FR2779526A1 - Nouveau procede de dosage de la troponine i cardiaque - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de la troponine I cardiaque dans les milieux biologiques permettant de doser la troponine I plusieurs jours après le prélèvement biologique. Ce procédé met en oeuvre des couples d'anticorps monoclonaux reconnaissant la région épitopique entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 90, plus particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88, de la séquence de la troponine I cardiaque.
Description
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La présente invention concerne un nouveau procédé de dosage de la troponine I cardiaque dans les milieux biologiques permettant de doser la
troponine I plusieurs jours après le prélèvement biologique.
On sait que la troponine est un complexe protéique myofibrillaire, constitué de trois protéines, les troponines 1, T et C. Ce complexe protéique permet de 2+ contribuer à la régulation de la contraction du muscle par l'ion Ca2, en interagissant avec la myosine et l'actine. De façon plus précise, on sait que lorsqu'un influx nerveux arrive au niveau de la plaque motrice d'un muscle, il y a
génération d'un potentiel d'action qui est transmis au réticulum sarcoplasmique.
Le Ca2+ est alors libéré dans le cytosol et se fixe sur la troponine C, ce qui entraîne un renforcement de l'interaction entre la troponine I et la troponine C et, par suite, un changement de conformation du complexe troponine 1, T, C. Il y a alors libération des sites d'interaction actine - myosine, ce qui permet le
mouvement de contraction du muscle.
Lorsque le muscle est endommagé, de manière irréversible que ce soit le muscle cardiaque, lors d'une nécrose myocardique consécutive à un infarctus du myocarde, ou que ce soit le muscle squelettique lors d'efforts physiques prolongés, les troponines alors libérées apparaissent (plus ou moins rapidement)
dans la circulation sanguine.
Ainsi, on a récemment préconisé le dosage de la troponine pour le diagnostic précoce de l'infarctus du myocarde, que ce soit celui de la troponine T dans Circulation (1991,) 83, pp. 902-912, ou de la troponine I dans Am. Heart J.
(1987), 110, pp. 1333-1344, et Molecular lmmunology (1992), 29 (2), pp. 271-
278. De même, on a proposé le dosage de la troponine T cardiaque pour mesurer le succès de la thérapie thrombolytique suite à un infarctus du myocarde dans Br. Heart J., (1994), 71, pp. 242-248, ainsi que le dosage de la troponine I squelettique pour la mesure du dommage des muscles squelettiques (D. Rama et al, Clinical Chemistry (1996), 42 n 12 p. 2033). Il est à noter que le dosage des différentes troponines cardiaques et squelettiques est aujourd'hui un moyen très
utile pour le diagnostic de diverses pathologies humaines et animales.
On connaît déjà des méthodes immunoenzymatiques permettant la détermination de la troponine I cardiaque. Larue C. et al dans Mol. Immunol. (1992), 29(2), pp. 271-278 et C/lin. Chem. (1993), 39/6, pp. 972-979 décrivent un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich qui utilise pour la
révélation enzymatique le substrat chromogène tetraméthylbenzydine (TMB)-
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H202. Après la révélation, la lecture de l'absorbance est faite à 450 nm et la limite de détection, selon les auteurs, est de 0,2 pg/l. Une trousse de dosage mettant en oeuvre cette méthode est disponible dans le commerce (Sanofi Diagnostics Pasteur, Marnes-la Coquette, France). La limite de détection de cette trousse est de l'ordre de 0,03 à 0,04 pg/l (J. Mair et al. Clin. Chim. Acta. (1996), 245, pp. 19- 38). Un autre procédé immunoenzymatique de la troponine I est décrit par Bodor et al. Ce procédé permet de détecter cette dernière à des concentrations de l'ordre de 1,5 à 3,1 pg/1 (Bodor et ai, Clin. Chem. (1992), 38/11, p. 2203-2214; Adams J. et ai, Circulation (1993), 88(1), pp. 101-106). Ce dosage utilise pour la révélation enzymatique un substrat chromogène de la phosphatase
alcaline, le p-nitrophénylphosphate, et la mesure est effectuée à 405 nm.
