KR101914673B1 - 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법 - Google Patents

혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101914673B1
KR101914673B1 KR1020187009587A KR20187009587A KR101914673B1 KR 101914673 B1 KR101914673 B1 KR 101914673B1 KR 1020187009587 A KR1020187009587 A KR 1020187009587A KR 20187009587 A KR20187009587 A KR 20187009587A KR 101914673 B1 KR101914673 B1 KR 101914673B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
afp
detection
serum
concentration
Prior art date
Application number
KR1020187009587A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180039184A (ko
Inventor
이잉 장
닝 리
성치 왕
양 커
Original Assignee
베이징 유안 호스피탈 캐피탈 메디칼 유니버시티
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베이징 유안 호스피탈 캐피탈 메디칼 유니버시티 filed Critical 베이징 유안 호스피탈 캐피탈 메디칼 유니버시티
Publication of KR20180039184A publication Critical patent/KR20180039184A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101914673B1 publication Critical patent/KR101914673B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J19/0046—Sequential or parallel reactions, e.g. for the synthesis of polypeptides or polynucleotides; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making molecular arrays
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00277—Apparatus
    • B01J2219/00497—Features relating to the solid phase supports
    • B01J2219/00527—Sheets
    • B01J2219/00533—Sheets essentially rectangular
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
    • B01J2219/00614—Delimitation of the attachment areas
    • B01J2219/00621—Delimitation of the attachment areas by physical means, e.g. trenches, raised areas
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
    • B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
    • B01J2219/00659—Two-dimensional arrays
    • B01J2219/00662—Two-dimensional arrays within two-dimensional arrays
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/0068—Means for controlling the apparatus of the process
    • B01J2219/00693—Means for quality control
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
    • B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
    • B01J2219/00718—Type of compounds synthesised
    • B01J2219/0072—Organic compounds
    • B01J2219/00725—Peptides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
    • G01N2333/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/471—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2440/00—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material
    • G01N2440/38—Post-translational modifications [PTMs] in chemical analysis of biological material addition of carbohydrates, e.g. glycosylation, glycation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
    • G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7023—(Hyper)proliferation
    • G01N2800/7028—Cancer

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

본 발명은 혈청 당단백질의 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트와 검측 방법에 관하는데 단백질 검측 기술에 속한다. 상기 단백질 칩의 기질 운반체에는 적어도 한 검측아구를 포함하고, 한 상기 검측아구에서는 한 혈청 샘플을 검측하고 상기 검측아구 내에는 2개의 검측반점구역과 한 줄대조 반점구역이 설치되어 있고 그 중의 한 검측반점구역에는 태아 단백질의 특이성항체를 고정시키러 형성하는 검측반점이 있고 다른 한 검측반점구역에는 LcA를 고정시키러 형성하는 검측반점이 있으며 상기 대조반점 구역에는 소의 형청 알부민을 고정시키러 형성하는 대조반점이 있으며 같은 검측반점구역 내에는 모든 검측반점에서의 물질의 농도는 같다. 본 발명의 단백질 칩, 키트와 방법은 정확하게 혈청 당단백질의 푸코오스 지수를 검측할 수 있어서 임상 응용에는 정밀도가 높고 시간이 절약되고 편리하고 경제적인 장점을 가지고 있다는 것을 특징으로 한다.

