CN106198986A - 联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒及其制备、使用方法 - Google Patents

联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒及其制备、使用方法 Download PDF

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张美山
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Abstract

本发明公开了一种联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒及其制备、使用方法。该联合检测试剂盒主要有两个项目的检测组成，分别检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ；同时在此基础上，本发明也提供了一种仅适用于本试剂盒的可供参考的判断胃部疾病的检测用标志物联合标准值。本试剂盒在诊断胃病和早期胃癌筛查方面具有线性范围广，灵敏度高，特异性强，操作简便等优势，且对胃部疾病的诊断更加准确详细，避免了X‑射线对人体的侵害和胃镜的不便，具有较高的市场推广价值。

Description

联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒及其制备、使用方法
技术领域
本发明涉及免疫检测领域，具体涉及一种联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术
胃癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率和病死率在常见的恶性肿瘤中长居高位。中国是胃癌的高发区，在《2012年中国肿瘤登记年报》中指出胃癌发病率排名第二，仅次于肺癌，胃癌死亡率排名第三，仅次于肺癌和肝癌，据胃癌流行病学的研究，中国是世界范围内胃癌发病率最高的国家之一，我国每年胃癌的死亡人数居世界首位。目前胃癌和其他胃部疾病的诊断仍依靠胃镜、钡餐造影等检测手段来进行确诊。其中胃镜被称为是确诊胃癌的“金标准”，但胃镜检查有一定痛苦，受医生水平影响较大，一般人难以接受，而钡餐造影检查存在放射线照射损伤，对早期胃癌判定无力等问题，这两种检查都需要大型医疗设备和专职人员，耗时、费力、费用高、不适合用作普查手段。
临床研究发现，对始发阶段的小胃癌、微小胃癌进行早期治疗，10年存活率可达100％，而晚期胃癌患者术后5年生存率仅为20％。因此早发现、早诊断、早治疗是降低胃癌病死率的关键措施之一，但早期胃癌缺乏特异性表现，当出现明显消化道症状时，病情往往已处于中、晚期。因此建立一种非介入性、简便、快速、便于动态监测的检查方法，对筛选高危人群，降低胃癌风险具有重要意义。
胃蛋白酶原(pepsinogen，PG)是由胃部分泌的参与消化的胃蛋白酶的前体，是由375个氨基酸组成的单链多肽，平均分子量42kD，分为PGⅠ和PGⅡ两种亚型。胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)来源于胃底腺的主细胞和颈粘液细胞，胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)由胃底腺、贲门腺、幽门腺和Brμnner＇s腺分泌。正常情况下约1％的PG进入血循环，进入的量十分稳定，可以反应出胃总体分泌PG水平。血清PGⅠ与胃泌酸腺细胞功能相关，PGⅡ与胃底粘膜病变的相关性较大，PGⅠ/PGⅡ水平与胃癌和胃癌前期病变呈负相关。随着胃病的发展，血清中PGⅠ先升高再降低、PGⅡ升高后维持较高水平，这样PGⅠ、PGⅡ、PGⅠ/PGⅡ比值的异常会提示不同的胃病，所以PG是浅表性胃炎、糜烂性胃炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、萎缩性胃炎、胃癌等胃部疾病的初筛选指标和治疗的监控指标。而且在2014年发布的首部国内体检行业“准规范”——《健康体检基本项目专家共识》中更是将胃蛋白酶原的检测纳入了胃癌风险筛查检测项目当中。
目前市场上PGⅠ和PGⅡ的检测方法主要有乳胶增强免疫比浊法、时间分辨免疫荧光法、酶联免疫法及化学发光法。其中化学发光法兴起于20世纪80年代，是继酶联免疫技术和放免技术后发展起来的新兴技术，目前，这一技术已从实验室的稀有技术过渡到临床医学的常规检测手段。化学发光免疫分析既具有放射免疫的高灵敏度，又具有酶联免疫的操作简便、快速的特点，易于标准化操作。且测试中不使用有害的试剂，试剂保持期长，应用于生物学、医学研究和临床实验诊断工作，成为非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。目前市场上测定PGⅠ和PGⅡ的试剂盒仍然是以免疫比浊法和酶联免疫法为主。免疫比浊法和酶联免疫法存在操作繁琐、特异性差、敏感度低、时间长等缺点，而市面上其它的化学发光检测试剂其检测范围及临床应用相对狭窄，对PGⅠ有效检测范围仅在1～200ng/mL；因此寻找一种更有效的检测方式就成了临床应用的关键。
发明内容
