和/或刀豆凝集素。

在某些实施方式中，所述甲胎蛋白异质体分离方法还包括分离洗脱液、分离清洗液，用于提高甲胎蛋白异质体的分离方法的稳定性，提高分离效率和灵敏度，降低分离过程中的非特异性吸附。

在某些实施方式中，所述甲胎蛋白异质体检测磁珠表面经羧基、羟基、氨基任意一种生物活性基团处理，对应形成羧基磁珠、羟基磁珠或氨基磁珠。

在某些实施方式中，所述羧基磁珠、羟基磁珠或氨基磁珠与抗甲胎蛋白抗体结合，形成磁珠-抗体复合物，用于检测经分离磁珠分离的甲胎蛋白异质体。

在某些实施方式中，所述甲胎蛋白异质体分离、检测组合物还包括清洗液，酶标记抗体，底物液；所述清洗液用于甲胎蛋白异质体检测过程中的清洗，提高结合效率、降低非特异性吸附、提高检测的灵敏度；所述酶标记抗体包括酶标记的抗甲胎蛋白抗体，抗体缓冲液，用于在检测过程中与分离磁珠分离的甲胎蛋白异质体、检测磁珠-抗体复合物形成夹心复合物，然后与底物液进行显色或发光反应，准确测定甲胎蛋白异质体含量。

在某些实施方式中，所述甲胎蛋白分离检测组合物还包括甲胎蛋白检测磁珠，抗甲胎蛋白抗体，清洗液，酶标记抗体，底物液；所述甲胎蛋白检测磁珠与甲胎蛋白异质体检测磁珠相同；所述抗甲胎蛋白抗体和酶标记抗体与甲胎蛋白异质体检测方法包括的抗甲胎蛋白抗体和酶标记抗体相同。

在某些实施方式中，所述甲胎蛋白检测方法与甲胎蛋白异质体检测方法相同，使甲胎蛋白异质体检测和甲胎蛋白检测处于相同水平，确保甲胎蛋白异质体比率的准确性。

本发明的第二方面，提供一种甲胎蛋白异质体分离检测试剂盒，所述试剂盒包括甲胎蛋白异质体分离试剂、甲胎蛋白异质体检测试剂、甲胎蛋白检测试剂盒和定标液；所述检测试剂盒只需要加入样本等简单操作，在检测结束后，同时获取样本中甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、甲胎蛋白异质体比率三种检测结果。

在某些实施方式中，所述试剂盒包括第一试剂条和第二试剂条，且所述第一试剂条和第二试剂条设计为单人份检测形式；所述第一试剂条设计为包含甲胎蛋白异质体分离试剂、甲胎蛋白异质体检测试剂，所述第二试剂条设计为包含所述甲胎蛋白检测试剂。

在某些实施方式中，所述检测试剂盒的甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体的空白检测限位0.1ng/ml以下；甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体的线性范围在 [0.6,1200]ng/mL范围内，相关系数(r)为0.99以上，优选0.995以上，更优选 0.999以上；甲胎蛋白异质体比率的的线性范围在[5％,100％]范围内，相关系数(r)0.99以上，优选0.995以上，更优选0.999以上。

有益效果：

与现有技术相比，本发明对甲胎蛋白异质体的分离与检测方法采用不同大小的磁珠，利用磁珠大小不同形成的磁珠的比表面积、磁吸附效果不同，提高甲胎蛋白异质体的分离效率和精准度；同时使用相同的方法检测分离后的甲胎蛋白异质体和相同来源样本中的甲胎蛋白，确保了甲胎蛋白异质体比率计算的准确性；同时本发明试剂盒在检测结束后，同时获取样本中甲胎蛋白、甲胎蛋白异质体、甲胎蛋白异质体比率三种检测结果，且试剂空白检测限和线性范围明显高于现有技术。总之，本发明方法简便，检测快捷，结果准确，灵敏度高，且自动化，为肝癌早诊的预防、诊断、治疗提供有效支持。

