WO2010128223A1 - Anticorps biomarqueur et dispositif de diagnostic pour la détection de certaines maladies auto-immunes - Google Patents

Anticorps biomarqueur et dispositif de diagnostic pour la détection de certaines maladies auto-immunes Download PDF

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WO2010128223A1
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Maan Zrein
Philippe Vanhems
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Hospices Civils De Lyon
Universite Claude Bernard Lyon I
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    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9

Definitions

  • the invention relates to the field of immunology, namely the field of interaction between an antigen and an antibody. More particularly, the invention relates to the use of a synthetic antigen (TCSP), derived from a protein of the unicellular parasite Trypanosoma Cruzi, which is the cause of Chagas' disease, for the detection of antibodies unrelated to Chagas disease, which can diagnose certain autoimmune diseases in a human patient.
  • TCSP synthetic antigen
  • infectious agents can escape the immune system of a host by interfering with the normal maturation of an effective humoral immune response, and by directing antibodies induced against autoantigens.
  • certain infectious agents are capable of triggering an autoimmune response in hosts that exhibit a genetic predisposition.
  • Chagas disease is endemic in Latin America and South America, and is a major cause of morbidity and mortality in the countries where it occurs. It is practically absent on other continents. About 16 to 18 million people are infected, and about 50,000 patients die each year. It is the infection with the unicellular parasite Trypanosoma Cruzi (T. cruzi), a member of the order Kinetoplastida and the family Trypanosomatidae, which induces Chagas disease in humans; this protozoan parasite is transmitted by several species of hematophagous insects, and in particular by the triatominae (haematophagous bugs).
  • T. cruzi is known to infect cardiac and skeletal muscle cells, glial cells and mononuclear phagocyte cells. After passive penetration in the host cell, the trimastogite form of the parasite differentiates into amastigote form; it divides actively, then the trypomastigote forms are released, thus causing a new cell invasion. About 30% of patients with this disease develop severe cardiac clinical symptoms such as cardiomyopathies (see the article by K. Karratolios et al., "Inflammatory Cardiomyopathy", published in the journal Hellenic Journal of Cardiology, 2006, volume 47 , P. 54-65, and the article by J.
  • Comparable cardiac impairment may be observed in patients infected with human immunodeficiency virus (HIV) or other infectious agents outside of any Chagas disease context. Comparable heart attacks may also occur with less frequency in apparently healthy subjects; We know (see the article by F. Kierszenbaum, “Views on the autoimmunity hypothesis for Chagas disease pathogenesis”, published in 2003 in the journal “FEMS Immunology and Medical Microbiology", vol 1545, pp. 1-11, and article by R. Jahns et al., "Pathological autoantibodies in cardiomyopathy", published in Autoimmunity, vol 41 (6), p 454-461, September 2008, showing that these disorders result from autoimmune mechanisms of undetermined origin.
  • HCV human immunodeficiency virus
  • T. cruzi antigen TCSP
  • Antibodies have been described against (adrenergic or cholinergic) receptors without defining their specificity with respect to the TCSP peptide and in no way the involvement of a T. cruzi parasite antigen outside its natural context of Chagas disease. It is known that each stage of the T. cruzi parasite life cycle expresses specific antigenic proteins, as described, for example, in the article by Hoft et al.
  • T. cruzi Expresses Various Repetitive Protein Antigens
  • TCR70 which is identical to TCR 69
  • TCR 70 has been highly conserved, with only occasional substitutions.
  • Their frequent occurrence in all isolated fractions and the diversity of these repetitive units suggests that they are involved in the contortion of the destructive role of the immune system. Since these repetitive units are effective modulators of the immune system, it may be thought that other infectious agents use similar strategies, or even the same repetitive units.
  • T. cruzi antibodies which are used in blood banks (particularly in Brazil where screening is mandatory), include indirect immunofluorescence (IFA), indirect haemagglutination (IHA), and assay by immunoenzymatic techniques (ELISA).
  • IFA indirect immunofluorescence
  • IHA indirect haemagglutination
  • ELISA assay by immunoenzymatic techniques
  • a second subject of the invention is an antigen which specifically binds to the antibody according to the first subject, with the exception of antigens which also bind to antibodies induced by T. cruzi and which are genetically encoded by parasite T. cruzi, that is to say with the exception of antigens comprising the sequence SEQ ID No. 1.
  • a third object is the use of a peptide or protein having the sequence
  • said peptide or said protein may be a TCSP peptide or a variant of the peptide
  • TCSP provided that said variant has a specific activity vis-à-vis the antibodies according to the first subject of the invention.
  • the antibodies can bind to antigens of an infectious agent, an allergen and / or an autoantigen; said infectious agent may be a pathogen, and the presence of said antibodies is then linked to an infectious or autoimmune disease.
  • Said pathogen can also be selected from the group consisting of prions, viruses, prokaryotes, unicellular or multicellular eukaryotes.
  • Said infectious or autoimmune disease can be selected from the group consisting of cardiomyopathy, myocarditis, systemic lupus erythematosus.
  • Another object of the invention is a method for the detection of antibodies according to the first object in a liquid sample, this method comprising the following steps:
  • a biological sample preferably a sample of body fluid and / or supernatant fluid of a cell culture ("liquid sample")
  • a biological sample preferably a sample of body fluid and / or supernatant fluid of a cell culture ("liquid sample")
  • a biological sample preferably a sample of body fluid and / or supernatant fluid of a cell culture ("liquid sample")
  • a peptide or a protein comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, or with a TCSP peptide or a variant of the TCSP peptide, as long as said peptide or said protein exhibits an antibody-specific activity according to claim 1
  • the marker may be selected from the group consisting of chemoluminescence markers, agglutination markers
  • kits or device for carrying out the method according to the preceding object, comprising: (a) a determined quantity of one or more peptides and / or proteins comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and / or a TCSP peptide or a variant of the TCSP peptide, as long as said peptides or proteins exhibit antibody-specific activity. according to the first object of the invention; (b) one or more appropriate markers capable of determining the complex formed between said peptide or protein and the antibody according to the first subject of the invention; (c) optionally, a solid support, preferably impregnated with said peptide or said protein.
  • the marker may be selected from the group consisting of chemoluminescence markers, agglutination markers, membrane markers, immunoenzymatic markers, radioactive markers.
  • an immunodiagnostic method comprising a step of qualitative or quantitative detection of the antibodies according to the first subject by the use of a peptide or a protein comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, or with a TCSP peptide or a variant of the TCSP peptide, as long as said peptide or said protein exhibits an antibody-specific activity according to the first object.
  • Yet another object is a method for reducing the level of antibodies according to the first object in a biological fluid sample, such as a blood sample, or in a flow of biological fluid, such as a blood fluid, comprising a step precipitating said antibodies with a peptide or a protein comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, or with a TCSP peptide or a variant of the TCSP peptide, provided that said peptide or said protein has an antibody-specific activity according to the first object.
  • the TCSP peptide or variants thereof can also be used to obtain antibodies or antibody fragments having NCRA-equivalent binding activity (Non-Cruzi-Related Antibody, ie, an antibody not induced by T. cruzi); this is yet another object of the invention.
  • the peptides or proteins comprising one of the peptide sequences can be used to identify or even isolate the immunogens that induce the NCRA antibodies.
  • Computer methods for searching sequence homologies using elaborate algorithms can serve as tools for identifying immunogenic candidates.
  • Said immunogenic candidates can be synthesized and then tested for reactivity with biological samples suspected of containing NCRAs.
  • TCSP peptide or a variant of the TCSP peptide forms another object of the present invention.
  • This interaction results from a homology between the pathogen and the TCSP or the variant of the latter.
  • Yet another subject of the invention is represented by the use of a peptide or a protein comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, or a TCSP peptide. or a variant of a TCSP peptide, provided that said peptide or said protein exhibits an activity specific for antibodies according to the first subject of the invention, for obtaining antibodies or fragments of antibodies having equivalent binding activity to NCRA.
  • a final subject of the invention is a pharmaceutical preparation comprising antibodies or antibody fragments having NCRA equivalent binding activity, a pharmaceutically acceptable injectable solution and optionally one or more excipients (such as polysorbate and / or sucrose). ) or additives, said antibodies or antibody fragments having been obtained either by use according to the third object in a living organism, leading to the immunization of said organism against the TCSP peptide, or by screening using the TCSP on a library of bacteriophages that express specific antibodies.