La demande de brevet WO 96/22535 décrit également un procédé de dosage immunoenzymatique de type sandwich permettant le dosage quantitatif de la troponine I cardiaque. Ce procédé utilise pour la révélation enzymatique un substrat chimiluminescent, choisi parmi des dérivés d'une diacylhydrazine et un dérivé de 1,2-dioxetane et peut être réalisé soit par un
système manuel (kit de dosage de diagnostic), soit par un système automatisé.
Selon le mode de réalisation, il est possible d'effectuer soit un dosage en un
temps, soit un dosage en deux temps.
La demande de brevet WO 96/33415 décrit également des procédés d'immunodosage de type sandwich permettant d'évaluer les quantités de la troponine I et T ou de complexes de troponine I C et/ou T dans les milieux biologiques. Plus récemment, il a été démontré que la troponine I cardiaque, lorsque contenue dans des sérums des patients, subit une dégradation rapide. En effet, Katrukha A. et ai (" Stability of cardiac troponin I in human serum " IFCC, Basel 1997) ont observé que la troponine I cardiaque telle qu'elle est dans le sérum subit une dégradation d'environ de 81% lorsque conservée à 7 C pendant 10 jours. Il a maintenant été trouvé que pour les essais de type sandwich, en fonction des anticorps monoclonaux utilisés pour le dosage, il est possible de surmonter les problèmes de la dégradation de la troponine I cardiaque dans les
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milieux biologiques et de pouvoir doser cette dernière dans le plasma et le sérum
de malades avec précision même plusieurs jours après le prélèvement.
Le fait de pouvoir doser la troponine I cardiaque plusieurs jours après le prélèvement présente un intérêt évident pour le clinicien. Par exemple, si le tube n'est pas dosé immédiatement, il n'y a pas de doute quant à la conservation. Il en est de même lorsqu'un nouveau dosage de confirmation doit être effectué. Le même prélèvement peut être dosé plusieurs fois sans que des problèmes de
conservation se posent.
La présente invention concerne donc un procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich, mettant en oeuvre au moins deux anticorps monoclonaux reconnaissant la région épitopique comprise entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 90, plus particulièrement entre les acides aminés
27 à 30 et les acides aminés 87 à 88 de la séquence de la troponine I cardiaque.
Parmi de tels anticorps, on peut citer les anticorps 11E12 décrits par C. Larue et ai dans Molecular Immunology (1992), vol. 29 n 2 pp. 271-278. Cet anticorps reconnaît l'épitope de la troponine I situé entre les acides aminés 31 à 34 de la séquence de la troponine I. Cette séquence a été décrite par Vallins et ai dans FEBS Letters (1990), vol. 270 n 1. 2, pp. 57-61. D'autres anticorps monoclonaux, qui reconnaissent le même épitope, sont les anticorps 19G5,
17Fl 1et 14C3.
Lors des procédés de dosage, selon l'invention, on peut également mettre en oeuvre l'anticorps monoclonal 10F4, (décrit par G. Ferrieres et al. dans Clinical Chemistry (1998), vol. 44 n 3, pp.487-493) qui reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés 34 à 37 de la séquence de la troponine I cardiaque ou l'anticorps 19C7 (commercialisé par Hytest Turku, Finlande) qui reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés 41 à 47 ou encore les anticorps 16E2, 17F3, 16A11 (commercialisés par Hytest Turku, Finlande) et 8E10 (décrit par G. Ferrieres et al. dans Clinical Chemistry (1998), vol. 44 n 3, pp.487-493) qui reconnaissent l'épitope situé entre les acides aminés 88 à 94 de la séquence de la troponine I
cardiaque.
D'autres anticorps pouvant être utilisés sont l'anticorps 5F1, qui reconnaît l'épitope de la troponine I situé entre les acides aminés 91- 94 de sa séquence et
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les anticorps 13H7 et 20C5 qui identifient l'épitope situé entre les acides aminés
91 à 100.