附图说明

图1为甲胎蛋白异质体比率的线性范围在5％-100％的线性图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明提供了一种甲胎蛋白异质体分离、检测的方法、组合物及应用，首先通过特异性的分离磁珠对样本中甲胎蛋白异质体的精准分离，然后通过包被甲胎蛋白抗体的检测磁珠对血液样本中甲胎蛋白异质体进行检测，得到甲胎蛋白异质体的准确含量，通过采用同样方法检测的样本中甲胎蛋白含量，计算得到甲胎蛋白异质体的比率。其中所述甲胎蛋白异质体分离、检测的方法、组合物包含两种及两种以上的磁珠，所述磁珠中至少有一种磁珠用于分离甲胎蛋白异质体，为甲胎蛋白异质体分离磁珠；至少有另外一种磁珠用于检测甲胎蛋白异质体，为甲胎蛋白异质体检测磁珠；所述甲胎蛋白异质体分离磁珠和甲胎蛋白异质体检测磁珠的粒径、和/或平均粒径不同，优选甲胎蛋白异质体分离磁珠粒径、和/或平均粒径与甲胎蛋白异质体检测磁珠粒径、和 /或平均粒径比值大于1的磁珠。

以下通过具体实施方式，并结合附图对本发明作进一步说明。

实施例1

本实施例为甲胎蛋白异质体分离组合物的示例性制备方法，为说明本发明，本实施例采用硅化物包埋的甲胎蛋白异质体分离磁珠和小扁豆凝集素 (LCA)进行说明。

1、磁珠-凝集素偶联复合物制备(粒径20-300μm)

硅化物包埋的分离磁珠和小扁豆凝集素(LCA)均为商品化的原料，可以通过sigma等知名原辅材料供应公司购买，或通过文献公开的方法制备。

硅化物包埋的分离磁珠和小扁豆凝集素(LCA)通过以下步骤形成磁珠- 凝集素偶联复合物：

(1)将硅化物包埋的分离磁珠用磁性分离架分离，然后用纯化水或1mM 的HCl溶液洗涤，去除残留溶液；

(2)取适量LCA，溶于LCA偶联缓冲液中，LCA与偶联缓冲液比例为1:2-1:5，偶联缓冲液为0.1mmol/L NaHCO3，0.5mol/L NaCl，pH 7-9。

(3)取硅化物包埋的分离磁珠(g)与LCA(mg)比例为:1:1-1：5的硅化物包埋的分离磁珠，加入(2)中的溶液中，室温颠倒混匀2h以上。

(4)用适量偶联缓冲液洗去未偶联的LCA。经测定洗涤液中的LCA含量，计算硅化物包埋的分离磁珠与LCA偶联率不低于98％。

(5)在(4)中加入0.2mol/L甘氨酸缓冲液或BSA缓冲液，室温室温颠倒混匀2h以上。

(6)依次用适量的0.1mol/L醋酸缓冲液(pH 4，含0.5mol/L NaCl)和0.1 mol/LTris缓冲液(pH 8，含0.5mol/L NaCl)洗涤3次，再以适量的含0.1％ BSA和0.1mmol/LCaCl2的PBS(PBS-BSA)和纯化水各洗涤1次，4℃暂存备用。

2、分离洗脱液制备

分离洗脱液为TRIS缓冲液，0.1-1M的蔗糖、葡聚糖或D-甘露糖苷；或 0.02M PBS(pH7.0)，5M D-甘露糖苷。

3、分离清洗液制备

分离清洗液为TRIS缓冲液，pH值6.0-9.0，

实施例2

本实施例为甲胎蛋白异质体检测组合物的示例性制备方法，本实施例采用羧基磁珠进行说明。

1、磁珠-抗体复合物制备(粒径0.1-20μm)

所述磁珠-抗体复合物由羧基磁珠与抗AFP抗体1结合，形成磁珠-抗体复合物，用于检测经分离磁珠分离的AFP-L3。制备过程如下：

将羧基磁珠混匀后加磁场去掉上清，用包被缓冲液清洗磁珠一次，然后加入活化剂EDC至10-50mg/ml，常温震荡反应0.5-2h，然后去上清，加入包被缓冲液及适量抗AFP抗体1，常温震荡1-5h，反应结束后加入封闭液并震荡，最后加清洗液，清洗完成后加入保存液过夜保存即可。

包被缓冲液：为0.1mol/L的pH5.0-8.0的MES缓冲液；

抗AFP抗体1使用浓度为10-100μg/mg羧基磁珠；

封闭液为：50mM Tris、1-5％BSA、1‰Proclin300、pH 7-9；

包被保存液为：磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.80％、BSA 1-5％、Proclin300 1‰、pH 7-9。

