EP2558486A1 - Construction antigenique et ses applications pour le depistage de trypanosomoses chez l'homme et l'animal - Google Patents

Construction antigenique et ses applications pour le depistage de trypanosomoses chez l'homme et l'animal

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EP2558486A1
EP2558486A1 EP11720188A EP11720188A EP2558486A1 EP 2558486 A1 EP2558486 A1 EP 2558486A1 EP 11720188 A EP11720188 A EP 11720188A EP 11720188 A EP11720188 A EP 11720188A EP 2558486 A1 EP2558486 A1 EP 2558486A1
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EP
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antigenic construct
screening
antigenic
animal
antigen
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Withdrawn
Application number
EP11720188A
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Inventor
Philippe Holzmuller
Silla Semballa
Philippe Vincendeau
Gérard CUNY
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CENTRE DE COOPERATION INTERNATIONALE EN RECHERCHE
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
Original Assignee
Institut de Recherche pour le Developpement IRD
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Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56905—Protozoa
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/44—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from protozoa

Definitions

  • the subject of the invention is an antigenic construct and its use for developing a kit and implementing a method for trypanosomosis screening in humans and animals.
  • HAT Human African trypanosomiasis
  • AAT animal trypanosomiasis
  • stage 1 lymphatic-blood
  • stage 2 neurological
  • melarsoprol whose toxic side effects are important (overall mortality of 5-10% ).
  • stage 1 lymphatic-blood
  • stage 2 neurological
  • the diagnosis of stage still depends today on the examination of the cerebrospinal fluid after lumbar puncture and the positivity threshold of the cytorachia is still debated (5, 10 or 20 cells / ⁇ ).
  • CATT Card Agglutination Test For Trypanosomiasis
  • the assay includes fixed trypanosomes of LiTat variant 1.3.
  • a variant of CATT consists of semi-purified antigens (LiTat 1.3, 1.5 and 1.6) coupled to latex beads.
  • the main problem related to CATT is a lack of specificity because the antigens used are responsible for many cross-reactions and thus false positives.
  • blood, diluted blood or plasma have variable antibody titers against these antigens. Thus parasito logically positive patients may be CATT negative.
  • the CATT does not allow the diagnosis of stage and a satisfactory serological follow-up of the patients after treatment, in particular because of the cross reactions with other infections.
  • High titers of anti-WE antibodies of IgM isotype were measured by ELISA in the serum of patients with human African trypanosomiasis (HAT), and increased titers were found in stage 2 patients (Okomo-Assoumou et al. al., 1995 (ref 2)).
  • the work of the inventors in this field has shown an unexpected effect of glutaraldehyde on the optimal orientation that it confers on synthetic antigen. Indeed, it has been found that glutaraldehyde serves as a spacer and orienting arm of the synthetic antigen WE when it is coupled to an inert support such as latex beads or ELISA plates. As illustrated in FIGS. 1A and 1B, to which the following example refers, the antigenic construct of the invention constitutes a mimotope of the natural antigen, when it is coupled only to the latter, which allows better recognition by anti-WE antibodies.
  • the object of the invention is therefore to provide a new antigenic construct. It also aims to take advantage of the properties of this construction in a kit and a screening method for human and animal trypanosomoses.
  • the antigenic construct of the invention is based on the coupling of an epitope of interest to glutaraldehyde and their attachment to an inert carrier.
  • the invention thus relates to an antigenic construct containing a tryptophan epitope, characterized in that it is formed of a tryptophan motif W, or a peptide of 3 or 4 amino acids comprising a motif W, coupled with glutaraldehyde.
  • said peptide corresponds to the sequence SEQ ID No. 1 CxWy, in which "x” represents K, A, S, V, T, R, I, E, D, N or G, and "y” represents D, S, T, E, N, K, G, Q, R or I, either of "x” or "y” may be absent.
  • a representative sequence, SEQ ID No. 2, is of the CKWD type.