  • excipients such as polysorbate and / or sucrose
  • Figure 1 shows the signal intensity distribution related to the presence of antibodies that specifically bind to the TCSP peptide, and which are not necessarily related to T. cruzi infection (these antibodies being called NCRA, Non-Cruzi-Related Antibodies). These data come from an epidemiological test involving an N number of patients belonging to four groups:
  • DS Healthy donors (ie, supervised and selected blood donors who are in better health than the general population)
  • HIV Africa African Patients Responding Positively to Virus Screening
  • HIV Western HIV: Western patients who respond positively to HIV testing.
  • Chagas Patients infected with T. cruzi.
  • Figure 2 shows the results of an epidemiological study of 79 patients, that is, the rate of NRCA as a function of time (in years) since the inclusion of patients in the study. Description
  • Chagas disease refers to a pathological condition caused by infection with the parasite Trypanosoma Cruzi, parenterally or otherwise.
  • non-Chagas disease refers to any condition not caused by the Trypanosoma Cruzi parasite, which results in increased reactivity of the antibodies against a novel antigen, referred to herein as TCSP, defined below.
  • amino acid we mean natural amino acids and unnatural amino acids.
  • Natural amino acids include the L-form of amino acids that can be found in naturally occurring proteins, that is: alanine (A), arginine (R), asparagine (N), aspartic acid (D), cysteine (C), glutamine (Q), glutamic acid (E), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), leucine (L), lysine (K), methionine (M), phenylalanine (F), proline (P), serine (S), threonine (T), tryptophan (W), tyrosine (Y) and valine (V).
  • the "unnatural” amino acids include the D-form of natural amino acids, the homo forms of certain naturally occurring amino acids (such as: arginine, lysine, phenylalanine, and serine), and the nor forms of leucine and valine. They also include other synthetic amino acids.
  • Protein compounds include especially peptides and polypeptides, including derivatives obtained for example by glycosylation, acetylation, phosphorylation, reaction with fatty acids. This term also includes proteins and peptides of natural origin.
  • antibodies includes polyclonal and monoclonal antibodies.
  • monoclonal antibody refers to an antibody composition having a homogeneous population, regardless of the species, origin and method of obtaining the antibody.
  • antibodies includes human antibodies in which at least a portion of the immunoglobulin domains are present, such as antibody fragments and so-called VHVL domains (Variable Heavy and Variable Light Chains), and mini-antibodies.
  • NCRA non-Cruzi-Related Antibodies
  • TCSP Troposoma Cruzi Synthetic Peptide
  • TCSP antigen TCSP peptide
  • TCSP protein all mean a new peptide. as defined by the invention, which comprises an amino acid sequence which is also found in the TCR70 and TCR69 proteins, namely SEQ ID No. 1, defined below, which can be isolated in T. cruzi , and which acts as an antigen with NCRA, as well as all variants and functional equivalents, such as its linear or non-linear epitopes recognized by NCRA as defined above.
  • SEQ ID N 0 2 defined below.
  • autoantigen refers to an epitope present in an endogenous host molecule, which may be recognized by the immune system of said host, to eventually elicit an immune response. This mechanism can lead to an "autoimmune disease”. defined here as a pathological condition caused by an undesired immune response of a host against an autoantigen (also called auto-epitope).
  • infectious agent refers here to any agent, living or not, capable of triggering an immune response. More particularly, it refers to pathogens, allergens and haptens.
  • the agents . pathogens include prions, viruses, prokaryotes, eukaryotes, isolated or not.
  • the allergens include any substances or molecules capable of spontaneously provoking an immune response in a host when said host is exposed to said substances or molecules.
  • biological fluid refers to the body liguide of a living organism, such as a human patient, that is to say any liquid taken from a patient, such as serum, plasma, whole blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva, or the supernatant fluid of a cell culture.
  • the problem is solved by the use of a new antibody that reacts with a new antigen (TCSP), derived from a protein of a unicellular parasite that causes Chagas' disease, the Trypanosome Cruzi (T cruzi).
  • TCSP new antigen
  • NCRA antibodies antibodies not related to the T. cruzi parasite
  • This phenomenon of heterologous recognition is explained by the structural mimetism of the TCSP antigen with another immunogen, endogenous or exogenous, which has immunized the individual and induces NCRA.
  • the peptide sequence of the TCSP antigen is derived from a known protein and present in the Swissprot, Uniprot and TrEMBL databases (Accession Q7M3W1). This protein is known as TCR69; it is similar to the TCR70 protein. According to the invention, the peptide sequence of the protein used to define the NCRA 1 antibody expressed in three-letter amino acid codes, is:
  • the immunoreactive variants of this peptide are also retained within the scope of the present invention, provided that they show the same antigenic properties.
  • the variants of a peptide sequence may be obtained for example by substitution of one or more amino acids with other chemical entities, provided that the bioactivity of the original sequence is retained; they can also be obtained by adding chemical compounds such as biotin or natural or synthetic polymers, such as polylysine or polysaccharide. All such variants that retain the bioactivity of the original sequences are covered by the present invention.
  • the TCSP can be obtained by purification from T. cruzi parasite protein extract, typically leading to TCR69 or TCR70 proteins (see Hoft et al., Cited above), which have the sequences SEQ ID N ° 1, SEQ ID No. 2 and SEQ ID No. 3.
  • the TCSP and its variants can also be derived from a chemical synthesis (for example according to the method of Merrifield, well known to those skilled in the art). They can also be obtained by molecular cloning technology, such as I 1 recombinant DNA involving protein expression in microbial expression systems after insertion of a nucleotide sequence encoding the peptide sequence, followed by culturing extraction and purification of the peptide of interest.
  • the TCSP antigens and its variants are not suitable for screening for Chagas disease because they lead to false positive reactions.
  • the inventors have discovered that the TCSP interacts specifically with the NCRA. This means that the TCSP has a specific peptide sequence, which is able to bind to the NCRA. This binding can be detected by any known method, such as chemiluminescence, agglutination methods, immunoenzymatic or radioactive methods.
  • the biomarker antibody is present in biological fluids, and its presence correlates with clinical symptoms in patients with cardiomyopathy, for example, HIV-infected individuals who have developed cardiac complications.
  • the present invention relates to the peptide sequence of the TCSP as well as any structural analog capable of binding to the same biomarker antibody and which are not necessarily induced by the T. cruzi parasite (NCRA).
  • the invention also relates to an immunoassay method for detecting and monitoring myocarditis and cardiomyopathies in patients following autoimmune infection or inflammation.
  • One embodiment of the invention is a method for qualitatively or quantitatively determining the level of NCRA in a biological sample, comprising the following steps: a) Obtaining a biological sample, such as serum, plasma , whole blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva, a biopsy specimen, or the supernatant fluid of a cell culture; b) Determination of the NCRA level in this biological sample.
  • a biological sample such as serum, plasma , whole blood, urine, cerebrospinal fluid, saliva, a biopsy specimen, or the supernatant fluid of a cell culture.
  • the biological sample may be in liquid, gel or solid form. It can come from a patient or from in vitro cultures.
  • the present invention also relates to monitoring the treatment of cardiomyopathies, by determining the rate of NCRA.
  • the method described above can also be applied to the estimation of the probability of fetal death caused by cardiac arrest in utero, because of the presence of NCRAs in pregnant women. Indeed, trans-placental passage of these antibodies can damage heart cells during embryogenesis. Their effects are all the more significant as the cardiac tissue is still primitive.
  • a sample of a biological fluid of the patient, who is a pregnant woman is obtained and the rate of NCRA is determined in that sample.
  • the determination of NCRA can lead to a therapeutic strategy in patients with cardiomyopathies or the development of a vaccine against this disease.
  • the nature of the immunogen inducing biomarker antibodies is not known; however, the TCSP sequence disclosed in the present invention may lead to characterization of the etiology of the disease, isolation of an infectious or non-infectious agent inducing said NCRAs in human subjects not in contact with the parasite T. cruzi, and thus contribute to the development of new therapeutic strategies.
  • anti-TCSP antibodies or antibody fragments can be designed to prevent, by competition, the binding of NCRAs to their biological target site and thereby inhibit their pathogenic effects. The design of such competing antibodies is made possible by this discovery.
  • the measurement of NCRA longitudinally may indicate a change in cardiomyopathy and the effectiveness of its possible treatment.
  • the subtraction of these same NCRAs from the bloodstream e.g. by immunoadsorption techniques, can reduce or even completely eliminate their pathogenic effects.