2、酶标记抗体制备

AFP酶标记抗体包括酶标记的抗AFP抗体2，抗体缓冲液，用于在检测过程中经分离磁珠分离的AFP-L3、检测磁珠-抗体复合物形成夹心复合物，然后与底物液进行显色或发光反应，准确测定AFP-L3含量。以碱性磷酸酶 (ALP)标记为例进行说明，制备如下：

碱性磷酸酶(ALP)标记工艺为：取抗AFP抗体2质量比为5:1-1:1的ALP，加入与ALP溶液等体积、等浓度的NaIO₄(10-20mg/ml，现配)，4℃避光反应 0.5-1.5h，然后加入与ALP溶液等体积的乙二醇溶液，室温静置避光反应0.5- 1.5h。加入抗AFP抗体2，再加入混合液1/20体积的CBS标记抗体缓冲液 (0.05mol/L，pH9.6)置4℃避光透析过夜，最后加入硫酸铵溶液，反应1-5小时，离心，弃去上清，沉淀用0.01mol/L的PBS溶解后置4℃避光透析过夜，透析完后加等体积甘油混匀，-20℃保存。用含有1-10％BSA或牛血清的稀释缓冲液配置成使用浓度即可。

3、底物液

底物液用于在检测过程中与分离磁珠分离的AFP-L3、检测磁珠-抗体复合物形成夹心复合物进行显色或发光反应，准确测定甲胎蛋白异质体含量。

底物液主要来源于直接购买的商品化底物液。

实施例3

本实施例为AFP检测组合物的示例性制备方法，本实施例采用羧基磁珠进行说明。为保证AFP、AFP-L3检测过程中的背景相同，并保证AFP-L3 比率的准确性，甲胎蛋白检测组合物的示例性制备方法与实施例2中的甲胎蛋白异质体的检测组合物的示例性制备方法相同，制备过程中应用的原辅材料相同，详细说明如下：

1、磁珠-抗体复合物制备(粒径0.1-20μm)

所述磁珠-抗体复合物由羧基磁珠与抗AFP抗体1结合，形成磁珠-抗体复合物，用于检测样本中的AFP含量。

制备过程如下：

将羧基磁珠混匀后加磁场去掉上清，用包被缓冲液清洗磁珠一次，然后加入活化剂EDC至10-50mg/ml，常温震荡反应0.5-2h，然后去上清，加入包被缓冲液及适量抗AFP抗体1，常温震荡1-5h，反应结束后加入封闭液并震荡，最后加清洗液，清洗完成后加入保存液过夜保存即可。

包被缓冲液：为0.1mol/L的pH5.0-8.0的MES缓冲液；

抗AFP抗体1使用浓度为10-100μg/mg羧基磁珠；

封闭液为：50mM Tris、1-5％BSA、1‰Proclin300、pH 7-9；

包被保存液为：磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.2g、氯化钠0.80％、BSA 1-5％、Proclin300 1‰、pH 7-9。

2、酶标记抗体制备

AFP酶标记抗体包括酶标记的抗AFP抗体2，抗体缓冲液，用于在检测过程中经分离磁珠分离的AFP-L3、检测磁珠-抗体复合物形成夹心复合物，然后与底物液进行显色或发光反应，准确测定AFP-L3含量。以碱性磷酸酶 (ALP)标记为例进行说明，制备如下：

碱性磷酸酶(ALP)标记工艺为：取抗AFP抗体2质量比为5:1-1:1的ALP，加入与ALP溶液等体积、等浓度的NaIO₄(10-20mg/ml，现配)，4℃避光反应 0.5-1.5h，然后加入与ALP溶液等体积的乙二醇溶液，室温静置避光反应0.5- 1.5h。加入抗AFP抗体2，再加入混合液1/20体积的CBS标记抗体缓冲液 (0.05mol/L，pH9.6)置4℃避光透析过夜，最后加入硫酸铵溶液，反应1-5小时，离心，弃去上清，沉淀用0.01mol/L的PBS溶解后置4℃避光透析过夜，透析完后加等体积甘油混匀，-20℃保存。用含有1-10％BSA或牛血清的稀释缓冲液配置成使用浓度即可。