  • said coupling product is grafted onto latex beads. This formulation makes it possible to develop a rapid agglutination technique on the sera of patients or animals affected, respectively, with THA or TAA.
  • the coupling product is grafted onto ELISA plates, making it possible to develop a quantitative technique of "anti-trypanosome" antibody levels in patients or animals suffering from HAT or TAA.
  • the coupling product as defined above is grafted onto poly-L-lysine deposited at the bottom of ELISA plates.
  • This arrangement makes it possible to have a completely synthetic system, whether for the development in the form of beads or ELISA test.
  • the invention also relates to a screening kit for THA or TAA, characterized in that it comprises
  • one or more reagents for the antigen / antibody reaction and / or buffer solutions and / or reagents for the detection, quantification or visualization of antigen / antibody complexes when present are one or more reagents for the antigen / antibody reaction and / or buffer solutions and / or reagents for the detection, quantification or visualization of antigen / antibody complexes when present.
  • the kit above advantageously comprises, according to a further feature of the invention, the reagents for carrying out an immunoassay, especially an indirect ELISA or an ELISA inhibition test, making an anti-monoclonal antibody compete with one another. -WE with anti-WE antibodies infected host sera.
  • the antigenic construct is attached to a support.
  • the invention is further directed to a method for screening for THA or TAA, characterized in that it comprises
  • This new serological diagnostic test which is cheap, stable and easy to handle, combined with an indirect ELISA or an ELISA-based inhibition test based on anti-WE antibodies and which has proved its effectiveness, can be used for a diagnosis of mass and stage (determination of antibody titers of patients in stages 1 and 2) of HAT or TAA in the field, with high specificity.
  • This test is particularly suitable for a specific screening of human or animal African trypanosomiasis.
  • FIGS. 1 to 5 represent, respectively,
  • Figures 1A-1C the native steric hindrance of the CKWD sequence (Figure 1A), an inert carrier-type sequence with amine-glutaraldehyde-W function ( Figure 1B), and a sequence attached to an ELISA plate (Fig. . 1 C)
  • Figure 2 and 3 the diagnostic test results, respectively, on human serum and blood
  • Figure 4 a graph of results obtained with animal sera infected with different species of Trypanosomes
  • Example 1 synthesis of coupling products W-glutaraldehyde or C-x-W-y-glutaraldehyde Production of coupled latex beads
  • hapten tryptophan or peptide
  • concentration of 5 mg / ml in a 1.5 M acetate buffer, pH 8.3, vial 100 ⁇ l of 5% glutaraldehyde are added under vortex for approximately 10 seconds.
  • amino latex beads (Sigma) are added and allowed to react for at least 10 minutes with slow stirring.
  • the reaction is stopped by addition of 100 ⁇ l of 1M NaBH 4 and leave the mixture for 10 minutes while stirring slowly.
  • the mixture is dialyzed against distilled water supplemented with NaBH 4 (lspatula / 51) all day long by changing the dialysis water 2 to 3 times, then about 14h (all night) with water, remove the excess of NaBH 4 .
  • FIGS. 1A and 1B show the planarized chemical formulas of the native epitopic sequence and the chemical sequences used according to the invention which clearly show that the construction of the invention reproduces the molecular configuration of the epitope of the invention. 'interest.
  • ELISA plate (Nunc, PolySorp or MaxiSorp)
  • 200 ⁇ l of a mixture of ⁇ of hapten tryptophan or peptide, 5 mg / ml in a 1.5 M acetate buffer pH 8.3 are added.
  • 100 ⁇ l of 5% glutaraldehyde added under vortex for about 10 seconds. Allowed to react for at least 30 minutes with slow stirring.
  • reaction is stopped by the addition of 100 ⁇ l of 1M NaBH 4 and the mixture is left for 10 minutes while stirring slowly.
  • the plates are washed (5 times 1 hour) with distilled water containing NaBH 4 (lspatule / 51), then about 14 hours (overnight) with water only, to remove excess NaBH 4 .
  • Example 3 Diagnostic Test Associating an ELISA Test for the Diagnosis of Stage

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Abstract

L'invention a pour objet une construction antigénique renfermant un épitope trytophane, caractérisée en ce qu'elle est formée d'un motif tryptophane W,ou d'un peptide de 3 ou 4 acides aminés comportant un motif W, couplé à du glutaraldéhyde. Application au dépistage de la trypanosomose humaine ou animale.

