FR3109447A1

FR3109447A1 - Detection immunologique du sars-cov2 dans un echantillon salivaire

Info

Publication number: FR3109447A1
Application number: FR2004393A
Authority: FR
Inventors: Alain Rambach
Original assignee: Balel S A; BALEL SA
Current assignee: Balel S A; BALEL SA
Priority date: 2020-04-17
Filing date: 2020-05-04
Publication date: 2021-10-22
Also published as: FR3109446A1

Abstract

La présente invention fournit un test salivaire pour la détection d’immunoglobulines dirigés contre le SARS-CoV2 chez un sujet.

Description

DETECTION IMMUNOLOGIQUE DU SARS-COV2 DANS UN ECHANTILLON SALIVAIRE

En décembre 2019, un nouveau virus, le SARS-CoV-2, est apparu en Chine. Ce virus est responsable d’une nouvelle maladie infectieuse respiratoire aigüe, la COVID-19 (pour « coronavirus disease 19 »). Devant le développement rapide de la COVID-19, se traduisant notamment par une hausse rapide du nombre de cas et un nombre de pays touchés toujours plus important, l’Organisation mondiale pour la santé (OMS) a qualifié cette maladie de pandémie. De fait, à la mi-avril 2020, près de deux millions de malades ont été identifiés dans plus de 200 pays et territoires, pour plus de 120 000 décès recensés (cf. Center for Systems Science and Engineering, John Hopkins University).

Le SARS-CoV-2 est un nouveau virus de la famille des coronavirus. Il est plus particulièrement apparenté sur le plan phylogénétique au virus du SRAS (pour « syndrome respiratoire aigu sévère », « Severe Respiratory Acute Syndrome » ou « SARS » en anglais). Il entre dans les cellules, principalement les pneumocytes de type II, en se liant à l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2). Ce récepteur est exprimé sur les cellules épithéliales de type II situées dans les alvéoles pulmonaires, mais aussi dans l'œsophage, dans les entérocytes absorbants de l'iléon et du côlon et dans le pancréas.

La maladie se manifeste par un ensemble disparate de symptômes, dans toutes les gammes de sévérité. Ainsi, certaines personnes, bien qu’infectées, ne présentent aucun symptôme. Chez d’autres, les symptômes sont peu spécifiques et peuvent être aisément pris pour le signe d’un rhume ou d’une grippe. Ils comprennent notamment les maux de tête, les douleurs musculaires, la fatigue. La fièvre et les signes respiratoires arrivent secondairement, souvent deux ou trois jours après ces premiers symptômes. La plupart (environ 80 %) des personnes guérissent sans avoir besoin de traitement particulier. Toutefois, environ une personne sur six contractant la maladie présente des symptômes plus graves, qui associent fièvre, toux, douleurs thoraciques et gêne respiratoire. Un scanner thoracique montre presque toujours une pneumonie touchant les deux poumons. Dans environ 2 à 3 % des cas, l’infection se termine par le décès du patient. La durée de l'incubation est en moyenne de 5 jours, avec des extrêmes de 2 à 14 jours. Il s’écoule en moyenne environ une semaine entre l'apparition des premiers symptômes et l'admission à l'hôpital.

Il semble aujourd’hui bien établi que le SARS-CoV2 est un virus d’origine animale. La transmission interhumaine est depuis établie : on estime qu’en l’absence de mesures de contrôle et de prévention, chaque porteur infecte entre 2 et 3 personnes conduisant à un développement exponentiel de l’épidémie. Le virus est transmis par le biais de gouttelettes respiratoires expulsées par le nez ou par la bouche. Ainsi les personnes présentant des symptômes transmettent-elles le virus lorsqu’elles toussent ou éternuent. Cependant, ces personnes ne représentent qu’une petite partie de la population susceptible de diffuser le SARS-CoV2. Les personnes asymptomatiques peuvent elles aussi transmettre le virus. En outre, de nombreuses personnes atteintes de la COVID-19 ne présentent que des symptômes très faibles, ce qui rend difficile leur dépistage. Or ces personnes sont contagieuses. Il en résulte un problème majeur de santé publique, puisqu’une grande partie de la population contagieuse n’est pas détectable.

