JP2002221521A

JP2002221521A - 新規蛍光原

Info

Publication number: JP2002221521A
Application number: JP2001018501A
Authority: JP
Inventors: Magohei Yamada; 孫平山田; Takeo Honda; 建夫本田
Original assignee: International Reagents Corp
Current assignee: Sysmex International Reagents Co Ltd
Priority date: 2001-01-26
Filing date: 2001-01-26
Publication date: 2002-08-09

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明の課題は、新規蛍光原を提供すること、
及び検出感度の高い新規蛍光源を用いるＰＯＤ、過酸化
水素、抗原又は抗体の定量方法を提供することにある。【解決手段】一般式（Ｉ）で表される化合物が、ＰＯＤ
の存在下で過酸化水素と反応して二量体化することによ
って優れた蛍光物質となることを見出し、本発明を完成
した。（I）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、臨床検査等の分野
で利用される新規な蛍光原およびそれを用いたペルオキ
シダーゼ（以下「ＰＯＤ」という。）、類縁物質の定量
方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野では、抗原抗体反応を利
用した免疫学的測定法（例えば、酵素免疫測定法、放射
免疫測定法、ラテックス凝集反応試験法等）による生体
試料中の微量成分（例えば、タンパク質、ホルモン、酵
素、脂質、薬物等）や生体外の化合物等の測定法が広く
行われている。これらの免疫学的測定法の中でも、酵素
免疫測定法（以下「ＥＩＡ」と略す。）は、測定感度が
高くしかも放射性物質等による汚染の心配がなく取扱が
容易であるため、一般の検査室で広く利用されている測
定法である。

【０００３】ＥＩＡに於いては、西洋ワサビＰＯＤ、ラ
クトＰＯＤ、マイクロＰＯＤ等のＰＯＤが標識酵素とし
てよく使用され、その他にグルコースオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等
が用いられている。ＰＯＤの検出法として、ｏ−フェニ
レンジアミン等を基質として用いる比色法や、ＰＯＤの
存在下で過酸化水素と反応して蛍光物質を形成しする2-
メトキシフェノール（以下「２ＭＰ」という。）を蛍光
原として使用する方法（特開昭57-144998公報）が報告
されている。さらに高感度でのＰＯＤ定量が可能である
ｐ−ヒドロキシフェニル−プロピオン酸（以下、「ＨＰ
ＰＡ」という。）等を蛍光原として用いる蛍光法が一般
に良く用いられている。しかし臨床検査の分野では、使
用しやすく、さらに感度の高い蛍光原の開発が望まれて
いる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、使用
しやすく、さらに感度の高い新規な蛍光原を提供するこ
とである。また、本発明の課題は、該新規蛍光原を用い
たＰＯＤの定量を手段とした高感度免疫学的測定法を提
供することにある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成するために鋭意研究を行った結果、後記一般式
（Ｉ）で表される化合物が、ＰＯＤの存在下で過酸化水
素と反応して二量体化することによって蛍光物質となる
ことを見出し、本発明を完成するに至った。

【０００６】即ち、本発明は、以下の通りである。１．一般式（Ｉ）：

【化６】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される蛍光原。２．ペルオキシダーゼの存在下に、一般式（Ｉ）：

【化７】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とするペルオキシダーゼの定量方
法。３．ペルオキシダーゼの存在下に、一般式（Ｉ）：

【化８】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とする過酸化水素の定量方法。４．ペルオキシダーゼで標識した抗体を抗原と反応さ
せて、抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体に結合し
たペルオキシダーゼの存在下に、一般式（Ｉ）：

【化９】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とする抗原の定量方法。５．ペルオキシダーゼで標識した抗原を抗体と反応させ
て、抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体に結合した
ペルオキシダーゼの存在下に、一般式（Ｉ）：

【化１０】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とする抗体の定量方法。からな
る。６．前項２〜５のいずれか１に記載の定量方法に使用す
る試薬を含む試薬キット。