Description

혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법{CHEMILUMINESCENCE PROTEIN CHIP, KET AND METHOD FOR DETECTING SEROGLYCOID FUCOSE INDEX}
본 발명은 단백질 검측 기술에 관하는데 특히 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트와 검측방법에 관한 것이다.
원발성 간암은 간염, 간경변 등 양성의 간질환이 생성하는 태아 단백질（alpha fetoprotein, AFP）과 당사슬 구조에는 아주 큰 차이가 존재하는데 즉 양성의 간질환에 비하면 간암이 생성하는 AFP의 푸코오스 지수가 더 많이 높은 것이다. 푸코오스는 Lens culinaris agglutinin(LcA)와 결합하는 특성을 가지고 있다. AFP는 푸코오스가 LcA에 대한 친화력의 다름에 따라 AFP- L1、AFP-L2 와 AFP-L3을 나눈다. 그 중에는 AFP-L1은 주로 양성의 간질환에서 오고, AFP-L2는 주로 임산부에서 오며 AFP-L3은 태아단백질의 푸코오스 당화반응 형식으로서 주로 HCC에서 온다. 2005년, FDA가 정식으로 AFP-L3을 원방성 간암의 표식물질의 하나로 비준한다. AFP-L3은 간암의 조기진단과 감별진단, 치료효과와 예후검측 등 쪽에는 다 좀 높은 특이성와 민감성을 가지고 있다.
푸코오스는 메틸화6탄당이고 조직과 혈청의 여러 가지 당단백질 당사슬에서 존재하고 단백질 결합 푸코오스(protein-bound fucose, P-bf)라고 부른다. AFP탄수화물 사슬에서는 푸코오스 잔기가 존재하고 이런 이질체는 푸코오스 당화반응 AFP(FucAFP)라고 부르며 이가 AFP 총량을 차지하는 백분율은 푸코오스메틸화지수(Fucosylation Index, Fuol)라고 부른다. 푸코오스메틸화지수는 아주 중요한 이론적 의의와 임상응용의의를 가지고 있고 간암진단과 예후응용에는 한 가지의 중요한 지표로 간주될 수 있다.
종래의 혈청 푸코오스단백질 분리법은 교차면역전기이동법, 친화 블로팅법, 친화 크로마토그래피법,“샌드위치”효소결합면역흡착측정법, LiBASys측정기, μTASWako® i30검측시스템기술과 열경생물회사의 글리코실기 포획 스핀 칼럼 전처리 기술을 포함한다. 그중에서는 식물응집소친화면역 전기이동 기술과μTASWako® i30검측시스템기술은 요구가 높고 조작하기가 복잡하고 시제가 비싸서 넓게 사용하기에는 한계가 있다. 그런데 글리코실기포획 스핀 칼럼 기술은 샘풀 처리와 검측이 따로 진행시켜야 해서 조작하기가 불편하다.
본 발명은 본 분야에서 혈청에서의 AFP와 AFP-L3을 정량으로 검측하는 기술의 필요와 결핍에 정량으로 생물 샘플 중에서의 태아 단백질과 푸코오스 메틸화 태아 단백질을 검측하는 한 가지의 키트와 검측방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 기술적 방법은 다음과 같다.
한 가지의 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩은 상기 단백질 칩의 기질 운반체에는 적어도 한 검측아구를 포함하고 상기 한 검측아구은 한 혈청 샘플을 검측하는 것을 특징으로 한다.
상기 검측아구에는 2개의 검측 반점 구역과 한 개의 줄 대조 반점구역이 설치되어 있는데 그중의 한 검측 반점 구역에는 태아 단백질의 특이성항체를 고정시키러 형성하는 검측반점이 있고 다른 검측반점구역에는 LcA를 고정시키러 형성하는 검측 반점이 있으며 상기 대조반점구역에는 소의 혈청 알부민을 고정시키러 형성하는 대조반점이 있다.
같은 검측반점구역 내의 모든 검측반점에서의 물질의 농도가 같다.
상기 한 검측반점구역에는 적어도 두개의 상기 검측반점을 포함한다.
상기 태아단백질의 특이성항체는 쥐 항 인간 태아단백질 항체이다.
상기 기질 운반체 위에는 여러 개의 상기 검측아구가 설치되어 있고 상기 검측반점구역마다 한 줄로 배열되어 있는 4개의 검측반점을 포함하고 상기 대조반점구역은 한 줄로 배열되어 있는 4개의 대조반점을 포함하며 상기 검측반점과 대조반점은 평행으로 되어 있는 3줄로 배열된다.
상기 검측아구 사이에는 돌기가 설치되어 물리적 칸막이 역할을 한다.
한 가지의 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 키트는 청구범위 제1항 내지 제4항 중 임의의 어느 한 항에서 말하는 화학 발광 단백질 칩을 포함하는 것으로 특징으로 한다.
이 키트는 또한 AFP표준품, 비오틴 표시의 AFP 다클론성항체, 아비딘 HRP와HRP 화학발광기질액을 같이 포함한다. 상기 비오틴 표시의 AFP 다클론항체는 토끼에서 기원하는 항체이고 상기 검측반점에서 고정되어 있는 AFP 특이성항체와 다른 물종에서 기원한다.
또한 세척과 희석에서 사용되는 상용의 시제 PBST와 PBS도 포함한다.
상기 임의의 키트는 태아 단백질과 푸코오스 메틸화 태아 단백질과 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 쪽에서의 응용.
한 가지의 정량으로 푸코오스 메틸화 단백질을 검측하는 방법은 상기 어떤 하나의 화학 발광 단백질 칩을 사용할 때는 다음과 같은 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
(1) 샘플검측
측정할 혈청 샘플을 희석하고 상기 화학 발광 단백질 칩의 검측아구에 가입하고 부화한 후 PBST로 검측아구를 세척하고 비특이성결합물을 제거한다.
PBST로 희석하는 비오틴 표시의 AFP항체를 가입하고 부화한 후 PBST로 세척하고 비특이성결합물을 제거한다.
PBS로 희석하는 아비딘 HRP를 가입하고 부화한 후 PBST로 세척하고 비특이성결합물을 제거한다.
HRP 기질발광액을 가입하고 화학발광스캐너로 단백질잘 칩을 스캔하고 희석 후 측정할 샘플 중의 태아 단백질의 발광 화소 수치와 푸코오스 메틸화 단백질의 발광 화소 수치를 획득한다.
(2) 태아 단백질 표준곡선 방정식과 푸코오스 메틸화 단백질의 표준곡선 방정식을 획득한다.
상기 태아 단백질 표준곡선 방정식의 가로의 좌표 x는 AFP 표준품의 경도 농도 수치이고 세로의 좌표 y는 경도농도의 AFP 표준품을 계열 측정될 샘플로 하여 단계(1)에서의 방법으로 획득한 태아단백질의 계열 발광 화소수치다.
상기 태아 단백질 표준곡선 방정식의 가로 좌표 x는 AFP-L3 표준품 중에서 AFP-L3의 경도 농도 수치이고 이의 세로 좌표 y는 경도 농도의 AFP-L3 표준품을 계열 측정될 샘플로 하고 단계(1)에서의 방법으로 측정된 푸코오스 메틸화 단백질의 계열 발광 화소 수치이며 상기 AFP-L3 표준품은 푸코오스 단백질(AFP)을 함유하는 혈청이다.
(3) 상기 단계(1)에서의 측정될 혈청 샘플의 태아 단백질의 발광 화소 수치를 상기 태아 단백질 표준곡선 방정식에 대입하고 희석 후 혈청에서의 태아 단백질 농도를 획득한 후 희석 배수를 곱하고 측정될 혈청 태아 단백질 농도를 획득한다. 단계(1)에서의 측정될 혈청 샘플의 푸코오스 메틸화 단백질의 발광 화소 수치를 상기 푸코오스 메틸화 단백질 표준곡선 방정식에 대입하고 희석 후 혈청에서의 푸코오스 메틸화 단백질 농도를 획득한 후 희석 배수를 곱하고 측정될 혈청 푸코오스 메틸화 단백질의 농도를 획득한다.
측정될 푸코오스 메틸화 단백질의 농도는 상기 측정될 혈청 태아단백질 농도의 비율은 푸코오스 메틸화 지수다.
상기 부화는 37도에서 30분을 부화한다는 것을 가리킨다.