本发明所要解决的第一个技术问题是：提供一种联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒，该联合检测试剂盒主要有两个项目的检测组成，分别检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ；可以检测出血清中的胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)和胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)的含量；
本发明所要解决的第二个技术问题是：提供一种联合诊断胃病的化学发光检测的方法；
本发明所要解决的第三个技术问题是：提供一种联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的应用。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒，该试剂盒包括PGⅠ包被微孔板、PGⅠ酶结合物、PGⅠ参考品及质控品、PGⅡ包被微孔板、PGⅡ酶结合物、PGⅡ参考品及质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A、发光底物液B。所述PGⅠ包被微孔板内包被有PGⅠ抗体；所述PGⅠ参考品及质控品为系列稀释后的PGⅠ抗原；所述PGⅠ酶结合物为酶标记的PGⅠ抗体；所述PGⅡ包被微孔板内包被有PGⅡ抗体；所述PGⅡ参考品及质控品为系列稀释后的PGⅡ抗原；所述PGⅡ酶结合物为酶标记的PGⅡ抗体；所述浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液；所述发光底物液A为含有鲁米诺的发光底物液，发光底物液B为含有过氧化氢的发光底物液。
本试剂是将双抗体夹心法免疫测定原理与酶标记技术和酶催化化学发光免疫分析相结合的检测产品，定量测定人血清中的PGⅠ或PGⅡ的含量。以一株抗PGⅠ或PGⅡ抗体包被微孔板，用辣根过氧化物酶标记另一株与之配对的抗体。检测时血清样本中的PGⅠ或PGⅡ与包被的和酶标记的两株抗体形成夹心抗原抗体复合物，再加入发光底物，用微孔板发光分析仪读取发光数值并计算其含量。
优选的，所述的PGⅠ抗体包被微孔板和PGⅡ抗体包被微孔板，更优选不透明聚苯乙烯48孔或96孔化学发光酶标板包被微孔板；
所述的PGⅠ抗体和PGⅡ抗体优选为鼠源的单克隆抗体，上述单克隆抗体的包被浓度为1～5μg/mL，其中优选5μg/mL作为包被浓度。
所述的PGⅠ酶结合物，为辣根过氧化物酶(HRP)标记的PGⅠ抗体，是与包被微孔板的PGⅠ抗体配对的另一株单克隆抗体，双抗体夹心法需要一对抗体，一株用于包被，另一株用于标记，是针对蛋白不同表位的抗体，使用时用稀释液稀释至浓度为1:1000～1:1500(体积比)，其中优选1:1500；
所述的PGⅡ酶结合物，为辣根过氧化物酶标记的PGⅡ抗体，是与包被微孔板的PGⅡ抗体配对的另一株单克隆抗体，使用时用稀释液稀释至浓度为1:1000～1:1500(体积比)，其中优选1:1000；
所述的PGⅠ参考品浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL；
所述的PGⅠ质控品浓度分别为10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
所述的PGⅡ参考品浓度分别为0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
所述的PGⅡ质控品浓度分别为3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL；
所述的参考品稀释液为：含有牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白、蔗糖及Proclin-300的pH＝8.5浓度0.05mol/L的Tris-Hcl缓冲溶液。
所述的浓缩洗涤液为：以体积百分比计，含有0.05％的Triton X-100、0.03％的Proclin-300、pH为7.4浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；
所述的发光底物液A为每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)0.05g、对位碘酚0.0075g，另外还有极少量盐酸(每1000ml底物液A加500μl盐酸)，用作调节溶液的pH值至pH＝9。
所述的发光底物液B为每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、Tris1.5g、过氧化氢0.25ml，另外还有极少量盐酸(每1000ml底物液B加500μl盐酸)，用作调节溶液的pH值至pH＝9。
本发明还提供了联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备PGⅠ包被微孔板；制备PGⅡ包被微孔板；
(2)配制PGⅠ参考品和质控品；配制PGⅡ参考品和质控品；
(3)配制PGⅠ酶结合物；配制PGⅡ酶结合物；
(4)配制浓缩洗涤液；
(5)配制发光底物液A和发光底物液B；
(6)酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B的分装。