  • the invention is based on the surprising discovery of the antigenic properties of a protein isolated from the parasite T. cruzi in subjects who have never been in contact with this parasite. Indeed, the TCSP antigen exhibits exceptional "cross-reactive" activity with NCRAs that are prevalent in living human subjects outside the endemic areas of the parasite. This is clearly a mechanism of peptide mimicry; these antibodies induce false-positive reactions when tested for Chagas disease.
  • an embodiment of the present invention is to employ the TCSP polypeptide or its immunoreactive variants for the detection of NCRA.
  • These NCRA antibodies can also bind to self antigens, or antigens of infectious organisms with more or less affinity and specificity than those of TCSP binding.
  • the present invention provides a polypeptide as described above for the identification or isolation of an infectious or noninfectious agent inducing antibodies which in turn may cause an autoimmune disease.
  • the present invention also provides a polypeptide as described above, wherein said infectious agent is a relatively common virus or microbe among subjects seemingly healthy and widespread, especially in HIV-infected individuals, such as mycoplasmas or other opportunistic infections.
  • the present invention also makes it possible to employ a polypeptide as described above, wherein said autoimmune disease is selected from those described in cardiac pathologies such as cardiomyopathies and myocarditis.
  • the present invention provides a method for detecting antibodies against the TCSP polypeptide, by contacting the TCSP, or a variant, with the NCRAs present in a biological fluid sample, detecting the binding of the NCRAs in the said biological sample by methods known to those skilled in the art
  • the present invention provides an assay method for the detection of antibodies against the TCSP polypeptide, comprising reagents or tools for detecting antigen-antibody binding using methods known to those skilled in the art. immunoassay.
  • the TCSP polypeptide or variants thereof are employed, provided that the latter have a specific activity against NCRAs 1 to improve the specificity of serological screening assays for the disease. of Chagas. It is clear from the results shown in Figure 1 that NCRAs, detected in screening tests, may be from an origin other than that of T. cruzi infection. Therefore, inhibition of these antibodies by the TCSP antigen may improve the specificity of Chagas disease diagnostic tests.
  • the immunoreactivity tests in the present invention were carried out by an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) technique, known to those skilled in the art; however any other technique for detecting or measuring the antigen-antibody binding can also be applied to the present invention, in particular to implement the new immunodiagnostic method which forms one of the objects of the invention.
  • ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
  • Another aspect of the invention is the therapeutic use of the TCSP peptide or variants thereof for obtaining antibodies or antibody fragments having NCRA equivalent binding activity.
  • antibodies or antibody fragments are first prepared by injecting a living organism (eg, animals) against the TCSP peptide.
  • a pharmaceutical preparation comprising these antibodies or antibody fragments, a pharmaceutically acceptable injectable solution and optionally adjuvants (such as polysorbate, sucrose) is prepared.
  • this pharmaceutical preparation is administered (eg injected) to a patient to compete with the pathogenic NCRAs.
  • the rate of pathogenic NCRA is decreased, and the clinical symptoms of the patient improve.
  • Yet another aspect of the invention is a method for reducing the level of antibodies according to the invention in a sample of biological fluid, and in particular a blood sample or in a blood stream, comprising a step of retaining said antibodies to using a peptide or a protein comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, or with a TCSP peptide or a variant of the TCSP peptide, provided that said peptide or said protein has a specific activity against the antibodies according to the invention.
  • This method can be implemented for diagnostic purposes, for the purpose of treating a quantity of biological fluid or for therapeutic purposes by plasmapheresis. It can be implemented statically or in a flow of said biological fluid.
  • the biological fluid comes into contact with a solid support on which is fixed said peptide or said protein or protein comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, or said TCSP peptide or a variant of said TCSP peptide.
  • the antibodies if present, then precipitate on this solid support and are removed from the biological fluid.
  • Another aspect of the invention is a pharmaceutical preparation comprising antibodies or antibody fragments having NCRA equivalent binding activity, a pharmaceutically acceptable injectable solution and optionally one or more adjuvants (such as polysorbate and / or sucrose) .
  • These antibodies or antibody fragments can be obtained in different ways. In one embodiment, they can be obtained by screening using the TCSP on a bacteriophage library that express specific antibodies. In another embodiment, they can be obtained in a living organism, by using a peptide or protein comprising the sequence SEQ ID N 0 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3 for the detection of the antibodies that bind in a specific manner to a peptide having the sequence SEQ ID N C 1 and which are not induced in a host following its T. cruzi infection, said use leading to the immunization of said organism against the TCSP peptide.
  • Yet another aspect of the invention is the use of the TCSP, and in particular the TCSP comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 or SEQ ID No. 3, in a vaccine composition, for immunizing a human at least partially against a disease other than Chagas disease, and in particular against autoimmune cardiomyopathy, myocarditis and systemic lupus erythematosus.
  • This vaccination can be done by injecting a single dose or a plurality of doses.
  • the TCSP can be used as such, as a peptide, or in biotinylated form and / or bound to an avidin derivative, and in particular to an avidin derivative obtained by known chemical and enzymatic modification. under the name NeutraLite Avidin.
  • Said composition may comprise solvents, additives, buffers and pharmacologically acceptable carriers, as well as, if appropriate, other active ingredients.
  • a peptide or a protein comprising the sequence SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, or a TCSP peptide or a variant of the TCSP peptide, is used. as long as said peptide or said protein exhibits an activity specific to the antibodies according to the invention, for identifying or isolating a pathogen which specifically binds to NCRAs or which is specifically recognized by NCRA.
  • This new method identifies pathogens that can induce diseases other than Chagas disease that induce NCRA formation.
  • the TCSP may be advantageous to label the TCSP, for example using a chromophore or a fluophore, or another easily detectable chemical entity (enzyme, radioactive isotope). , biotin, hapten, etc.).
  • a chromophore or a fluophore or another easily detectable chemical entity (enzyme, radioactive isotope). , biotin, hapten, etc.).
  • Example 1 These examples correspond to screening tests carried out on an N number of several populations of humans. Tables 1 and 2 and Figure 1 show results from these screening tests. We describe here the ELISA diagnostic technique used for these tests, as well as the successive stages of the tests
  • the TCSP peptide represented by a synthetic peptide of sequence SEQ ID No. 1, was adsorbed on polystyrene microplates at a concentration of 1 ⁇ g / ml. The Free binding sites were then saturated with immunologically neutral proteins (in this case albumin). The microplates were then rinsed with a wash buffer and dried to be ready for use. Samples to be tested were incubated in the wells after dilution 1/20 in dilution buffer; antibodies not fixed on the antigenic surface were removed by three wash cycles. The specific TCSP antibodies fixed on the microplates were detected by an antibody against human IgG and labeled with an enzyme tracer. A chromogenic substrate of the enzyme employed served to reveal the binding of the anti-TCSP by measuring the optical density corresponding to the absorption of the chromogen in an adequate range of wavelengths, and in particular to a length of wave of about 450 nm.
  • T. cruzi uses a highly immunogenic motif that could be used by other pathogens as well, and / or that could give rise to autoimmune antibodies.
  • Reaction of the TCSP peptide with the NCRAs present in patient sera by interaction of the sera samples and solid surfaces on which the TCSP was previously adsorbed. 4. Reaction of the TCSP with the sera of patients infected with the T. cruzi parasite: Since the TCSP antigen is derived from a protein of the T. cruzi parasite, it is difficult, by conventional techniques, to distinguish the antibodies induced by T. cruzi infection of those induced by the mechanism of autoimmunity (NCRA). In an ELISA using the TCSP as an antigen, it was found that both classes of antibodies are confounded; the EIA result is not discriminating.

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Abstract

L'invention concerne des nouveaux anticorps qui se lient de manière spécifique à un peptide comportant la séquence Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID N° 1), et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi.

Description

Anticorps biomarqueur et dispositif de diagnostic pour la détection de certaines maladies auto-immunes
Domaine technique de l'invention
L'invention concerne le domaine de l'immunologie, à savoir le domaine de l'interaction entre un antigène et un anticorps. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation d'un antigène de synthèse (TCSP), dérivé d'une protéine du parasite unicellulaire Trypanosoma Cruzi, qui est la cause de la maladie de Chagas, pour la détection d'anticorps non reliés à la maladie de Chagas, qui permettent de diagnostiquer certaines maladies auto-immunes dans un patient humain.
