JP3385572B2 - ヒト羊水からのｃａ１９５状物質およびその分離方法 - Google Patents
ヒト羊水からのｃａ１９５状物質およびその分離方法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はヒト羊水からのＣＡ195
状物質の分離およびその使用に関する。ＣＡ195 状（Ｃ
Ａ195 −like）免疫反応性抗原がヒト羊水中に確認され
た。この物質は、ＣＡ195 と類似の作用をし、これと極
めて類似した組成を有する。
状物質の分離およびその使用に関する。ＣＡ195 状（Ｃ
Ａ195 −like）免疫反応性抗原がヒト羊水中に確認され
た。この物質は、ＣＡ195 と類似の作用をし、これと極
めて類似した組成を有する。
【０００２】
【従来の技術】ＣＡ195 はモノクローナル抗体、ＣＣ３
Ｃ195 （Bray等、1987年）によって識別される腫瘍関連
抗原である。正常の被検者は、現行のラジオイムノメト
リック方（Gupta 等、1987年；Sundaram等、1987年；Bh
argavva 等、1987年）では極めて低いか検出できない血
清ＣＡ195 レベルを示す。しかしながら、膵臓、胃、肝
臓、結腸、および他の胃腸悪性腫瘍の患者では高レベル
のＣＡ195 がしばしば見られる。Sundaram等（1987年）
は、結腸・がんの検出に、伝統的な腫瘍マーカーＣＥＡ
よりＣＡ195 の方が優れていることを見い出した。血清
レベルは、主に病気の予後および経過をみるのに用いら
れる。このマーカーは診断段階で有用性があまりない
が、いまだに付加的手段として使用されている。Hybrit
ech 社は、ヒト結腸腫瘍から膜を用いて腫瘍関連抗原を
検出するためのラジオイムノアッセイを開発した。この
ラジオイムノアッセイはHybritech 社から市販されてい
る。このアッセイのためのキャリブレータおよび対照物
質（Controls）が、種々の悪性腫瘍組織またはヒト結腸
・がん細胞株から得られる（Fukuta等、1987年）。しか
しながら、ヒトがん組織は得るのがむずかしく、高価で
あり、種々の安全性における問題を有する。ヒト細胞株
からＣＡ195 を得るには組織培養設備を必要とし、安全
性の問題を伴い、高価であり、そして比較的少量しか得
られない。
Ｃ195 （Bray等、1987年）によって識別される腫瘍関連
抗原である。正常の被検者は、現行のラジオイムノメト
リック方（Gupta 等、1987年；Sundaram等、1987年；Bh
argavva 等、1987年）では極めて低いか検出できない血
清ＣＡ195 レベルを示す。しかしながら、膵臓、胃、肝
臓、結腸、および他の胃腸悪性腫瘍の患者では高レベル
のＣＡ195 がしばしば見られる。Sundaram等（1987年）
は、結腸・がんの検出に、伝統的な腫瘍マーカーＣＥＡ
よりＣＡ195 の方が優れていることを見い出した。血清
レベルは、主に病気の予後および経過をみるのに用いら
れる。このマーカーは診断段階で有用性があまりない
が、いまだに付加的手段として使用されている。Hybrit
ech 社は、ヒト結腸腫瘍から膜を用いて腫瘍関連抗原を
検出するためのラジオイムノアッセイを開発した。この
ラジオイムノアッセイはHybritech 社から市販されてい
る。このアッセイのためのキャリブレータおよび対照物
質（Controls）が、種々の悪性腫瘍組織またはヒト結腸
・がん細胞株から得られる（Fukuta等、1987年）。しか
しながら、ヒトがん組織は得るのがむずかしく、高価で
あり、種々の安全性における問題を有する。ヒト細胞株
からＣＡ195 を得るには組織培養設備を必要とし、安全
性の問題を伴い、高価であり、そして比較的少量しか得
られない。
【０００３】
【発明の構成】本発明は、ヒト羊水中のＣＡ195 状物質
の識別に関する。この物質は、正常ヒト血清中よりも羊
水中にずっと多量に存在し、他の人由来物質を取扱う困
難を伴わずに分離できる。羊水中のＣＡ195 状物質の識
別は、以前の物質および方法より産生がずっと安価であ
り、以前の物質と同じ位有用な物質の分離を可能にす
る。
の識別に関する。この物質は、正常ヒト血清中よりも羊
水中にずっと多量に存在し、他の人由来物質を取扱う困
難を伴わずに分離できる。羊水中のＣＡ195 状物質の識