所述的PGⅠ包被微孔板的制备方法为：采用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲溶液，将PGⅠ单克隆抗体稀释至浓度为5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3小时后放于2～8℃静置21小时，从而将PGⅠ单克隆抗体吸附于微孔板上。再用浓缩洗涤液进行洗涤、封闭液进行封闭和保护，最后通过干燥制得PGⅠ包被微孔板。
所述的PGⅡ包被微孔板的制备方法为：采用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲溶液，将PGⅡ单克隆抗体稀释至浓度为5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3小时后放于2～8℃静置21小时，从而将PGⅡ单克隆抗体吸附于微孔板上；再用浓缩洗涤液进行洗涤、封闭液进行封闭和保护，最后通过干燥制得PGⅡ包被微孔板。
所述的封闭液配制方法为：将10g牛血清白蛋白、20g海藻糖溶于1L包被缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
所述的PGⅠ参考品和质控品的配制方法为：使用参考品稀释液将PGⅠ标准品按一定的比例稀释成0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL的系列浓度，建立定量参考品。
所述的PGⅡ参考品和质控品的配制方法为：使用参考品稀释液将PGⅡ标准品按一定的比例稀释成0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL的系列浓度，建立定量参考品。
所述的参考品稀释液的配制方法为：1)基础缓冲溶液(Tris-Hcl)的配制：称取6.057g Tris溶于1L纯水中，用盐酸调节PH为8.5-9.0。2)称取10g牛血清白蛋白、20g酪蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
所述的PGⅠ酶结合物为HRP标记的PGⅠ单克隆抗体。
所述的PGⅠ酶结合物的配制方法为：将HRP标记的PGⅠ单克隆抗体与酶结合物稀释液以体积比1:1000～1500配制成工作溶液；优选比例为1:1500。
所述的PGⅡ酶结合物为HRP标记的PGⅡ单克隆抗体。
所述的PGⅡ酶结合物的配制方法为：将HRP标记的PGⅡ单克隆抗体与酶结合物稀释液以体积比1:1000～1500配制成工作溶液；优选比例为1:1000。
所述的酶结合物稀释液的配制方法为：1)基础缓冲溶液(Tris-Hcl)的配制：称取6.057g Tris溶于1L纯水中，用盐酸调节pH为8.5～9.0。2)称取20g牛血清白蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl缓冲液中，再加入体积分数10％的小牛血清和体积分数0.03％的Proclin-300，经过滤除菌后，加入0.3～1.0％的复合酶稳定剂AES。
本发明试剂盒中涉及的各试剂盒组分包括：PGⅠ参考品和质控品，PGⅡ参考品和质控品，PGⅠ酶结合物，PGⅡ酶结合物，化学发光溶液(发光底物液A和发光底物液B)，浓缩洗涤液及在试剂盒制备过程中使用到的各溶液配方，这些组分及配制方法均对检测结果有至关重要的影响。
按照上述方法制备的试剂盒能够达到很好的线性范围，PGⅠ标准曲线范围可以达到1ng/mL～350ng/mL；PGⅡ标准曲线范围可以达到1ng/mL～100ng/mL，以及很好的灵敏度，PGⅠ灵敏度为1ng/mL、PGⅡ灵敏度为1ng/mL。
本发明还提供了联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
(1)样品收集
取待测者血液，静置待测血清30分钟，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟，即可进行检测。
(2)加样检测步骤
PGⅠ测定：
a、将在冷藏环境中贮存的各试剂等在室温下平衡15分钟以上；
b、将浓缩洗涤液按1:40(体积比)的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
c、根据PGⅠ参考品、质控品及待测样品确定所需孔数；
d、直接取PGⅠ参考品、质控品及待测样品各50μL加入到各自的待测孔内；
e、取50μL PGⅠ酶结合物分别加入到各孔，振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置37℃水浴50～60分钟；
f、取出微孔板，用洗涤液洗板5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
g、根据使用量，将底物液A、B按1：1混匀，现用现配；每孔加入100μL，用振荡器振荡20秒钟，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果。
PGⅡ测定：
a、将在冷藏环境中贮存的各试剂等在室温下平衡15分钟以上；
b、将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