3、底物液

底物液用于在检测过程中与样本中的AFP、检测磁珠-抗体复合物形成夹心复合物进行显色或发光反应，准确测定甲胎蛋白含量。

底物液主要来源于直接购买的商品化底物液。

实施例4

本实施例为试剂盒例，其包括试剂盒1和试剂盒2。其中试剂盒 1包括实施例1和实施例2的组合物。试剂盒2包括实施例1、实施例2和实施例3的组合物，用于甲胎蛋白异质体的定量检测、糖链蛋白的定量检测和甲胎蛋白异质体比率的检测。

此外，试剂盒1和试剂盒2还分别包括定标液或者定标液和质控品的组合物。

定标液制备：

定标液缓冲液配制：含10-50％牛血清溶液。

将商品化的甲胎蛋白异质体相对应的糖链蛋白纯品加入到定标缓冲液中，稀释到适宜浓度即可，如50ng/mL、500ng/mL。

由于冻干品相对液体定标液稳定，上述定标液可按照相关程序制备成冻干品保存。

实施例5

本实施例提供本发明的试剂盒的使用方法，即本发明的检测方法，以试剂盒2为例说明其使用步骤：

1、AFP-L3分离步骤：

按照标准分离程序：100μl分离磁珠，50μl样本，37℃孵育20min，200μl 清洗液清洗1次，200μl洗脱液洗脱1次，使用磁分离架进行分离。

2、AFP-L3和AFP检测步骤：

在对应试管底部加50μl定标液/样本/分离后的AFP-L3，50μl包被抗体， 50μl标记抗体，用塑料薄膜覆盖试管，混匀器轻轻震荡管架后，置37℃恒温培养箱中孵育10min；将试管放置在磁力分离架上，吸附磁珠，进行固液分离；然后加入380μl清洗液至每个试管中，置混匀器上轻轻震荡混匀，清洗3 遍；加入底物液150μl至试管中混匀，迅速用准备好的发光检测仪进行检测。

3、试剂盒自动化检测步骤：

上述1、2检测步骤可用手工实现，也可以匹配北京热景生物技术股份有限公司的MQ60系列、C2000系列全自动化学发光免疫分析仪使用，进行自动化检测。自动化检测仅需将定标液/样本加入样本孔中，自动反应后，即可获得AFP、AFP-L3、AFP-L3比率(AFP-L3％)三种检测结果。

实施例6

本实施例提供本发明的试剂盒的使用方法和性能评估方法，即本发明的检测方法和利用本发明的试剂盒进行性能评估的方法，并采用北京热景生物技术股份有限公司的MQ60系列全自动化学发光免疫分析仪进行全自动检测、分析和进一步说明。本实施例的试剂盒为试剂盒2。经性能分析，AFP-L3分离、检测试剂盒的灵敏度明显提高和线性范围扩大对肿瘤的早诊早治的进一步研究，提高早诊率有着重要临床意义和社会意义。

1、最低检测限

以三批不同批次的检测试剂盒同时检测20次校准品稀释液样本或者零背景值的样本，计算平均值(Mean)和标准差(SD)，由拟合方程Mean+2×SD计算出RLU值，并计算其浓度值。

表1最低检测限实验结果

由上述三批试剂检测结果分析，空白检测限的最低检测结果平均为 0.0785ng/ml，小于0.1ng/ml,最低检测限检测结果符合实验预期，因此将检测试剂盒的最低空白检出限定义不大于0.1ng/ml。

2、线性范围

(1)甲胎蛋白异质体浓度线性范围测定

选择浓度为(1500±150)ng/mL的分离后的AFP-L3样本和AFP样本，稀释成为0.3ng/mL到1300ng/mL范围内的至少7个稀释浓度，按照本发明试剂盒的说明书要求，在MQ60系列全自动化学发光免疫分析仪上检测，将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，并计算线性相关系数r≥0.9900。

表2线性测定范围实验结果

由表中计算出剂量-反应曲线的线性来看，在0.3-1200ng/mL和0.6- 1200ng/mL范围内相关系数为0.9999；在0.3-1300ng/mL和0.6-1300ng/mL范围内相关系数小于0.9900；考虑到0.3ng/mL的检测结果CV值大于15％，因此将本试剂盒AFP线性范围规定在0.6-1200ng/mL。