【０００７】

【発明の実施の形態】本明細書において、各置換基の定
義は次の通りである。Ｘにおける置換されていてもよい
アルキル基とは、水酸基、カルボキシル基、アルコキシ
ル基または４級アンモニウム塩で置換されていてもよい
アルキル基であり、水酸基、カルボキシル基が１〜３個
置換していてもよい炭素数１〜５個の直鎖又は分岐状ア
ルキル基を意味し、具体的にはメチル基、エチル基、プ
ロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、ｓｅｃ−ブ
チル基、ｔｅｒｔ−ブチル基、イソブチル基、１−カル
ボキシイソプロピル基、１，３−ジカルボキシイソプロ
ピル基、１−ジカルボキシイソプロピル基、３−カルボ
キシプロピル基、３，４−ジカルボキシ−ｓｅｃ−ブチ
ル基、１−メチル−２，４−ジカルボキシブチル基、
２，３−ジヒドロキシプロピル基、１，３−ジヒドロキ
シイソプロピル基等が挙げられる。好ましくはメチル
基、エチル基、１−カルボキシイソプロピル基、２，３
−ジヒドロキシプロピル基、１，３−ジヒドロキシイソ
プロピル基である。最適のＸは、-CH_3、-CH₂COOH、-CH
（CH₃）COOH、-O-CH₃、-N⁺(CH₃)₃ または-CH₂-CH₂-OHで
ある。特に好ましくは４-メトキシフェノール（以下
「４ＭＰ」という。）である。

【０００８】本発明の化合物は、公知であり、４ＭＰは
市販（キシダ化学）されている。ＣＡＳ−ＮＯ．１５０
−７６−５である。入手は、自体公知の合成法により容
易に可能である。本化合物の蛍光原としての特長は、水
に対する溶解性に優れ（３０〜４５g/L）、蛍光感度が
従前化合物と同等またはそれより高い値を維持すること
である。さらに本化合物は安定性も優れている。

【０００９】本発明の蛍光原による定量方法は、例えば
次のようにして実施される。本発明化合物（Ｉ）は、Ｐ
ＯＤの存在下で、過酸化水素と反応して二量体を形成す
る。該二量体は、ＰＯＤ、過酸化水素の量に対して１次
関数的に生成する。ここで、本発明化合物（Ｉ）は非蛍
光物質であるが、これを二量体化することによって波長
３００〜３４０ｎｍの光により励起され、波長３９０〜
４４０ｎｍの蛍光を発する蛍光物質となる。

【００１０】本発明化合物（Ｉ）と過酸化水素との反応
は、通常、ＰＯＤの存在下、ｐＨ４〜９の条件下で行わ
れる。即ち、各種既知量のＰＯＤの存在下に、前記のよ
うに過酸化水素と本発明化合物（Ｉ）とを反応させて、
本発明化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめる。該二量体
を検出する工程として、蛍光光度計を用いてその蛍光強
度より二量体量を測定する。各種ＰＯＤ量とその蛍光強
度より検量線を作成し、該検量線を用いて未知量のＰＯ
Ｄの定量を行うことができる。同様にして、過酸化水素
量とその蛍光強度より検量線を作成して、これを用いて
過酸化水素の定量を行うことができる。

【００１１】また、抗原の定量は次のようにして行うこ
とができる。先ず、自体既知の方法を用いて、ＰＯＤで
標識した抗体を抗原と反応させて抗原−抗体複合体を形
成させる。次いで、該複合体に結合したＰＯＤの存在下
に、上記のように本発明化合物（Ｉ）と過酸化水素とを
反応させて、本発明化合物（Ｉ）の二量体を生成せしめ
る。既知量の抗原を用い、前記と同様にして作成した検
量線を用いて、該二量体からの蛍光強度より、ＰＯＤを
定量、即ち抗原を定量することができる。ＰＯＤで標識
した抗原を用い、同様にして、抗体の定量を行うことが
できる。

【００１２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をさらに説明す
るが、本発明は実施例に限定されるものではない。

【００１３】

【実施例１】（水への溶解性の確認）蛍光原として用い
られる４ＭＰ（キシダ化学）、４-アセトアミドフェノ
ール（以下「ｐＡＰ」と略す。（シグマ））、ＨＰＰＡ
（同仁化学製）および２ＭＰについて、水に対する溶解
性を確認した。その結果、表１に示すように、本発明の
４ＭＰが極めて優れた水溶解性を有することを確認し
た。