c、根据PGⅡ参考品、质控品及待测样品确定所需孔数；
d、直接取PGⅡ参考品、质控品及待测样品各50μL加入相应孔内；
e、取50μL PGⅡ酶结合物加入各孔，振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置37℃水浴50～60分钟；
f、取出微孔板，用洗涤液洗板5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
g、根据使用量，将发光底物液A、发光底物液B按1:1混匀，现用现配；每孔加入100μL，用振荡器振荡20秒钟，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果。
(3)检测结果
根据各标准溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线。最后根据标准曲线即可计算出样本中PGⅠ、PGⅡ的浓度。
(4)结果分析
在上述试剂盒的制备和使用的基础上，本发明也提供了一种仅适用于本试剂盒的可供参考的判断胃部疾病的检测用标志物联合标准值，具体内容如下：
1)各试剂盒的正常参考区间为：
a.正常人PGⅠ含量：60ng/mL～240ng/mL；
b.正常人PGⅡ含量：<15ng/mL；
c.PGⅠ与PGⅡ比值(PGⅠ/PGⅡ)的正常标准值为：>7.5。
2)PGⅠ与PGⅡ进行联合检测时的参考区间为：
a.PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≤7.5，正常；
b.PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≦7.5，则异常；
c.PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5，则正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，则异常；
d.PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；若PGⅠ/PGⅡ>7.5，则正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，则异常；
若结果提示异常，则建议定期复查PG或进一步进行胃镜检查。
本发明是一种可以联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒，包括检测胃蛋白酶原Ⅰ和胃蛋白酶原Ⅱ两个项目，可以检测出血清中的胃蛋白酶原Ⅰ(PGⅠ)和胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)的含量。
经采用上述方案进行制备后，本发明的有益技术效果是：
1)本发明是一种非介入性、简便、快速、便于动态监测的检查方法，避免了X-射线对人体的侵害和使用胃镜的不便，它具有无创、线性范围宽、特异性好等优点，本发明试剂盒能够对PGⅠ和PGⅡ进行快速、准确的检测，而且误差小、检测灵敏度高、对检测设备要求低；
2)由于本发明试剂盒体系中所采用的溶液配方和各组分的制备方法中大部分是为本发明独立制作，保障了检测的稳定性和准确性，使得本发明试剂盒的检测结果的准确程度优于目前市场上其它类型的PGⅠ和PGⅡ试剂盒；
3)在本发明试剂盒的临床应用方面，本试剂盒还提供了更为详细的可供参考的判断早期胃部疾病的检测用标志物联合标准值，拓宽了的应用范围，具有目前市场上其它PGⅠ和PGⅡ试剂盒不具备的应用。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一、联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒
一种联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒，该试剂盒包括PGⅠ包被微孔板、PGⅠ酶结合物、PGⅠ参考品及质控品、PGⅡ包被微孔板、PGⅡ酶结合物、PGⅡ参考品及质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A、发光底物液B。
其中，PGⅠ抗体包被微孔板和PGⅡ抗体包被微孔板，优选进口乳白色不透明聚苯乙烯48孔或96孔化学发光酶标板包被微孔板；PGⅠ包被微孔板内包被有PGⅠ抗体；PGⅠ参考品及质控品为系列稀释后的PGⅠ抗原；PGⅠ酶结合物为辣根过氧化物酶标记的PGⅠ抗体，是与包被微孔板的PGⅠ抗体配对的另一株单克隆抗体，双抗体夹心法需要一对抗体，一株用于包被，另一株用于标记，是针对蛋白不同表位的抗体，工作浓度为1:1500；
PGⅡ包被微孔板内包被有PGⅡ抗体；PGⅡ参考品及质控品为系列稀释后的PGⅡ抗原；PGⅡ酶结合物为辣根过氧化物酶标记的PGⅡ抗体，是与包被微孔板的PGⅡ抗体配对的另一株单克隆抗体，工作浓度为1:1000；
其中，PGⅠ抗体和PGⅡ抗体优选鼠源的单克隆抗体，上述单克隆抗体的包被浓度优选5μg/mL。
试剂盒内浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液；发光底物液A为含有鲁米诺的发光底物液，发光底物液B为含有过氧化氢的发光底物液。