(2)甲胎蛋白异质体比率的线性范围测定

选择AFP-L3％检测为5％的阴性样本以及AFP-L3％为100％的纯品，分别配置成比值为：2.5％、5％、10％、20％、40％、80％、100％纯品等多种浓度，按照说明书要求，在MQ60上检测，将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值，并计算实际检测AFP-L3％与理论AFP-L3％线性相关系数r≥0.9900。

表3 AFP-L3％测定范围实验结果

由表3中计算出实际检测AFP-L3％－理论AFP-L3％线性来看，在5％-50％和5％-100％范围内相关系数大于0.9900；将本试剂盒AFP-L3％线性范围规定在5％-100％(参见图1)。

3、精密度

(1)批内精密度

用同一批试剂盒测定AFP-L3％为15％和30％的精密度样本，平行测定10 次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批内精密度(CV)＝SD/ Mean×100％，应不高于10.0％。

表4批内精密实验结果

从上表数据可知，用同一批试剂盒测定同一份精密度样本，批内精密度都小于10％，表明试剂盒的均一性良好，结果具有重复性。

(2)批间精密度

用三批试剂盒分别AFP-L3％在(15±1.5％)和(30％±3％)水平的AFP-L3％样本，平行测定10次，计算测定结果的平均浓度(Mean)与标准差(SD)，批间精密度(CV)＝SD/Mean×100％，CV应不大于15.0％。

表5批间精密度实验结果

从上表数据可知，用三批试剂盒测定同一份精密度样本，批间精密度小于10.0％，表明不同批次的试剂盒之间变异很小，测量结果具有重复性。

4、分析特异性

分析特异性是为了检测血液中其它物质对试剂盒测量的干扰。在人血液中容易对AFP的测量造成干扰的物质有人血清白蛋白(HSA)、CEA；用高浓度的HAS(2×106ng/mL)、CEA等物质加入AFP-L3％低浓度(5％左右)样本中进行实验，结果表明，试剂盒与这些物质的交叉反应很低，不会对AFP-L3％的测量造成干扰。干扰物质检测结果如下：

表6干扰物质的交叉反应数据

综上所述，高浓度的HAS、CEA等物质对本试剂盒无干扰。

实施例7

采用本实施例1-4中记载的方法和试剂盒对收集的待测血液样本进行检测，所有收集的待测样本临床诊断背景清晰，检测结果如下表所示：

表7临床样本检测符合情况对比

实验结果表明，本发明对于原发性肝癌的检测阳性率达到93％，对于健康人的特异性达到100％，对于肝癌高危人群中的肝硬化以及肝炎的特异性分别达4.7％和97.2％，对于其他癌症的特异性达到了0％。

比较例

依据上海良润生物医药科技有限公司的专利CN 105785043 A3公开记载，该专利公开了用于定量检测AFP-L3％的试剂盒，其中甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体检测使用相同的磁珠，大小均为0.1-10μm，该试剂的最低检测限： AFP最低检测限不大于1.5ng/mL。AFP-L3最低检测限不大于0.8ng/mL；.线性：AFP试剂盒2ng/mL-500ng/mL区间内，其线性相关系数(r)应不低于0.990， AFP-L3试剂盒1ng/mL-250ng/mL区间内，其线性相关系数(r)应不低于0.990，未记载AFP-L3比率的检出情况和线性情况。

依据本发明专利实施例1-7的记载，使用不同的甲胎蛋白异质体分离磁珠和甲胎蛋白异质体检测磁珠，且分离磁珠粒径/检测磁珠大于1，本发明最低检出限，即空白检测限的最低检测结果平均为0.0785ng/ml，不大于0.1ng/ml；在0.3-1200ng/mL和0.6-1200ng/mL范围内相关系数为0.9999；考虑到0.3ng/mL 的检测结果CV值大于15％，因此将本试剂盒AFP线性范围规定在0.6- 1200ng/mL，其线性相关系数不低于0.990；AFP-L3比率的5％-100％范围内线性相关系数为0.9988，不低于0.9900。

由此可见，本发明实现的AFP-L3、AFP-L3％的灵敏度及线性范围远高于对比专利记载的专利数据，达成的发明效果也明显优于对比专利。

上述说明示出并描述了本发明的示例性的实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (11)