別は、以前の物質および方法より産生がずっと安価であ
り、以前の物質と同じ位有用な物質の分離を可能にす
る。
【０００４】本発明は、このような物質の識別のみなら
ず、ＣＡ195 状物質の使用および分離の技術をもカバー
するものである。
ず、ＣＡ195 状物質の使用および分離の技術をもカバー
するものである。
【０００５】本発明は、ＣＡ195 と免疫的に同じような
作用をし、ＣＡ195 と同じ組成であると考えられる物
質、ＣＡ195 状抗原の新規なソースに関する。
作用をし、ＣＡ195 と同じ組成であると考えられる物
質、ＣＡ195 状抗原の新規なソースに関する。
【０００６】本発明は、また、ＣＡ195 状物質の分離お
よび使用に関する。
よび使用に関する。
【０００７】本発明においては、ヒト羊水をヒト被検者
から採集し、これを分析してＣＡ195 状物質が存在する
かどうかを調べる。羊水を分析するために、固相ツーサ
イトイムノラジオメトリックアッセイ（solid phase,tw
o-site immunoradio metricassay ）を使用する市販の
ラジオイムノアッセイ技術（Hybritech 社製ＣＡ−195
−ＲＩＡ）を用いる。このアッセイにおいて、試料を、
ＣＡ195 抗原に対する抗体でコートしたプラスチックビ
ーズと反応させ、同時に同じ特異性を有する放射性標識
化抗体と反応させる。ヒト血清中よりずっと多量のＣＡ
195 状物質が、ヒト羊水中に存在することがわかった。
ヒト羊水中の前記物質のレベルは約800〜1000Ｕ／mlで
あり、一方正常なヒト血清中の前記物質のレベルは10Ｕ
／ml未満であることがわかった。ヒト血清中のＣＡ195
状物質の濃度が10Ｕ／mlを超えるとがん状態に関係する
と思われる（Bhargava等、J.Tumor Marker Oncology ，
２巻（1987年）319 ページ）。このイムノアッセイが羊
水中の物質を検出するという事実は、免疫学的特性にお
いてＣＡ195 状物質が真正ＣＡ195 抗原と、同一ではな
いとしても類似するものであることを示している。
から採集し、これを分析してＣＡ195 状物質が存在する
かどうかを調べる。羊水を分析するために、固相ツーサ
イトイムノラジオメトリックアッセイ（solid phase,tw
o-site immunoradio metricassay ）を使用する市販の
ラジオイムノアッセイ技術（Hybritech 社製ＣＡ−195
−ＲＩＡ）を用いる。このアッセイにおいて、試料を、
ＣＡ195 抗原に対する抗体でコートしたプラスチックビ
ーズと反応させ、同時に同じ特異性を有する放射性標識
化抗体と反応させる。ヒト血清中よりずっと多量のＣＡ
195 状物質が、ヒト羊水中に存在することがわかった。
ヒト羊水中の前記物質のレベルは約800〜1000Ｕ／mlで
あり、一方正常なヒト血清中の前記物質のレベルは10Ｕ
／ml未満であることがわかった。ヒト血清中のＣＡ195
状物質の濃度が10Ｕ／mlを超えるとがん状態に関係する
と思われる（Bhargava等、J.Tumor Marker Oncology ，
２巻（1987年）319 ページ）。このイムノアッセイが羊
水中の物質を検出するという事実は、免疫学的特性にお
いてＣＡ195 状物質が真正ＣＡ195 抗原と、同一ではな
いとしても類似するものであることを示している。
【０００８】さらに、この分野において周知の技術を用
いてヒト羊水から前記物質を分離するためにさらなる作
業を行うことができる。それらの技術には、クロマトグ
ラフィー技術およびイムノメトリック（immunometric）
技術があるが、これらに限定されるものではない。
いてヒト羊水から前記物質を分離するためにさらなる作
業を行うことができる。それらの技術には、クロマトグ
ラフィー技術およびイムノメトリック（immunometric）
技術があるが、これらに限定されるものではない。
【０００９】ＣＡ195 状物質を分離すると、他の実験室
において悪性腫瘍組織からのＣＡ195 が使用されるよう
な種々の用途に、すなわち、ヒト血清中のＣＡ195 の定
量的および定性的測定のための臨床検定の対照物質（co
ntrols）として使用できる物質を開発するため、分離さ
れたＣＡ195 状物質を用いることができる。