试剂盒内包括的PGⅠ参考品浓度分别为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL；
PGⅠ质控品浓度分别为10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
PGⅡ参考品浓度分别为0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；
PGⅡ质控品浓度分别为3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL；
其中，参考品稀释液的配制方法为：
1)基础缓冲溶液(Tris-Hcl)的配制：称取6.057g Tris溶于1L纯水中，用盐酸调节PH为8.5。
2)称取10g BSA、20g酪蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
浓缩洗涤液配制方法为：含有体积分数分别为0.05％的Triton X-100、0.03％的Proclin-300的pH＝7.4浓度0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；
发光底物液A配制方法为：每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、三羟甲基氨基甲烷(Tris)1.5g、3-氨基邻苯二甲酰肼(鲁米诺)0.05g、对位碘酚0.0075g，另外还有极少量盐酸(每1000ml底物液A加500μl盐酸)，用作调节溶液的pH值至pH＝9。
发光底物液B配制方法为：每250ml溶液含有牛血清白蛋白2.5g、Tris1.5g、过氧化氢0.25ml，另外还有极少量盐酸(每1000ml底物液B加500μl盐酸)，用作调节溶液的pH值至pH＝9。
此外，本发明试剂盒还设置有固定包被微孔板的板架，防止潮湿的干燥剂，用于存放一次实验未用完微孔板的自封袋，以及用于实验时避光的封板膜。
实施例二、联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的制备方法
(1)制备PGⅠ包被微孔板；
(2)制备PGⅡ包被微孔板；
(3)配制PGⅠ参考品和质控品；
(4)配制PGⅡ参考品和质控品；
(5)配制PGⅠ酶结合物；
(6)配制PGⅡ酶结合物；
(7)配制浓缩洗涤液；
(8)配制发光底物液A和发光底物液B；
(9)酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B的分装。
其中，PGⅠ包被微孔板的制备方法为：
(1)配制包被缓冲液：包被缓冲溶液为PH＝9.6的碳酸盐缓冲液；配制方法如下：称取2.93g NaHCO3、1.59g Na2CO3溶于1L纯水中，调节PH值至9.6。
(2)包被：用包被缓冲液将PGⅠ单克隆抗体分别稀释至5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3小时后放于2～8℃静置21小时，从而将PGⅠ单克隆抗体吸附于微孔板上。
(3)洗涤：使用浓缩洗涤液进行洗涤，洗板两次。
(4)封闭：使用封闭液对微孔板进行封闭和保护，130μL/孔，4℃放置24小时，封闭液配制方法为：将10g BSA、20g海藻糖溶于1L包被缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
(5)干燥：甩出板孔中的封闭液，用吸水纸吸干，18～25℃干燥48小时；
(6)分别将上述干燥后的微孔板装入铝箔袋，封口，2～8℃保存备用。
所述PGⅡ包被微孔板的制备方法为：
(1)配制包被缓冲液：包被缓冲溶液为PH＝9.6的碳酸盐缓冲液；配制方法如下：称取2.93g NaHCO3、1.59g Na2CO3溶于1L纯水中，调节PH值至9.6。
(2)包被：用包被缓冲液将PGⅡ单克隆抗体分别稀释至5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3小时后放于2-8℃静置21小时，从而将PGⅡ单克隆抗体吸附于微孔板上。
(3)洗涤：使用浓缩洗涤液进行洗涤，洗板两次。
(4)封闭：使用封闭液对微孔板进行封闭和保护，130μL/孔，4℃放置24小时，封闭液配制方法为：将10g BSA、20g海藻糖溶于1L包被缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
(5)干燥：甩出板孔中的封闭液，用吸水纸吸干，18～25℃干燥48小时；分别将上述干燥后的微孔板装入铝箔袋，封口，2～8℃保存备用。
PGⅠ参考品和质控品的配制方法为：使用参考品稀释液将PGⅠ标准品按一定的比例稀释成0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL的系列浓度，建立定量参考品。
PGⅡ参考品和质控品的配制方法为：使用参考品稀释液将PGⅡ标准品按一定的比例稀释成0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL的系列浓度，建立定量参考品。
参考品稀释液的配制方法为：1)基础缓冲溶液(Tris-Hcl)的配制：称取6.057gTris溶于1L纯水中，用盐酸调节PH值为8.5。2)称取10g BSA、20g酪蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