1.一种用于甲胎蛋白异质体的分离、检测从而提高检测灵敏度和线性范围的组合物，其特征在于，包含两种以上的磁珠，其中至少一种磁珠为甲胎蛋白异质体分离磁珠，其用于分离甲胎蛋白异质体；至少一种磁珠为甲胎蛋白异质体检测磁珠，其用于检测甲胎蛋白异质体，且所述甲胎蛋白异质体检测磁珠的表面经选自由羧基、羟基和氨基组成的组中的至少一种生物活性基团处理，从而形成羧基磁珠、羟基磁珠或氨基磁珠，所述羧基磁珠、羟基磁珠或氨基磁珠能够与甲胎蛋白抗体结合，形成磁珠-抗体复合物；

其中所述甲胎蛋白异质体分离磁珠和所述甲胎蛋白异质体检测磁珠位于不同的溶液中，且所述甲胎蛋白异质体分离磁珠的粒径和/或平均粒径与所述甲胎蛋白异质体检测磁珠的粒径和/或平均粒径的比值为2:1-200:1，且所述甲胎蛋白异质体检测磁珠的粒径和/或平均粒径为0.01μm-100μm。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述甲胎蛋白异质体分离磁珠的粒径和/或平均粒径与所述甲胎蛋白异质体检测磁珠的粒径和/或平均粒径的比值为10:1-100:1。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述甲胎蛋白异质体分离磁珠的粒径和/或平均粒径与所述甲胎蛋白异质体检测磁珠的粒径和/或平均粒径的比值为10:1-50:1。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述甲胎蛋白异质体分离磁珠的粒径和/或平均粒径为1μm-1000μm。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述甲胎蛋白异质体分离磁珠经高分子材料包埋处理形成复合包埋磁珠，且所述高分子材料选自由硅化物、聚苯乙烯、葡聚糖、琼脂糖、牛血清白蛋白和纤维素组成的组的中的至少一种。

6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述复合包埋磁珠与凝集素偶联形成磁珠-凝集素偶联复合物，用于样本中甲胎蛋白异质体的分离；其中所述凝集素包括小扁豆凝集素和/或刀豆凝集素。

7.根据权利要求1所述的组合物，其还包括选自分离洗脱液、分离清洗液、检测清洗液、酶标记抗体和底物液组成的组中的至少一种。

8.根据权利要求1-7任一项所述的组合物在制备用于提高甲胎蛋白异质体的分离效率和精准度的试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒设计为包括甲胎蛋白异质体分离组合物、甲胎蛋白异质体检测组合物的形式，其中甲胎蛋白异质体分离组合物包含甲胎蛋白异质体分离磁珠，甲胎蛋白异质体检测组合物包含甲胎蛋白异质体检测磁珠；所述试剂盒用于通过甲胎蛋白异质体的分离和检测两个步骤获得样本中的甲胎蛋白异质体的定量检测结果。

9.根据权利要求1-7任一项所述的组合物在制备用于提高甲胎蛋白异质体的分离效率和精准度的试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒设计为包括甲胎蛋白异质体分离组合物、甲胎蛋白异质体检测组合物和甲胎蛋白检测组合物的形式，其中甲胎蛋白异质体分离组合物包含甲胎蛋白异质体分离磁珠，甲胎蛋白异质体检测组合物包含甲胎蛋白异质体检测磁珠，甲胎蛋白检测组合物包含与甲胎蛋白异质体检测磁珠相同的检测磁珠；所述试剂盒用于同时获得样本中的甲胎蛋白异质体的定量检测结果、甲胎蛋白的定量检测结果、甲胎蛋白异质体比率共计三种检测结果；所述甲胎蛋白异质体比率＝甲胎蛋白异质体的定量检测结果/甲胎蛋白的定量检测结果。

10.根据权利要求8或9所述的用途，所述试剂盒包括第一试剂条和第二试剂条，且所述第一试剂条和第二试剂条设计为单人份检测形式；所述第一试剂条设计为包含甲胎蛋白异质体分离试剂、甲胎蛋白异质体检测试剂，所述第二试剂条设计为包含所述甲胎蛋白检测试剂。

11.根据权利要求8所述用途，其中所述试剂盒的甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体的空白检测限为0.1ng/ml以下；在0.6-1200ng/mL范围内，甲胎蛋白和甲胎蛋白异质体的线性相关系数为0.99以上；在5％-100％范围内，甲胎蛋白异质体比率的线性相关系数为0.99以上。

Images