본 발명은 한 가지의 혈청 당단백질 푸코오스지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩을 제공하는데 이는 항체 항원 항체 샌드위치 반응 원리와 화학발광원리에 의하고 동시에 태아 단백질 특이성 항체와 LcA가 있고 태아 단백질 특이성 항체는 혈청에서의 모든 태아 단백질（AFP- L1、AFP-L2 와 AFP-L3）을 결합하는데 사용되고, LcA는 푸코오스 메틸화 태아단백질을 결합하는데 사용된다. 동시에 대조반점을 설치한다. 절대적으로 같은 조건하에 동시에 측정될 혈청 중에서 태아 단백질의 총 농도와 푸코오스 메틸화 태아 단백질의 농도를 검측할 수 있고 정확히 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 획득한다. 본 발명에서 제공하는 화학 발광 단백질 칩은 적어도 한 검측아구를 포함하고 이는 한 혈청 샘플을 검측할 수 있다. 대부분의 시실예에서 바람직하게 적어도 두 개의 검측아구를 설치하고 그 중의 하나는 대조혈청을 검측하는데에 사용되고 다른 하나는 측정될 혈청 샘플을 측정하는 것에 사용된다. 더 고중성자속 검측을 실현시키기 위해 바람직하게 여러 개, 예를 들어, 3개, 4 개, 5 개, 6개, 7개, 8개, 9개나 10개의 검측아구를 선택하고 이러면 바로 한 장의 칩에서 여러 개의 혈청 샘플을 검측할 수 있으므로 임상 검측 효율을 높이고 원가를 낮출 수 있다. 도 1에서 도시하는 바와 같이, 본 발명에서의 한 바람직한 실시예에서 한 상기 검측아구은 4개의 AFP특이성항체를 고정하는 검측반점, 4개의 LcA를 고정하는 검측반점과 4개의 대조반점을 포함하는데 두 개의 검측반점과 대조반점은 각 평행으로 되어 있는 3줄로 배열한다.
본 발명은 한 가지의 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 키트를 제공하는데 그 중에는 상기 단백질 칩과 화학발광의 상용의 시제, 표준곡선방정식 데이터 등을 포함한다.
본 발명은 단백질 칩의 사용은 이하 3가지의 장점을 가지고 있다.
1. 기본상 완전히 같은 조건하에 혈청에서의 태아 단백질과 푸코오스 메틸화 태아 단백질을 검측해서 측정된 푸코오스 메틸화 지수를 더욱 정확하게 한다.
2. 여러 개 샘플을 동시에 검측할 수 있게 한다. 여러 개 중복되는 샘플을, 혹은 다른 시간점에서의 샘플을 응용해서 동태적 수치를 획득하고 또 혹은 각 다른 샘플이며 한 마디로 고중성자속 검측을 실현시킨다. 전체적으로 검측 원가를 낮추고 검측 효율을 높인다.
3. 본 발명의 단백질 칩을 사용하면 필요하는 혈액 샘플과 항체의 양은 많이 줄었다. 원시의 혈청의 양은 그저 2.5 ul~ 10 ul이라면 되지만, ELISA 방법은 혈청 50 ul이 필요하며 단백질 칩으로 샘플을 응용하면 5 ul의 양은 20장 칩을 응용하고, 200부 혈청을 검측할 수 있으므로 항체가 필요되는 양은 ELISA 보다 많이 낮고 이는 검측 원가와 비용을 대폭 낮출 수 있다.
동시에 본 발명은 상기 키트를 이용해 푸코오스 메틸화 태아 단백질을 정량으로 검측하는 방법도 제공한다. 우선으로 본 발명은 구매한 AFP 항원표준품을 사용해 경도 농도의 측정될 AFP희석액으로 만들어놓고 화학 발광 검측 방법으로 각 경도와 대응하는 발광 화소 수치를 측정하고 경도 농도를 가로의 좌표로 하고 영광 화소 수치를 세로의 좌표로 해서 표준곡선을 만들고 직선회귀방정식을 획득한다.
본 발명이 제공하는 혈청당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 방법은 상기 단백질 칩에서 항체를 이용해 항원특이성과 LcA 특이성과 결합하는 특징을 이용해 혈청이나 혈장 표본을 가입하여 부화한 다음에 비오틴 표시의 AFP다클론항체, HRP 표시의 아비딘, 마지막으로 HRP 발광 기질을 가입하여 화학 발광 스캐너를 통해 발광 신호에 대해 스캔, 계량화한다. 획득된 신호 수치를 미리 만들어놓은 직선회귀 방정식에 대입하고 샘플 중의 푸코오스 단백질 AFP-L3의 농도를 획득한다.
본 발명의 방법의 검측 원리는 일반적 화학 발광 면역 반응과 차이점이 있고 일반적인 화학 발광 면역 반응 Elisa 반응은 '항체-항원-겨자무과산화효소 표시의 이차 항체' 복합물을 형성하고 마지막으로 HRP화학 발광기질액을 가입하여 발광 수치를 획득한다. 그러나 겨자무과산화효소 자체에는 당잔기가 존재하는데 만약에 본 발명에서의 이차 항체는 겨자무과산화효소로 표시하고 겨자무과산화효소의 당 잔기가 LcA를 결합하면 심하게 검측 수치를 교란시킬 수 있는데 본 발명이 한 여러 실험으로 이러면 정확한 푸코오스 메틸화 지수를 획득할 수 없고 위험성이 아주 높고 정상적 혈청에서라도 아주 높은 푸코오스 메틸화 지수를 획득할 수 있다고 증명한다. 이로 인해 본 발명은 제공하는 칩과 방법의 원리는 다음과 같은데 즉 항 AFP 단클론항체와 LcA를 순서적으로 단백질 칩에다 고정시키고 순서에 따라 측정될 혈청, 비오틴 표시의 AFP 다클론항체와 아비딘 HRP를 가입하고 각각 'AFP항체- AFP-비오틴 표시의 AFP 다클론항체-아비딘 HRP복합물', 그리고 'LcA－AFP-L3-비오틴 표시의 AFP 항체-아비딘 HRP복합물'로 형성하고, 마지막으로 HRP화학 발광 기질액을 가입하여 부화하고 화학 발광 분석기로 스캔해서 발광 화소 수치를 획득하고 화소 수치를 표준곡선과 대응하는 직선회귀방정식에 대입하고 각각 AFP와 AFP-L3의 농도를 획득하고 푸코오스 메틸화 태아 단백질 AFP-L3이 AFP총량를 차지하는 백분율, 즉 푸코오스 지수를 획득한다.
실험 결과, 본 발명의 방법은 정성으로 검측할 수 있을 뿐만 아니라 발광 강도를 통해 AFP와 푸코오스 메틸화AFP를 정량으로 검측할 수도 있다. ELISA 방법에 비교하면 민감성과 특이성은 다 ELISA법보다 좋고 시간적으로 비교하면 ELISA검측은 적어도 3시간이 필요하지만 본 발명은 오직 1.5시간이 필요하며 항체의 용량 쪽으로 비교하면 본 발명의 키트에서의 단백질 칩으로 항체 샘플을 응용하면 5 ul의 항체는 적어도 20장 칩을 샘플 응용할 수 있고 200분 혈청을 검측할 수 있어서 항체가 필요되는 양은 ELISA 방법보다 많이 적다. 혈청의 용량 쪽으로 비교하면ELISA 방법으로 검측하면 50 ul혈청이 필요하지만 본 발명의 키트와 방법으로 한 부의 혈청 샘플을 검측하면 오직 2.5 ul ~ 10 ul의 원시적 혈청 용량이 필요하므로 본 발명이 제공하는 키트와 검측방법은 민감도가 높고 시간이 절약되고 경제적인 특성을 가지고 있어서 혈청단백질의 검측 원가와 시간을 많이 줄일 수 있다.
상술한 바를 종합하면, 본 발명의 방법은 화학 발광 검측 방법, 표준곡선과 단백질 칩 기술의 응용을 결합해서 키트로 정량으로AFP-L3을 검측하는 결과의 민감도와 정확도와 효율성을 높이고 원가를 낮추는 것을 확보한다. 본 발명은 한 가지의 실행이 가능하고 신뢰할만하고 경제적이면서도 간단하고 시간이 절약되는 방법을 제공한다. 본 발명의 기술방법은 혈청 중의 푸코오스 메틸화 태아 단백질을 대규모로 검측하는 데에 한 가지의 경제적이고 신뢰할 만한 키트와 검측방법을 제공할 것이다.
본 발명은 본 분야에서 혈청에서의 AFP와 AFP-L3을 정량으로 검측하는 기술의 필요와 결핍에 정량으로 생물 샘플 중에서의 태아 단백질과 푸코오스 메틸화 태아 단백질을 검측하는 한 가지의 키트와 검측방법을 제공하는데 이 방법은 혈청 중의 AFP 항원의 검측에 적용할 뿐만 아니라 다른 푸코오스 메틸화 단백질의 검측이 가능하고 시간이 절약되고 경제적이고 정확하고 편리한 장점을 가지고 있다.
도 1은 AFP/ LcA 단백질 칩의 샘플 응용 설명도이다.