Les différents résultats des essais effectués ont démontré que la troponine I cardiaque se décompose dans les milieux biologiques aussi bien à partir de son extrémité N-terminale qu'à partir de son extrémité C-terminale. Donc pour pouvoir doser la troponine I de manière exacte, il faut choisir des anticorps qui
reconnaissent des épitopes situés dans la partie de la troponine I la plus stable.
De tels anticorps sont ceux, comme indiqué précédemment, qui reconnaissent des épitopes situés entre les acides aminés 27 à 30 et 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94, plus particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88 de la séquence de
la troponine I cardiaque.
Les procédés de dosage selon l'invention sont des immunodosages de type sandwich, mettant en ceuvre au moins deux anticorps, tels que décrit précédemment, et peuvent être réalisés en un ou plusieurs temps (deux temps,
trois temps, e.t.c.).
La détection peut être effectuée de manière immunoenzymatique en mettant en oeuvre soit des substrats chromogènes comme la tetraméthylbenzydine ou le p-nitrophénylphosphate, soit des substrats chimiluminescents tels que les dérivés de 1,2-dioxétane ou les dérivés de diacylhydrazine. Comme enzymes, on peut utiliser toute enzyme appropriée comme par
exemple la phosphatase alcaline ou la peroxydase.
L'invention vise également des trousses d'immunodosage de la troponine I cardiaque mettant en oeuvre au moins deux anticorps monoclonaux reconnaissant la région épitopique de la troponine I cardiaque située entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94, plus particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88 de la séquence de la
troponine I cardiaque.
Les exemples suivants sont donnés à titre non limitatif pour illustrer l'invention.
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EXEMPLE 1
Dosage de la troponine I cardiaque en utilisant différents couples d'anticorps Le système automatisé utilisé pour le dosage immunoenzymatique est le système "Access immunoassay", système commercialisé par Beckman. Le dosage est effectué de la manière suivante: dans la cupule du dosage sont introduits 50!l de l'échantillon à doser, 25 gl d'une solution d'immunoglobulines de souris à 4 mg/ml, 10!l de tampon succinate et 50!l de billes de latex ferriques (Rhône Poulenc réf. MI-070/60) sur lesquelles est fixé, par des liaisons covalentes, le premier anticorps monoclonal anti-troponine I cardiaque utilisé pour
la mise en oeuvre du procédé.
Après incubation pendant 5 minutes à 37 C, sont introduits 50 pI d'un conjugué constitué du deuxième anticorps anti-troponine I cardiaque, utilisé pour
le dosage, et de la phosphatase alcaline (C = 5 glg/ml).
Le mélange est incubé pendant 5 minutes à 37 C, puis les billes de latex ferriques sont séparées à l'aide d'un champ magnétique. On procède au lavage à l'aide d'une solution tampon Tris pH 8, et on ajoute ensuite 200!1 de substrat
Lumi-Phos (R) 530.
La révélation est effectuée à 37 C et on mesure la luminescence générée
par la réaction avec un luminomètre.
Pour la gamme d'étalonnage, on utilise des solutions de la troponine I
cardiaque humaine.
Comme couples d'anticorps monoclonaux, on utilise les couples 1OB11/1OF4, 7F4/8E10 et 10F4/8E10. Pour le couple 1OB11/10/F4, I'anticorps F4 a été fixé sur les billes de latex ferriques. Pour le couple 10F4/8E10, c'est l'anticorps 8E10 qui a été fixé sur les billes de latex ferriques, et pour le couple
7F4/8E10, c'est l'anticorps 8E10 qui est fixé sur les microbilles.
L'anticorps 1OB11 fourni par Hytest reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés 14 à 22 de la séquence de la troponine I cardiaque et l'anticorps 7F4 fourni par la même société reconnaît l'épitope situé entre les acides aminés à 194. Les épitopes reconnus par les anticorps 8E10 et 10F4 ont été décrits
précédemment.
Lors de cet essai ont été testés 3 pools de sérums positifs S1, S2 et S3.