La détection rapide et précise du SARS-CoV-2 est donc cruciale pour contrôler l'épidémie dans les hôpitaux en particulier et dans la population en général. Les tests développés jusqu’ici reposent avant tout sur l’amplification de séquences spécifiques du virus par RT-PCR. Ils nécessitent toutefois un appareillage spécifique et ne permettent pas d’identifier des patients qui ont été préalablement infectés ou sont infectés de manière asymptomatique.

Il existe donc toujours un besoin pour un procédé de détection du SARS-CoV2 qui soit simple, aisé et robuste, et qui permette d’identifier à la fois les personnes actuellement infectées et les personnes qui ont préalablement été en contact avec le virus.

La présente invention répond à ce besoin.

La présente description a pour objet un procédé de détection d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 dans la salive. L’utilisation d’un prélèvement de salive est particulièrement avantageuse parce qu’il permet de s’affranchir des problèmes liés à d’autres fluides corporels, comme notamment le sang ou ses dérivés. En effet, la salive est obtenue facilement, avec un risque minimal pour le donneur et des coûts et des contraintes réglementaires réduits pour la collecte, le transport et l'analyse. En comparaison, la collecte d'échantillons sanguins est invasive et peut être stressante pour le donneur, ce qui pose notamment des problèmes pour la répétition des prélèvements qui seront fait en masse dans les populations et répétés plusieurs fois pour chaque personne. Elle nécessite en outre un équipement de collecte complet pour se conformer aux précautions en matière de biosécurité, tout en étant coûteuses à traiter.

En outre, le procédé de détection décrit ici présente l’avantage d’être un procédé immunologique. On entend par là qu’à la différence des tests de détection du SARS-CoV2 actuellement autorisés, lesquels sont fondés sur l’amplification de séquences génomiques virales et nécessitent pour ce faire un appareillage et des réactifs coûteux, le présent procédé repose sur la détection des immunoglobulines spécifiques reconnaissant spécifiquement le virus ou des portions de celui-ci. Le présent inventeur a ainsi montré que des anticorps contre le SARS-CoV2 peuvent être détectés dans la salive d’un sujet positif pour la COVID-19 par des tests de diagnostic rapide tels que les tests d’agglutination ou les tests immunochromatographiques. Ces anticorps peuvent même être mesurés par une méthode quantitative ou semi-quantitative du type ELISA. La mise en œuvre du présent procédé est donc beaucoup plus simple, plus rapide et moins coûteuse que les tests actuels.

Dans un premier mode de réalisation, la présente description fournit un procédé de détection d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 chez un sujet, ledit procédé comprenant des étapes de :

a) obtention d’un échantillon salivaire du sujet,

b) mise en contact de l’échantillon salivaire avec le SARS-CoV2 ou un ou plusieurs fragments de celui-ci, et

c) détection de la liaison à l’échantillon salivaire avec le SARS-CoV2 ou le ou les fragments de celui-ci.

La personne du métier comprendra immédiatement que la liaison de l’échantillon au SARS-CoV2 ou aux fragments de celui-ci indique la présence dans cet échantillon d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2.

Le « sujet » du procédé décrit ici est une personne, de préférence une personne susceptible d’avoir été infectée par le SARS-CoV2. Par « sujet », on entend ici aussi bien les personnes susceptibles d’avoir été infectées récemment que celles qui l’ont été à une date plus ancienne, par exemple plusieurs jours, voire plusieurs semaines, voire plusieurs mois auparavant. Par ailleurs, le sujet tel qu’on l’entend ici peut aussi bien être une personne asymptomatique qu’une personne présentant ou ayant présenté des symptômes de la COVID-19, quelle que soit la gravité de ceux-ci.

Par « immunoglobuline » ou « anticorps » on entend ici une glycoprotéine de type gamma-globuline circulant dans le sang ou les liquides biologiques tels que la salive et reconnaissant spécifiquement un antigène.