Etat de la technique
On sait que les agents infectieux peuvent échapper au système immunitaire d'un hôte en interférant avec la maturation normale d'une réponse immunitaire humorale effective, et en dirigeant des anticorps induits contre des autoantigènes. De plus, dû à des similitudes structurelles entre certains antigènes infectieux et antigènes du soi (« self antigens » en anglais), on pense que certains agents infectieux sont capables de déclencher une réponse auto-immunitaire dans des hôtes qui présentent une prédisposition génétique.
La maladie de Chagas est endémique en Amérique Latine et Amérique du Sud, et représente une cause importante de morbidité et mortalité dans les pays où elle sévit. Elle est pratiquement absente sur les autres continents. Environ 16 à 18 millions de personnes sont infectées, et environ 50 000 patients en meurent chaque année. C'est l'infection par le parasite unicellulaire Trypanosoma Cruzi (T. cruzi), membre de l'ordre des Kinetoplastida et de la famille des Trypanosomatidae, qui induit la maladie de Chagas chez l'être humain ; ce parasite protozoaire est transmis par plusieurs espèces d'insectes hématophages, et notamment par les Triatominae (punaises hémato- phages). La transmission a lieu lorsque les formes infectieuses du parasite sont déposées lors de la piqûre de l'insecte, lorsque des déjections de l'insecte vecteur entrent en contact avec le sang ou les muqueuses de l'hôte. L'insecte vecteur libère ainsi les formes trypomastigotes métacycliques infectieuses qui, par la voie de la circulation sanguine, vont coloniser de nombreux types cellulaires. Le cycle de vie complexe du parasite lui permet d'échapper à la réponse immunitaire de l'hôte, sans conduire à la mort de l'hôte. Le parasite passe par une étape épimastigote dans l'insecte vecteur, une étape trypomastigote dans le sang du mammifère hôte, et une étape amastigote intracellulaire : pendant cette dernière étape, le parasite se multiplie par division binaire. Une autre voie de contamination est la transfusion sanguine avec du sang contaminé ; plusieurs procédés de dépistage ont été développés (voir par exemple les brevets EP 0 976 763 et US 6,458,922).
On sait que T. cruzi infecte les cellules musculaires cardiaques et squelettiques, les cellules gliales et les cellules du système phagocytaire mononucléé. Après pénétration passive dans la cellule hôte, la forme trimastogite du parasite se différencie en forme amastigote ; elle se divise activement, puis les formes trypomastigotes sont libérées, provoquant ainsi une nouvelle invasion cellulaire. Environ 30% des patients atteints par cette maladie développent de sévères symptômes cliniques cardiaques de type cardiomyopathies (voir l'article de K. Karratolios et al., "Inflammatory Cardiomyopathy", paru en 2006 dans la revue Hellenic Journal of Cardiology, vol. 47, P. 54-65, et l'article de J. Burian et al., « Myocarditis : the immunologist's view on pathogenesis and treatment », paru en 2005 dans la revue Swiss Médical Weakly, vol. 135, p. 359-364) ; ces cardiomyopathies peuvent être aiguës ou chroniques.
Des atteintes cardiaques comparables peuvent être observées chez des patients infectés par le virus d'immunodéficience humaine (VIH) ou d'autres agents infectieux en dehors de tout contexte de la maladie de Chagas. Des atteintes cardiaques comparables peuvent également exister avec moins de fréquence chez des sujets apparemment sains ; on sait (voir l'article de F. Kierszenbaum, « Views on the autoimmunity hypothesis for Chagas disease pathogenesis », paru en 2003 dans la revue "FEMS Immunology and Médical Microbiology, vol. 1545, p. 1 - 11 , et l'article de R. Jahns et al., « Pathological autoantibodies in cardiomyopathy », paru en septembre 2008 dans la revue Autoimmunity, vol 41(6), p. 454 - 461 ) que ces atteintes résultent de mécanismes auto-immunitaires d'origine indéterminée. En effet, des réactions auto- immunes peuvent être observées chez les patients atteints de cardiomyopathies sans que l'on ne connaisse précisément l'origine, ni la spécificité des anticorps impliqués, ni à fortiori celle des immunogènes. Aucun document ne fait état d'une structure antigénique définie, responsable de cette auto-immunité et plus particulièrement d'un antigène de T. cruzi (TCSP). Des anticorps ont été décrits contre des récepteurs (adrénergiques ou cholinergiques) sans pour autant définir leur spécificité vis-à-vis du peptide TCSP et d'aucune façon l'implication d'un antigène du parasite T. cruzi en dehors de son contexte naturel de la maladie de Chagas. On sait que chaque étape du cycle de vie du parasite T. cruzi exprime des protéines antigènes spécifiques, comme décrit par exemple dans l'article de Hoft et al. (« Trypanosama cruzi Expresses Diverse Répétitive Protein Antigens »), paru en juillet 1989 dans la revue Infection and Immunity, vol. 57 (7), p. 1959-1967). Dans les études décrites dans cette publication, les auteurs ont criblé une banque d'expression de T. cruzi avec des anti-sérums humains et ont trouvé des cDNA qui codent des polypeptides contenant des unités répétitives comprenant de 6 à 34 acides aminés. La séquence d'acides aminés de TCR70 (qui est identique à TCR 69) a été fortement conservée, avec seulement quelques substitutions occasionnelles. Leur apparition fréquente dans toutes les fractions isolées et la diversité de ces unités répétitives suggère qu'ils sont impliqués dans le contoumement du rôle destructif du système immunitaire. Puisque ces unités répétitives sont des modulateurs efficaces du système immunitaire, on peut penser que d'autres agents infectieux utilisent des stratégies similaires, voire même les mêmes unités répétitives.
Les méthodes de dépistage des anticorps dirigés contre T. cruzi, qui sont utilisées dans les banques de sang (notamment au Brésil où ce dépistage est obligatoire), comprennent l'immunofluorescence indirecte (IFA), l'hémagglutination indirecte (IHA), et le dosage par des techniques immunoenzymatiques (ELISA). La plupart de ces kits de dosage, qui sont commercialement disponibles, utilisent des extraits bruts de parasites ou des fractions subcellulaires comme préparations d'antigènes. Il a été trouvé que les extraits de parasites réagissent, avec des sérums de patients qui présentent d'autres maladies, telles que la leishmaniose, l'infection Trypanosoma rangeli, la syphilis ou la fièvre rhumatoïde. Par conséquent, l'utilisation d'unités répétitives similaires par différents organismes pathogènes complique le diagnostic et le traitement. D'autre part, une réponse faussement positive lors du dépistage de la maladie de Chagas peut conduire à un diagnostic erroné qui sera suivi d'un traitement superflu et / ou inefficace.
Par conséquent, il y a un besoin urgent de pouvoir détecter des unités répétitives qui peuvent être utilisés par différents organismes pathogènes. Cependant, dans l'état de la technique, il n'existe pas de document qui montre ou suggère que les motifs polypeptidiques TCR 70 qui sont identifiés chez T. cruzi existent dans d'autres maladies sans rapport avec la maladie de Chagas, ou entraînent des désordres auto- immunitaires. Il n'a pas non plus été démontré ou suggéré dans l'état de la technique que ces unités répétitives peuvent permettre le développement d'outils fiables pour le diagnostic et le traitement ou la prévention efficace de pathologies cardiaques ou de désordres auto-immunitaires liées ou non à la maladie de Chagas. Il y a donc également un besoin de disposer de méthodes immunodiagnostiques, de préférence rapides ou utilisables sous la forme de kits, pour détecter des anticorps pathogènes capables de se lier de manière spécifique aux antigènes exprimés par T. cruzi. Et finalement, on manque de méthodes pour pouvoir réduire le taux de ces anticorps pathogènes dans le sang.
Objets de l'invention
Selon l'invention, les problèmes posés sont résolus par l'utilisation d'anticorps qui se lient de manière spécifique à un peptide comportant la séquence
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Val
(SEQ ID N0 I ), et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi. Ces anticorps en tant que tels représentent le premier objet de la présente invention.
Un deuxième objet de l'invention est un antigène qui se lie de manière spécifique à l'anticorps selon le premier objet, à l'exception des antigènes qui se lient aussi à des anticorps induits par T. cruzi et qui sont codés génétiquement par le parasite T. cruzi, c'est-à-dire à l'exception des antigènes comportant la séquence SEQ ID N° 1.
Un troisième objet est l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence
Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°2), et de préférence la séquence
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°3), et encore plus préférentiellement la séquence SEQ ID N° 1 , pour la détection et/ou la précipitation des anticorps selon le premier objet, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps. En particulier, ledit peptide ou ladite protéine peut être un peptide TCSP ou un variant du peptide
TCSP, pour autant que ledit variant présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention.