において悪性腫瘍組織からのＣＡ195 が使用されるよう
な種々の用途に、すなわち、ヒト血清中のＣＡ195 の定
量的および定性的測定のための臨床検定の対照物質（co
ntrols）として使用できる物質を開発するため、分離さ
れたＣＡ195 状物質を用いることができる。
【００１０】さらにまた、ＣＡ195 状物質は、抗体を産
生するための免疫原としても使用できる。ポリクローナ
ル、モノクローナルまたは他の抗体を、ＣＡ195 状物質
に対して用いることもできる。抗体（ポリクローナルま
たはモノクローナル）を産生する技術は十分に確立され
ている。ポリクローナル抗体を産生するため、ヒトＣＡ
195 状物質を所望の動物（通常ウサギ）に注射して免疫
反応を生じさせることができる。次に、この動物の血清
をＣＡ195 への抗体のソースとして使用する。動物がＣ
Ａ195 に対して特異的な抗体のみを産生し、外来性タン
パクに対して特異的な抗体は産生しないように、免疫原
として使用すべく多量の純粋ＣＡ195 を有することが特
に有用である。モノクローナル抗体を産生するため、ヒ
トＣＡ195 状物質を所望の系統のマウス（あるいは技術
が確立していれば他の動物でも可）に注射し、不滅の抗
体（immortal antibody ）分泌細胞株を産生し、これを
ＣＡ195 識別のためスクリーニングすることができる。
ここでも多量の純粋ＣＡ195 はスクリーニングの時間を
短縮すると共に、ＣＡ195 に対して特異的な抗体を分泌
する細胞株を得る可能性を大幅に向上させる。
生するための免疫原としても使用できる。ポリクローナ
ル、モノクローナルまたは他の抗体を、ＣＡ195 状物質
に対して用いることもできる。抗体（ポリクローナルま
たはモノクローナル）を産生する技術は十分に確立され
ている。ポリクローナル抗体を産生するため、ヒトＣＡ
195 状物質を所望の動物（通常ウサギ）に注射して免疫
反応を生じさせることができる。次に、この動物の血清
をＣＡ195 への抗体のソースとして使用する。動物がＣ
Ａ195 に対して特異的な抗体のみを産生し、外来性タン
パクに対して特異的な抗体は産生しないように、免疫原
として使用すべく多量の純粋ＣＡ195 を有することが特
に有用である。モノクローナル抗体を産生するため、ヒ
トＣＡ195 状物質を所望の系統のマウス（あるいは技術
が確立していれば他の動物でも可）に注射し、不滅の抗
体（immortal antibody ）分泌細胞株を産生し、これを
ＣＡ195 識別のためスクリーニングすることができる。
ここでも多量の純粋ＣＡ195 はスクリーニングの時間を
短縮すると共に、ＣＡ195 に対して特異的な抗体を分泌
する細胞株を得る可能性を大幅に向上させる。
【００１１】抗体（モノクローナル，ポリクローナル，
その他）を産生するための技術は当業者にとって周知で
ある。例えば、Koehler,G.およびMilstein C.,256 Natu
re（1975年），495 ページ；並びにDavis,B.,R.Dulbecc
o,H.Eisen,H.GinsbergおよびW.Wood,Principles of Mic
robiology and Immunology, 第２巻，Harper Z Row,New
York,1973年を参照のこと。
その他）を産生するための技術は当業者にとって周知で
ある。例えば、Koehler,G.およびMilstein C.,256 Natu
re（1975年），495 ページ；並びにDavis,B.,R.Dulbecc
o,H.Eisen,H.GinsbergおよびW.Wood,Principles of Mic
robiology and Immunology, 第２巻，Harper Z Row,New
York,1973年を参照のこと。
【００１２】先に述べた事項は、ＣＡ状物質を使用する
ための最良の態様を記載している。しかしながら、ラジ
オイムノアッセイ，ELISA および他の分析技術などを加
えた全ての分析法においてＣＡ195 状物質は真性ＣＡ19
5 を代替することができることに留意されたい。例え
ば、抗原を検出するためのほとんどのノムノアッセイ
は、標識化抗原か標識化抗体のどちらかを利用する。Ｃ
Ａ195 状抗原または抗体は、例えば放射性標識、酵素標