Par « immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 » on entend ici des immunoglobulines produites par un sujet et reconnaissant spécifiquement un ou plusieurs antigènes portés par le SARS-CoV2.

Un « antigène » tel qu’on l’entend ici est une molécule déterminée à laquelle un anticorps peut se lier sélectivement. L'antigène cible peut être un polypeptide, un glucide, un acide nucléique, un lipide, un haptène ou tout autre composé naturel ou synthétique. Par exemple, l’antigène peut être un virus, tel que le SARS-CoV2, ou un fragment de celui-ci. En particulier, l’antigène peut être un fragment de l’enveloppe du virus, notamment une des protéines de cette enveloppe qui est codée par le génome viral ; dans le cas du SARS CoV2, l’enveloppe virale comprend trois protéines, la protéine spike (S), elle-même clivée en trois sous-unité S1, S2 et S2’, la protéine de membrane (M), la protéine de la nucléocapside (N) et la protéine d’enveloppe (E). Plus particulièrement, l’antigène peut être le domaine extracellulaire d’une telle protéine.

Le terme « immunoglobuline » ou « anticorps » est utilisé ici dans le sens le plus large et couvre spécifiquement les anticorps polyclonaux de tout isotype tels que IgG, IgM, IgA, IgD et IgE, les anticorps monoclonaux, les anticorps multispécifiques, les anticorps artificiels et les anticorps chimériques et les fragments de liaison à l'antigène.

Un anticorps typique est composé de deux chaînes légères identiques et de deux chaînes lourdes identiques qui sont jointes par des liaisons disulfure. Le terme « chaîne légère » fait ici référence à une chaîne légère d'immunoglobuline de mammifère, lambda (λ) ou kappa (κ), ayant deux domaines successifs : un domaine constant et un domaine variable. Le terme « chaîne lourde » quant à lui se réfère à une chaîne d'immunoglobuline de mammifère désignée par α, δ, ε, γ ou μ. Chaque chaîne lourde possède deux régions, la région constante et la région variable. La région constante est identique dans tous les anticorps du même isotype. Les régions variables des chaînes lourdes et légères déterminent la spécificité de reconnaissance de l’antigène par l’anticorps.

Les immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 détectées dans le procédé décrit ici sont notamment des anticorps polyclonaux.

Un « anticorps polyclonal » est un anticorps qui a été produit parmi ou en présence d'un ou plusieurs autres anticorps non identiques. En général, les anticorps polyclonaux sont produits à partir d'un lymphocyte B en présence de plusieurs autres lymphocytes B produisant des anticorps non identiques. Ces différents anticorps peuvent tous reconnaître le même antigène, par exemple la même protéine du SARS-CoV2. Alternativement, ces différents anticorps peuvent reconnaître plusieurs antigènes différents, comme, par exemple, plusieurs protéines différentes du SARS-CoV2.

Les immunoglobulines font partie du système immunitaire adaptatif. Elles sont produites en réponse à la présence dans le corps du sujet d’un antigène, par exemple un antigène porté par le virus SARS-CoV2. La cinétique de production des immunoglobulines varie en fonction de l’isotype de l’immunoglobuline considérée. Par « isotype » ou « classe », on entend ici les différents types d’immunoglobulines en ce qu’elles se distinguent les unes des autres par le type de région constante possédée par la chaîne lourde de l’immunoglobuline. Il existe cinq grandes classes d’immunoglobulines : IgA, IgD, IgE, IgG et IgM. Les domaines constants de chaîne lourde qui correspondent aux différentes classes d'immunoglobulines sont appelés respectivement α, δ, ε, γ et μ. Les IgD, les IgG et les IgE n’existent que sous la forme de monomères. Les IgA existent à la fois sous forme de monomère et sous forme de dimère. Les IgM, quant à elles, se trouvent sous forme de pentamères.