PGⅠ酶结合物为HRP标记的PGⅠ单克隆抗体。
PGⅠ酶结合物的配制方法为：使用酶结合物稀释液将HRP标记的PGⅠ单克隆抗体溶液稀释配制为1:1500的工作浓度。
PGⅡ酶结合物为HRP标记的PGⅡ单克隆抗体。
PGⅡ酶结合物的配制方法为：使用酶结合物稀释液将HRP标记的PGⅡ单克隆抗体溶液稀释配制为1:1000的工作浓度。
酶结合物稀释液的配制方法为：1)基础缓冲溶液(Tris-Hcl)的配制：称取6.057gTris溶于1L纯水中，用盐酸调节PH值为8.5。2)称取20g BSA、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl缓冲液中，再加入100mL的小牛血清和0.3mL的Proclin-300，经过滤除菌后，加入5mL的酶稳定剂AES。
实施例三、联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的使用方法
(1)样品收集
静置待测血清30min，对所述待测血清进行离心处理10～20分钟，即可进行检测。
(2)检测方法
PGⅠ测定：
a、将在冷藏环境中贮存的各试剂等在室温下平衡15分钟以上；
b、将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
c、根据PGⅠ参考品、质控品及待测样品确定所需孔数；
d、直接取PGⅠ参考品、质控品及待测样品各50μL加入相应孔内；
e、取50μL PGⅠ酶结合物加入各孔，振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置37℃水浴50～60分钟；
f、取出微孔板，用洗涤液洗板5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
g、根据使用量，将底物液A、B按1：1混匀，现用现配；每孔加入100μL，用振荡器振荡20秒钟，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果。
PGⅡ测定：
a、将在冷藏环境中贮存的各试剂等在室温下平衡15分钟以上；
b、将浓缩洗涤液按1:40的比例稀释，摇匀备用，作为应用洗涤液；
c、根据PGⅡ参考品、质控品及待测样品确定所需孔数；
d、直接取PGⅡ参考品、质控品及待测样品各50μL加入相应孔内；
e、取50μL PGⅡ酶结合物加入各孔，振荡器振荡30秒钟，盖上封板膜，置37℃水浴50～60分钟；
f、取出微孔板，用洗涤液洗板5次，洗涤时每孔注满洗涤液，停留10秒后吸尽拍干；
g、根据使用量，将底物液A、B按1：1混匀，现用现配；每孔加入100μL底物液A、B混合液，用振荡器振荡20秒钟，设定每孔测量时间为1秒，于5分钟内测定结果
(3)检测结果
根据各标准溶液发光值，借助微孔板化学发光仪分析软件进行四参数Logistic拟合，坐标选择X-Y，得标准曲线；也可采用双对数Log(X)-Log(Y)线性分析方法，得标准曲线。最后根据标准曲线即可计算出样本中PGⅠ、PGⅡ的浓度。
(4)结果分析
在上述试剂盒的制备和使用的基础上，本发明也提供了一种仅适用于本试剂盒的可供参考的判断早期胃部疾病及胃癌风险的检测用标志物联合标准值，具体内容如下：
1)各试剂盒的正常参考区间为：
a、正常人PGⅠ含量：60ng/mL～240ng/mL；
b、正常人PGⅡ含量：<15ng/mL；
c、PGⅠ与PGⅡ比值的正常标准值为：>7.5。
2)PGⅠ与PGⅡ进行联合检测时的参考区间为：
a、PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≤7.5，正常；
b、PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5或≦7.5，则异常；
c、PGⅠ：60ng/mL～240ng/mL；PGⅡ≧15ng/mL；PGⅠ/PGⅡ>7.5，则正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，则异常；
d、PGⅠ<60ng/mL或>240ng/mL；PGⅡ<15ng/mL；若PGⅠ/PGⅡ>7.5，则正常；若PGⅠ/PGⅡ≦7.5，则异常；
若结果提示异常，则建议定期复查PG或进一步进行胃镜检查。
实施例四、联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的主要产品性能指标为：
(1)最低检测限(灵敏度)
10孔平行测定样本稀释液，计算测定结果的平均数(M)与标准差(SD)，得出M+2SD对应的发光值，代入剂量-反应曲线，计算出相应的浓度值，该浓度值即为本试剂盒的最低检测限。经验证，本试剂盒的最低检测限指标检测结果如下表：
表1试剂盒最低检测限的测定
测定的PGⅠ样本稀释液的平均发光值M＝1125.1，SD＝143.57，将(M+2SD)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：0.04ng/mL(<1ng/mL)，符合要求。