識、蛍光標識、ケミルミネッセント標識あるいは免疫化
学分析法における有用性を付与する他の標識を付加する
などの種々の確立された技術を利用して標識化できる。
これらの標識はノムノアッセイのリポーティング群(rep
orting group）として機能する。既知の濃度の所望の抗
原を含む基準物質(standard)またはキャリブレータもま
た、通常必要である。ヒト羊水からのＣＡ195 状物質あ
るいはそれから産生される抗体は、上記成分の安価なソ
ースを与える。ヒト羊水は、真性ＣＡ195 が現在使用さ
れている他の分析法において、濃縮して用いるか、もし
くは濃縮せずに用いることもできる。
ための最良の態様を記載している。しかしながら、ラジ
オイムノアッセイ，ELISA および他の分析技術などを加
えた全ての分析法においてＣＡ195 状物質は真性ＣＡ19
5 を代替することができることに留意されたい。例え
ば、抗原を検出するためのほとんどのノムノアッセイ
は、標識化抗原か標識化抗体のどちらかを利用する。Ｃ
Ａ195 状抗原または抗体は、例えば放射性標識、酵素標
識、蛍光標識、ケミルミネッセント標識あるいは免疫化
学分析法における有用性を付与する他の標識を付加する
などの種々の確立された技術を利用して標識化できる。
これらの標識はノムノアッセイのリポーティング群(rep
orting group）として機能する。既知の濃度の所望の抗
原を含む基準物質(standard)またはキャリブレータもま
た、通常必要である。ヒト羊水からのＣＡ195 状物質あ
るいはそれから産生される抗体は、上記成分の安価なソ
ースを与える。ヒト羊水は、真性ＣＡ195 が現在使用さ
れている他の分析法において、濃縮して用いるか、もし
くは濃縮せずに用いることもできる。
【００１３】ＣＡ195 状物質またはそこから産生される
抗体は固体支持体上に固定することができる。その支持
体としては種々の支持体が使用できる。例えば、アガロ
ース樹脂（セファロース他）、ガラスビーズその他が支
持体として使用できる。ＣＡ195 状物質に対する固定化
抗体は粗ソースから純粋なＣＡ195 状物質を得るための
迅速で有効な純粋ツールとして作用する。同様に、純粋
な抗体が固定化ＣＡ状物質を用いて得られる。これらの
イムノアフィニティークロマトグラフ法は文献において
十分確立されている。
抗体は固体支持体上に固定することができる。その支持
体としては種々の支持体が使用できる。例えば、アガロ
ース樹脂（セファロース他）、ガラスビーズその他が支
持体として使用できる。ＣＡ195 状物質に対する固定化
抗体は粗ソースから純粋なＣＡ195 状物質を得るための
迅速で有効な純粋ツールとして作用する。同様に、純粋
な抗体が固定化ＣＡ状物質を用いて得られる。これらの
イムノアフィニティークロマトグラフ法は文献において
十分確立されている。
【００１４】上記は固定化リガンドがどのように使用さ
れるかの例を示しているが、それは限定的なものではな
い。例えば、固定化ＣＡ195 状物質抗体を、ＣＡ195 を
含まない血清を得るための除去剤(stripping agent）と
して使用することもできる。
れるかの例を示しているが、それは限定的なものではな
い。例えば、固定化ＣＡ195 状物質抗体を、ＣＡ195 を
含まない血清を得るための除去剤(stripping agent）と
して使用することもできる。
【００１５】
【実施例】本発明を以下の実施例に基づいてさらに詳細
に説明する。
に説明する。
【００１６】以下の実施例は、ＣＡ195 状物質のソース
の採集、ＣＡ195 状物質の識別、純粋化およびその利用
の種々の面について記載する。
の採集、ＣＡ195 状物質の識別、純粋化およびその利用
の種々の面について記載する。
【００１７】実施例１ ヒト羊水の採集
手を加えていないヒト羊水(raw human amniotic fluid)
をプールし、チーズクロスを通して濾過して粒子を除去
した。プールのpHを４ＮＨＣｌまたは６ＮＮａＯＨで6.
8 ±0.1 に調整した。次にこのプールを、3.0 ミクロン
以上の粒子を通過させないカートリッジを通して濾過し
た。次にこのプールを−20℃で冷凍保存した。
をプールし、チーズクロスを通して濾過して粒子を除去
した。プールのpHを４ＮＨＣｌまたは６ＮＮａＯＨで6.