도 2는 AFP/ LcA 항체 샌드위치법 단백질 칩의 계통도이다.
도 3은 AFP 단백질 칩으로 AFP 표준품을 검측하는 결과의 스캔도이다.
상기 단백질 칩의 샘플 응용 항체는 농도가 서로 다른 AFP 항체이고 A: 1mg/ml; B: 0.5mg/ml; C: 0. 25mg/ml, 검측물은 각각 1.80ng/ml，2.40ng/ml，3. 20ng/ml，4. 10ng/ml，5. 5ng/ml，6. 간암혈청，7. 간암혈청，8.black control，9.건강혈철，10.간암혈청이다.
도 4는 AFP 단백질 칩으로 AFP3을 검측하는 표준곡선도와 회귀방정a이다.
도 5는 AFP 단백질 칩으로 AFP 표준품과 혈청 샘플을 검측하는 스캔도이다.
상기 검측물 1-5는 각각 80ng/ml, 40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，6. 간암혈청，7. 간암혈청，8. 간암혈청，9. 간암혈청， 10. 간암혈청（칩 항체의 샘플 응용 항체는AFP 0.5mg/ml임）이다.
도 6은 AFP/ LcA로 칩을 샘플 응용하고 AFP-L3 표준품을 검측하는 결과의 스캔도이다. A: AFP 항체 0.5mg/ml; B: LcA 4mg/ml; 다른 농도의 혈청을 샘플 응용하는 혈청 농도의 AFP-L3： (1-5) 100ng/ml; 50ng/ml; 25ng/ml; 12.5ng/ml; 6.25ng/ml; (6-9) 100ng/ml; 50ng/ml; 25ng/ml; 12.5ng/ml. (10)black control
도 7은 AFP/ LcA가 칩을 샘플 응용하고 AFP-L3을 검측하는 표준곡선도와 회귀방정b이다.
도 8은 AFP/ LcA가 칩을 샘플 응용하고 간암과 정상의 혈청 샘플을 검측하는 스캔도이다.
아래는 구체적 실시방식을 결합하여 본 발명에 대해 더 상세히 설명하지만 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 특별한 설명이 없으면 아래 실시예에서 사용하는 조작은 다 일반적 방법이고 사용된 시제는 다 구매를 통해 획득할 수 있다.
주요 기계와 설비
화학발광 스캐너, 군사의학과학원에 의해 만들어진 것임.
주요 시제와 유래
쥐과의 단클론항체 AFP(션전페이봉 회사), LcA (Sigma회사), 알데히드기 칩(상하이백오 회사), 비오틴 표시의 면원항체, HRP 표시의 아비딘(미국abcam회사), HRP 화학발광기질액 A액과 B액을 1:1의 비율로 혼합하고 신선하게 배치한다.(미국Millipore회사)
실시예1. 단백질 칩의 제조와 사용과정
실험으로 사용되는 시제와 기계: 쥐과의 단클론항체 AFP(션전페이봉 회사), LcA (Sigma회사), 알데히드기 칩(상하이백오 회사), 비오틴 표시의 면원일차항제(미국abcam회사), 아비딘 HRP(미국abcam회사), 화학발광스캐너(군사의학과학원 왕승계 교수의 실험실에서 연구, 제조된 것임)
PBS 처방: 염화나트륨(NaCl) 8g, 염화칼륨(KCl) 0.2g, 인산수소이나트륨(Na2HPO4) 1.44g, 인산이수소칼륨(KH2PO4) 0.24g, pH 값을 7.4로 조절하고 양은1L로 정함.
PBST 처방：PBS, 1L＋Tween-20,1ml
칩은 알데히드기 칩(상하이백오 회사)이고 칩 매장마다 10개의 검측 격자(검측아구)를 포함하고 격자마다 혈청 한 부를 검측하고 한 번에는 혈청 10부를 검측한다.
매 검측격자 내에는 쥐과의 단클론항체 AFP(션제인페이봉 회사)와 LcA (Sigma회사)를 순서적으로 칩 위에 떨어뜨리고 샘플 응용 4번을 하고 농도 단클론항체 AFP 0.5mg/ml와 LcA 4mg/ml를 샘플 응용하고 두 줄에 8개의 검측반점을 만들며 10%의 소의 혈청 알부민(BSA)을 음성대조로 하고 똑같이 4번을 샘플응용하고 대조반점을 만든다.
단백질 칩의 조작 과정：
만들어놓은 단백질 칩으로 건강 대조군과 간암 실험군에서의 동태적인 혈청 샘플에서의 종양 표시물을 검측한다.
혈청 샘플 10ul, (혹2.5ul를 4배로 희석함)를 칩 위에 떨어뜨리고 37도에서 30분을 부화하고 항원이 항체와 결합하는 특성과 LcA가 푸코오스와 결합하는 특성을 이용해 혈청에서의 AFP와 칩에 대응하는 (쥐과의)항체의 특이성과 결합시켜 항원항체(쥐과) 복합물을 형성하며 LcA가 푸코오스와 결합하여 LcA항원 복합물을 형성한다.
PBST로 4번을 세척하고 비특이성의 결합을 제거하고 PBS로 희석하는 비오틴 표시의 면원일차항체를 가입하고 37도에서 30분을 부화한다. 면원항체가 항원과 결합하여 쥐과의 항체-AFP-토끼과의 비오틴 표시의 항체복합물과, LcA-푸코오스 메틸화 AFP-토끼과의 비오틴 표시의 항체 복합물을 형성한다.
PBST로 4번을 세척하고 비특이성결합을 제거한 후 PBS로 희석하는 아비딘 HRP를 가입하여 37도에서 30분을 부화한다. 비오틴이 아비딘과 결합하여 “쥐과의 항체-AFP-토끼과의 비오틴 표시항체-아비딘HRP복합물”과 “LcA-푸코오스 메틸화 AFP-토끼과의 비오틴 표시의 항제-아비딘 HRP복합물'을 형성한다.
PBST로 4번을 세척하고 비특이성의 결합을 제거하여 HRP 발광기질을 가입하여 37도에서 30분을 부화하며 화학발광스캐너로 스캔을 한다.
고상 운반체에서의 화학 발광 화소와 샘플에서의 검측받는 항원의 양과 순방향의 연관성이 있고 이때 복합물에서의 화소 수치를 측정하면 바로 측정될 항원의 함량을 확정할 수 있다. 칩의 샘플 응용 항체(쥐과의 일차 항체)와 검측용 항체(토끼과의 일차 항체)는 각각 다른 종속의 동물에서 온 것이다. 도 2에서 도시하는 샌드위치법의 단백질 칩의 계통도과 같다.
실시예2. 본 발명의 검측 방법의 건립
(1) 표준곡선과 회귀방정식a
구매하는 AFP 항원(미국abcam회사)을 사용해서 서로 다른 농도의 경도 (1-5)80ng/ml, 40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，6. 간암혈청，7. 간암혈청，8 black control，9. 건강혈청， 10. 간암혈청(도3, 칩 항체의 샘플 응용 항체는 AFP A: 1mg/ml; B: 0.5mg/ml; C: 0. 25mg/ml임)를 설치한다.
실시예1에서의 조작 과정과 단백질 칩을 이용해 AFP 표준품의 각 농도의 경도를 검측하고 검측,스캔 결과는 도 3을 참조한다. 검측 결과를 표준곡선도로 그리고 표준물 농도를 가로의 좌표로 하고 화소 수치를 세로의 좌표로 하며 모눈종이에서 표준곡선을 그려낸다. 샘플의 화소 수치에 따라 표준곡선에 의해 대응하는 농도를 사출하고 희석 배수를 곱하고 혹은 표준물의 농도와 OD 수치를 이용해 표준곡선의 직선회귀방정식을 계산하고 샘플의 OD 수치를 방정식에 대입하고 샘플의 농도를 계산한 후 희석 배수를 곱하면 바로 샘플의 실제적 농도이며 표준곡선과 회귀방정a는 도 4를 참조한다.
(2) 표준곡선과 회귀방정식b
미리 알고 있는 AFP-L3 농도의 혈청을 이용해 배수 비례로 희석하고 다른 농도의 경도를 (1-5)200ng/ml, 100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml，12.5ng/ml，（6-9）200ng/ml, 100ng/ml，50ng/ml，25ng/ml. 10black control(도 6)로 설치한다.
실시예1에서의 조작 과정과 단백질 칩을 이용해 혈청（AFP-L3）표준품의 각 농도경도를 검측하고 검측 결과는 도 6을 참조한다. 검측 결과를 표준곡선도로 그리고 표준물의 농도를 가로의 좌표로 하고 화소 수치를 세로의 좌표로 하며 모눈종이에서 표준 곡선을 그려낸다. 샘플의 화소 수치에 따라 표준곡선에 의해 상응하는 농도를 사출하고 희석 배수를 곱하며 혹은 표준물의 농도와 OD 수치로 표준곡선의 직선회귀방정식을 계산하고 샘플의 OD 수치를 방정식에 대입하고 샘플 농도를 계산하고 희석 배수를 곱하면 즉 샘플의 실제적 농도이며 표준곡선과 회귀방정b는 도 7을 참조한다.