测定的PGⅡ样本稀释液的平均发光值M＝1158.60，SD＝157.64，将(M+2SD)的值带入此次反应曲线，得其灵敏度为：0.01ng/mL(<1ng/mL)，符合要求。
(2)剂量-反应曲线的线性
PGⅠ：复孔测定试剂盒的参考品(S0～S5，浓度依次为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL)，用四参数进行拟合，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900。经验证，r＝0.9997，符合要求。
PGⅡ：复孔测定试剂盒的参考品(S0～S5，浓度依次为0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL)，用四参数进行拟合，剂量-反应曲线线性相关系数(r)应不小于0.9900。经验证，r＝0.9998，符合要求。
(3)准确度
PGⅠ：浓度为10ng/mL和100ng/mL的参考品的测定值与靶值的相对偏差(Bias％)应不超过15.0％。
PGⅡ：浓度为3ng/mL和30ng/mL的参考品的测定值与靶值的相对偏差(Bias％)应不超过15.0％。
表2试剂盒准确度的测定
(4)精密度
a、分析内精密度
PGⅠ：浓度分别为10ng/mL和100ng/mL的参考品重复检测，其变异系数(CV)均应不高于15.0％。经验证，10ng/mL、CV＝2.01％；100ng/mL、CV＝2.26％，符合要求。
PGⅡ：浓度分别为3ng/mL和30ng/mL的参考品重复检测，其变异系数(CV)均应不高于15.0％。经验证，3ng/mL、CV＝3.47％；30ng/mL、CV＝3.99％，符合要求。
b、分析间精密度
PGⅠ：同一批号试剂盒，用浓度分别为10ng/mL和100ng/mL的参考品检测，3次独立分析，其变异系数(CV)均应不高于20.0％。经验证，10ng/mL、CV＝3.3％；100ng/mL、CV＝3.0％，符合要求。
PGⅡ：同一批号试剂盒，用浓度分别为3ng/mL和30ng/mL的参考品检测，3次独立分析，其变异系数(CV)均应不高于20.0％。经验证，3ng/mL、CV＝4.5％；30ng/mL、CV＝4.1％，符合要求。
c、批间精密度
PGⅠ：用3个批号的试剂盒分别检测浓度为10ng/mL和100ng/mL的参考品，各重复10次，则3个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)均应不高于20.0％。经验证，10ng/mL、CV＝4.5％；100ng/mL、CV＝3.1％，符合要求。
PGⅡ：3个批号的试剂盒分别检测浓度为3ng/mL和30ng/mL的参考品，各重复10次，则3个批号试剂盒之间的批间变异系数(CV)均应不高于20.0％。经验证，3ng/mL、CV＝4.8％；30ng/mL、CV＝4.4％，符合要求。
从上述中可以看出，本发明设计的联合诊断胃病或评价胃癌风险的化学发光检测试剂盒在灵敏度、准确度、精密度等各项质量参数均处于领先地位。
实施例五、联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的检测实例如下：
(1)PGⅠ：采用本发明试剂盒进行检测，总共检测样本240例。其中阳性样本约80例(均经胃镜检查，病理确诊)；阴性样本约160例(体检后经证实无消化道疾病，肝、肾疾病，无胃痛史人群)，其中包含干扰因素及交叉反应样本40例(高脂血样本、溶血样本、高胆红素样本、类风湿因子阳性样本各10例)。检测结果如下表：
表3 PGⅠ考核试剂与对比试剂检测结果比较
结论：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,200，P＞0.05，两种试剂差别无显著性，说明两试剂测定结果高度相关，具有等效性。
PGⅠ考核试剂与对比试剂阳性符合率为98.75％，阴性符合率为100％，总符合率为99.58％。通过相关性分析、卡方检验及配对t检验，说明考核试剂和临床诊断不存在显著性差异，具有很好的相关性。
(2)PGⅡ：采用本发明试剂盒进行检测，总共检测样本240例。其中阳性样本约80例(均经胃镜检查，病理确诊)；阴性样本约160例(体检后经证实无消化道疾病，肝、肾疾病，无胃痛史人群)，其中包含干扰因素及交叉反应样本40例(高脂血样本、溶血样本、高胆红素样本、类风湿因子阳性样本各10例)。检测结果如下表：
表4 PGⅡ考核试剂与对比试剂检测结果比较
结论：t值＜t0.05,500＝1.965＜t0.05,200，P＞0.05，两种试剂差别无显著性，说明两试剂测定结果高度相关，具有等效性。
PGⅡ考核试剂与对比试剂阳性符合率为97.5％，阴性符合率为100％，总符合率为98.75％。通过相关性分析、卡方检验及配对t检验，说明考核试剂和临床诊断不存在显著性差异，具有很好的相关性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括：PGⅠ包被微孔板、PGⅠ酶结合物、PGⅠ参考品及质控品、PGⅡ包被微孔板、PGⅡ酶结合物、PGⅡ参考品及质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A、发光底物液B；