Les IgA sous forme de dimère, aussi appelées IgA sécrétoires, se rencontrent surtout dans le mucus et les autres sécrétions comme, par exemple, la salive. Les IgA constituent la majeure partie des immunoglobulines présentes dans la salive. Cet anticorps joue un rôle de premier plan en empêchant les agents pathogènes de pénétrer dans l'organisme. Les IgM et les IgG circulent de façon prédominante dans le sang ; toutefois, on les trouve aussi, mais de façon mineure, dans les fluides corporels tels que la salive (Plomp et al., Front. Immunol. 9:2436, 2018).

Habituellement, lors de la première exposition à l’antigène, les premières immunoglobulines qui apparaissent dans le sang sont des IgM, suivie par des IgA et des IgG, ces dernières persistant après la disparition des premières (voir par exemple Guo et al. Clin Infect Dis. 2020 Mar 21 [Pub. Électronique anticipée]). Cependant, le comportement des immunoglobulines dans la salive est différent, avec notamment des IgA qui apparaissent dès les premiers jours suivant l’infection mais qui peuvent persister pendant plusieurs dizaines de jours (cf. par exemple Aase et al., Immunol muqueux. 9(4): 884-893, 2016). En revanche, le profil des IgG semble être similaire dans le sang et la salive (Hettegger et al. PLoSONE 14(6): e0218456, 2019).

Le procédé de l’invention présente donc l’avantage de pouvoir en particulier identifier les personnes infectées par le virus SARS-CoV2 à un stade précoce de l’infection. Il ne nécessite pas pour cela d’équipement lourd et peut être mis en œuvre à un coût réduit. Ainsi, des anticorps contre le SARS-CoV2 peuvent être mis en évidence dans la salive d’un sujet infecté par des tests simples comme un test d’agglutination, un test immunochromatographique ou encore un test ELISA. En outre, le procédé décrit ici permet d’identifier les personnes qui ont été préalablement en contact avec le virus, y compris les cas asymptomatiques. Ces personnes présentent un risque réduit, voire plus de risque du tout, d’être de nouveau infectées par le virus.

Le procédé décrit ici porte donc plus particulièrement sur la détection d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 dans la salive. Dans un premier mode de réalisation, lesdites immunoglobulines comprennent des IgA, des IgM ou des IgG. Selon un autre mode de réalisation, ces immunoglobulines sont uniquement des IgA, des IgM ou des IgG. De façon préférée, les immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 détectée par le procédé décrit ici comprennent des IgA et des IgM. Selon un autre mode de réalisation préféré, ces immunoglobulines comprennent des IgA et des IgG. Selon un autre mode de réalisation préféré, ces immunoglobulines comprennent des IgM et des IgG. Selon encore un autre mode de réalisation préféré, ces immunoglobulines comprennent des IgA, des IgM et des IgG.

La détection des IgA et/ou des IgG et/ou des IgM présentes dans la salive permet ainsi de déterminer si le sujet est infecté par le SARS-CoV2 sans avoir besoin d’amplifier le génome viral et sans prélèvement sanguin. Elle permet aussi de dire si le sujet a préalablement été en contact avec le virus.

Par « SARS-CoV2 », on entend ici le coronavirus apparu à Wuhan en 2019 et responsable de la COVID-19. Le génome du SARS-CoV2 a été intégralement séquencé (Zhu et al., N. Engl. J. Med. 382 : 727–733, 2020). Sa séquence est disponible sous la référence Genbank : MN908947. Le génome viral code notamment trois protéines virales ancrées dans l'enveloppe virale : la protéine spike (S), la protéine de membrane (M) et la protéine d’enveloppe (E), et une nucléocapside (N). Les séquences de ces protéines sont accessibles sous les références Uniprot : P59594, P59596, P59637 et P59595, respectivement.

Selon un mode de réalisation préférentiel, le procédé décrit ici permet de détecter des immunoglobulines présentes dans la salive et reconnaissant spécifiquement la protéine S, la protéine M, la protéine E ou la protéine N du SARS-CoV2.

La protéine S est clivée en trois deux sous-unités, S1, S2 et S2’. Dans un mode de réalisation plus préféré, les immunoglobulines détectées dans la salive reconnaissent la sous-unité S1 et/ou la sous-unité S2 et/ou la sous-unité S2’, la protéine M, la protéine E ou la protéine N du SARS-CoV2.

S2 apparaît comme étant la plus conservée parmi les coronavirus des produits du clivage de S, tandis que S1 semble plus spécifique du SARS-CoV2 (Obka et al., Emerging Infectious Diseases 26(7), 2020 Jul, https://doi.org/10.3201/eid2607.200841). Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, les immunoglobulines détectées dans la salive reconnaissent la sous-unité S1.

L’échantillon de salive peut être obtenu de toute manière convenable à l’utilisation envisagée et connue de la personne du métier (voir par exemple, Miočević et al., Front Public Health 5 : 133, 2017). Dans tous les cas, l’échantillon de salive est obtenu par un prélèvement non-invasif, au contraire du prélèvement des échantillons de sang. Les méthodes courantes de collecte de salive comprennent entre autres la collecte de la salive totale non stimulée, l'utilisation de tampons et tampons en coton ou absorbants, ou des dispositifs d'aspiration pour l'extraction de l'échantillon directement des glandes salivaires.

Il existe de nombreuses méthodes permettant de détecter la liaison entre un anticorps et sa cible, ici le SARS-Cov2 ou un ou plusieurs fragments de celui-ci. Ces méthodes sont bien connues de la personne du métier. Elles comprennent notamment les méthodes immuno-enzymatiques, les tests de détection rapide, mais aussi l’immunodot, le RIA (Radio Immunosorbent Assay), la cytométrie de flux, l’immunoprécipitation, l’immunohistologie, le western blot, le dot blot, les puces à protéines, les puces à anticorps, ou les puces à tissu couplées à l’immunohistochimie.

Selon un mode de réalisation préféré, le ou les antigènes sont immobilisés sur un support solide. Tel qu'utilisé ici, « support solide » se réfère à toute surface solide sur laquelle des antigènes, y compris le SARS-CoV2 ou un ou des fragments de celui-ci, peuvent être déposés et immobilisés pour réaliser des dosages et des réactions. Il pourra notamment être avantageux pour ce faire d’utiliser des antigènes exprimés par le biais de constructions recombinantes dans des systèmes d’expression appropriés, par exemple dans la bactérie E.coli, dans les levures Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris ou dans des cellules d’insectes ou de mammifères. Le terme « immobilisé » signifie qu'un antigène, y compris le SARS-CoV2 ou un fragment de celui-ci, est lié de manière covalente ou non covalente à un support solide. Dans cet état, l’antigène, y compris le SARS-CoV2 ou un fragment de celui-ci, est relativement stationnaire et non libéré pendant les étapes d'incubation et / ou de lavage effectuées avec le support solide. Le support solide sur lequel est immobilisé l’antigène est par exemple une bille, une plaque, une lame ou encore une membrane de nitrocellulose.

De façon préférée, la liaison entre les immunoglobulines présentes dans l’échantillon et le SARS-Cov2 ou des fragments de celui-ci sont des méthodes immuno-enzymatiques ou des tests de détection rapide. Il a ainsi été montré, notamment par des tests aussi simples que des tests d’agglutination, des tests immunochromatographiques ou encore des tests ELISA, que la salive d’un sujet ayant souffert de la COVID-19 comprend des anticorps contre des antigènes spécifiques du SARS-CoV2 comme, par exemple, la protéine S1.

Les méthodes immuno-enzymatiques (également appelées EIA pour Enzyme ImmunoAssay) utilisent les anticorps pour détecter la présence d'antigènes ou l'inverse en fonction du test réalisé. Elles incluent entre autres, les techniques ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique), ELISPOT (enzyme-linked immunospot), etc. Plus préférablement, la personne du métier utilisera une technique ELISA comme par exemple l’ELISA indirect, l’ELISA en sandwich, l’ELISA par compétition ou encore l’immuno-dot (tests ELISA multiples, dirigés contre divers antigènes, réunis sur une bandelette) ou la technique CLIA (chemiluminescent assay). Ces techniques utilisent un anticorps secondaire spécifique des immunoglobulines cibles qui est couplé à un système de révélation permettant la détection. Cet anticorps de révélation peut par exemple être conjugué avec une enzyme dont l’activité permet de visualiser et de quantifier la liaison entre l’antigène et l’anticorps, ou à un autre système de révélation, y compris notamment l’or, la biotine ou la streptavidine. Il a notamment été montré par ELISA que la salive d’un sujet ayant souffert de la COVID-19 comprend des anticorps contre des antigènes spécifiques du SARS-CoV2 comme, par exemple, la protéine S1. Ces techniques sont couramment utilisées dans les laboratoires depuis de très nombreuses années. Des réactifs commerciaux sont disponibles chez de très nombreux fournisseurs. Elles n’ont donc pas besoin d’être décrites ici en détail.

Les tests de diagnostic rapide (TDR) sont un ensemble de techniques permettant de détecter en quelques minutes la présence d’immunoglobulines dirigées contre un antigène, comme par exemple le SARS-CoV2 ou un ou plusieurs fragments de celui-ci, le plus souvent grâce à des réactions chimiques par immunoprécipitation sur membranes ou immuno-chromatographie sur bandelettes (Lateral Flow Test). Ces tests ont l’avantage d’être simple à réaliser, ne nécessitant aucun matériel particulier ni connaissance approfondie en biologie. Dans l’ensemble, ils ont une bonne sensibilité (aux environs de 90%) et une bonne spécificité (aux environs de 100%) et permettent d’obtenir un résultat qualitatif, voire semi-quantitatif en quelques minutes. Les TDRs comprennent notamment les tests d’agglutination, les tests d'immunodiffusion, y compris l’immunodiffusion simple (technique de Oudin) et l'immunodiffusion double (Technique d'Ouchterlony), et les tests immunochromatographiques (« Lateral Flow Test » en anglais), parfois appelés test de flux latéral ou essais immunochromatographiques à flux latéral. Ces derniers consistent à mettre en contact un échantillon salivaire avec un antigène immobilisé sur une membrane de nitrocellulose ; le complexe antigène-anticorps migre par capillarité et est arrêté par des anticorps de capture immobilisés sur la membrane, ce qui peut être visualisé par une réaction colorimétrique. Un tel test immunochromatographique permet de mettre en évidence des anticorps anti-CoV2 dans la salive d’un sujet positif pour la COVID-19, comme l’a montré le présent inventeur. Les tests TDRs sont bien connus de la personne du métier, car ils sont utilisés depuis plusieurs dizaines d’années dans le cadre du diagnostic de plusieurs maladies, notamment des maladies tropicales ou le SIDA.

Dans le cadre du procédé décrit ici, les méthodes préférées de détection de liaison entre les immunoglobulines présentes dans l’échantillon salivaire et l’antigène sont celles qui permettent de déterminer en outre l’isotype des immunoglobulines. A cet égard, on mentionnera en particulier, les techniques d’ELISA et les tests immunochromatographiques qui permettent de pouvoir distinguer entre IgA, IgM et IgG. Ces deux techniques utilisent des anticorps secondaires, lesquels peuvent être spécifiques d’un isotype particulier. Les techniques immunochromatographiques sont même particulièrement avantageuses, parce qu’elles permettent de détecter en un seul test la présence de plusieurs classes d’immunoglobulines, dans le même échantillon de salive. En effet, il suffit d’immobiliser des anticorps de capture spécifique des différents isotypes à différents endroits de la membrane de nitrocellulose. Il est ainsi possible de déterminer si le sujet dont provient l’échantillon est infecté par le SARS-CoV2 ou a été préalablement infecté par le virus. Dans le premier cas, les immunoglobulines détectées sont des IgA ou des IgM tandis que la détection d’IgG indique une mise en contact antérieure du sujet avec le virus, comme expliqué plus haut.

Le procédé de détection décrit plus haut peut ainsi être aussi utilisé dans une méthode de diagnostic d’une infection au SARS-CoV2 chez un sujet. Une telle méthode comprend des étapes de :

a) détection d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 chez le sujet selon le procédé décrit plus haut, et

b) détermination du diagnostic d’une infection au SARS-CoV2 chez le sujet au vu des résultats de l’étape de détection.

De façon préférée, l’étape de détection comprend la détermination de l’isotype des immunoglobulines. La détection d’immunoglobulines de type IgA ou IgM indique que le sujet est infecté par le SARS-CoV2.

Le diagnostic peut optionnellement être confirmé par une réaction de RT-PCR. Cette réaction peut par exemple être fondée sur l’amplification des gènes viraux RdRp, E et N, selon la méthode mise au point par le laboratoire du Dr. Victor Corman (Hôpital de la Charité, Allemagne) ; voir par exemple, Corman et al. Euro Surveill. 25(3): 2000045, 2020.

Le procédé de détection décrit plus haut peut aussi être utilisé dans une méthode pour déterminer si un sujet a été préalablement infecté par le SARS-CoV2. Une telle méthode comprend des étapes de :

b) détermination de l’existence d’une infection préalable ou non du sujet par le SARS-CoV2 au vu des résultats de l’étape de détection.

De façon préférée, l’étape de détection comprend la détermination de l’isotype des immunoglobulines. La détection d’immunoglobulines de type IgA, IgM, IgG indique que le sujet a été préalablement infecté par le SARS-CoV2.

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : Test d’agglutination

La protéine N du virus SARS-CoV2 extraite et purifiée à partir de baculovirus dans des cellules d’insecte a été obtenue auprès de Sino Biological (Pékin, Chine). Des tests d’agglutination sur lame ont été réalisés avec de la salive. Trois personnes immunisées et quatre non-immunisées sont testées. Les personnes immunisés sortant tout récemment de la maladie et non immunisés (3 immunisés et 4 non-immunisés) ont préalablement été identifiées comme telles à l’aide du kit SARS-CoV-2 IgG/IgM (Bio Time, Xiamen, Chine) depuis le sang.

Les tests d’agglutination sur lame avec la salive ont montré une certaine corrélation entre l’agglutination et l’état immunisé.

EXEMPLE 2 : Test immunochromatographique

Afin de confirmer les résultats du test d’agglutinaiton, un test immunochromatographique (lateral flow assay) a été réalisé pour un sujet COVID+ et un sujet COVID- à l’aide du SARS-CoV-2 IgG/IgM Rapid Qualitative Test Kit, (lot X2003004 de la société BIOTIME, Xiamen Biotime Biotechnology Co., Ltd, Xiamen, Chine) en suivant les instructions du fabricant.

La présence d’immunoglobulines reconnaissant le SARS-CoV2 a d’abord été recherchée dans le sang. Pour chaque sujet (COVID+ ou COVID-), un échantillon de sang a été déposé sur la membrane, conduisant à l’apparition des bandes IgG et IgM pour le sujet COVID+ après le même temps d’attente d’environ 2 minutes.

Le même test a ensuite été utilisé pour rechercher la présence d’immunoglobulines contre le SARS-CoV2 dans des échantillons de salive. Pour cela, un écouvillon a été déplacé sous les gencives puis trempé, dans un tube conique plastique Ependorf, dans 0,1ml de sérum physiologique NaCl 9g/L (Physiodose, Laboratoires Gilbert) puis vortexé. A l’aide d’une pipette, 0,1ml de vortexat a été déposé sur la membrane. Après 2 minutes, deux bandes d’intensité égales ont été détectées à l’œil nu pour le sujet COVID+. En revanche, aucune de ces deux bandes n’est observée avec l’échantillon du sujet COVID.

Un test immunochromatographique permet donc de détecter avec succès des anticorps contre le SARS-CoV2 présents dans la salive.