실시예3. 샘플 검측으로 본 발명 방법의 안정성, 정확성과 신뢰성 검측
혈청 샘플:
간암혈청 39 부: 수도의과대학부속우안병원 샘플 창고에서 유래함.
정상하고 건강한 사람의 혈청 32 부,
Black control(Black control는1×PBS임) 9 부.
검측 과정은 실시예1과 같다.
샘플의 화소 수치를 도 4의 회귀방정식a에 대입하고 샘플 AFP의 농도를 계산하고 희석 배수를 곱하면 바로 샘플의 AFP 총농도이다. 샘플의 회소 수치를 도 7의 회귀방정식b에 대입하고 샘플 AFP-L3의 농도를 계산하고 희석 배수를 곱하면 바로 샘플의 AFP-L3 총농도이다.
칩 매장마다는 10개의 검측아구가 있고 건강 혈청 샘플, 간암 혈청 샘플, Black control를 포함하고 구체적으로 표1에서의 칩 번호와 검측아구 번호로 나눈다.
샘플 검측 결과와 스캔 결과는 도 8을 참조한다.
계산공식:AFP총농도X={（스캔 화소수치Y-39.05）/5.476}×희석배수
AFF-l3총농도X={(스캔 화소수치Y-24.65)/2.26}×희석 배수
AFP-L3 지수=AFP-L3/AFP
검측 결과는 표1에서 나타난 바와 같다.
표1 임상샘플의 검측 결과 집계표.
칩 번호 검측 아구 샘플 AFP화소 AFP-l3화소 AFP농도 AFP-L3농도 AFP-L3/AFP
N0.1 1 HCC 55 20 11.65084 ― ―
2 HCC 230 40 139.4814 27.16814 0.19478
3 HCC 80 30 29.91234 9.469027 0.316559
4 HCC 255 90 157.7429 115.6637 0.733242
5 HCC 255 100 157.7429 133.3628 0.845444
6 C 21 10 ― ― ―
7 N 17 10 ― ― ―
8 HCC 255 65 157.7429 71.41593 0.452736
9 N 20 18 ― ― ―
10 HCC 245 18 150.4383 ― ―
NO.2 1 HCC 90 12 37.21695 ― ―
2 HCC 255 56 157.7429 55.48673 0.351754
3 HCC 150 49 81.04456 43.09735 0.531773
4 HCC 255 140 157.7429 204.1593 1.294254
5 C 10 10 ― ― ―
6 HCC 160 50 88.34916 44.86726 0.50784
7 HCC 83 10 32.10373 ― ―
8 HCC 255 70 157.7429 80.26549 0.508837
9 N 30 14 ― ― ―
10 HCC 255 60 157.7429 62.56637 0.396635
N0.3 1 HCC 130 10 66.43535 ― ―
2 HCC 80 10 29.91234 ― ―
3 HCC 250 63 154.0906 67.87611 0.440495
4 HCC 25 10 ― ― ―
5 C 10 10 ― ― ―
6 HCC 160 10 88.34916 ― ―
7 HCC 255 34 157.7429 16.54867 0.104909
8 HCC 255 60 157.7429 62.56637 0.396635
9 HCC 70 10 22.60774 ― ―
10 HCC 50 10 7.998539 ― ―
NO.4 1 HCC 255 230 157.7429 363.4513 2.304074
2 HCC 64 20 18.22498 ― ―
3 N 20 20 ― ― ―
4 N 20 10 ― ― ―
5 C 10 10 ― ― ―
6 HCC 255 70 157.7429 80.26549 0.508837
7 HCC 90 40 37.21695 27.16814 0.729994
8 N 20 20 ― ― ―
9 HCC 255 70 157.7429 80.26549 0.508837
10 HCC 230 12 139.4814 ― ―
No.5 1 HCC 255 55 157.7429 53.71681 0.340534
2 HCC 255 197 157.7429 305.0442 1.933807
3 HCC 255 180 157.7429 274.9558 1.743063
4 N 40 20 0.693937 ― ―
5 C 10 10 ― ― ―
6 HCC 76 30 26.9905 9.469027 0.350828
7 N 20 13 ― ― ―
8 N 30 10 ― ― ―
9 N 20 20 ― ― ―
10 C 10 10 ― ― ―
No.6 1 HCC 255 30 157.7429 9.469027 0.060028
2 HCC 255 27 157.7429 4.159292 0.026368
3 HCC 255 27 157.7429 4.159292 0.026368
4 HCC 255 30 157.7429 9.469027 0.060028
5 HCC 255 20 157.7429 ― ―
6 C 10 10 ― ― ―
7 N 10 10 ― ― ―
8 N 10 10 ― ― ―
9 N 10 10 ― ― ―
10 N 10 10 ― ― ―
No.7 1 N 10 10 ― ― ―
2 N 10 10 ― ― ―
3 N 10 10 ― ― ―
4 N 10 10 ― ― ―
5 C 10 10 ― ― ―
6 N 10 10 ― ― ―
7 N 10 10 ― ― ―
8 N 10 10 ― ― ―
9 N 10 10 ― ― ―
10 N 10 10 ― ― ―
No.8 1 N 10 10 ― ― ―
2 N 10 10 ― ― ―
3 N 10 10 ― ― ―
4 N 10 10 ― ― ―
5 C 10 10 ― ― ―
6 N 10 10 ― ― ―
7 N 10 10 ― ― ―
8 N 10 10 ― ― ―
9 N 10 10 ― ― ―
10 N 10 10 ― ― ―
주：HCC: 간암 혈청；N:정상의 건강한 사람의 혈청 ;C:black control, ―：양성의 신호가 검출되지 않음
AFP≥20ng/ml AFP<20ng/ml AFP-L3 AFP-L3/AFP≥10% AFP-L3/AFP<10%
HCC (39) 35 2 26 22 4
건강혈청(32) 0 1 0 0 0
Black control(9) 0 0 0 0 0
현재의AFP검측 수준은20ng/ml를 분계선으로 하고 정상인은20ng/ml보다 낮다. AFP-L3(% )>10～15%는 양성 판단 지표다.본 칩의 검측 결과:
Black control 9부에는 AFP와 AFP-L3이 검출되지 않아서 본 실험에서 사용하는 칩은 무효라고 판단한다.
39부의 간암혈청에서 37부에서 AFP（94.87 %）가 검출되고 그 중에는 35부의 간암혈청 샘플에서 AFP의 함량은 20ng/ml（89.74 %）보다 높으며 26부의 간암혈청에서 AFP와 AFP-L3이 검출되고 2부의 샘플에서 AFP도 AFP-L3도 검출되지 않는다. AFP와 AFP-L3이 검출되는 26부의 간암혈청 샘플에서 22부의 AFP-L3/AFP의 비율은10%（84.61%）보다 크고 4부의 샘플에서의 AFP-L3/AFP 비율은 10% 보다 작다. 이는 본 발명의 칩과 밥법은 35/39＝89.74% 의 검출 민감성, 100%의 특이성과 신뢰할 만한 임상 응용가치를 가지고 있다고 증명한다.
이상의 데이터는 본 발명의 칩과 방법은 안정성, 정확성과 우수한 신뢰성을 가지고 있다고 말한다.
검측 중, 4부 샘플에서의 AFP-L3/AFP 비율은 1보다 큰데 이는 샘플의 AFP 농도가 지나치게 높고 169 ng/ml을 넘어간다는 것을 원인으로 한다. 이는 이 칩 화소 분석의 상한값 255를 넘는데 이 경우를 만나면 혈청을 검측할 때, 배가하게 고농도 AFP 혈청을 희석한 후 검측하는 방법으로 혈청의 실제적 AFP 농도를 획득한다.