【００１４】（表１） ─────────────────────────────── 蛍光原４ＭＰｐＡＰＨＰＰＡ２ＭＰ溶解度 (mg/mL) ４１１４１０１７ ───────────────────────────────

【００１５】

【実施例２】（ＰＯＤ濃度と蛍光強度）各蛍光原と蛍光
強度の関係について検討した。蛍光原として、４ＭＰ
（キシダ化学）、ｐＡＰ（シグマ）、ＨＰＰＡ（同仁化
学）、4-(N-methoxycarbonil-N-methylamino)phenol
（以下「ＭＣ−ＭＡＰ」と略す。（特開平9‐87241公
報、国際試薬））を使用した。各蛍光原溶液（最終300
μl混合時2〜30mM）と0.1M-KH₂PO₄-KOHの混合液（pH6.
8） 200μLと過酸化水素溶液として11.2mM過酸化水素/
0.1M-KH₂PO₄-KOH（pH6.8）100μLとを混合した。これ
に、0、1、2.5、5及び10mU/mL濃度のＰＯＤを20μL加
え、37℃10分間インキュベートし、その後、0．2％Na₂S
O₃を含む0.1Mグリシン緩衝液pH10.5で反応停止し、蛍光
光度計（島津：RF‐510）を用い、相対蛍光強度を各基
質の至適波長で測定した。

【００１６】各蛍光原の励起波長nmと蛍光波長nmは以下
のとおりである。（表２） ─────────────────────────────── ＨＰＰＡｐＡＰ４ＭＰＭＣ−ＭＡＰ励起波長（nm） 325 330 364 326 蛍光波長（nm） 410 420 440 420 ───────────────────────────────

【００１７】各蛍光原について、ＰＯＤ濃度と相対蛍光
強度の関係を図１に示した。この結果、本発の明化合物
は、ｐＡＰと同程度の蛍光強度が高く、ＰＯＤ検出感度
に優れていることが確認された。

【００１８】

【実施例３】過酸化水素量と蛍光強度及びＣＥＡ（がん
胎児性抗原）濃度と蛍光強度を特開平９‐８７２４１に
準じて検討したが、本発明化合物（４ＭＰ）は、いずれ
も蛍光強度が強く、各検出感度が高いことが確認され、
いずれもｐＡＰと同程度であった。

【００１９】

【発明の効果】以上のように、本発明化合物４ＭＰは、
水溶性に優れ、同時にＰＯＤ、過酸化水素、抗原又は抗
体の定量において、検出感度が高く、蛍光基質（蛍光
原）として有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】各蛍光原について、ＰＯＤ濃度と相対蛍光強度
の関係を示す。

【記号の説明】

ＨＰＰＡ：ｐ−ヒドロキシフェニル−プロピオン酸ＭＣ−ＭＡＰ：4-(N-メトキシカルボニル-N-メチルアミ
ノ)フェノールｐＡＰ：４-アセトアミドフェノール４ＭＰ：４-メトキシフェノール

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Ｉ）：【化１】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される蛍光原。
【請求項２】ペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）：【化２】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とするペルオキシダーゼの定量方
法。
【請求項３】ペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）：【化３】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とする過酸化水素の定量方法。
【請求項４】ペルオキシダーゼで標識した抗体を抗原
と反応させて、抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体
に結合したペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）：【化４】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とする抗原の定量方法。
【請求項５】ペルオキシダーゼで標識した抗原を抗体
と反応させて、抗原−抗体複合体を形成させ、該複合体
に結合したペルオキシダーゼの存在下に、一般式
（Ｉ）：【化５】（Ｉ）（式中、Ｘは置換されていてもよいアルキル基を示
す）で表される化合物Ｉと過酸化水素とを反応させて、
化合物Ｉの二量体を生成せしめ、該二量体を検出する工
程を有することを特徴とする抗体の定量方法。
【請求項６】請求項２〜５のいずれか１に記載の定量方
法に使用する試薬を含む試薬キット。