Par ailleurs, du sérum humain a été surchargé, soit avec de la troponine I cardiaque humaine, soit avec un complexe tertiaire des troponines ITC. La
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cardiaque humaine, soit avec un complexe tertiaire des troponines ITC. La troponine I cardiaque humaine et le complexe des troponines ITC ont été fournis par Hytest. Les deux échantillons ont été nommés respectivement S4 et S5. Les échantillons ont été dosés immédiatement (TO) et après conservation pendant 8 jours, soit à température ambiante, soit après conservation pendant 8 jours à 4 C. Les résultats de cette étude sont donnés dans le tableau I.
Tableau I
Couple AcM C 8 Jours TA* % C 8 Jours 4 C** %|
TO TO
Blanc sérum 10B11/10F4 98 101
7F4/8E10 95 102
F4/8E10 110 114
Si 1OB11/10F4 21 58
7F4/8E10 20 61
F4/8E10 53 110
S2 1 OB11/1 OF4 7 47
7F4/8E10 23 64
F4/8E10 38 88
S3 10B11/10F4 nd * nd'
7F4/8E10 56 85
F4/8E10 72 101
S4 10B11/10F4 87 97
7F4/8E10 97 92
F4/8E10 78 115
S5 1OB11/10F4 17 40
7F4/8E 10 22 24
F4/8E10 41 100
* C 8 iours TA %: (Concentration trouvée après 8 jours de conservation TO à température ambiante / Concentration trouvée à
TO) x 100.
C 8 iours 4 C %: (Concentration trouvée après 8 jours de conservation
TO à 4 C/Concentration trouvée à TO) x 100.
* Immunoréactivité trop basse non exploitable.
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Les données du tableau I démontrent que le couple 10F4/8E10 donne de
très bons résultats.
Une augmentation de l'immunoréactivité est observée au cours du temps sur l'échantillon S4, augmentation due probablement à la dissociation du
complexe des troponines ITC.
Le couple 10B/1110F4 donne de mauvais résultats, malgré des épitopes très proches, reconnus par les deux anticorps, ce qui démontre que ces deux épitopes se trouvent d'un côté et de l'autre du site, o le clivage de la troponine I
cardiaque est effectué, lors de sa dégradation ( côté N-terminal).
Des résultats insatisfaisants ont également été observés pour le couple 7F4/8E10. L'anticorps 7F4 reconnaît la partie C-terminale de la troponine I qui
doit se dégrader lors de la conservation des échantillons.
EXEMPLE 2
Etude de la dégradation de la troponine I L'essai décrit dans l'exemple 1 a été répété avec un certain nombre de couples d'anticorps monoclonaux dans le but d'affiner la localisation des sites de la troponine I cardiaque, auxquels le clivage a lieu, qui conduit à la dégradation de la troponine I cardiaque après un certain temps de conservation des échantillons biologiques la contenant. Les différents anticorps utilisés, ainsi que la position de l'épitope qu'ils reconnaissent sur la séquence de la troponine I sont
donnés dans le tableau Il.
La localisation de différents épitopes a été effectuée selon la technique
décrite par G. Ferrieres et al. dans Clinical Chemistry (1998), vol. 44 n 3. pp.487-
493.
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Tableau II
AcM| Position de l'épitope
B11 14-22
19011 20-23
402 26 - 32
14G5 26 - 32
11E12 31 - 34
19G5 31 - 34
17F11 31 - 34
1403 31 - 34
1 0F4 34 - 37
19C7 41-47
16E2 88 - 94
17F3 88 - 94
16A11 88 - 94
8E10O 88 - 94
F1 91 - 94
13H7 91 - 100
C5 91 - 100
8E1 157- 160
9E8 167 - 173
7F4 190 - 196
Les résultats obtenus avec les différents couples d'anticorps sont donnés
dans le tableau III.