8 ±0.1 に調整した。次にこのプールを、3.0 ミクロン
以上の粒子を通過させないカートリッジを通して濾過し
た。次にこのプールを−20℃で冷凍保存した。
【００１８】実施例２ 羊水試料のラジオイムノアッセイ
羊水の必要な試料を解凍し、Hybritech 社から購入した
ラジオイムノアッセイを用いてＣＡ195 状物質の存在を
確かめるための検定を行った。それは、試料をＣＡ195
抗原に対する抗体でコートしてあるプラスチックビーズ
と反応させ、同時に同じ特異性を有する放射性標識化抗
体と反応させる固相ツーサイトアッセイであった。製造
者の支持を正確に守って実行した。このアッセイにおい
て、ビーズを羊水の試料および放射性標識化ＣＡ195 抗
体と混合した。次にビーズを洗浄して未結合標識化抗体
を除去した。固相に結合した放射能は試験試料中に存在
するＣＡ195 状物質の濃度に直接比例する。
ラジオイムノアッセイを用いてＣＡ195 状物質の存在を
確かめるための検定を行った。それは、試料をＣＡ195
抗原に対する抗体でコートしてあるプラスチックビーズ
と反応させ、同時に同じ特異性を有する放射性標識化抗
体と反応させる固相ツーサイトアッセイであった。製造
者の支持を正確に守って実行した。このアッセイにおい
て、ビーズを羊水の試料および放射性標識化ＣＡ195 抗
体と混合した。次にビーズを洗浄して未結合標識化抗体
を除去した。固相に結合した放射能は試験試料中に存在
するＣＡ195 状物質の濃度に直接比例する。
【００１９】このキットは、Ｉ−125 標識化抗ＣＡ195
抗体、抗ＣＡ195 抗体でコートされたビーズ、ＣＡ195
基準液（０，10，30，60，90および120 Ｕ ＣＡ195 ／
ml）、そして使用上の指示を含んでいた。
抗体、抗ＣＡ195 抗体でコートされたビーズ、ＣＡ195
基準液（０，10，30，60，90および120 Ｕ ＣＡ195 ／
ml）、そして使用上の指示を含んでいた。
【００２０】50マイクロリッターの基準液または検体を
指定されたチューブにピペット取りした。次に200 マイ
クロリッターのＩ−125 標識化抗ＣＡ195 抗体を全ての
チューブにピペット取りした。各チューブに１つのビー
ズを入れた。チューブをボルテックスして(vortex)、室
温で２時間、170rpmにセットされた水平ローテーター上
に置いた。次にビーズを２mlの洗浄溶液で３回洗浄し、
適当な井戸型ガンマシンチレーションカウンターで測定
した。
指定されたチューブにピペット取りした。次に200 マイ
クロリッターのＩ−125 標識化抗ＣＡ195 抗体を全ての
チューブにピペット取りした。各チューブに１つのビー
ズを入れた。チューブをボルテックスして(vortex)、室
温で２時間、170rpmにセットされた水平ローテーター上
に置いた。次にビーズを２mlの洗浄溶液で３回洗浄し、
適当な井戸型ガンマシンチレーションカウンターで測定
した。
【００２１】実施例３ 粗ＣＡ195 状物質抗原
以下はヒト羊水から粗ＣＡ195 状物質を生成する方法の
例である。
例である。
【００２２】ヒト羊水を採集し、保存のため直ちに冷凍
した。使用時に、所望の重量となる羊水を解凍した。各
容器について満足すべき物性を有しているかどうかを検
査した。必要に応じて全ての設備について清潔さを検査
し、最終濾過の設備を蒸気清浄した。ＣＡ195 ラジオイ
ムノアッセイを実施例２のようして実施した。800 Ｕ／
mlを超える試料のみを合格とした。羊水をチーズクロス
を通して濾過し、重量を記録した。プールのpHを４ＮＨ
Ｃｌまたは６ＮＮａＯＨで6.8 ±0.1 に調整した。次に
プールを少なくとも3.0 ミクロンのカートリッジを通し
て濾過した。次に、濾過を、濃縮装置（例えばＹＭ10膜
を用いたAmicon Stirred Cell Model 8400）を用いて1
0,000ダルトン未満の分子をカットオフして約8000Ｕ／m
lまで濃縮した。この濃縮物を、10×10−３Ｍリン酸カ
リウム緩衝液pH6.9 （100 倍）に一晩（５℃）透析し
た。次にこの透析物を蒸気清浄したタンクへと0.45ミク
ロンのフィルターを通して濾過し、清潔なボトルの所望
のレベルまで満たした。得られた生成物は−20℃で冷凍
保存するか以下の実施例４に従って凍結乾燥した。
した。使用時に、所望の重量となる羊水を解凍した。各
容器について満足すべき物性を有しているかどうかを検
査した。必要に応じて全ての設備について清潔さを検査
し、最終濾過の設備を蒸気清浄した。ＣＡ195 ラジオイ
ムノアッセイを実施例２のようして実施した。800 Ｕ／
mlを超える試料のみを合格とした。羊水をチーズクロス
を通して濾過し、重量を記録した。プールのpHを４ＮＨ
Ｃｌまたは６ＮＮａＯＨで6.8 ±0.1 に調整した。次に
プールを少なくとも3.0 ミクロンのカートリッジを通し
て濾過した。次に、濾過を、濃縮装置（例えばＹＭ10膜
を用いたAmicon Stirred Cell Model 8400）を用いて1
0,000ダルトン未満の分子をカットオフして約8000Ｕ／m
lまで濃縮した。この濃縮物を、10×10−３Ｍリン酸カ
リウム緩衝液pH6.9 （100 倍）に一晩（５℃）透析し
た。次にこの透析物を蒸気清浄したタンクへと0.45ミク
ロンのフィルターを通して濾過し、清潔なボトルの所望
のレベルまで満たした。得られた生成物は−20℃で冷凍
保存するか以下の実施例４に従って凍結乾燥した。
【００２３】実施例４ 凍結乾燥工程
以下の手順に従って工業的真空乾燥機（Hull社製モデル
651 ＶＣ36Ｆ40）を凍結乾燥工程に用いた。
651 ＶＣ36Ｆ40）を凍結乾燥工程に用いた。
【００２４】試料を充填する前にシェルフ温度(shelf t
emperature) を−29℃以下まで下げた。次に生成物を充
填し、生成物の全温度が−29℃以下になったらシェルフ
温度を＋５℃にセットした。生成物の全温度が−１℃に
達するまでシェルフ温度を＋５℃に維持した。次にシェ
ルフ温度を＋16℃まで上げ、生成物の全温度が＋10℃に
なるまでこの温度に保持した。次にシェルフ温度を＋27