Claims (11)

  1. 한 가지의 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩은 상기 단백질 칩의 기질 운반체에는 적어도 한 검측아구를 포함하고 상기 한 검측아구은 한 혈청 샘플을 검측하고,
    상기 검측아구에는 2개의 검측반점구역과 한 줄의 대조반점구역을 포함하고, 그 중 하나의 검측반점구역에는 태아단백질의 특이적 항체를 고정시키기 위해 형성하는 검측반점이 있고 다른 검측반점구역에는 LcA를 고정시키기 위해 형성하는 검측반점이 있으며 상기 대조반점구역에는 소의 혈청단백질을 고정시키기 위해 형성하는 대조반점이 있고,
    태아단백질의 특이적 항체의 농도는 0.5mg/ml이고, LcA의 농도는 4mg/ml이며, 같은 검측반점구역 내의 모든 검측반점에서의 물질의 농도가 같은 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학 발광 단백질 칩은 상기 한 검측 반점구역에는 적어도 두개의 상기 검측반점을 포함한다는 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학 발광 단백질 칩은 상기 태아 단백질의 특이적 항체는 항마우스 인간 태아 단백질 항체인 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학 발광 단백질 칩은 상기 기질 운반체 위에는 여러 개의 상기 검측아구가 설치되어 있고 상기 검측반점구역마다 한 줄로 배열되어 있는 4개의 검측반점을 포함하고 상기 대조반점구역은 한 줄로 배열되어 있는 4개의 대조반점을 포함하며 상기 검측반점과 대조반점은 평행으로 되어 있는 3줄로 배열된다는 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 화학 발광 단백질 칩은 상기 검측아구 사이에는 돌기가 설치되어 물리적 칸막이 역할을 하는 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 의한 화학 발광 단백질 칩을 포함하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 키트.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 화학 발광 키트는 태아단백질(AFP) 표준품, 비오틴 표시의 태아단백질(AFP) 다클론성항체, 아비딘 HRP와 HRP 화학 발광 기질액을 같이 포함하며, 상기 비오틴 표시의 AFP 다클론항체는 토끼에서 기원하는 항체이고 상기 검측반점에서 고정되어 있는 태아단백질(AFP)의 특이적 항체와 다른 물종에서 기원하는 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 키트.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 화학 발광 키트는 세척과 희석에 사용되는 상용의 시제 PBST와 PBS를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 키트.
  9. 삭제
  10. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법은
    (1) 단계 샘플검측
    측정할 혈청 샘플을 희석하고 상기 화학 발광 단백질 칩의 검측아구에 주입하고 반응시킨 후 PBST로 검측아구를 세척하고 비특이성결합물을 제거한다. PBS로 희석하는 비오틴 표시의 AFP 항체를 주입하고 반응시킨 후 PBST로 세척하고 비특이성결합물을 제거한다. PBS로 희석하는 아비딘 HRP를 주입하고 반응시킨 후 PBST로 세척하고 비특이성결합물을 제거한다. HRP 기질발광액을 주입하고 화학발광스캐너로 단백질 칩을 스캔하고 희석 후 측정할 샘플 중의 태아단백질의 발광 화소 수치와 푸코오스 메틸화 단백질의 발광 화소 수치를 획득한다;
    (2) 단계
    태아 단백질 표준곡선 방정식과 푸코오스 메틸화 단백질의 표준곡선방정식을 획득한다. 상기 태아 단백질 표준곡선 방정식의 가로의 좌표 x는 AFP 표준품의 경도 농도 수치이고 세로의 좌표 y는 경도 농도의 AFP 표준품을 계열 측정될 샘플로 하여 상기 단계(1)에서의 방법으로 획득한 태아 단백질의 계열 발광 화소 수치다. 상기 태아 단백질 표준곡선 방정식의 가로 좌표 x는 AFP-L3 표준품 중에서 AFP-L3의 경도 농도 수치이고 이의 세로 좌표 y는 경도 농도의 AFP-L3 표준품을 계열 측정될 샘플로 하고 상기 단계(1)에서의 방법으로 측정된 푸코오스 메틸화 단백질의 계열 발광 화소 수치이며 상기AFP-L3 표준품은 푸코오스 단백질(AFP)을 함유하는 혈청이다;
    (3) 단계
    상기 단계(1)에서의 측정될 혈청 샘플의 태아 단백질의 발광 화소 수치를 상기 태아 단백질 표준곡선 방정식으로 대입하고 희석 후 혈청에서의 태아 단백질 농도를 획득한 후 희석 배수를 곱하고 측정될 혈청 태아 단백질 농도를 획득한다. 상기 단계(1)에서의 측정될 혈청 샘플의 푸코오스 메틸화 단백질의 발광 화소 수치를 상기 푸코오스 메틸화 단백질 표준곡선 방정식에 대입하고 희석 후 혈청에서의 푸코오스 메틸화 단백질 농도를 획득한 후 희석 배수를 곱하고 측정될 혈청 푸코오스 메틸화 단백질의 농도를 획득한다. 측정될 푸코오스 메틸화 단백질의 농도는 상기 측정될 혈청 태아 단백질농도의 비율은 푸코오스 메틸화 지수다;
    를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 반응은 37도에서 30분을 부화하는 것을 특징으로 하는 혈청 당단백질 푸코오스 지수의 검측 방법.
KR1020187009587A 2014-08-05 2015-07-17 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법 KR101914673B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410381461.8 2014-08-05
CN201410381461 2014-08-05
CN201410772665.4A CN104678103A (zh) 2014-08-05 2014-12-12 检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片、试剂盒及检测方法
CN201410772665.4 2014-12-12
CN201510058591.2 2015-02-04
CN201510058591.2A CN104849468B (zh) 2014-08-05 2015-02-04 检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片、试剂盒及检测方法
PCT/CN2015/084356 WO2016019797A1 (zh) 2014-08-05 2015-07-17 检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片、试剂盒及检测方法