Lesdits anticorps peuvent se lier à des antigènes d'un agent infectieux, d'un allergène et/ou d'un auto-antigène ; ledit agent infectieux peut être un agent pathogène, et la présence desdits anticorps est alors lié à une maladie infectieuse ou auto-immune.
Ledit agent pathogène peut aussi être sélectionné dans le groupe formé par les prions, les virus, les procaryotes, des eucaryotes unicellulaires ou multicellulaires. Ladite maladie infectieuse ou auto-immune peut être sélectionnée dans le groupe formé par la cardiomyopathie, la myocardite, le lupus érythémateux systémique.
Un autre objet de l'invention est un procédé pour la détection d'anticorps selon le premier objet dans un échantillon liquide, ce procédé comprenant les étapes suivantes :
(a) Mettre un échantillon biologique, de préférence un échantillon de fluide corporel et/ou de liquide surnageant d'une culture cellulaire (« échantillon liquide »), en contact avec un peptide ou une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1 ; (b) Déterminer la liaison dudit anticorps selon la revendication 1 dans ledit échantillon liquide avec ledit peptide ou ladite protéine à l'aide d'un ou plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon la revendication 1. Ledit marqueur peut être sélectionné dans le groupe constitué par les marqueurs de chemoluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes, les marqueurs immunoenzymatiques, les marqueurs radioactifs.
Encore un autre objet de l'invention est un kit ou dispositif pour mettre en oeuvre le procédé selon l'objet précédent, comprenant : (a) une quantité déterminée d'un ou plusieurs peptides et/ou protéines comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, et/ou d'un peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que lesdits peptides ou lesdites protéines présentent une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention ; (b) un ou plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon le premier objet de l'invention ; (c) optionnellement, un support solide, de préférence imprégné par ledit peptide ou ladite protéine. Ledit marqueur peut être sélectionné dans le groupe constitué par les marqueurs de chemoluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes, les marqueurs immunoenzymatique, les marqueurs radioactifs. Encore un autre objet est une méthode d'immunodiagnostic comportant une étape de détection qualitative ou quantitative des anticorps selon le premier objet par l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet.
Encore un autre objet est une méthode pour réduire le taux d'anticorps selon le premier objet dans un échantillon de fluide biologique, tel qu'un échantillon sanguin, ou dans un flux de fluide biologique, tel qu'un fluide sanguin, comportant une étape de précipitation desdits anticorps à l'aide d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet.
On peut également utiliser le peptide TCSP ou ses variants pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA (Non- Cruzi-Related Antibody, i.e. un anticorps non induit par T. cruzi) ; cela constitue encore un autre objet de l'invention.
Les peptides ou protéines comportant l'une des séquences peptidiques (SEQ ID NC1 , SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3) peuvent être utilisés pour identifier voire isoler les immunogènes qui induisent les anticorps NCRA. Des méthodes informatiques de recherches d'homologies de séquences utilisant des algorithmes élaborés peuvent servir d'outils pour l'identification de candidats immunogènes. Lesdits candidats immunogènes peuvent être synthétisés puis testés pour leurs réactivités avec des échantillons biologiques suspectés de contenir des NCRA. L'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou d'un peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention, pour identifier ou isoler un agent pathogène qui se lie spécifiquement aux NCRA ou qui est reconnu spécifiquement par NCRA, forme un autre objet de la présente invention. Cette interaction découle d'une homologie entre l'agent pathogène et le TCSP ou du variant de ce dernier. Encore un autre objet de l'invention est représenté par l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou d'un peptide TCSP ou d'un variant d'un peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon le premier objet de l'invention, pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA.
Un dernier objet de l'invention est une préparation pharmaceutique comprenant des anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA, une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs excipients (tels que du polysorbate et/ou de la saccharose) ou additifs, lesdits anticorps ou fragments d'anticorps ayant été obtenus soit par une utilisation selon le troisième objet dans un organisme vivant, conduisant à l'immunisation dudit organisme contre le peptide TCSP, soit par criblage en utilisant le TCSP sur une banque de bactériophages qui expriment des anticorps spécifiques.
Figures
La figure 1 montre la distribution de l'intensité d'un signal lié à la présence d'anticorps qui se lient de manière spécifique au peptide TCSP, et qui ne sont pas nécessairement liés à une infection par T. cruzi (ces anticorps étant appelés NCRA, Non-Cruzi-Related Antibodies). Ces données proviennent d'un essai épidémiologique impliquant un nombre N de patients appartenant à quatre groupes :
DS = Donneurs sains (i.e. des donneurs de sang surveillés et sélectionnés, qui ont donc un état de santé meilleur que la moyenne de la population générale)
VIH Afrique : Patients africains qui réagissent positifs à un dépistage du virus
VIH. VIH Occidentaux : Patients occidentaux qui réagissent positifs à un dépistage du virus VIH. Chagas : Patients infectés par T. cruzi.
Les données contenues dans ce tableau proviennent de dosages de type ELISA. Elles sont représentées numériquement dans les tableaux 1 et 2.
La figure 2 montre les résultats d'une étude épidémiologique sur 79 patients, à savoir le taux de NRCA en fonction du temps (en années) depuis l'inclusion des patients dans l'étude. Description
1. Définitions
Dans le cadre de la présente invention, les termes suivants prennent un sens particulier :
L'expression « maladie de Chagas » désigne un état pathologique causé par l'infection avec le parasite Trypanosoma Cruzi, par voie parentérale ou non. L'expression « maladie autre que Chagas » désigne tout état pathologique non causé par le parasite Trypanosoma Cruzi, et qui entraîne une réactivité accrue des anticorps contre un antigène nouveau, appelé ici TCSP, défini ci-dessous.
Nous entendons par « acide aminé » les acides aminés naturels et les acides aminés non naturels. Les acides aminés « naturels » comprennent la forme L des acides aminés qui peuvent être trouvés dans des protéines d'origine naturelle, c'est-à-dire : alanine (A), arginine (R), asparagine (N), acide aspartique (D), cystéine (C), glutamine (Q), acide glutamique (E), glycine (G), histidine (H), isoleucine (I), leucine (L), lysine (K), méthionine (M), phénylalanine (F), proline (P), serine (S), thréonine (T), tryptophane (W), tyrosine (Y) et valine (V).
Les acides aminés « non naturels » comprennent la forme D des acides aminés naturels, les formes homo de certains acides aminés naturels (tels que : arginine, lysine, phénylalanine et serine), et les formes nor de la leucine et de la valine. Ils comprennent aussi d'autres acides aminés synthétiques.
Les « composés peptidigues » comprennent notamment les peptides et les polypeptides, y compris des dérivés obtenus par exemple par glycosylation, acétylation, phosphorylation, réaction avec des acides gras. Ce terme inclut également des protéines et peptides d'origine naturelle.
Le terme « anticorps » comprend les anticorps polyclonaux et monoclonaux. Le terme « anticorps monoclonal » désigne une composition d'anticorps présentant une population homogène, quel que soit l'espèce, l'origine et le procédé d'obtention de cet anticorps. Par ailleurs, le terme « anticorps » inclut les anticorps humains dans lesquels au moins une partie des domaines de l'immunoglobuline est présente, tels que les fragments d'anticorps et les domaines dits VHVL (Variable Heavy and Variable Light Chains), et les mini-anticorps.
L'expression « NCRA » ou « anticorps NCRA » (Non-Cruzi-Related Antibodies) désigne des anticorps qui se lient de manière spécifique à l'antigène TCSP, et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi.
Les expressions « TCSP » (Trypanosoma Cruzi Synthetic Peptide), « antigène TCSP », « peptide TCSP » ou « protéine TCSP » signifient toutes un nouveau peptide tel que défini par l'invention, qui comporte une séquence d'acides aminés que l'on trouve également dans les protéines TCR70 et TCR69, à savoir SEQ ID N° 1 , définie ci-dessous, qui peuvent être isolés dans T. cruzi, et qui agit comme un antigène avec NCRA, ainsi que toutes les variantes et équivalents fonctionnels, tels que ses épitopes linéaires ou non-linéaires reconnus par NCRA comme défini ci-dessus. La structure minimale de l'épitope correspond à la SEQ ID N0 2, définie ci-dessous. Le terme « auto-antigène » se réfère à un épitope présent dans une molécule endogène de l'hôte, et qui peut être reconnu par le système immunitaire dudit hôte, pour éventuellement déclencher une réponse immunitaire. Ce mécanisme peut conduire à une « maladie auto-immune ». définie ici comme un état pathologique causé par une réponse immunitaire non souhaitée d'un hôte contre un auto-antigène (appelé aussi auto-épitope).