所述PGⅠ包被微孔板内包被有PGⅠ抗体；所述PGⅠ参考品及质控品为稀释后的PGⅠ抗原；所述PGⅠ酶结合物为辣根过氧化物酶标记的PGⅠ抗体；所述PGⅡ包被微孔板内包被有PGⅡ抗体；所述PGⅡ参考品及质控品为稀释后的PGⅡ抗原；所述PGⅡ酶结合物为辣根过氧化物酶标记的PGⅡ抗体。
2.如权利要求1所述的联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含有以体积百分比计的0.05％的Triton X-100、0.03％的Proclin-300、pH为7.4、浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液；所述发光底物液A为含有以质量百分比计的1％牛血清白蛋白、0.6％三羟甲基氨基甲烷、0.003％对位碘酚、0.02％鲁米诺的发光底物液；发光底物液B为含有以质量百分比计的1％牛血清白蛋白、0.6％三羟甲基氨基甲烷以及以体积百分比计的0.1％的过氧化氢的发光底物液。
3.如权利要求2所述的联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述PGⅠ抗体和所述PGⅡ抗体为鼠源的单克隆抗体。
4.联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a.制备PGⅠ包被微孔板，制备PGⅡ包被微孔板：采用pH＝9.6的碳酸盐缓冲液作为包被缓冲溶液，将PGⅠ单克隆抗体稀释至浓度为5μg/mL作为包被液，按100μL/孔对微孔板进行包被，室温放置3小时后放于2～8℃静置21小时，从而将PGⅠ单克隆抗体吸附于微孔板上；再用浓缩洗涤液进行洗涤、封闭液进行封闭和保护，最后通过干燥制得PGⅠ包被微孔板；然后以此方法制备PGⅡ包被微孔板；
b.配制PGⅠ参考品和质控品,配制PGⅡ参考品和质控品：使用参考品稀释液将PGⅠ标准品按比例稀释成0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL、350ng/mL的浓度，建立定量参考品；使用参考品稀释液将PGⅡ标准品按比例稀 释成0ng/mL、1ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL的浓度，建立定量参考品；
c.配制PGⅠ酶结合物，配制PGⅡ酶结合物：将辣根过氧化物酶标记的PGⅠ或PGⅡ单克隆抗体分别与酶结合物稀释液以体积比1:1000～1500配制成工作溶液；
d.配制浓缩洗涤液；
e.配制发光底物液A和发光底物液B；
f.酶结合物、参考品、质控品、浓缩洗涤液、发光底物液A和发光底物液B的分装。
5.如权利要求4所述的联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述封闭液配制方法为：将10g牛血清白蛋白、20g海藻糖溶于1L包被缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
6.如权利要求4所述的联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的参考品稀释液的配制方法为：
(1)缓冲溶液三羟甲基氨基甲烷-盐酸的配制：称取6.057g三羟甲基氨基甲烷溶于1L纯水中，用盐酸调节pH为8.5～9.0；
(2)称取10g牛血清白蛋白、20g酪蛋白、100g蔗糖溶于1L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，再加入0.3mL的Proclin-300。
7.如权利要求4所述的联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的PGⅠ质控品浓度分别为10ng/mL、30ng/mL、100ng/mL；所述步骤b中的PGⅡ质控品浓度分别为3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL。
8.如权利要求4所述的联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于：所述步骤c中的酶结合物稀释液的配制方法为：
(1)缓冲溶液三羟甲基氨基甲烷-盐酸的配制：称取6.057g三羟甲基氨基甲烷溶于1L纯水中，用盐酸调节pH为8.5～9.0；
(2)称取20g牛血清白蛋白、100g蔗糖溶于1L的Tris-Hcl缓冲液中，再加入体积分数10％的小牛血清和体积分数0.03％的Proclin-300，经过滤除菌 后，加入0.3～1.0％的复合酶稳定剂AES。
9.联合诊断胃病的化学发光检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括以下步骤：
a.样品收集：收集待测血液，静置待测血清30分钟，离心处理10～20分钟；
b.PGⅠ测定及PGⅡ测定：分别取PGⅠ、PGⅡ参考品、质控品及待测样品各50μL加入到各自的待测孔内，然后分别加入50μL PGⅠ或PGⅡ酶结合物，振荡30秒钟，盖上封板膜，然后37℃水浴50～60分钟，用洗涤液洗涤5次，拍干；
c.检测结果：在拍干后的微孔板上每孔加入100μL发光底物液A和发光底物液B的混合液，测定；
d.结果分析：根据可供参考的检测用标志物联合标准值进行结果分析。
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