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177006041A Division KR20170040318A (ko) 2014-08-05 2015-07-17 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180039184A KR20180039184A (ko) 2018-04-17
KR101914673B1 true KR101914673B1 (ko) 2018-11-02

Family

ID=53313448

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177006041A KR20170040318A (ko) 2014-08-05 2015-07-17 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법
KR1020187009587A KR101914673B1 (ko) 2014-08-05 2015-07-17 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177006041A KR20170040318A (ko) 2014-08-05 2015-07-17 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20160223556A1 (ko)
JP (1) JP6082767B2 (ko)
KR (2) KR20170040318A (ko)
CN (2) CN104678103A (ko)
AU (1) AU2016101432A4 (ko)
CA (1) CA2882151C (ko)
GB (1) GB2548978B (ko)
SE (1) SE1750227A1 (ko)
WO (1) WO2016019797A1 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102166711A (zh) * 2010-02-26 2011-08-31 昆山巨仲电子有限公司 散热器的制作方法及其散热器
CN104678103A (zh) * 2014-08-05 2015-06-03 首都医科大学附属北京佑安医院 检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片、试剂盒及检测方法
CN105785043B (zh) * 2016-04-06 2018-02-02 上海良润生物医药科技有限公司 用于定量检测afp‑l3%的试剂盒
JP6935184B2 (ja) * 2016-05-31 2021-09-15 シスメックス株式会社 糖ペプチドと反応するモノクローナル抗体およびその用途
CN106198998A (zh) * 2016-06-30 2016-12-07 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 人甲胎蛋白异质体3化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
CN107727864A (zh) * 2016-07-01 2018-02-23 首都医科大学附属北京佑安医院 一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法
CN106248959B (zh) * 2016-07-21 2019-01-25 首都医科大学附属北京佑安医院 一种检测血清岩藻糖蛋白的免疫渗滤方法及免疫渗滤装置
CN107748261A (zh) * 2017-06-30 2018-03-02 首都医科大学附属北京佑安医院 一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法
CN107525937A (zh) * 2017-08-25 2017-12-29 苏州优函信息科技有限公司 基于上转换发光标记物、蛋白芯片及检测方法
CN108872594A (zh) * 2018-07-05 2018-11-23 潍坊市康华生物技术有限公司 一种甲胎蛋白检测试剂盒及其制备方法
CN111665235A (zh) * 2019-03-08 2020-09-15 上海索昕生物科技有限公司 一种化学发光微阵列芯片及其应用
CN116162538B (zh) * 2022-12-16 2024-01-26 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 一种同时检测蛋白和rna的微流控芯片及试剂盒

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070131552A1 (en) 2005-12-08 2007-06-14 Jung Moon Y Biomolecule detection device, mobile phone for biomolecule detection, and biomolecule detection method
JP2013061179A (ja) 2011-09-12 2013-04-04 Konica Minolta Holdings Inc 表面プラズモン励起増強蛍光分光法用センサチップおよびそれを用いた測定方法
CN103823058A (zh) 2014-02-27 2014-05-28 首都医科大学附属北京佑安医院 血清中抗原类蛋白的化学发光蛋白芯片方法和试剂盒