℃まで上げ、生成物の全温度が＋21℃になるまでこの温
度に保持した。次にシェルフ温度を＋43℃まで上げ、生
成物の全温度が＋38℃になるまでこの温度に保持した。
生成物の全温度が＋38℃に達した後、さらに12時間を要
した。乾燥サイクルを完了した後、乾燥機を排気し、生
成物を取り出した。
emperature) を−29℃以下まで下げた。次に生成物を充
填し、生成物の全温度が−29℃以下になったらシェルフ
温度を＋５℃にセットした。生成物の全温度が−１℃に
達するまでシェルフ温度を＋５℃に維持した。次にシェ
ルフ温度を＋16℃まで上げ、生成物の全温度が＋10℃に
なるまでこの温度に保持した。次にシェルフ温度を＋27
℃まで上げ、生成物の全温度が＋21℃になるまでこの温
度に保持した。次にシェルフ温度を＋43℃まで上げ、生
成物の全温度が＋38℃になるまでこの温度に保持した。
生成物の全温度が＋38℃に達した後、さらに12時間を要
した。乾燥サイクルを完了した後、乾燥機を排気し、生
成物を取り出した。
【００２５】実施例５ 標準グレードＣＡ195 状物質
以下はヒト羊水から部分純粋化ＣＡ195 状物質を生成す
る手順を示す。
る手順を示す。
【００２６】濃縮工程を通して実施例３に示した粗ＣＡ
195 状物質を得る工程を実施した。セファデックスＧ−
200 カラムを用意し、ブルーデキストラン溶液を用いて
ボイド容積を求めた。次に、調製した濃縮物をセファデ
ックスＧ−200 サイジングカラムに加えた。前記カラム
の（予備較正に基づく）ボイド容積に対応する試料を集
め、実施例２で述べたラジオイムノアッセイを用いてＣ
Ａ195 活性を検定した。ＣＡ195 状物質の正のピークを
プールし、10,000未満の分子量カットオフによって約80
00Ｕ／mlまで濃縮し、0.45ミクロンフィルターを通して
濾過した。得られた生成物をボトルの所望のレベルまで
満たし、冷凍保存するか実施例４のように凍結乾燥し
た。
195 状物質を得る工程を実施した。セファデックスＧ−
200 カラムを用意し、ブルーデキストラン溶液を用いて
ボイド容積を求めた。次に、調製した濃縮物をセファデ
ックスＧ−200 サイジングカラムに加えた。前記カラム
の（予備較正に基づく）ボイド容積に対応する試料を集
め、実施例２で述べたラジオイムノアッセイを用いてＣ
Ａ195 活性を検定した。ＣＡ195 状物質の正のピークを
プールし、10,000未満の分子量カットオフによって約80
00Ｕ／mlまで濃縮し、0.45ミクロンフィルターを通して
濾過した。得られた生成物をボトルの所望のレベルまで
満たし、冷凍保存するか実施例４のように凍結乾燥し
た。
【００２７】実施例６ ＣＡ195 状物質を含む腫瘍マーカー対照物
以下はヒト血清ベース中にＣＡ195 状物質を含む腫瘍マ
ーカー対照物を調製する方法を示す。
ーカー対照物を調製する方法を示す。
【００２８】所望の量を得るのに十分な量のヒト血清を
解凍した。全タンパク質は5.0 〜6.0g／dlであった。こ
のヒト血清はバクテリアの混入を示す目に見える兆候を
全く示さなかった。血清と未純粋化ストック溶液につ
き、いかに示す全成分の内因性レベルを試験した。血清
のpHを４ＮＨＣｌを用いて6.1 に調整し、pHが約6.8 に
達するまでかくはんした。この溶液をヘペス(Hepes) 緩
衝液中で1.5 ×10−２Ｍとし、pHを6.8 〜7.0 に調整し
た。0.1 〜0.5 ％のセライト（Celite) をプールした血
清に加え、混合し、少なくとも0.5 ミクロンのパッドを
通して濾過した。次に下記の成分を、中程度の速度でプ
ールを混合しながら所望のレベルまで加えた：α−フェ
トプロテイン、がん胎児抗原、ＣＡ125 、ＣＡ19−9 、
ＣＡ50、ＣＡ15−3 フェリチン、β−ｈＣＧ、免疫エラ
スターゼ、前立腺酸ホスファターゼ、組織ポリペプチド
抗原、およびＣＡ195 状物質（ヒト羊水由来）。プール
を0.45ミクロンのフィルターで濾過し、各ガラスビン当
り5.2ml とした。得られた生成物は実施例４のようにし
て凍結乾燥した。
解凍した。全タンパク質は5.0 〜6.0g／dlであった。こ
のヒト血清はバクテリアの混入を示す目に見える兆候を
全く示さなかった。血清と未純粋化ストック溶液につ
き、いかに示す全成分の内因性レベルを試験した。血清
のpHを４ＮＨＣｌを用いて6.1 に調整し、pHが約6.8 に
達するまでかくはんした。この溶液をヘペス(Hepes) 緩
衝液中で1.5 ×10−２Ｍとし、pHを6.8 〜7.0 に調整し
た。0.1 〜0.5 ％のセライト（Celite) をプールした血
清に加え、混合し、少なくとも0.5 ミクロンのパッドを
通して濾過した。次に下記の成分を、中程度の速度でプ
ールを混合しながら所望のレベルまで加えた：α−フェ
トプロテイン、がん胎児抗原、ＣＡ125 、ＣＡ19−9 、
ＣＡ50、ＣＡ15−3 フェリチン、β−ｈＣＧ、免疫エラ
スターゼ、前立腺酸ホスファターゼ、組織ポリペプチド
抗原、およびＣＡ195 状物質（ヒト羊水由来）。プール
を0.45ミクロンのフィルターで濾過し、各ガラスビン当
り5.2ml とした。得られた生成物は実施例４のようにし
て凍結乾燥した。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，Ｖ
ｏｌ．187，Ｎｏ．３（1990）ｐ．199−
206
Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ．，Ｖｏｌ．255，Ｎｏ．１
（1987），ｐ．214−216
Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．35,
Ｎｏ．６（1989）ｐ．1079
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C07G 17/00
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (7)
- 【請求項１】 ヒト羊水からＣＡ１９５状物質を分離す
る方法であって、 ａ）８００Ｕ／ｍｌを超える濃度のＣＡ１９５状物質を
含むヒト羊水試料を選択し、 ｂ）該ヒト羊水からＣＡ１９５状物質を分離するか、あ
るいは該ヒト羊水を濃縮する、 各工程を含むことを特徴とする方法。 - 【請求項２】 前記選択が、イムノメトリック法の使用
を含むことを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 前記分離が、カラムクロマトグラフィー
技術の使用を含むことを特徴とする請求項１記載の方
法。 - 【請求項４】 前記ＣＡ１９５状物質が、抗体の作成に
用いられることを特徴とする請求項１から３何れか１項
記載の方法。 - 【請求項５】 前記抗体の作成が、ポリクロナール抗体
技術またはモノクロナール抗体技術によって成されるこ
とを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 前記ＣＡ１９５状物質が、分析対照物質
の作成に用いられることを特徴とする請求項１から３何
れか１項記載の方法。 - 【請求項７】 前記ＣＡ１９５状物質が、診断キットの
作成に用いられることを特徴とする請求項１から３何れ
か１項記載の方法。
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|---|---|---|---|
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0641172A JPH0641172A (ja) | 1994-02-15 |
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Family
ID=24751592
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| JP00278192A Expired - Fee Related JP3385572B2 (ja) | 1991-04-12 | 1992-01-10 | ヒト羊水からのｃａ１９５状物質およびその分離方法 |
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| DE (1) | DE69204718T2 (ja) |
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| WO2012089814A1 (en) | 2010-12-30 | 2012-07-05 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antigen binding formats for use in therapeutic treatments or diagnostic assays |
| WO2013041901A1 (en) | 2011-09-20 | 2013-03-28 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for preparing single domain antibody microarrays |
| EP2855678B1 (en) | 2012-05-25 | 2017-08-23 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for selecting binders by phage display and masked selection |
| EP2733153A1 (en) | 2012-11-15 | 2014-05-21 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for the preparation of immunoconjugates and uses thereof |
| EP2818867A1 (en) | 2013-06-27 | 2014-12-31 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Antibodies conjugated to at least one nucleic acid molecule and their use in multiplex immuno-detection assays |
| EP3016973A1 (en) | 2013-07-05 | 2016-05-11 | INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Novel alternative splice transcripts for mhc class i related chain alpha (mica) and uses thereof |
| WO2016135041A1 (en) | 2015-02-26 | 2016-09-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Fusion proteins and antibodies comprising thereof for promoting apoptosis |
| WO2017081190A1 (en) | 2015-11-13 | 2017-05-18 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Anti- nkg2d single domain antibodies and uses thereof |
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| WO2022101463A1 (en) | 2020-11-16 | 2022-05-19 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Use of the last c-terminal residues m31/41 of zikv m ectodomain for triggering apoptotic cell death |