Les résultats du tableau III démontrent que les couples d'anticorps présentant la meilleure stabilité sont les couples qui reconnaissent des épitopes situés entre les acides aminés 27à 30 et l'acide aminé 157 de la séquence de la troponine I cardiaque humaine. Grâce aux anticorps 4C2 et 14G5, il a été confirmé le clivage de la troponine I cardiaque en extrémité N-terminale. En
extrémité C-terminale, le clivage devrait avoir lieu après l'acide aminé 157.
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Tableau III
Couple Essai 1 Essai 2 AcM AcM
MP* PAL**
Clone Clone T24h TA/ T7J +4 0C/ T24h TA/ T7J + 40C/
TO*** TO TO*** TO..
17F3 19C7 1.05 1.34 1.08 2.09
16E2 19C7 0.97 1.31 1.11 2.18
4C2 19C7 0.77 0.45 1.01 0.81
F4 9E8 0.78 0.76 1.14 1.83
11E12 9E8 0.71 0.93 1.10 1.78
4C2 16E2 0.89 0.57 0.84 0.61
14G5 16E2 0.91 0.60 0.83 0.63
F4 16E2 1.03 0.90 0.87 0.86
11E12 16E2 1.05 1.14 0.89 1.17
F4 17F3 1.05 0.95 0.93 0.98
11E12 17F3 1.16 1.39 0.97 1.42
11E12 8E1 0.67 0.66 nd nd *AcM MP: anticorps lié aux microbilles de latex ferriques **AcM PAL: anticorps lié à la phosphatase alcaline *** Rapport de concentration (C) trouvé: C après conservation pendant 24 heures à
température ambiante / C à TO.
*** Rapport de concentration (C) trouvé: C après conservation pendant 7 jours à
4 C / C à TO.
nd: non déterminé
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Claims (7)
1. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich, mettant en oeuvre au moins deux anticorps monoclonaux qui reconnaissent la région épitopique comprise entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de
préférence entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 90 à 94.
2. Procédé de dosage selon la revendication 1, mettant en oeuvre au moins deux anticorps monoclonaux qui reconnaissent la région épitopique comprise
entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88.
3. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich, mettant en oeuvre au moins deux anticorps choisis parmi les anticorps 11E12, 19G5,
17F11, 14C3, 10F4,19C7, 16E2,17F3,16A11, 8E10, 5F1, 13H7et20C5.
4. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque de type sandwich selon
l'une quelconque des revendications 1 à 3 réalisé en un ou plusieurs temps.
5. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque selon l'une quelconque des
revendications 1 à 4, de type sandwich immunoenzymatique, mettant en oeuvre
des substrats chromogènes ou des substrats chimiluminescents.
6. Procédé de dosage de la troponine I cardiaque selon l'une quelconque des
revendications 1 à 5, de type sandwich immunoenzymatique, mettant en oeuvre
comme enzyme la phosphatase alcaline ou la peroxydase.
7. Trousse d'immunodosage de la troponine I cardiaque comportant au moins deux anticorps monoclonaux qui reconnaissent la région épitopique de la troponine I cardiaque située entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 157, de préférence entre les acides aminés 27 à 30 et l'acide aminé 90, plus
particulièrement entre les acides aminés 27 à 30 et les acides aminés 87 à 88.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9807214A FR2779526A1 (fr) | 1998-06-09 | 1998-06-09 | Nouveau procede de dosage de la troponine i cardiaque |
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|---|---|---|---|
| FR9807214A FR2779526A1 (fr) | 1998-06-09 | 1998-06-09 | Nouveau procede de dosage de la troponine i cardiaque |
Publications (1)
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| FR2779526A1 true FR2779526A1 (fr) | 1999-12-10 |
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ID=9527165
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| FR9807214A Pending FR2779526A1 (fr) | 1998-06-09 | 1998-06-09 | Nouveau procede de dosage de la troponine i cardiaque |
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| EP0752426A2 (fr) * | 1995-07-06 | 1997-01-08 | Bayer Ag | Calibrateurs synthétiques pour usage dans des essais immunologiques consistant d'antigènes entiers ou partiels conjugués aux molécules porteuses inertes |
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