Family Cites Families (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0718875B2 (ja) * 1987-06-19 1995-03-06 ヤマサ醤油株式会社 血中または体液中の微量物質含有量の測定法
JPH07325083A (ja) * 1994-05-31 1995-12-12 Nakarai Tesuku Kk 糖タンパク質の特定糖鎖割合の測定方法
DE19806185C2 (de) * 1998-02-02 1999-11-18 Biogenes Gmbh Immunoassay und Testkit zur Bestimmung von fucosyliertem Protein in einer biologischen Probe
JP3833955B2 (ja) * 2002-03-27 2006-10-18 株式会社東芝 光導波路型プロテインチップおよびプロテイン検出装置
WO2003087821A2 (en) * 2002-04-05 2003-10-23 University Of Georgia Research Foundation Method for cleaving and deglycosylating antibodies to promote ligand binding
GB0212391D0 (en) * 2002-05-29 2002-07-10 Axis Shield Asa Assay
CN2613759Y (zh) * 2003-03-31 2004-04-28 穆海东 一种蛋白质芯片
GB2404734A (en) * 2003-08-05 2005-02-09 Secr Defence A method of screening a sample for abnormally glycosylated and/or expressed proteins
WO2005064333A1 (ja) * 2003-12-25 2005-07-14 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology タンパク質と糖鎖との相互作用を分析する方法
US20090042734A1 (en) * 2005-03-25 2009-02-12 Ngk Insulators, Ltd. Probe Array and Method for Producing Probe Array
JP2007132866A (ja) * 2005-11-11 2007-05-31 Toyota Central Res & Dev Lab Inc 反応アレイ
JP4711190B2 (ja) * 2006-07-28 2011-06-29 国立大学法人 東京大学 グリコシル化異常症の検査方法
JP5109001B2 (ja) * 2007-02-27 2012-12-26 株式会社Ｊ−オイルミルズ α１，６フコース糖鎖の検出および分別方法
CN101308141B (zh) * 2007-05-16 2012-08-29 陕西北美基因股份有限公司 一种分析糖蛋白的方法
CN101266251A (zh) * 2008-04-25 2008-09-17 南通大学附属医院 玻璃微柱亲和层析测定肝癌特异性afp的方法
CN101603966A (zh) * 2008-06-12 2009-12-16 上海裕隆生物科技有限公司 一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片及其试剂盒
EP2204651A1 (en) * 2009-01-06 2010-07-07 Shiming Lin Electrosensing antibody-probe detection and measurement sensor and method
JP2010236997A (ja) * 2009-03-31 2010-10-21 Panasonic Corp マイクロアレイ及びこれを用いた生体情報測定方法
US9796761B2 (en) * 2009-07-14 2017-10-24 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Glycan markers as measure of disease state of hepatic diseases
CN102043046B (zh) * 2009-10-13 2014-05-07 张志丽 一种检测糖链异常IgA肾病的蛋白芯片
US8481275B2 (en) * 2010-01-21 2013-07-09 J-Oil Mills, Inc. Method of detecting pancreatic cancer
CN102081100B (zh) * 2010-07-20 2015-06-24 李伯安 一种肝癌多标志物微阵列试剂盒、其制备方法及其应用
WO2013038914A1 (ja) * 2011-09-15 2013-03-21 コニカミノルタホールディングス株式会社 表面プラズモン共鳴及び表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いた特定のアナライトの定量測定方法
JP5726038B2 (ja) * 2011-09-30 2015-05-27 コニカミノルタ株式会社 表面プラズモン励起増強蛍光分光法を用いた前立腺特異抗原の定量方法
JP5991032B2 (ja) * 2012-06-07 2016-09-14 コニカミノルタ株式会社 レクチンを用いたアナライトの検出方法
CN103822878A (zh) * 2012-11-16 2014-05-28 上海市肿瘤研究所 凝集素功能化的纳米金及其制备方法和应用
CN103336126B (zh) * 2013-05-08 2015-12-02 西北大学 一种针对唾液样本的凝集素测试芯片及其处理方法
CN104678103A (zh) * 2014-08-05 2015-06-03 首都医科大学附属北京佑安医院 检测血清糖蛋白岩藻糖指数的化学发光蛋白芯片、试剂盒及检测方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070131552A1 (en) 2005-12-08 2007-06-14 Jung Moon Y Biomolecule detection device, mobile phone for biomolecule detection, and biomolecule detection method
JP2013061179A (ja) 2011-09-12 2013-04-04 Konica Minolta Holdings Inc 表面プラズモン励起増強蛍光分光法用センサチップおよびそれを用いた測定方法
CN103823058A (zh) 2014-02-27 2014-05-28 首都医科大学附属北京佑安医院 血清中抗原类蛋白的化学发光蛋白芯片方法和试剂盒

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Nanomaterials, vol. 2012, pp. 1-7 (2012.01.)

Also Published As

Publication number Publication date
US20160223556A1 (en) 2016-08-04
JP2016038375A (ja) 2016-03-22
CA2882151C (en) 2017-10-03
AU2016101432A4 (en) 2016-09-08
KR20180039184A (ko) 2018-04-17
GB2548978A (en) 2017-10-04
GB2548978B (en) 2019-08-21
GB2548978A8 (en) 2018-10-10
WO2016019797A1 (zh) 2016-02-11
SE1750227A1 (en) 2017-03-02
KR20170040318A (ko) 2017-04-12
CA2882151A1 (en) 2016-02-02
GB201703351D0 (en) 2017-04-19
CN104678103A (zh) 2015-06-03
CN104849468B (zh) 2018-02-13
CN104849468A (zh) 2015-08-19
JP6082767B2 (ja) 2017-02-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101914673B1 (ko) 혈청 당단백질 푸코오스 지수를 검측하는 화학 발광 단백질 칩, 키트 및 이의 검측방법
WO2017107974A1 (zh) 血清psmd4蛋白的检测试剂盒及其检测方法与应用
CN102116770B (zh) 一种免疫层析快速试剂盒及其生产制备
CN101603966A (zh) 一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片及其试剂盒
CN107727864A (zh) 一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法
TW201643429A (zh) 前列腺抗原標準品及其用途
CN106443018A (zh) 一种肌红蛋白单克隆抗体酶标记复合及其制备方法和检测试剂盒
Huang et al. Impact of freeze-thaw cycles on circulating inflammation marker measurements
CN103823058B (zh) 血清中抗原类蛋白的化学发光蛋白芯片方法和试剂盒
CN104569374B (zh) 一种快速定量检测c‑反应蛋白的均相荧光免疫试剂组及其制备方法
CN1987468B (zh) 血管内皮生长因子时间分辨荧光免疫分析方法及试剂盒
Wang et al. Application of ultrasensitive assay for SARS-CoV-2 antigen in nasopharynx in the management of COVID-19 patients with comorbidities during the peak of 2022 Shanghai epidemics in a tertiary hospital
CN107703315A (zh) 叶酸检测试剂盒及其制备方法
CN107942066A (zh) 白介素‑6检测试剂盒及其制备方法
CN108362892A (zh) 一种降钙素原胶体金免疫比浊法检测试剂
CN107748261A (zh) 一种检测血清中异常脱羧凝血酶原的蛋白芯片、试剂盒及其制备方法
CN111735950B (zh) Fgf18和ca125联合用作早期卵巢癌生物标志物以及试剂盒
Maeno et al. Development of a novel and rapid measurement system for growth differentiation factor-15, progranulin, and osteopontin in uterine sarcoma
CN201247246Y (zh) 一种男性多肿瘤标志物检测蛋白芯片及其试剂盒
Boerman et al. Time-resolved immunofluorometric assay for the ovarian carcinoma-associated antigenic determinant CA 125 in serum.
Wang et al. Improvement for identification of heterophile antibody interference and AFP hook effect in immunoassays with multiplex suspension bead array system
Wang et al. Establishment of growth stimulating gene 2 protein time-resolved fluorescence immunoassay and its application in sepsis
Mader et al. Comparison of an immunoradiometric and an immunoluminometric assay for the evaluation of the tumour associated antigens CA 19-9 and CA 125
Grari Precision Matters: Repeatability and Reproducibility of Total PSA and Homocysteine Measurements in Alinity i-System
Chen et al. Evaluation of different immunoassays for the quantitative detection of Epstein–Barr virus capsid antigen immunoglobulin A using a candidate reference

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
A302 Request for accelerated examination
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant