WO1989001045A1 - Antigenes specifiques de leishmania et leur procede de preparation, profils antigeniques contenant ces antigenes et leur application au diagnostic des leishmanioses viscerales - Google Patents

Antigenes specifiques de leishmania et leur procede de preparation, profils antigeniques contenant ces antigenes et leur application au diagnostic des leishmanioses viscerales Download PDF

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WO1989001045A1
WO1989001045A1 PCT/FR1988/000400 FR8800400W WO8901045A1 WO 1989001045 A1 WO1989001045 A1 WO 1989001045A1 FR 8800400 W FR8800400 W FR 8800400W WO 8901045 A1 WO8901045 A1 WO 8901045A1
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leishmania
appropriate
antibodies
igg
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Armand Berneman
Xavier Rolland
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Institut Pasteur
Universite De Compiegne (I.T.S.)
Virbac S.A.
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/20—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans from protozoa
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa

Definitions

  • the present invention relates to Leishmania specific antigens and to their preparation process, to antigen profiles containing these antigens and to their application to the diagnosis of visceral leishmaniasis.
  • Leishmaniasis is an endemic disease caused by a monoflagellated protozoan of the genus Leishmania.
  • the Leishmania cycle is divided into a non-mobile form, present in the macrophages of the vertebrate host, and a mobile form in a vector insect, the sandfly.
  • Each species of Leishmania causes a type of disease with well-defined symptoms: skin, mucocutaneous or visceral. These diseases, apart from the fact that they are widespread throughout the world, are difficult to identify and to cure.
  • Leishmaniasis can be diagnosed in the laboratory, in humans or dogs for example, either by isolation and identification of the parasite, or for certain leishmaniases, by the detection of specific antibodies in the serum.
  • the cultures which it is necessary to carry out in order to isolate and identify the parasite are long and tedious to implement; moreover, this identification can, above all, prove to be dangerous in the case of a visceral syndrome (bone marrow punctures, splenic punctures).
  • immunological diagnostic tests which detect specific antibodies constitute screening reactions capable of confirming or confirming the diagnosis of leishmaniasis, particularly visceral, at a sufficiently early stage.
  • the immunological diagnostic tests can only be carried out in the case of leishmaniasis producing specific antibodies, in particular visceral leishmaniasis, and not in the case for example of “Old World” cutaneous leishmaniasis, the latter not giving not result in the formation of specific antibodies.
  • the first antibody detection tests for visceral leishmaniasis were the immunofluorescence reaction and electrosyneresis; however, these tests have the disadvantage of being cumbersome methods to implement.
  • PAPPAS et al. Have proposed an ELISA type test which proves to be faster and more sensitive than said first tests; however, the ELISA type test, for the diagnosis of visceral leishmaniasis, described by PAPPAS et Al., lack of specificity and 20% of positive rates are obtained with patients having trypanosomiasis and also with healthy subjects living in Africa.
  • the present invention is therefore intended to provide Leishmania specific antigens which cause visceral leishmaniasis in mammals, in particular in humans and dogs, which give an antibody response with a safety of 100% diagnosis, when used for the diagnosis of visceral leishmaniasis, in the form of electrophoretic profiles transferred to strips, as part of the immunoblot analysis technique and / or when they are used in isolation as part of an ELISA test or an RIA test.
  • the subject of the present invention is antigens specific for Leishmania, a parasite which causes visceral leishmaniasis in mammals, in particular in humans and / or in dogs, characterized in that they are specifically recognized by sera from patients.
  • the specific antigens are Leishmania infantum antigens.
  • the specific antigens are Leishmania donovani antigens.
  • the specific antigens of Leishmania infantum are characterized in that they respectively have a molecular mass of 150 KD, a molecular mass of 94 KD, a molecular mass of 75 KD, a molecular mass of 30 KD, a molecular weight of 33 KD and a molecular weight of 20 KD.
  • the molecular weights were calculated by comparing the rate of electrophoretic migration of said antigens with that of appropriate molecular weight markers, such as those supplied by Pharmacia.
  • the specific antigens of Leishmania infantum of molecular mass 150 KD, 94 KD and 75 KD are recognized by IgG from sera of patients of human origin.
  • the specific antigens of Leishmania infantum of molecular mass 75 KD, 33 KD and 20 KD are recognized by IgG from sera from patients of canine origin.
  • the Leishmania specific antigens of molecular mass 30 KD are recognized by IgE from sera of patients of human origin.
  • the 150 KD antigen has an isoelectric point (pI) of 6.5.
  • the 94 KD antigen has a pI of 7.6.
  • the 75 KD antigen is a mixture of molecules whose pi are respectively 7.6; 7.5? 6.9; 5.3; 4.85.
  • the 33 KD antigen is a mixture of two molecules of pi 5.30 and 5.00.
  • the 20 KD antigen is a mixture of two molecules of pi 7.6 and 6.5.
  • the isoelectric points are determined by isoelectric focusing in agarose, followed by electrophoresis in PAGE-SDS. The profile obtained is transferred to nitrocellulose and then subjected to an immunoblot with a patient's serum (man or dog).
  • each of said antigens is in the pure state and is in liquid or lyophilized form.
  • the antigens are adsorbed on solid supports.
  • the present invention also relates to an agent for diagnosing visceral leishmaniasis in humans and in animals, in particular dogs, which diagnostic agent is characterized in that it consists of an electrophoretic profile, preferably set in the form of a strip, which contains the antigens defined above.
  • the present invention also relates to a process for the preparation of specific Leishmania antigens which cause visceral leishmaniasis in mammals.
  • the method consists in: - cultivating strains of Leishmania causing visceral leishmaniasis in mammals, at a temperature and for an appropriate duration, in an appropriate medium;
  • the antigens separated by electrophoresis are transferred, by transfer or electrotransfer on strips of suitable material such as nitrocellulose or polyamide (nylon) in particular, to form antigen profiles, part of which is optionally advantageously colored using an appropriate dye such as Indian ink in particular, the antigen profiles obtained carried by said strips being advantageously kept dry.
  • suitable material such as nitrocellulose or polyamide (nylon) in particular
  • strains of Leishmania infantum are cultivated in an appropriate medium for approximately 3 days and at a temperature of 28 ° C., to obtain a volume containing 4.10 7 Leishmania / ml .
  • the strain of Leishmania infantum used is a strain LEM497 (MCAN / GR / 82).
  • the Leishmania infantum strain used is an LGR4 strain (HOM / GR / 78 / LGR4).
  • the culture medium is an RPM1 / 199 medium (1: 1) containing 10% of FCS.
  • electrophoresis is carried out according to the LAEMMLI technique with polyacrylamide gels of appropriate concentration, on which 6.10 8 Leishmania obte are deposited. naked from the culture centrifugation pellet resuspended in an appropriate buffer.
  • the transfer or electrotransfer of the antigens separated by electrophoresis is carried out at ambient temperature on nitrocellulose or polyamide (nylon), preferably according to the TOWBIN method, to form the antigenic profiles of said strains.
  • the non-stained transferred antigenic electrophoretic profiles constitute one of the reagents of a diagnostic kit and the stained transferred electrophoretic profiles, in particular with Indian ink, constitute the total antigenic profile of Leishmania, both colored and non-colored electrophoretic profiles being cut into strips.
  • an uncoloured strip is incubated on the one hand with a patient's or dog's serum, then on the other hand, the antigenicor complex is revealed by an anti-human or anti-dog enzyme conjugate according to the case, and finally, the enzyme activity is visualized on the strip; this makes it possible to selectively detect the specific antigens of human or animal visceral leishmaniasis on an adequate support.
  • a colored strip makes it possible to reveal most of the antigens present, which are identified using molecular weight markers.
  • the Rf of each migrated antigen band is defined by the distance of migration of an antigen from the origin over the distance of a migration control from the origin, which is visualized by a dye such as the bromophenol blue.
  • strains of Leishmania donovani are cultivated.
  • the method consists in:
  • Said antigens can then be used jointly or separately, said antigens being optionally adsorbed on an appropriate solid support.
  • strains of Leishmania infantum are cultivated in an RPMl / 199 medium (1: 1) at 10% FCS for approximately 3 days at a temperature of 28 ° C. so as to obtain a volume containing 4.10 7 Leishmania / ml.
  • the electrophoresis is carried out on polyacrylamide gels of appropriate concentration and on which are deposited from 12.10 8 to 18.10 8 Leishmania in said gel.
  • a part of said gel is colored by means of a dye, said coloring making it possible to determine the migration of Leishmania specific antigens in said gel.
  • another part of said gel is cut in relation to said Leishmania specific antigens, put into an injectable form and injected into an animal, in particular ment a rabbit, to produce in the latter antibodies which are isolated from the serum taken from said animal, said antibodies being purified on an appropriate chromatography column, then coupled to Sepharose using an appropriate coupling agent (bromide cyanogen in particular), to form an affinity gel.
  • an appropriate coupling agent bromide cyanogen in particular
  • the purification can be carried out either on a column of protein A-Sepharose (Pharmacia), or on a column of ion exchangers (DEAE-Cellulose Pharmacia).
  • the coupling is carried out either with Sepharose C16D or with Sepharose C14B Pharmacia.
  • an affinity column is passed with said coupled antibodies, in which a Leishmania lysate resuspended in an appropriate buffer is passed.
  • the antigens retained on the column are collected in the presence of a high ionic strength and constitute the specific pure Leishmania antigens according to the invention. It was found that the specific antigens of
  • Leishmania according to the present invention have a very high sensitivity and that their application, either in the form of antigenic profiles in the context of the immunoblot analysis technique, either in an ELISA test or in an RIA test, makes it possible to obtain 100% diagnostic reliability.
  • Leishmania specific antigens according to the present invention make it possible to detect in sera of patients, the presence of specific anti-Leishmania IgG.
  • the present invention therefore also relates to a method for diagnosing visceral leishmaniasis which consists in detecting the antileishmania antibodies present in a serum to be checked, using specific Leishmania antigens according to the invention, by incubating said serum with said antigens to which the Leishmania group antibodies bind, if such antibodies are present in the serum sample to be checked, whatever the infecting strain of Leishmania with visceral pathogenesis.
  • an appropriate quantity of a conjugate (anti-IgG or anti-IgGAM antibody (or anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM ) labeled with an enzyme, in particular peroxidase), is brought into contact with any antigen-antibody complexes previously formed to cause the attachment of anti-IgG or anti-IgGAM (or anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM ) on said bound antibodies, this second step of the diagnostic process being followed by a third step which consists in revealing said antigen-antibody complexes previously formed using an appropriate substrate, in particular diaminobenzidine added with hydrogen peroxide in a Tris buffer, to cause, in the presence of anti-Leishmania antibodies, the appearance of a color resulting from the reaction of the enzyme of the conjugate with the aforementioned substrate, said reaction being stopped by means ns appropriate.
  • an ELISA test or an RIA test is used.
  • the present invention also relates to a process for the production of anti-Leishmania antigen antigens which cause visceral leishmaniasis in mammals, characterized in that: - An appropriate animal is immunized by injection of Leishmania antigens in accordance with the invention; - The antibodies produced by said animal are purified on Sepharose. According to an advantageous embodiment of the process for the production of anti-Leishmania antigens, said antibodies produced are monoclonal antibodies.
  • said antibodies produced are polyclonal antibodies.
  • the present invention further relates to a kit, or box, or coordinated assembly, ready for use for the implementation of the method for diagnosing visceral leishmaniasis according to the present invention, which is characterized in that it comprises in a first realization:
  • control strip having an Leishmania antigen profile which has already reacted with a positive canine serum; - an appropriate amount of conjugate for human diagnosis of anti-IgG or anti-IgGAM or anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM antibodies labeled with the appropriate enzyme, in a suitable container;
  • kits, or box, or coordinated assembly, ready for use said kit is characterized in that it comprises:
  • a LEM497 strain of Leishmania infantum is cultivated at 28oC in RPMI / 199 medium (1: 1) at 10% FCS for three days.
  • the virulence of the strains is tested on Balb / c mice after five passages in weekly culture consecu tifs. 1.b.
  • the Leishmania obtained are centrifuged, the centrifugation pellet being washed 2 to 3 times with a sterile PBS buffer, a Leishmania count is then carried out and the pellet is resuspended in a Tris- ⁇ -mercaptoethanol-SDS buffer, the suspension obtained being put in a volume so that this volume contains 6.10 8 Leishmania. 2. a.
  • Electrophoresis is carried out according to the LAEMMLI technique using 10% polyacrylamide gels on which said volume containing 6.10 ⁇ Leishmania is deposited, in order to separate the antigens present and thus to achieve an antigenic electrophoretic profile.
  • the antigens thus separated are transferred onto a nitrocellulose sheet, according to the TOWBIN method, under the action of an electric field, at room temperature, the potential difference being 6 volts / cm distance between the electrodes, in a Tris / glycine / methanol buffer.
  • the antigenic profile thus transferred is then kept dry and used in the form of strips as and when required; said strips have the Leishmania antigen profiles in accordance with the invention.
  • Example 2 Preparation of Leishmania specific antigens from Leishmania infantum 1.a. The Leishmania are grown as described in Example 1 above. 1.b. The Leishmania are centrifuged as described in Example 1 above.
  • the suspension obtained is put in a volume so that this volume contains 12.10 8 to 18.10 8 Leish mania.
  • Electrophoresis is carried out on polyacrylamide gel.
  • the gel is cut into two unequal parts; a first part is colored and makes it possible to determine the migration of Leishmania specific antigens; a second part is cut according to the migration of said antigens.
  • Said second part of the gel is then reduced to a puree, dried to reduce the mass, then resuspended in 1 to 2 ml of water and injected into a rabbit in dorsal subcutaneous fashion.
  • 3. a. Three repeated injections are made four weeks apart.
  • the rabbit is bled and 30 to 40 ml of blood are collected from which the serum is recovered. vs. The reactivity of said rabbit serum is tested.
  • Rabbit serum is used to make an affinity column; the antibodies are first purified on an appropriate chromatography column, then they are coupled to Sepharose using an appropriate coupling agent (cyanogen bromide in particular), to form an affinity gel.
  • an appropriate coupling agent cyanogen bromide in particular
  • the purification can be carried out either on a column of protein A-Sepharose (Pharmacia), or on a column of ion exchangers (DEAE-cellulose Pharmacia).
  • the coupling is carried out either with Sepharose C16D or with Sepharose C14B Pharmacia.
  • the column is washed several times with 0.1% PBS-Tween 20. vs.
  • the antigens to be passed through the column are prepared as follows:
  • the Leishmania pellet obtained under the conditions of Example 1 is sonicated in the presence of 0.1% Tween 20.
  • An appropriate amount of the mixture of antigens thus obtained is passed through the affinity column, the amount introduced being a function of the retention capacity of the column.
  • the column retains Leishmania specific antigens. e. Washed with 0.1% PBS-Tween 20. 5.a.
  • the antigens are then eluted from the column in the presence of a high ionic strength (1 M in NaCl) and collected.
  • Said antigens collected are dialyzed then lyophilized and stored in suitable containers or adsorbed, in the presence of a preservative such as sodium azide at 0.1% or merthiolate at 0.1%, on solid supports.
  • the diagnostic test for leishmaniasis which is the subject of the present invention is a simple, sensitive and specific test for visceral leishmaniasis, both in humans and in animals, in particular the dog, which makes it possible to detect anti-Leishmania antibodies using strips presenting specific Leishmania antigenic profiles, which react with the patient's serum, whatever the infecting serotype, while not exhibiting cross-reactions .
  • This diagnostic test is based on the following principles: The serum to be checked is incubated in an incubator containing channels serving to accommodate the strips having the antigenic profiles in accordance with the invention.
  • anti-Leishmania antibodies are present in the human sample, they bind to said antigens.
  • the specificity of the test is linked to the following recognitions: In humans, the serum must recognize the three antigens following born: 150 KD, 94 KD and 75 KD, simultaneously or not.
  • Table I represents the frequency of recognition of the 150 KD, 94 KD and 75 KD antigens in humans. TABLE I
  • FIG. 1 represents an antigenic profile in the presence of molecular weight markers and makes it possible to determine the location of the antigens 150 KD, 94 KD and 75 KD.
  • FIG. 2 which can only be read with reference to FIG. 1, represents the immunoblots for recognition of the antigens by human sera, as defined in Table I. It can be seen that only subjects suffering from visceral leishmaniases recognize with a frequency as presented in Table I, the three antigens.
  • a conjugate such as anti-IgG or anti-IgGAM antibody labeled with an enzyme, in particular peroxidase, is added in a second step and binds to the fragments of the antibodies retained on the strips.
  • each channel is filled with 1 ml of said buffer; left in contact for 5 minutes and drained by inversion or aspiration; this operation is repeated 5 times. Then a final washing is carried out by filling each channel with 1 ml of 0.1% PBS-Tween 20 buffer; left in contact for 5 minutes and drained by inversion or aspiration; dl) 1 ml is distributed per channel of human test serum diluted to 1/200 in PBS-Tween 20 at 0.1%, two vats being provided for the control strips with positive human serum and negative human serum; d2) One hour incubation at room temperature with stirring; e) The channels are emptied by inversion or aspiration and washed 6 times 5 minutes with 0.1% PBS-Tween 20; f) Addition of the conjugate to peroxidase.
  • the dilution depends on the batch and the brand used.
  • the "Nordic" reagents - Man: human anti-IgG (H + L) goat allow to work at the 1/5000 dilution. 1 ml of the final reaction of the reagent is distributed in PBS-Tween 20 at 0.1%;
  • Example ⁇ Detection of the presence of anti-Leishmania antibodies in dogs by the immunoblot technique in dogs. A. This diagnostic test is based on the same principles as those specified in Example ⁇ .
  • the serum In dogs, the serum must recognize the following three antigens: 75 KD, 33 KD and 20 KD separately, in pairs or simultaneously.
  • Table II represents the frequency of recognition of said three antigens in dogs.
  • Figures 3a, 3b, 3c and 3d show the immu no fingerprints for recognition of antigens by positive canine sera as defined in Table II.
  • a rabbit anti-IgG (H + L) dog-type conjugate is used.
  • a substrate of the same type as that described in Example ⁇ is used.
  • test sample contains antibodies, a more or less intense coloring appears on the nitrocellulose sheet according to the same mechanism as that described in Example ⁇ .
  • Canine serums are stored under glycerol at 50% and at - 20oC.
  • Example ⁇ . B The technique used is identical to that of Example ⁇ . III - RESULTS OF VISCERAL LEISHMANIOSIS SERODIAGNOSTICS
  • EXAMPLE A Demonstration of the specificity of the immunoblot technique (comparison with other patients) in humans.
  • Table I and Figure 2 show the frequency of recognition of antigens depending on the origin of the serum used.
  • the sera from visceral leishmaniasis specifically recognize an antigen of molecular mass of the order of 150 KD, 20/22 recognize an antigen of molecular mass of 94 KD and 21/22 an antigen of molecular mass of 75 KD and 22/22 recognize a 150 KD antigen and / or a 94 KD antigen and / or a 75 KD antigen.
  • the recognition of these three antigens simultaneously or not, makes it possible to establish a safe and specific diagnosis of visceral leishmaniasis with this immunoblot technique.
  • the study of specificity checks shows that these antigens are not recognized by the antibodies present in the sera of patients with different parasitoses.
  • EXAMPLE B Demonstration of the specificity of the immunoblot technique in dogs.
  • Table II and Figures 3a, 3b, 3c and 3d show the frequency of recognition of antigens depending on the origin of the serum used.
  • 66/92 canine sera from leishmaniasis specifically recognize a 75 KD molecular weight antigen, 77/92 recognize a 33 KD antigen and 84/92 recognize a 20 KD antigen and 92/92 recognize a 75 KD antigen and / or a 33 KD antigen and / or a 20 KD antigen.
  • Leishmania infantum antigens also seem to be recognized by the sera of patients with other parasitoses, notably flagellates; thus antigens 70 KD and the region 55-60 KD are recognized, both by sera from patients suffering from visceral leishmaniasis and by sera from patients suffering from other flagellated diseases, such as Chagas disease, African trypanosomiasis, and even by patients with New World cutaneous leishmaniasis. These cross reactions can reflect a kinship antigen between the different trypanosomids studied.
  • the antigens according to the invention are specific for visceral leishmaniases and do not exhibit cross-reactions.
  • the general immunoblotting profile obtained with IgG shows that a specific humoral immunity is directed against some Leishmania infantum antigens.

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Abstract

La présente invention est relative à des antigènes spécifiques de Leishmania, à leur procédé de préparation et à des profils antigéniques contenant ces antigènes. Lesdits antigènes sont reconnus de manière spécifique par des sérums de malades d'origine humaine ou animale, notamment canine, atteints de leishmaniose viscérale et ne présentant pas de réactions croisées avec des sérums de malades atteints d'autres affections. Application au diagnostic de la leishmaniose viscérale.

Description

ANTIGENES SPECIFIQUES DE LEISHMANIA ET LEUR PROCEDE DE PREPARATION, PROFILS ANTIGENIQUES CONTENANT CES ANTIGENES ET LEUR APPLICATION AU DIAGNOSTIC DES LEISHMANIOSES VISCERALES .
La présente invention est relative à des antigènes spécifiques de Leishmania et à leur procédé de préparation, à des profils antigéniques contenant ces antigènes et à leur application au diagnostic des leishmanioses viscérales. Les leishmanioses sont des maladies endémiques provoquées par un protozoaire monoflagellé du genre Leishmania . Le cycle des Leishmania se répartit entre une forme non mobile, présente chez les macrophages de l'hδte vertébré, et une forme mobile chez un insecte vecteur, le phlébotome. Chaque espèce de Leishmania provoque un type de maladie aux symptômes bien définis : cutanés, cutanéomuqueux ou viscéraux. Ces maladies, outre le fait qu'elles soient largement répandues dans le monde, sont difficilement identifiables et guérissables. Les leishmanioses peuvent être diagnostiquées au laboratoire, chez l'homme ou chez le chien par exemple, soit par isolement et identification du parasite, soit pour certaines leishmanioses, par la détection d'anticorps spécifiques dans le sérum. Toutefois, les cultures qu'il est nécessaire de réaliser pour isoler et identifier le parasite sont longues et fastidieuses à mettre en oeuvre ; de plus, cette identification peut, surtout, s'avérer dangereuse dans le cas d'un syndrome viscéral (ponctions de moelle osseuse, ponctions spléniques).
Au contraire, les tests de diagnostic immunologique qui détectent les anticorps spécifiques constituent des réactions de dépistage propres à affirmer ou confirmer de façon suffisamment précoce le diagnostic d'une leishmaniose, notamment viscérale.
Cependant, les tests de diagnostic immunologiques ne peuvent être réalisés que dans le cas des leishmanioses productrices d'anticorps spécifiques, notamment les leishmanioses viscérales, et non dans le cas par exemple des leishmanioses cutanées de "l'Ancien Monde", ces dernières ne donnant pas lieu à la formation d'anticorps spécifiques.
Les premiers tests de détection des anticorps, en ce qui concerne les leishmanioses viscérales, ont été la réaction d'immunofluorescence et l'électrosynérèse ; cependant, ces tests présentent l'inconvénient d'être des méthodes lourdes à mettre en oeuvre.
PAPPAS et Al. ont proposé un test de type ELISA qui se révèle plus rapide et plus sensible que lesdits premiers tests ; cependant, le test de type ELISA, pour le diagnostic de la leishmaniose viscérale, décrit par PAPPAS et Al., manque de spécificité et 20 % de taux positifs sont obtenus avec des malades ayant une trypanosomiase et également avec des sujets sains vivant en Afrique.
D'autres réactions croisées avec les leishmanioses ont été décrites, notamment avec les sérums de malades atteints de lèpre, de tuberculose et de paludisme.
Bien que la mise en oeuvre du test ELISA constitue un progrès important par rapport aux méthodes précédemment préconisées, son manque de spécificité ne permet pas de l'envisager comme un test de référence, dans le cas de la leishmaniose.
En effet, lorsqu'on utilise le test ELISA, comme test de diagnostic des leishmanioses, on observe un bruit de fond trop important, qui ne permet pas d'évaluer les résultats obtenus.
La présente invention s'est, en conséquence, donné pour but de pourvoir à des antigènes spécifiques des Leishmania qui provoquent la leishmaniose viscérale chez les mammifères, notamment chez l'homme et chez le chien, qui donnent une réponse en anticorps avec une sûreté de diagnostic de l'ordre de 100 %, lorsqu'ils sont utilisés pour le diagnostic de la leishmaniose viscérale, sous forme de profils électrophorétiques transférés sur des bandelettes, dans le cadre de la technique d'analyse par immunoempreinte et/ou lorsqu'ils sont utilisés sous forme isolée dans le cadre d'un test ELISA ou d'un test RIA. La présente invention a pour objet des antigènes spécifiques de Leishmania, parasite qui provoque la leishmaniose viscérale chez les mammifères, notamment chez l'homme et/ou chez le chien, caractérisés en ce qu'ils sont reconnus de manière spécifique par des sérums de malades d'origine humaine ou animale, notamment canine, atteints de leishmaniose viscérale et en ce qu'ils ne présentent pas de réactions croisées avec des sérums de malades atteints d'autres affections. Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les antigènes spécifiques sont des antigènes de Leishmania infantum.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les antigènes spécifiques sont des antigènes de Leishmania donovani.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les antigènes spécifiques de Leishmania infantum sont caractérisés en ce qu'ils ont respectivement une masse moléculaire de 150 KD, une masse moléculaire de 94 KD, une masse moléculaire de 75 KD, une masse moléculaire de 30 KD, une masse moléculaire de 33 KD et une masse moléculaire de 20 KD.
Les poids moléculaires ont été calculés en comparant la vitesse de migration électrophorétique desdits antigènes à celui de marqueurs de poids moléculaire appropriés, tels que ceux fournis par Pharmacia.
Selon une modalité avantageuse de cette disposition, les antigènes spécifiques de Leishmania infantum de masse moléculaire 150 KD, 94 KD et 75 KD sont reconnus par des IgG de sérums de malades d'origine humaine.
Selon une autre modalité avantageuse de cette disposition, les antigènes spécifiques de Leishmania infantum de masse moléculaire 75 KD, 33 KD et 20 KD sont reconnus par des IgG de sérums de malades d'origine canine. Selon encore une autre modalité avantageuse de cette disposition, les antigènes spécifiques de Leishmania de masse moléculaire 30 KD sont reconnus par des IgE de sérums de malades d'origine humaine.
L'antigène 150 KD a un point isoélectrique (pI) de 6, 5.
L'antigène 94 KD a un pI de 7, 6.
L'antigène 75 KD est un mélange de molécules dont les pi sont respectivement de 7,6 ; 7,5 ? 6,9 ; 5,3 ; 4,85.
L'antigène 33 KD est un mélange de deux molécules de pi 5,30 et 5,00.
L'antigène 20 KD est un mélange de deux molécules de pi 7,6 et 6,5.
La détermination des points isoélectriques se fait par isoélectrofocalisation en agarose, suivie d'une électrophorèse en PAGE-SDS. Le profil obtenu est transféré sur nitrocellulose puis soumis à une immunoempreinte avec un sérum de malade (homme ou chien).
Selon un autre mode de réalisation, chacun desdits antigènes est à l'état pur et se trouve sous forme liquide ou lyophilisée.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, les antigènes sont adsorbés sur des supports solides.
La présente invention a également pour objet un agent de diagnostic de la leishmaniose viscérale chez l'homme et chez l'animal, notamment le chien, lequel agent de diagnostic est caractérisé en ce qu'il est constitué par un profil électrophorétique, de préférence mis sous forme de bandelette, qui contient les antigènes définis précédemment. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation des antigènes spécifiques des Leishmania qui provoquent la leishmaniose viscérale chez les mammifères.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux, le procédé consiste à : - cultiver des souches de Leishmania provoquant la leishmaniose viscérale chez les mammifères, à une température et pendant une durée appropriée, dans un milieu approprié ;
- séparer les antigènes obtenus, après centrifugation desdites cultures, dans le culot de centrifugation remis en suspension dans un tampon approprié, en réalisant une electrophorese appropriée.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé conforme à l'invention, les antigènes séparés par electrophorese, comme décrit ci-dessus, sont transférés, par transfert ou électrotransfert sur des bandelettes en matériau approprié tel que nitrocellulose ou polyamide (nylon) notamment, pour former des profils antigéniques dont une partie est éventuellement avantageusement colorée à l'aide d'un colorant approprié tel que de l'encre de Chine notamment, les profils antigéniques obtenus portés par lesdites bandelettes étant avantageusement conservés à sec.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de préparation conforme à la présente invention, on cultive des souches de Leishmania infantum dans un milieu approprié pendant environ 3 jours et à une température de 28ºC, pour obtenir un volume contenant 4.107 Leishmania/ml.
Selon une modalité avantageuse de l'invention, la souche de Leishmania infantum utilisée est une souche LEM497 (MCAN/GR/82).
Selon une autre modalité avantageuse de cette disposition, la souche de Leishmania infantum utilisée est une souche LGR4 (HOM/GR/78/LGR4).
Selon une autre modalité avantageuse de l'invention, le milieu de culture est un milieu RPMl/199 (1:1) à 10 % de SVF.
Selon encore une autre modalité avantageuse de l'invention, l'électrophorèse est réalisée selon la technique de LAEMMLI avec des gels de polyacrylamide de concentration appropriée, sur lesquels sont déposées 6.108 Leishmania obte nues à partir du culot de centrifugation de culture remis en suspension dans un tampon approprié.
Selon une autre modalité avantageuse de l'invention, le transfert ou l'électrotransfert des antigènes séparés par electrophorese est réalisé à température ambiante sur nitrocellulose ou polyamide (nylon), de préférence selon la méthode de TOWBIN, pour former les profils antigéniques desdites souches.
Selon une autre modalité avantageuse de l'invention, les profils electrophoretiques antigéniques transférés non colorés constituent l'un des réactifs d'un coffret de diagnostic et les profils electrophoretiques transférés colorés, notamment à l'encre de Chine, constituent le profil antigénique total de Leishmania, les profils electrophoretiques tant colorés que non colorés étant découpés en bandelettes.
Conformément à l'invention, une bandelette non colorée subit une incubation d'une part avec un sérum de malade ou de chien malade, puis d'autre part, le complexe antigèneanticors est révélé par un conjugué enzymatique anti-homme ou anti-chien selon le cas, et enfin, on visualise sur la bandelette l'activité enzymatique ; ceci permet de détecter sélectivement les antigènes spécifiques de la leishmaniose viscérale humaine ou animale sur un support adéquat.
Conformément à l'invention, une bandelette colorée permet de révéler la plupart des antigènes présents, qui sont identifiés à l'aide de marqueurs de masse moléculaire.
Le Rf de chaque bande antigénique ayant migré est défini par la distance de migration d'un antigène à partir de l'origine sur la distance d'un témoin de migration à partir de l'origine, qui est visualisé par un colorant tel que le bleu de bromophénol.
En variante à ce mode de mise en oeuvre, on cultive des souches de Leishmania donovani.
Selon un autre mode de mise en oeuvre du procédé de préparation des antigènes, le procédé consiste à :
- cultiver des souches de Leishmania qui provoquent la leish maniose viscérale chez les mammifères, à une température et pendant une durée appropriées, dans un milieu approprié ;
- séparer les antigènes obtenus, après centrifugation desdites cultures, dans le culot de centrifugation remis en suspension dans un tampon approprié, en réalisant une electrophorese appropriée ;
- injecter les antigènes ainsi séparés à un animal, notamment un lapin, pour provoquer la production chez ce dernier d'anticorps spécifiques contre lesdits antigènes, - séparer les anticorps produits par l'animal immunisé, notamment le lapin, du sérum prélevé chez ce dernier, par chromatographie d'affinité ;
- isoler les antigènes retenus sur la colonne d'affinité et les recueillir ensemble ou séparément sous forme liquide ou lyophilisée.
Lesdits antigènes sont alors utilisables conjointement ou séparément, lesdits antigènes étant éventuellement adsorbés sur un support solide approprié.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, on cultive des souches de Leishmania infantum dans un milieu RPMl/199 (1:1) à 10 % de SVF pendant environ 3 jours à une température de 28°C de manière à obtenir un volume contenant de 4.107 Leishmania/ml.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, l'électrophorese est réalisée sur des gels de polyacrylamide de concentration appropriée et sur lesquels sont déposés de 12.108 à 18.108 Leishmania dans ledit gel.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en oeuvre, une partie dudit gel est colorée au moyen d'un colorant, ladite coloration permettant de déterminer la migration des antigènes spécifiques de Leishmania dans ledit gel.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de réalisation, une autre partie dudit gel est découpée en rapport avec lesdits antigènes spécifiques de Leishmania, mise sous une forme injectable et injectée à un animal, notam ment un lapin, pour produire chez ce dernier des anticorps qui sont isolés du sérum prélevé chez ledit animal, lesdits anticorps étant purifiés sur une colonne de chromatographie appropriée, puis couplés à du Sepharose à l'aide d'un agent de couplage approprié (bromure de cyanogène notamment), pour former un gel d'affinité.
La purification peut être réalisée soit sur une colonne de protéine A-Sépharose (Pharmacia), soit sur une colonne d'échangeurs d'ions (DEAE-Cellulose Pharmacia). Le couplage est réalisé soit à du Sépharose C16D, soit à du Sepharose C14B Pharmacia.
Selon encore une autre disposition, on forme avec lesdits anticorps couplés une colonne d'affinité dans laquelle est passé un lysat de Leishmanies resuspendu dans un tampon approprié.
Selon une autre disposition les antigènes retenus sur la colonne sont recueillis en présence d'une haute force ionique et constituent les antigènes spécifiques purs de Leishmania conforme à l'invention. II s'est avéré que les antigènes spécifiques de
Leishmania conformes à la présente invention présentent une très grande sensibilité et que leur application, soit sous forme de profils antigéniques dans le cadre de la technique d'analyse par immunoempreinte, soit dans un test ELISA, soit dans un test RIA, permet d'obtenir une sûreté de diagnostic de 100 %.
En particulier, chez l'homme, la reconnaissance des antigènes 150 KD, 94 KD et 75 KD, simultanément ou pas, permet l'obtention d'un diagnostic sûr, hautement spécifique. De même, chez le chien, la reconnaissance des antigènes 75 KD, 33 KD et 20 KD, soit séparément, soit par paires, soit simultanément, permet l'obtention d'un diagnostic sûr, hautement spécifique.
Les antigènes spécifiques de Leishmania conformes à la présente invention permettent de détecter dans les sérums de patients, la présence d'IgG anti-Leishmania spécifiques.
La présente invention a en conséquence également pour objet un procédé de diagnostic de leishmaniose viscérale qui consiste à détecter les anticorps antileishmania présents dans un sérum à contrôler, à l'aide des antigènes spécifiques de Leishmania conformes à l'invention, en mettant en incubation ledit sérum avec lesdits antigènes auxquels se lient les anticorps du groupe Leishmania, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon de sérum à contrôler, quelle que soit la souche infectante de Leishmania à pathogénie viscérale.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de diagnostic de leishmaniose viscérale conforme à l'invention, une quantité appropriée d'un conjugué (anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM (ou anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM) marqués avec une enzyme, notamment la peroxydase), est mise en contact avec les éventuels complexes antigènes-anticorps préalablement formés pour provoquer la fixation des anti-IgG ou des anti-IgGAM (ou anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM) sur lesdits anticorps liés, cette seconde étape du procédé de diagnostic étant suivie d'une troisième étape qui consiste à révéler lesdits complexes antigènes-anticorps prélablement formés à l'aide d'un substrat approprié, notamment de la diaminobenzidine additionnée d'eau oxygénée dans un tampon Tris, pour provoquer, en présence d'anticorps anti- Leishmania, l'apparition d'une couleur résultant de la réaction de l'enzyme du conjugué avec le substrat susdit, ladite réaction étant arrêtée par des moyens appropriés.
Selon un autre mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de diagnostic de leishmaniose viscérale conforme à l'invention, un test ELISA ou un test RIA est mis en oeuvre.
La présente invention a également pour objet un procédé de production d'anticorps anti-antigênes des Leishmania qui provoquent la leishmaniose viscérale chez les mammifères, caractérisé en ce que : - l'on immunise un animal approprié par injection d'antigènes de Leishmania conformes à l'invention ; - l'on purifie les anticorps produits par ledit animal sur du Sépharose. Selon un mode de mise en oeuvre avantageux du procédé de production d'anticorps anti-antigènes de Leishmania, lesdits anticorps produits sont des anticorps monoclonaux.
Selon une autre disposition avantageuse du procédé de production d'anticorps anti-antigênes de Leishmania, lesdits anticorps produits sont des anticorps polyclonaux.
La présente invention a en outre pour objet un kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de leishmanioses viscérales conforme à la présente invention, qui est caractérisé en ce qu'il comprend dans une première réalisation :
- une série de bandelettes présentant le profil antigénique de Leishmania infantum non révélé contenues dans un incubateur à rigoles multiples, chaque rigole étant recouverte d'un papier d'aluminium thermoscellê, permettant l'utilisation de chaque bandelette indépendament ;
- un profil antigénique coloré à l'encre de Chine, permettant de déterminer la migration des antigènes indispensables au diagnostic ;
- une bandelette de contrôle présentant un profil antigénique de Leishmania ayant déjà réagi avec un sérum humain positif ;
- et/ou une bandelette de contrôle présentant un profil antigénique de Leishmania ayant déjà réagi avec un sérum canin positif ; - une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic humain d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM ou anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM marqués avec l'enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- et/ou une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic canin d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM ou anti-IgG, anti- IgA, anti-IgM marqués avec l'enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- une quantité appropriée de substrat approprié, notamment de diaminobenzidine dans un récipient convenable, additionnée d'une quantité appropriée de peroxyde d'hydrogène dans un récipient convenable ;
- une solution de saturation PBS-Tween 20 à 0,3 % - lait écrémé à 5 %, dans un récipient convenable, ou - une solution de saturation PBS-Tween 20 à 0,3 % - BSA à 1 %, dans un récipient convenable ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0,3 % ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0,1 % ;
- une solution de tampon Tris 0,01 M pH 7,2. Selon un autre mode de réalisation dudit kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, ledit kit est caractérisé en ce qu'il comprend :
- des antigènes de Leishmania infantum dans des récipients séparés et présentés sous forme lyophilisée et conservés dans des récipients convenables ou adsorbés, en présence d'un agent conservateur tel que l'azidure de sodium à 0,1 % ou le merthiolate à 0,1 %, sur des supports solides adéquats ;
- une quantité appropriée de sérum humain positif de contrôle, contenue dans un récipient convenable ;
- et/ou une quantité appropriée de sérum canin positif de contrôle, contenue dans un récipient convenable ;
- une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic humain d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM marqués avec une enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- et/ou une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic canin d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM marqués avec une enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- une quantité appropriée de substrat approprié, notamment de la diaminobenzidine pour la peroxydase, dans un récipient convenable additionnée d ' une quantité app ropriée de per oxyde d'hydrogène dans un récipient convenable ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0,3 % dans un récipient convenable ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0,01 % ; - une solution de tampon Tris 0,01 M pH 7,2 ;
- une pluralité de plaques de microtitration utiles pour la réalisation du test ELISA.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation de profils antigéniques de Leishmania, et à des exemples de préparation d'antigènes spécifiques de Leishmania conformes à l'invention, à des exemples de mise en oeuvre des tests de détection des anticorps anti-Leishmania dans un échantillon de sérum à contrôler, par la technique d'analyse par immunoempreinte, des résultats d'une série de sérodiagnostics de leishmaniose viscérale humaine, des résultats d'une série de sérodiagnostics de leishmaniose viscérale canine effectués à l'aide de la technique d'analyse par immunoempreinte.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et les parties descriptives correspondantes, sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. I - EXEMPLES DE PREPARATION DES PROFILS ANTIGENIQUES ET ANTIGENES SPECIFIQUES DE LEISHMANIA CONFORMES A L'INVENTION. Exemple 1 - Préparation des profils antigéniques spécifiques de Leishmania à partir de Leishmania infantum
1.a. On cultive une souche LEM497 de Leishmania infantum à 28ºC dans un milieu RPMI/199 (1:1) à 10 % de SVF pendant trois jours.
La virulence des souches est testée sur souris Balb/c au bout de cinq passage en culture hebdomadaires consécu tifs. 1.b. On centrifuge les Leishmania obtenues, le culot de centrifugation étant lavé 2 à 3 fois avec un tampon PBS stérile, on effectue alors une numération des Leishmania puis le culot est remis en suspension dans un tampon Tris-β-mercaptoéthanol-SDS, la suspension obtenue étant mise dans un volume de telle sorte que ce volume contienne 6.108 Leishmania. 2. a. On réalise une electrophorese selon la technique de LAEMMLI au moyen de gels de polyacrylamide à 10 % sur lesquels on dépose ledit volume contenant 6.10^ Leishmania, afin de séparer les antigènes présents et de réaliser ainsi un profil électrophorêtique antigénique. b. Les antigènes ainsi séparés sont transférés sur une feuille de nitrocellulose, selon la méthode de TOWBIN, sous l'action d'un champ électrique, à température ambiante, la différence de potentiel étant de 6 volts/cm de distance entre les électrodes, dans un tampon Tris/ glycine/méthanol. c. Le profil antigénique ainsi transféré est alors conservé à sec et utilisé sous forme de bandelettes au fur et à mesure des besoins ; lesdites bandelettes présentent les profils antigéniques de Leishmania conformes à l'invention. Une partie de ces bandelettes est colorée, notamment à l'encre de Chine, ce qui permet de visualiser le profil antigénique présent sur la feuille de nitrocellulose. Exemple 2 - Préparation des antigènes spécifiques de Leishmania à partir de Leishmania infantum 1.a. On cultive les Leishmania comme décrit dans l'Εxemple 1 ci-dessus. 1.b. On centrifuge les Leishmania comme décrit dans l'Exemple 1 ci-dessus.
La suspension obtenue est mise dans un volume de telle sorte que ce volume contienne 12.108 à 18.108 Leish mania. 2.a. On réalise une electrophorese sur gel de polyacrylamide. b. On découpe le gel en deux parties inégales ; une première partie est colorée et permet de déterminer la migration des antigènes spécifiques de Leishmania ; une deuxième partie est découpée en fonction de la migration desdits antigènes. c. Ladite deuxième partie du gel est alors réduite en purée, desséchée pour en réduire la masse puis remise en suspension dans 1 à 2 ml d'eau et injectée à un lapin en sous-cutanée dorsale. 3. a. On fait trois injections répétées à quatre semaines d'intervalle. b. Le lapin est saigné et on recueille 30 à 40 ml de sang à partir duquel le sérum est récupéré. c. La réactivité dudit sérum de lapin est testée.
4.a. Le sérum de lapin est utilisé pour faire une colonne d'affinité ; on purifie d'abord les anticorps sur une colonne de chromatographie appropriée, puis on les couple à du Sépharose à l'aide d'un agent de couplage approprié (bromure de cyanogène notamment), pour former un gel d'affinité.
La purification peut être réalisée soit sur une colonne de protéine A-Sépharose (Pharmacia), soit sur une colonne d'échangeurs d'ions (DEAE-cellulose Pharmacia).
Le couplage est réalisé soit à du Sepharose C16D, soit à du Sepharose C14B Pharmacia.
On lave plusieurs fois la colonne avec du PBS-Tween 20 à 0,1 %. c. On prépare les antigènes à passer sur la colonne comme suit :
Le culot de Leishmania obtenu dans les conditions de l'Exemple 1 est soniqué en présence de Tween 20 à 0,1 %. d. Une quantité appropriée du mélange d'antigènes ainsi obtenu est passée sur la colonne d'affinité, la quantité introduite étant fonction de la capacité de rétention de la colonne. La colonne retient les antigènes spécifiques de Leishmania. e. On lave avec du PBS-Tween 20 à 0, 1 %. 5.a. Les antigènes sont ensuite élues de la colonne en présence d'une force ionique importante (1 M en NaCl) et recueillis. b. Lesdits antigènes recueillis sont dialyses puis lyophilisés et conservés dans des récipients convenables ou adsorbés, en présence d'un agent conservateur tel que l'azidure de sodium à 0, 1 % ou le merthiolate à 0, 1 %, sur des supports solides. II - DETECTION DES ANTICORPS ANTI-LEISHMANIA PAR LA TECHNIQUE D'ANALYSE PAR IMMUNOEMPREINTE Exemple α - Détection de la présence d'anticorps anti-
Leishmania chez l'homme par la technique d'immunoempreinte Le test de diagnostic de leishmaniose qui fait l' objet de la présente invention est un test simple, sensible et spécifique de la leishmaniose viscérale, tant chez l'homme que chez l'animal, notamment le chien, qui permet de détecter les anticorps anti-Leishmania à l'aide de bandelettes présentant des profils antigéniques spécifiques de Leishmania, qui réagissent avec le sérum de malade, quel que soit le sérotype infectant, tout en ne présentant pas de réactions croisées. A. Ce test de diagnostic repose sur les principes suivants : Le sérum à contrôler est mis en incubation dans un incubateur contenant des rigoles servant à accueillir les bandelettes présentant les profils antigéniques conformes à l'invention.
Si des anticorps anti-Leishmania sont présents dans l'échantillon humain, ils se lient auxdits antigènes.
La spécificité du test est liée aux reconnaissances suivantes : Chez l'homme, le sérum doit reconnaitre les trois antigè nés suivants : 150 KD, 94 KD et 75 KD, simultanément ou pas.
Le Tableau I représente la fréquence de reconnaissance des antigènes 150 KD, 94 KD et 75 KD chez l'homme. TABLEAU I
Figure imgf000018_0001
* : Malades ** : Contrôles
Les sérums en provenance de sujets atteints de leishmanioses viscérales (bandelettes Nos. 1 à 22) reconnaissent les antigènes 150 KD, 94 KD et 75 KD avec une fréquence élevée, comme représenté sur le Tableau I. Par contre le sérum négatif (bandelette n° 23), les sérums en provenance de sujets atteints de toxoplasmose (bandelette nº 24), les sérums en provenance de sujets atteints de leishmaniose cutanée (bandelettes Nos. 25-27), les sérums en provenance de sujets atteints de maladie de Chagas (bandelette nº 28) ou de maladie du sommeil (bandelettes Nos. 29- 30) ne reconnaissent pas les trois antigènes spécifiques.
La figure 1 représente un profil antigénique en présence de marqueurs de masse moléculaire et permet de déterminer l'emplacement des antigènes 150 KD, 94 KD et 75 KD. La figure 2, qui ne peut être lue qu'en regard de la figure 1, représente les immunoempreintes de reconnaissance des antigènes par des sérums humains, telles que définies dans le Tableau I. On voit que seuls les sujets atteints de leishmanioses viscérales reconnaissent avec une fréquence telle que présentée dans le Tableau I, les trois antigènes. Un conjugué tel qu'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM marqués avec une enzyme, notamment la peroxydase, est ajouté dans un deuxième temps et se fixe sur les fragments des anti- corps retenus sur les bandelettes. L'addition d'un substrat adapté selon l'enzyme, notamment peroxydase, dans un dernier stade est suivie de l'apparition d'une coloration plus ou moins intense sur la feuille de nitrocellulose, résultant de la réaction enzymatique si l'échantillon contient des anticorps anti- Leishmania. Au contraire, si l'échantillon testé ne contient pas d'anticorps anti-Leishmania, le conjugué n'est pas retenu et aucune coloration ne se développe sur la nitrocellulose. REACTIFS
1. Bandelettes de nitrocellulose présentant des profils anti- géniques de Leishmania
2. Sérum humain de contrôle négatif
2' Sérum humain de contrôle positif provenant d'un malade connu pour être atteint de leishmaniose viscérale
3. Conjugué anticorps - anti-IgG - peroxydase 4. Substrat : diaminobenzidine
5. Peroxyde d 'hydrogène
6 . Tampons
6.1. Tampon PBS-Tween 20 à 0,3 % avec 5 % lait écrémé 6.2. Tampon PBS-Tween 20 à 0,3 % sans lait écrémé
6.3. Tampon PBS-Tween 20 à 0,1 %
6.4. Tampon Tris 0,01 M pH 7,2
B. La technique mise en oeuvre est décrite ci-après : a) Les bandelettes présentant les profils antigéniques de Leishmania sont placées dans chacune des rigoles de l'incubateur ; b) Lesdites bandelettes sont saturées avec le tampon PBS- Tween 20 à 0,3 % avec 5 % de lait écrémé pendant 45 minutes à température ambiante sous agitation ; c) Après avoir retiré le lait des rigoles par retournement ou aspiration, on effectue le lavage des bandelettes contenues dans les rigoles.
A l'aide d'une pissette contenant du tampon PBS-Tween 20 à 0,3 %, on remplit chaque rigole avec 1 ml dudit tampon ; on laisse en contact 5 minutes et on vidange par retournement ou aspiration ; on répète 5 fois cette opération. Puis on effectue un dernier lavage en remplissant chaque rigole avec 1 ml de tampon PBS-Tween 20 à 0,1 % ; on laisse en contact 5 minutes et on vidange par retournement ou aspiration ; dl) On distribue 1 ml par rigole de sérum à tester humain dilué au 1/200 dans du PBS-Tween 20 à 0,1 %, deux cuves étant prévues pour les bandelettes de contrôle avec sérum humain positif et sérum humain négatif ; d2) On incube une heure à température ambiante sous agitation ; e) On vide les rigoles par retournement ou aspiration et on lave 6 fois 5 minutes avec du PBS-Tween 20 à 0,1 % ; f) Addition du conjugué à la peroxydase.
La dilution dépend du lot et de la marque employée. En général, les réactifs "Nordic" - Homme : chèvre anti-IgG (H+L)humaine permettent de travailler à la dilution 1/5000. On distribue 1 ml de la réaction finale du réactif dans PBS-Tween 20 à 0,1 %;
On incube 30 minutes à 37ºC, à l'abri de la lumière, g) On vide les rigoles par retournement ou aspiration et on lave 6 fois 5 minutes avec du PBS-Tween 20 à 0,1 % ; h) On distribue 1 ml de la solution de substrat préparée selon un protocole approprié et on laisse incuber de 30 secondes à une heure à 37ºC.
On arrête la réaction par addition d'eau distillée. Remarque : Parfois, la réaction peut être extrêmemen rapide, dans le cas de certains sérums positifs. Il faut surveiller attentivement les empreintes, pour éviter tout bruit de fond. i) On laisse sécher les bandelettes dans l'incubateur puis on les stocke. On considère comme positif, c'est-à-dire contenant des anticorps anti-Leishmania, tout sérum, tant humain que canin, ayant conduit à. l'observation d'une coloration de la bandelette. Exemple β - Détection de la présence d'anticorps anti- Leishmania chez le chien par la technique d'immunoempreinte chez le chien. A. Ce test de diagnostic repose sur les mêmes principes que ceux précisés dans l'Exemple α .
La spécificité du test est liée aux reconnaissances suivantes :
Chez le chien, le sérum doit reconnaître les trois anti- gènes suivants : 75 KD, 33 KD et 20 KD séparément, par paire ou simultanément.
Le Tableau II représente la fréquence de reconnaissance desdits trois antigènes chez le chien.
TABLEAU II
Figure imgf000021_0001
* : Chiens malades ** : Contrôles
C'est ainsi que l'on peut constater que les sérums positifs de chien reconnaissent les bandes 75 KD, 33 KD et 20 KD selon les fréquences précisées dans le Tableau II. Les figures 3a, 3b, 3c et 3d représentent les immu noempreintes de reconnaissance des antigènes par des sérums canins positifs tels que définis dans le Tableau II.
Un conjugué de type lapin anti-IgG (H+L) de chien est utilisé. Un substrat de même type que celui décrit dansl'Exemple α est utilisé.
Si l'échantillon testé contient des anticorps, une coloration plus ou moins intense apparaît sur la feuille de nitrocellulose selon le même mécanisme que celui décrit dans l'Exemple α. REACTIFS
1. Bandelettes de nitrocellulose présentant ds profils antigéniques de Leishmania
2. Sérum canin de contrôle négatif 3. Sérum canin de contrôle positif
Les sérums canins sont conservés sous glycêrol à 50 % et à - 20ºC.
Le substrat et les tampons sont tels que définis dans l'Exemple α. B. La technique mise en oeuvre est identique à celle de l'Exemple α. III - RESULTATS DE SERODIAGNOSTICS DE LEISHMANIOSES VISCERALES
EXEMPLE A - Mise en évidence de la spécificité de la technique d'immunoempreinte (comparaison avec d'autres malades) chez l'homme. Le Tableau I et la figure 2 montrent la fréquence de reconnaissance des antigènes en fonction de l'origine du sérum utilisé. Les sérums venant de leishmaniose viscérale reconnaissent spécifiquement un antigène de masse moléculaire de l'ordre de 150 KD, 20/22 reconnaissent un antigène de masse moléculaire de 94 KD et 21/22 un antigène de masse moléculaire de 75 KD et 22/22 reconnaissent un antigène de 150 KD et/ ou un antigène de 94 KD et/ou un antigène de 75 KD. La reconnaissance de ces trois antigènes, simultanément ou pas, permet d'établir un diagnostic sûr et spécifique de leishmaniose viscérale avec cette technique d'immunoempreinte. L'étude des contrôles de spécificité (malades à parasitoses différentes) montre que ces antigènes ne sont pas reconnus par les anticorps présents dans les sérums de malades à parasitoses différentes.
EXEMPLE B - Mise en évidence de la spécificité de la technique d' immunoempreinte chez le chien. Le Tableau II et les figures 3a, 3b, 3c et 3d montrent la fréquence de reconnaissance des antigènes en fonction de l'origine du sérum utilisé.
66/92 sérums canins venant de leishmaniose reconnaissent spécifiquement un antigène de masse moléculaire de 75 KD, 77/92 reconnaissent un antigène de 33 KD et 84/92 reconnaissent un antigène de 20 KD et 92/92 reconnaissent un antigène de 75 KD et/ou un antigène de 33 KD et/ou un antigène de 20 KD.
Par conséquent, la reconnaissance de ces trois anti- gènes, séparément, par paire ou simultanément, permet d'établir un diagnostic sûr et spécifique de leishmaniose, chez le chien, avec cette technique d' immunoempreinte. EXEMPLE C - Réactions croisées.
Il faut noter que d'autres antigènes semblent fortement reconnus par les sérums de malades.
Des antigènes de Leishmania infantum semblent aussi reconnus par les sérums de malades présentant d'autres parasitoses notamment à flagellés ; ainsi des antigènes 70 KD et la région 55-60 KD sont reconnus, tant par des sérums de malades atteints de leishmaniose viscérale que par des sérums de malades atteints d'autres affections à flagellés, telles que la maladie de Chagas, la trypanosomiase africaine, et même par des malades atteints de leishmaniose cutanée du Nouveau Monde. Ces réactions croisées peuvent traduire une parenté antigénique entre les différents trypanosomidés étudiés.
Des parentés antigéniques ont déjà été observées par CAMARGO et Al. entre certains antigènes de flagellés.
Toutefois, comme le montrent les figures 2, 3a, 3b 3c et 3d, les antigènes selon l'invention sont spécifiques des leishmanioses viscérales et ne présentent pas de réactions croisées.
Le profil général en immunoempreintes obtenu avec des IgG montre qu'une immunité humorale spécifique est dirigée contre quelques antigènes de Leishmania infantum.
Il résulte des données qui précèdent que l'on obtient avec les profils antigéniques conformes à l'invention dans la technique d'analyse par immunoempreinte et avec les antigènes purs conformes a l'invention avec le test ELISA des résultats spécifiques et précocement positifs, dans des cas de leishmanioses productrices d'anticorps, tant chez l'homme que chez l'animal, notamment le chien, ce qui permet de dé tecter précocement l'infection leishmanique, et par conséquent permet un traitement rapide du sujet malade.

Claims

REVENDICATIONS 1º) Antigènes spécifiques de Leishmania, parasite qui provoque la leishmaniose viscérale chez les mammifères, notamment chez l'homme et/ou chez le chien, caractérisés en ce qu'ils sont reconnus de manière spécifique par des sérums de malades d'origine humaine ou animale, notamment canine, atteints de leishmaniose viscérale et en ce qu'ils ne présentent pas de réactions croisées avec des sérums de malades atteints d'autres affections. 2º) Antigènes selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont des antigènes de Leishmania infantum.
3º) Antigènes selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils sont des antigènes de Leishmania donovani.
4º) Antigènes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils ont respectivement une masse moléculaire de 150 KD, une masse moléculaire de 94 KD, une masse moléculaire de 75 KD, une masse moléculaire de 30 KD, une masse moléculaire de 33 KD et une masse moléculaire de 20 KD. 5º) Antigènes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que lorsqu'ils ont une masse moléculaire de 150 KD, de 94 KD ou de 75 KD, ils sont reconnus par des IgG de sérums de malades d ' origine humaine. 6º) Antigènes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que lorsqu'ils ont une masse moléculaire de 75 KD, de 33 KD ou de 20 KD, ils sont reconnus par des IgG de sérums de malades d'origine canine.
7º) Antigènes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que lorsqu'ils ont une masse moléculaire de 30 KD, ils sont reconnus par des IgE de sérums de malades d'origine humaine.
8º) Antigènes selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que lesdits antigènes se trouvent chacun à l'état pur, sous forme liquide ou lyophilisée. 9º) Antigènes selon la revendication 8, caractérisés en ce qu'ils sont adsorbés sur des supports solides.
10º) Agent de diagnostic de la leishmaniose viscérale chez l'homme et chez l'animal, notamment le chien, caractérise en ce qu'il est constitué par un profil électrophorétique, de préférence mis sous forme de bandelette, qui contient les antigènes selon l'une quelconque .des revendications précédentes.
11º) Procédé de préparation des antigènes spécifiques de Leishmania selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste :
- à cultiver des souches de Leishmania, parasite qui provoque la leishmaniose viscérale chez les mammifères, à une température et pendant une durée appropriée, dans un milieu approprié ;
- à séparer les antigènes obtenus, après centrifugation desdites cultures, dans le culot de centrifugation remis en suspension dans un tampon approprié, en réalisant une electrophorese appropriée. 12°) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les antigènes séparés par electrophorese sont transférés par transfert ou électrotransfert sur des bandelettes en matériau approprié, pour former des profils antigéniques, dont une partie est éventuellement colorée à l'aide d'un colorant approprié, notamment de l'encre de Chine, lesdits profils antigéniques obtenus, portés par lesdites bandelettes, étant avantageusement conservés à sec.
13º) Procédé de préparation selon la revendication 11, caractérisé en ce que l'on cultive des souches de Leishmania infantum dans un milieu approprié, pendant environ 3 jours et à une température de 28ºC pour obtenir un volume contenant 4.107 Leishmania/ml.
14º) Procédé selon la revendication 11 ou la revendication 13 , caractérisé en ce que la souche de Leisrimania infantum utilisée est une souche LEM497 (MCAN/GR/82). 15º) Procédé selon la revendication 11 ou la revendication 13, caractérisé en ce que la souche de Leishmania infantum utilisée est une souche LGR4 (HOM/GR/78/LGR4).
16º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 et 13 à 15, caractérisé en ce que le milieu de culture est un milieu RPMl/199 (1:1) à 10 % de SVF.
17º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 a 16, caractérisé en ce que l'electrophorese est réalisée selon la technique de LAEMMLI avec des gels de polyacrylamide de concentration appropriée et sur lesquels sont déposées 6.108 Leishmania obtenues à partir du culot de centrifugation de culture remis en suspension dans un tampon approprié.