Le terme « agent infectieux » se réfère ici à tout agent, vivant ou non, capable de déclencher une réponse immunitaire. Plus particulièrement, il se réfère aux agents pathogènes, aux allergènes et haptènes. Les agents . pathogènes comprennent notamment les prions, les virus, les procaryotes, les eucaryotes, isolés ou non. Les allergènes comprennent toutes substances ou molécules capables de provoquer spontanément une réponse immunitaire dans un hôte lorsque ledit hôte est exposé auxdites substances ou molécules. Le terme « fluide biologigue » se réfère au liguide corporel d'un organisme vivant, tel qu'un patient humain, c'est-à-dire tout liquide prélevé sur un patient, tel que le sérum, le plasma, le sang total, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, ou encore au liquide surnageant d'une culture cellulaire.
2. Description détaillée
Selon l'invention, le problème est résolu par l'utilisation d'un nouvel anticorps qui réagit avec un nouvel antigène (TCSP), dérivé d'une protéine d'un parasite unicellulaire cause de la maladie de Chagas, le Trypanosome Cruzi (T. cruzi). La particularité de cette invention réside dans la reconnaissance spécifique de l'antigène TCSP par des anticorps non reliés au parasite T. cruzi (appelés anticorps NCRA), donc n'ayant pas été induits par le dit antigène. Ce phénomène de reconnaissance hétérologue s'explique par le mimétisme structural de l'antigène TCSP avec un autre immunogène, endogène ou exogène, ayant immunisé l'individu et induit les NCRA. La séquence peptidique de l'antigène TCSP est dérivée d'une protéine connue et présente dans les bases de données Swissprot, Uniprot et TrEMBL (Accession Q7M3W1 ). Cette protéine est connue sous le nom de TCR69 ; elle est similaire à la protéine TCR70. Selon l'invention, la séquence peptidique de la protéine utilisée pour définir l'anticorps NCRA1 exprimée en codes acides-aminés à trois lettres, est :
Ala-Ata-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Val
(SEQ ID N0I ).
Les variants immunoréactifs de ce peptide sont également retenus dans le cadre de la présente invention, pour autant qu'ils montrent les mêmes propriétés antigéniques. Les variants d'une séquence peptidique peuvent être obtenus par exemple par substitution d'un ou plusieurs acides aminés par d'autres entités chimiques, à condition de conserver la bioactivité de la séquence d'origine ; ils peuvent être obtenus aussi par addition de composés chimiques tels que la biotine ou de polymères naturels ou synthétiques, tels que la polylysine ou le polysaccharide. Tous ces variants qui conservent la bioactivité des séquences d'origine sont couverts par la présente invention.
Ces variants peuvent notamment être constitués par la séquence
Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°2) et de préférence la séquence
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°3). Cette séquence peut être répétée une ou plusieurs fois, et lors de cette répétition, l'unité terminale (au sens « C-terminale ») d'alanine peut être substituée par une unité de thréonine, comme dans SEQ ID N° 1. Les peptides constitués par ces séquences montrent également cette même bioactivité et peuvent être utilisés dans le cadre de la présente invention.
Le TCSP peut être obtenu par purification à partir d'extrait de protéines du parasite T. cruzi, conduisant typiquement aux protéines TCR69 ou TCR70 (voir la publication de Hoft et al., citée ci-dessus), qui présentent les séquences SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 et SEQ ID N°3. Le TCSP et ses variantes peuvent aussi être issus d'une synthèse chimique (par exemple selon la méthode de Merrifield, bien connue de l'homme du métier). Ils peuvent également être obtenus par une technologie de clonage moléculaire, tel que I1ADN recombinant, impliquant l'expression protéique dans des systèmes d'expression microbiens après insertion d'une séquence nucléotidique codant pour la séquence du peptide, suivie d'une culture, extraction et purification du peptide d'intérêt. Les antigènes TCSP et ses variantes ne sont pas utilisables pour le dépistage de la maladie de Chagas car ils conduisent à des réactions faussement positives. Les inventeurs ont découvert que le TCSP interagit d'une manière spécifique avec le NCRA. Cela veut dire que le TCSP comporte une séquence peptidique spécifique, qui est capable de se lier au NCRA. Cette liaison peut être détectée par toute méthode connue, telle que la chemiluminescence, les méthodes d'agglutination, les méthodes immunoenzymatiques ou radioactives.
L'anticorps biomarqueur est présent dans les fluides biologiques, et sa présence corrélée à des symptômes cliniques chez des patients atteints de cardiomyopathie, par exemple, les sujets infectés par le VIH ayant développé des complications cardiaques.
La présente invention concerne la séquence peptidique du TCSP ainsi que tout analogue structural capable de se lier au même anticorps biomarqueur et qui ne sont pas nécessairement induits par le parasite T. cruzi (NCRA). L'invention concerne également une méthode de dosage immunologique, pour la détection et la surveillance des myocardites et des cardiomyopathies chez des patients suite une infection ou une inflammation auto-immune.
Un mode de réalisation de l'invention est une méthode pour déterminer, de manière qualitative ou quantitative, le taux de NCRA dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) Obtention d'un échantillon biologique, tel que le sérum, le plasma, le sang total, l'urine, le liquide céphalo-rachidien, la salive, un échantillon de biopsie, ou encore le liquide surnageant d'une culture cellulaire ; b) Détermination du taux de NCRA dans cet échantillon biologique.
L'échantillon biologique peut se présenter sous une forme liquide, gel, ou solide. Il peut provenir d'un patient ou de cultures in vitro.
La présente invention se rapporte également à la surveillance du traitement des cardiomyopathies, par la détermination du taux de NCRA. En effet, la méthode décrite ci-dessus peut s'appliquer également ^ l'estimation de la probabilité de mort foetale causée par un arrêt cardiaque in-utéro, en raison de la présence des NCRA chez les femmes enceintes. En effet, le passage trans-placentaire de ces anticorps peut endommager les cellules cardiaques au cours de l'embryogenèse. Leurs effets sont d'autant plus significatifs que le tissu cardiaque est encore primitif. Dans cette méthode, on obtient un échantillon d'un liquide biologique du patient, qui est une femme enceinte, et on détermine le taux de NCRA dans cet échantillon. En outre, le dosage des NCRA peut conduire à une stratégie thérapeutique chez des patients atteints de cardiomyopathies ou au développement d'un vaccin contre cette maladie. A l'heure actuelle, la nature de l'immunogène induisant les anticorps biomarqueurs n'est pas connue ; toutefois la séquence de TCSP divulguée dans la présente invention peut conduire à la caractérisation de l'étiologie de la maladie, à l'isolement d'un agent infectieux ou non infectieux induisant les dits NCRA chez les sujets humains n'ayant pas été en contact avec le parasite T. cruzi, et contribuer ainsi à l'élaboration de nouvelles stratégies thérapeutiques. A titre d'exemple, des anticorps ou fragments d'anticorps anti-TCSP peuvent être conçus de façon à empêcher, par compétition, la liaison des NCRA à leur site cible biologique et inhiber ainsi leurs effets pathogènes. La conception de tels anticorps compétiteurs est rendue possible par cette découverte.
D'autre part, la mesure des NCRA de façon longitudinale (chez le même patient au cours du temps), peut indiquer une évolution de la cardiomyopathie et l'efficacité de son éventuel traitement. La soustraction de ces mêmes NCRA à la circulation sanguine, e.g. par des techniques d'immunoadsorption, peut réduire voire supprimer totalement leurs effets pathogènes.
L'invention est basée sur la découverte surprenante des propriétés antigéniques d'une protéine isolée à partir du parasite T. cruzi chez des sujets qui n'ont jamais été en contact avec ce parasite. En effet, l'antigène TCSP montre une activité « hétérospécifique » exceptionnelle avec des NCRA qui sont répandus chez des sujets humains vivants en dehors des régions endémiques du parasite. Il s'agit clairement d'un mécanisme de mimétisme peptidique ; ces anticorps induisent des réactions faussement positives lors d'un test de dépistage de la maladie de Chagas.
Ce mécanisme permet au peptide TCSP de se lier spécifiquement aux NCRA dirigés contre des auto-antigènes ou contre des agents infectieux autres que T. cruzi. Par conséquent, un mode de réalisation de la présente invention a pour objet d'employer le polypeptide TCSP ou ses variants immunoréactifs, pour la détection de NCRA. Ces anticorps NCRA peuvent également se lier à des auto-antigènes, ou à des antigènes d'organismes infectieux avec plus ou moins d'affinité et de spécificité que celles de la liaison au TCSP.
Plus spécifiquement, la présente invention fournit un polypeptide comme décrit ci- dessus, pour l'identification ou l'isolement d'un agent infectieux ou non infectieux induisant des anticorps qui à leur tour peuvent causer une maladie auto-immune. La présente invention fournit également un polypeptide comme décrit ci-dessus, où ledit agent infectieux est un virus ou un microbe relativement répandu parmi les sujets humains apparemment en bonne santé et largement répandu notamment chez des sujets infectés par VIH, tels que les mycoplasmes ou d'autres agent d'infections opportunistes. La présente invention permet également d'employer un polypeptide comme décrit ci-dessus, où la dite maladie auto-immune est choisie parmi celles décrites dans des pathologies cardiaques telles que des cardiomyopathies et la myocardite. En outre, la présente invention fournit une méthode pour la détection des anticorps contre le polypeptide TCSP, en mettant en contact le TCSP, ou un variant, avec les NCRA présents dans un échantillon de fluide biologique, la détection de la liaison des NCRA dans le dit échantillon biologique par des méthodes connues par l'homme du métier
En outre, la présente invention fournit une méthode d'analyse pour la détection des anticorps contre le polypeptide TCSP, comportant des réactifs ou outils permettant de déceler la liaison antigène-anticorps à l'aide de méthodes connues par les scientifiques du métier de l'immunoanalyse. Dans encore un autre mode de réalisation de la présente invention, on emploie le polypeptide TCSP ou ses variants, pour autant que ces derniers présentent une activité spécifique vis-à-vis des NCRA1 pour améliorer la spécificité des analyses de dépistage sérologique de la maladie de Chagas. Il ressort clairement des résultats montrés sur la figure 1 que les NCRA, décelés lors des tests de dépistage, peuvent être d'une origine autre que celle d'une infection par le parasite T. cruzi. Par conséquent, l'inhibition de ces anticorps par l'antigène TCSP peut améliorer la spécificité des tests de diagnostic de la maladie de Chagas. Les tests d'immunoréactivité dans la présente invention ont été réalisés par une technique ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), connue de l'homme du métier ; cependant toute autre technique permettant de détecter ou mesurer la liaison antigène-anticorps peut également s'appliquer à la présente invention, notamment pour mettre en œuvre la nouvelle méthode d'immunodiagnostic qui forme un des objets de l'invention.
Un autre aspect de l'invention est l'utilisation thérapeutique du peptide TCSP ou de ses variants pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA. Dans cette utilisation, on prépare d'abord des anticorps ou fragments d'anticorps par inmmunisation d'un organisme vivant (par exemple d'animaux) contre le peptide TCSP. Ensuite, on prépare une préparation pharmaceutique comprenant ces anticorps ou fragments d'anticorps, une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement des adjuvants (tels que du polysorbate, du saccharose). Ensuite, cette préparation pharmaceutique est administrée (par exemple injectée) à un patient pour entrer en compétition avec les NCRA pathogènes. Ainsi le taux de NCRA pathogène est diminué, et les symptômes cliniques du patient s'améliorent.
Encore un autre aspect de l'invention est une méthode pour réduire le taux d'anticorps selon l'invention dans un échantillon de fluide biologique, et notamment d'un échantillon sanguin ou dans un flux sanguin, comportant une étape de rétention desdits anticorps à l'aide d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon l'invention. Cette méthode peut être mise en œuvre dans un but de diagnostic, dans un but de traitement d'une quantité de fluide biologique ou à des fins thérapeutiques par plasmaphérèse. Elle peut être mise en oeuvre de manière statique ou dans un flux dudit liquide biologique. De préférence, elle est mise en oeuvre comme une méthode d'immunoadsorption. Dans un mode de réalisation typique, le fluide biologique entre en contact avec un support solide sur lequel est fixé ledit peptide ou ladite protéine ou ladite protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou ledit peptide TCSP ou un variant dudit peptide TCSP. Les anticorps, s'ils sont présents, précipitent alors sur ce support solide et sont retirés du fluide biologique.
Un autre aspect de l'invention est une préparation pharmaceutique comprenant des anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA, une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs adjuvants (tels que du polysorbate et/ou du saccharose). Ces anticorps ou fragments d'anticorps peuvent être obtenus de différentes manières. Dans un mode de réalisation, ils peuvent être obtenus par criblage en utilisant le TCSP sur une banque de bactériophages qui expriment des anticorps spécifiques. Dans un autre mode de réalisation, ils peuvent être obtenus dans un organisme vivant, en utilisant un peptide ou protéine comportant la séquence SEQ ID N0 1 , SEQ ID N° 2 ou SEQ ID N° 3 pour la détection des anticorps qui se lient de manière spécifique à un peptide comportant la séquence SEQ ID NC1 et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi, ladite utilisation conduisant à l'immunisation dudit organisme contre le peptide TCSP.
Encore un autre aspect de l'invention est l'utilisation du TCSP, et notamment du TCSP comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2 ou SEQ ID N° 3, dans une composition de vaccin, permettant d'immuniser un humain au moins partiellement contre une maladie autre que la maladie de Chagas, et notamment contre la cardiomyopathie auto-immune, la myocardite et le lupus érythémateux systémique. Cette vaccination peut se faire par injection d'une dose unique ou d'une pluralité de doses. Dans ces compositions, le TCSP peut être utilisé tel quel, en tant que peptide, ou bien sous forme biotinylée et / ou liée à un dérivé de l'avidine, et notamment à un dérivé de l'avidine obtenu par modification chimique et enzymatique connu sous le nom NeutraLite Avidin. Ladite composition peut comporter des solvants, additifs, tampons et porteurs pharmacologiquement acceptables, ainsi que, le cas échéant, d'autres principes actifs.
Selon un autre aspect de l'invention, on utilise un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon l'invention, pour identifier ou isoler un agent pathogène qui se lie spécifiquement aux NCRA ou qui est reconnu spécifiquement par NCRA. Cette nouvelle méthode permet d'identifier les agents pathogènes susceptibles d'induire des maladies, autres que la maladie de Chagas, qui induisent la formation de NCRA. Dans certaines des utilisations du TCSP selon l'invention, il peut être avantageux de marquer le TCSP, par exemple à l'aide d'un chromophore ou d'un fluophore, ou d'une autre entité chimique facilement détectable (enzyme, isotope radioactif, biotine, haptène, etc.).
Exemples :
Les exemples qui suivent illustrent certains aspects de l'invention, sans la limiter.
1) Exemples d'études de groupe
Exemple 1 : Ces exemples correspondent à des essais de dépistage effectué sur un nombre N de plusieurs populations d'humains. Les tableaux 1 et 2 ainsi que la figure 1 montrent des résultats de ces essais de dépistage. Nous décrivons ici la technique de diagnostique ELISA employée pour ces essais, ainsi que les étapes successives des essais
Technique ELISA :
Le peptide TCSP, représenté par un peptide synthétique de séquence SEQ ID N° 1 , a été adsorbé sur des microplaques en polystyrène à une concentration de 1 μg/ml. Les sites de fixations libres ont ensuite été saturés par des protéines immunologiquement neutres (en l'occurrence l'albumine). Les microplaques ont ensuite été rincées par un tampon de lavage, puis séchées pour être prêtes à l'emploi. Les échantillons à tester ont été incubés dans les puits après dilution au 1/20eme dans un tampon de dilution ; les anticorps non fixés sur la surface antigénique ont été éliminés par trois cycles de lavage. Les anticorps spécifiques du TCSP fixés sur les microplaques ont été décelés par un anticorps dirigé contre les IgG humaines et marqués par un traceur enzymatique. Un substrat chromogène de l'enzyme employé a servi à révéler la fixation de l'anti-TCSP par mesure de la densité optique correspondante à l'absorption du chromogène dans une gamme adéquate de longueurs d'ondes, et notamment à une longueur d'onde d'environ 450 nm.
1. Réaction du peptide TCSP avec les NCRA présents dans des sérums issus de patients infectés par le VIH : Les échantillons sériques de patients infectés par le VIH ont été testés pour la présence de NCRA, pour deux populations : patients africains et patients occidentaux (sources européennes et américaines).