EXEMPLE 3 : Test ELISA

Un test ELISA a été réalisé afin d’obtenir une mesure quantitative de la capacité de détection des anticorps anti-SARS-CoV2 dans la salive. Deux protéines antigènes ont été utilisées dans des tests séparés :

Protéine A : Recombinant SARS-Cov-2 S1 subunit protein Host cell Receptor Binding Domain (RBD) (recombinant HEK 293) ref : 230-30162 RayBiotech (Peachtree Corners, Georgia USA); et

Protéine B : Recombinant SARS-Cov-2 S1 subunit protein (recombinant E coli) ref : 230-01101 Ray Biotech (Peachtree Corners, Georgia USA).

Deux échantillons de salive ont été testés dans chaque condition, l’un provenant d’un sujet COVID+ et l’autre d’un sujet COVID.. Le caractère COVID+ et COVID. a été confirmé en testant le sérum avec la Protéine A décrite ci-dessus. Les salives ont été diluées dans les proportions 1/320, 1/160, 1/80, 1/40 et 1/20 et testées avec respectivement les protéines A et B. La révélation a été faite avec des anticorps anti-immunoglobuline A humain. Les résultats sont rapportés dans le tableau 1.

Tableau 1 : Tests ELISA sur salive (unités arbitraires)

Protéine	Salive	1/320	1/160	1/80	1/40	1/20
A	COVID +	0,133	0,141	0,169	0,214	0,331
A	COVID -	0,131	0,152	0,162	0,177	0,220
B	COVID +	0,133	0,172	0,207	0,274	0,432
B	COVID -	0,145	0,173	0,203	0,237	0,295

Il apparaît donc que les réponses dans la salive pour le sujet COVID+ sont 50% à 100% plus élevées que le pour le sujet COVID.

Dans une deuxième série d’expériences, le même test ELISA a été réalisé avec des échantillons de salive des sujets positif et négatif pour la COVID-19 de l’Exemple 2. Comme attendu, le sujet COVID+, qui donnait une réponse positive dans le test immunochromatographique, donne une réponse environ 100% plus élevée (0,6 contre 0.3 à dilution 1/20) que le sujet COVID.

Il est donc possible de détecter la présence d’anticorps contre le SARS-CoV2 présents dans la salive d’un sujet à l’aide d’un test ELISA.

Claims

Procédé de détection d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 chez un sujet, ledit procédé comprenant des étapes de :
a) obtention d’un échantillon salivaire du sujet,
b) mise en contact de l’échantillon salivaire avec le SARS-CoV2 ou un ou plusieurs fragments de celui-ci, et
c) détection de la liaison des immunoglobulines présentes dans l’échantillon salivaire avec le SARS-CoV2 ou le ou les fragments de celui-ci.
Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le fragment de SARS-CoV2 est choisi parmi la protéine spike (S), les trois produits de clivage de celle-ci S1, S2 et S2’, la protéine de membrane (M), la protéine de la nucléocapside (N) et la protéine d’enveloppe (E).
Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le SARS-CoV2 ou le ou les fragments de celui-ci est immobilisé sur un support solide.
Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la détection est réalisée par une méthode immuno-enzymatique ou par un test de détection rapide.
Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l’isotype des immunoglobulines est déterminé dans l’étape de détection.
Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que la méthode immuno-enzymatique est une technique ELISA.
Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 ou 5, caractérisé en ce que le test de détection rapide est un test immunochromatographique.
Procédé selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que les immunoglobulines détectées comprennent au moins une classe d’immunoglobulines choisie parmi les IgA, les IgM et les IgG.
Méthode de diagnostic d’une infection au SARS-CoV2 chez un sujet, comprenant des étapes de :
a) détection d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 chez le sujet selon le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, et
b) détermination du diagnostic d’une infection au SARS-CoV2 chez le sujet au vu des résultats de l’étape a).
Méthode pour déterminer si un sujet a été préalablement infecté par le SARS-CoV2, comprenant des étapes de :
a) détection d’immunoglobulines spécifiques du SARS-CoV2 chez le sujet selon le procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, et
b) détermination de l’existence d’une infection préalable ou non du sujet par le SARS-CoV2 au vu des résultats de l’étape a).