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| WO2024018003A1 (en) | 2022-07-21 | 2024-01-25 | Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Extracellular vesicles functionalized with an erv syncitin and uses thereof for cargo delivery |
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| US4440863A (en) * | 1978-02-22 | 1984-04-03 | Duke University | Breast cyst fluid protein assay |
| GB2043890B (en) * | 1979-01-30 | 1983-09-07 | Otsuka Pharma Co Ltd | Determination of tumour associated glycolinkage and diagnosis of cancer |
| JPS5729949A (en) * | 1980-07-30 | 1982-02-18 | Nippon Koutai Kenkyusho:Kk | Determination of sugar branch related to cancer and diagnostic technique of cancer |
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4486530A (en) * | 1980-08-04 | 1984-12-04 | Hybritech Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| GB2114287B (en) * | 1982-01-29 | 1985-10-30 | Otsuka Pharma Co Ltd | Process for determining tumor-associated glycolinkage |
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| US4582787A (en) * | 1982-12-30 | 1986-04-15 | Frankel Jack W | Method of testing a patient for a predisposition to lung cancer, certain other cancers, neurofibromatosis and certain other hereditary disorders |
| US4818709A (en) * | 1983-01-21 | 1989-04-04 | Primus Frederick J | CEA-family antigens, Anti-CEA antibodies and CEA immunoassay |
| US4687733A (en) * | 1984-01-30 | 1987-08-18 | Ohio State University | Early cancer detection method |
-
1991
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- 1991-11-15 AU AU87891/91A patent/AU657102B2/en not_active Ceased
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1992
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- 1992-04-09 DE DE69204718T patent/DE69204718T2/de not_active Expired - Fee Related
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- 1992-12-21 US US07/993,588 patent/US5324822A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-07-11 HK HK97101551A patent/HK1000027A1/xx not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (3)
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|---|
| Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，Ｖｏｌ．２５５，Ｎｏ．１（１９８７），ｐ．２１４−２１６ |
| Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．３５，Ｎｏ．６（１９８９）ｐ．１０７９ |
| Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，Ｖｏｌ．１８７，Ｎｏ．３（１９９０）ｐ．１９９−２０６ |
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| HK1000027A1 (en) | 1997-10-09 |
| CA2055695C (en) | 2004-04-13 |
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| US5324822A (en) | 1994-06-28 |
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