2. Réaction du peptide TCSP avec des sérums issus de donneurs de sang « sains », i.e. négatifs pour les anticorps anti-VIH, anti-VHC, anti-VHB, Syphilis.
Pour évaluer la prévalence des anticorps contre TCSP, sur la base de l'hypothèse que ces anticorps n'ont pas été induits par une infection avec T. cruzi, des échantillons de sérum européens ont été utilisés. Ces sérums ont été obtenus par des donneurs de sang sains, comme indiqué ci-dessus ; ces donneurs sont donc dans un meilleur état de santé que la moyenne de la population dont ils sont issus.
Afin d'être parfaitement certain quant à l'origine de ces anticorps contre TCSP, tous les échantillons ont été testés dans un ordre aléatoire à l'aide de kits commercialement disponibles permettant de détecter une infection par T. cruzi ; aucun échantillon positif n'a été trouvé. En revanche, et de manière totalement inattendue, il a été trouvé qu'un pourcentage significatif de ces échantillons contenait néanmoins des anticorps contre TCSP. On en déduit que T. cruzi utilise un motif hautement immunogène qui pourrait être utilisé également par d'autres pathogènes, et/ou qui pourrait donner lieu à des anticorps auto-immuns.
3. Réaction du peptide TCSP avec les NCRA présents dans des sérums de patients : par une mise en interaction des échantillons de sérums et des surfaces solides sur lesquelles le TCSP a été préalablement adsorbé. 4. Réaction du TCSP avec les sérums de patients infectés par le parasite T. cruzi : Etant donné que l'antigène TCSP est dérivé d'une protéine du parasite T. cruzi, il est difficile, par des techniques classiques, de distinguer les anticorps induits par l'infection par T. cruzi de ceux induits par le mécanisme d'autoimmunité (NCRA). Dans un test ELISA employant le TCSP comme antigène, on a trouvé que les deux catégories d'anticorps sont confondues ; le résultat EIA n'est pas discriminant.
Les résultats sont documentés dans les Tableaux 1 et 2 ainsi que sur la figure 1. Cette figure montre pour chaque population de N patients la distribution de la réactivité 0 (exprimée en densité optique) de NCRA avec le peptide TCSP utilisé pour l'essai. Sont représenté pour chacune des populations la distribution des points individuels ; les rectangles (boîtes) représentent les intervalles semi-interquartiles (en anglais « interquartile ranges »). Les traits horizontaux pleins représentent la moyenne arithmétique de chacune des populations, et les traits horizontaux en pointillé 5 délimitent 95% de la distribution.
Tableau 1
Figure imgf000018_0001
Figure imgf000018_0002
0 Exemple 2 :
Dans une autre étude de groupe de N = 79 patients infectés par le VIH, on a constaté
(voir la figure 3) une nette relation entre l'augmentation des mesures de NCRA et l'évolution chronologique de ces patients sur une échelle de temps allant au-delà de deux ans.
Cette étude démontre que la surveillance des taux de NCRA peut permettre le pronostic de l'évolution de l'infection par le VIH et ses conséquences en terme de complications cardiaques.
2) Exemples de cas individuels (essais cliniques)
Dans des études transversales, on a mesuré le taux de NCRA chez des patients de sexe masculin infectés par le VIH, et on a pu étudier leur condition cardiaque. Le tableau 3 illustre ces résultats. A titre d'exemple, on note pour le patient PAT_001 la présence d'un titre fort en NCRA (à savoir : 8,19 ) dans un échantillon de sang prélevé antérieurement à son événement cardiaque.
Ces exemples montrent, d'une part, la relation entre les titres mesurés de NCRA et des événements cardiaques ultérieurs (voir PAT_001 , PAT_004, PAT_005), et d'autre part la possibilité qu'un événement cardiaque sub-clinique puisse induire l'apparition de NCRA à forte dose (voir PAT_009).
Tableau 3
Figure imgf000019_0001

Claims

Revendications :
1. Anticorps qui se lient de manière spécifique à un peptide comportant la séquence Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Thr-Ala-Ala-Ala-Pro-Val (SEQ ID N0 I), et qui ne sont pas induits dans un hôte suite à son infection par T. cruzi.
2. Antigène qui se lie de manière spécifique à l'anticorps selon la revendication 1 , à l'exception des antigènes codés génétiquement par le parasite T. cruzi.
3. Utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°2), et de préférence la séquence
Ala-Ala-Ala-Pro-Ala-Lys-Ala (SEQ ID N°3), et encore plus préférentiellement la séquence SEQ ID N° 1, pour la détection et/ou la précipitation des anticorps selon la revendication 1 , pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1.
4. Utilisation selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit peptide ou le ladite protéine est un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit variant présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1.
5. Utilisation selon les revendications 3 ou 4, caractérisée en ce que lesdits anticorps se lient à des antigènes d'un agent infectieux, d'un allergène et/ou d'un auto-antigène.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce que ledit agent infectieux est un agent pathogène, et en ce que la présence des anticorps selon la revendication 1 est lié à une maladie infectieuse ou auto-immune.
7. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que l'agent pathogène est sélectionné dans le groupe formé par les prions, les virus, les procaryotes, des eucaryotes unicellulaires ou multicellulaires.
8. Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que ladite maladie infectieuse ou auto-immune est sélectionnée dans le groupe formé par la cardiomyopathie, la myocardite, le lupus érythémateux systémique.
9. Procédé pour la détection d'anticorps selon la revendication 1 dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes :
(c) Mettre un échantillon biologique, de préférence un échantillon de fluide corporel et/ou de liquide surnageant d'une culture cellulaire (« échantillon liquide »), en contact avec un peptide ou une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide
TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1 ;
(d)Déterminer la liaison dudit anticorps selon la revendication 1 dans ledit échantillon liquide avec ledit peptide ou ladite protéine à l'aide d'un ou plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon la revendication 1.
10. Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit marqueur est sélectionné dans le groupe constitué par les marqueurs de chemoluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes, les marqueurs immunoenzymatiques, les marqueurs radioactifs.
11. Kit ou dispositif pour effectuer le procédé selon la revendication 10, comprenant :
(d) une quantité déterminée d'un ou plusieurs peptides et/ou protéines comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, et/ou d'un peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que lesdits peptides ou lesdites protéines présentent une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1 ;
(e) un ou plusieurs marqueurs appropriés, aptes à déterminer le complexe formé entre ledit peptide ou protéine et l'anticorps selon la revendication 1 ;
(f) optionnellement, un support solide, de préférence imprégné par ledit peptide ou ladite protéine.
12. Kit ou dispositif selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit marqueur est sélectionné dans le groupe constitué par les marqueurs de chemiluminescence, les marqueurs d'agglutination, les marqueurs de membranes, les marqueurs immunoenzymatique, les marqueurs radioactifs.
13. Méthode d'immunodiagnostic comportant une étape de détection qualitative ou quantitative des anticorps selon la revendication 1 par l'utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1.
14. Méthode pour réduire le taux d'anticorps selon la revendication 1 dans un échantillon de fluide biologique, tel qu'un fluide sanguin, ou dans un flux de fluide biologique, tel qu'un fluide sanguin, comportant une étape de précipitation desdits anticorps à l'aide d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou avec un peptide TCSP ou un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1.
15. Utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou d'un peptide TCSP ou d'un variant d'un peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1 , pour l'obtention d'anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au
NCRA.
16. Utilisation d'un peptide ou d'une protéine comportant la séquence SEQ ID N°1 , SEQ ID N°2, SEQ ID N°3, ou d'un peptide TCSP ou d'un variant du peptide TCSP, pour autant que ledit peptide ou ladite protéine présente une activité spécifique vis-à-vis des anticorps selon la revendication 1 , pour identifier ou isoler un agent pathogène qui se lie spécifiquement aux NCRA ou qui est reconnu spécifiquement par NCRA.
17. Préparation pharmaceutique comprenant des anticorps ou fragments d'anticorps ayant une activité de liaison équivalente au NCRA, une solution injectable pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un ou plusieurs excipients (tels que du polysorbate et/ou de la saccharose), lesdits anticorps ou fragments d'anticorps ayant été obtenus soit par une utilisation selon l'une quelconque des revendications 3 à 8 dans un organisme vivant, conduisant à l'immunisation dudit organisme contre le peptide TCSP.
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