18º) Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que le transfert ou l'électrotransfert des antigènes séparés par electrophorese, selon la revendication 10, est réalisé à température ambiante sur nitrocellulose ou polyamide (nylon ) , pour former des profils antigéniques .
19º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 12 et 18, caractérisé en ce que les profils electrophoretiques antigéniques transférés non colorés constituent l'un des réactifs d'un coffret de diagnostic et les profils electrophoretiques transférés colorés, notamment à l'encre de Chine, constituent le profil antigénique total de Leishmania, les profils electrophoretiques tant colorés que non colorés étant découpés en bandelettes.
20º) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu ' une bandelette non colorée subit une incubation avec un sérum de malade ou de chien malade, en ce que le complexe antigène-anticorps formé est révélé par un conjugué enzymatique anti-homme ou anti-chien et en ce qu'on visualise sur la bandelette l'activité enzymatique.
21º) Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'une bandelette colorée permet de révéler la plupart des antigênes présents, identifiés à l'aide de marqueurs de masse moléculaire.
22º) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'on cultive des souches de Leishmania donovani.
23º) Procédé de préparation des antigènes spécifiques de Leishmania selon les revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste à :
- cultiver des souches de Leishmania, parasite qui provoque la leishmaniose viscérale chez les mammifères à une température et pendant une durée appropriées, dans un milieu approprié ;
- séparer les antigènes obtenus après centrifugation desdites cultures, dans le culot de centrifugation remis en suspension dans un tampon approprié en réalisant une electrophorese appropriée ; - injecter les antigènes ainsi séparés à un animal, notamment un lapin, pour provoquer la production chez ce dernier d'anticorps spécifiques contre lesdits antigènes ;
- séparer les anticorps produits par l'animal immunisé, notamment le lapin, du sérum prélevé chez ce dernier par chromatographie d'affinité ;
- isoler lesdits antigènes retenus sur la colonne d'affinité et les recueillir ensemble ou séparément sous forme liquide ou lyophilisée, lesdits antigènes étant éventuellement adsorbés sur un support solide approprié. 24º) Procédé de préparation selon la revendication
22, caractérisé en ce qu'on cultive des souches de Leishmania infantum dans un milieu RPMI/199 (1:1) à 10 % de SVF pendant environ 3 jours à une température de 28ºC de manière à obtenir un volume contenant 4.107 Leishmania/ml. 25º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 et 24, caractérisé en ce que l'electrophorese est réalisée sur des gels de polyacrylamide de concentration appropriée et sur lesquels sont déposés de 12.108 à 18.108 Leishmania. 26º) Procédé selon l'une quelconque des revendica tions 23 à 25, caractérisé en ce qu'une partie dudit gel est colorée au moyen d'un colorant, ladite coloration permettant de déterminer la migration des antigènes spécifiques de Leishmania dans ledit gel. 27º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 26, caractérisé en ce qu'une autre partie dudit gel est découpée en rapport avec lesdits antigènes spécifiques de Leishmania, mise sous une forme injectable et injectée à un animal, notamment un lapin, pour produire chez ce dernier des anticorps qui sont isolés du sérum prélevé chez ledit animal, lesdits anticorps étant purifiés sur une colonne de chromatographie appropriée puis couplés à du Sepharose à l'aide d'un agent de couplage approprié (bromure de cyanogène notamment, pour former un gel d'affinité. 28º) Procédé selon l'une quelconque des revendications 23 à 27, caractérisé en ce qu'on produit avec les anticorps couplés, une colonne d'affinité dans laquelle est passé un lysat de Leishmanies resuspendu dans un tampon approprié. 29º) Procédé selon les revendications 23 à 28, caractérisé en ce que les antigènes retenus par la colonne sont recueillis en présence d'une haute force ionique et constituent les antigènes spécifiques purs de Leishmania selon la revendication 8.
30º) Procédé de diagnostic de leishmaniose viscérale qui consiste à détecter les anticorps anti-Leishmania présents dans un sérum à contrôler, à l'aide des antigènes spécifiques de Leishmania selon les revendications 1 à 10, en mettant en incubation ledit sérum avec lesdits antigènes auxquels se lient les anticorps du groupe Leishmania, si de tels anticorps sont présents dans l'échantillon de sérum à contrôler, quelle que soit la souche infectante de Leishmania à pathogénie viscérale.
31º) Procédé de diagnostic selon la revendication 30, caractérisé en ce qu'une quantité appropriée d'un conjugué (anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM ou anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM marqués avec une enzyme, notamment la peroxydase), est mise en contact avec les éventuels complexes antigènes- anticorps préalablement formés pour provoquer la fixation des anti-IgG ou des anti-IgGAM (ou anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM) sur lesdits anticorps liés, cette seconde étape du procédé de diagnostic étant suivie d'une troisième étape qui consiste à révéler lesdits complexes antigènes-anticorps préalablement formés à l'aide d'un substrat approprié, notamment de la diaminobenzidine additionnée d'eau oxygénée dans un tampon Tris, pour provoquer, en présence d'anticorps anti- Leishmania, l'apparition d'une couleur résultant de la réaction de l'enzyme du conjugué avec le substrat susdit, ladite réaction étant arrêtée par des moyens appropriés.
32º) Procédé de diagnostic selon l'une quelconque des revendications 30 et 31, caractérisé en ce que la troisième étape du procédé est constituée par la mise en oeuvre du test ELISA ou d'un test RIA.
33º) Procédé de production d'anticorps antiantigènes des Leishmania qui provoquent la leishmaniose viscérale chez les mammifères, caractérisé en ce que :
- l'on immunise un animal approprié par injection d'antigènes de Leishmania selon l'une quelconque des revendications 1 à
9 ;
- l'on purifie les anticorps produits par ledit animal sur du Sepharose.
34º) Procédé de production d'anticorps selon la revendication 33, caractérisé en ce que les anticorps produits sont des anticorps monoclonaux.
35°) Procédé de production d'anticorps selon la revendication 33, caractérisé en ce que les anticorps produits sont des anticorps polyclonaux.
36º) Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi pour la mise en oeuvre du procédé de diagnostic de leishmanioses viscérales, caractérisé en ce qu'il comprend : - une série de bandelettes présentant le profil antigénique de Leishmania infantum non révélé contenues dans un incubateur à rigoles multiples, chaque rigole étant recouverte d'un papier d'aluminium thermoscellé, permettant l'utilisation de chaque bandelette indépendament ; - un profil antigénique coloré à l'encre de Chine, permettant de déterminer la migration des antigènes indispensables au diagnostic ;
- une bandelette de contrôle présentant un profil antigénique de Leishmania ayant déjà réagi avec un sérum humain positif ;
- et/ou une bandelette de contrôle présentant un profil antigénique de Leishmania ayant déjà réagi avec un sérum canin positif ;
- une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic humain d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM ou anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM marqués avec l'enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- et/ou une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic canin d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM ou anti-IgG, anti- IgA, anti-IgM marqués avec l'enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- une quantité appropriée de substrat approprié, notamment de diaminobenzidine pour la peroxydase dans un récipient convenable, additionnée d'une quantité appropriée de peroxyde d'hydrogène dans un récipient convenable ;
- une solution de saturation PBS-Tween 20 à 0,3 % - lait écrémé à 5 %, dans un récipient convenable, ou
- une solution de saturation PBS-Tween 20 à 0,3 % - BSA à 1 %, dans un récipient convenable ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0,3 % ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0,1 % ;
- une solution de tampon Tris 0,01 M pH 7,2.
37°) Kit, ou coffret, ou ensemble coordonné, prêt à l'emploi, caractérisé en ce qu'il comprend : - des antigènes de Leishmania infantum dans des récipients séparés et présentés sous forme lyophilisée et conservés dans des récipients convenables ou adsorbés, en présence d'un agent conservateur tel que l'azidure de sodium à 0,1 % ou le merthiolate à 0,1 %, sur des supports solides adéquats ;
- une quantité appropriée de sérum humain positif de contrôle, contenue dans un récipient convenable ;
- et/ou une quantité appropriée de sérum canin positif de contrôle, contenue dans un récipient convenable ;
- une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic humain d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM marqués avec une enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- et/ou une quantité appropriée de conjugué pour diagnostic canin d'anticorps anti-IgG ou anti-IgGAM marqués avec une enzyme appropriée, dans un récipient convenable ;
- une quantité appropriée de substrat approprié, notamment de la diaminobenzidine pour la peroxydase dans un récipient convenable, additionnée d'une quantité appropriée de peroxyde d'hydrogène dans un récipient convenable ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0 , 3 % dans un récipient convenable ;
- une solution de tampon PBS-Tween 20 à 0,01 % ;
- une solution de tampon Tris 0,01 M pH 7,2 ; - une pluralité de plaques de microtitration utiles pour la réalisation du test ELISA.
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