Description

Construction antigénique et ses applications pour le dépistage de trypanosomoses chez l'homme et l'animal
L'invention a pour objet une construction antigénique et son utilisation pour élaborer un kit et mettre en œuvre une méthode de dépistage de trypanosomoses chez l'homme et l'animal.
La trypanosomose africaine humaine (THA) et la trypanosomose animale (TAA) affectent principalement les communautés rurales pauvres et sont bien souvent des maladies négligées, qui posent un grave problème de santé publique et un frein au développement économique de nombreux pays. La plus grande difficulté pour le contrôle de ces maladies résulte de la grande variabilité de la symptomatologie clinique associée au manque de sensibilité et de spécificité ou à la lourdeur de réalisation des tests de dépistage disponibles.
Un criblage actif de la population à risque est donc essentiel pour identifier précocement les individus infectés et réduire la transmission en diminuant le réservoir de parasites. De plus, un dépistage de THA doit inclure un diagnostic de stade 1 (lymphatico- sanguin) ou 2 (neurologique), car les patients en stade 2 sont traités au mélarsoprol dont les effets secondaires toxiques sont importants (mortalité globale de 5-10%). Le diagnostic de stade dépend encore aujourd'hui de l'examen du liquide céphalo-rachidien après ponction lombaire et le seuil de positivité de la cytorachie fait toujours débat (5, 10 ou 20 cellules/μΐ).
Actuellement, le CATT (Card Agglutination Test For Trypanosomiasis)/!1. b. gambiense correspond au test sérologique le plus couramment utilisé. Le test comporte des trypanosomes fixés du variant LiTat 1.3. Une variante du CATT se compose d'antigènes semi-purifîés (LiTat 1.3, 1.5 et 1.6) couplés à des billes de latex. Le principal problème lié au CATT est un manque de spécificité car les antigènes utilisés sont responsables de nombreuses réactions croisées et donc de faux-positifs De plus, le sang, le sang dilué ou le plasma ont des titres anticorps variables contre ces antigènes. C'est ainsi que des patients parasito logiquement positifs peuvent être négatifs au CATT. Enfin, le CATT ne permet pas le diagnostic de stade et un suivi sérologique satisfaisant des patients après traitement en particulier à cause des réactions croisées avec d'autres infections.
On mesure donc l'intérêt de disposer de nouveaux antigènes pour améliorer le dépistage, la détermination des stades et le suivi des THA et des TAA. Bien que quelques antigènes se soient révélés intéressants d'un aspect pathophysiologique, leur manipulation en conditions de terrain (Semballa et al., 2004 (réf. 1)) s'est avérée difficile. Les épitopes tryptophane (WE) qui représentent des antigènes constants du trypanosome induisent les anticorps spécifiques chez l'hôte (homme ou animal). Ces épitopes comprennent l'acide aminé L-tryptophane et sont situés dans des domaines constants de la partie C-terminale des glycoprotéines variables de surface (VSG). Des titres élevés d'anticorps anti-WE d'isotype IgM ont été mesurés par ELISA dans le sérum des patients atteints de trypanosomose humaine africaine (THA), et des titres accrus ont été trouvés chez les patients en stade 2 (Okomo-Assoumou et al., 1995(réf. 2)).
Ces résultats pionniers avaient été obtenus par le laboratoire des inventeurs grâce à des épitopes synthétiques proposés pour étudier leur reconnaisance par des anticorps anti- WE, notamment des constructions WE-glutaraldéhyde- BSA. Dans ces constructions, le glutaraldéhyde joue le rôle de fixateur entre l'antigène synthétique WE et la protéine porteuse (ici l'albumine bovine BSA). Ces constructions ont permis de démontrer le potentiel de l'épitope WE comme cible diagnostique.
Les travaux des inventeurs dans ce domaine ont montré un effet inattendu du glutaraldéhyde portant sur l'orientation optimale qu'il confère à l'antigène synthétique. En effet, il est apparu que le glutaraldéhyde sert de bras espaceur et orientateur de l'antigène synthétique WE lorsque celui-ci est couplé à un support inerte tel que des billes de latex ou des plaques ELISA. Comme illustré sur les figures 1A et 1B, auxquelles se réfère l'exemple ci-après, la construction antigénique de l'invention constitue un mimotope de l'antigène naturel, lorsqu'il est couplé uniquement à ce dernier, ce qui permet une meilleure reconnaissance par des anticorps anti-WE.
L'invention a donc pour but de fournir une nouvelle construction antigénique. Elle vise également la mise à profit des propriétés de cette construction dans un kit et une méthode de dépistage des trypanosomoses humaines et animales.
La construction antigénique de l'invention repose sur le couplage d'un épitope d'intérêt à du glutaraldéhyde et leur fixation sur un support inerte. L'invention vise ainsi une construction antigénique renfermant un épitope trytophane, caractérisée en ce qu'elle est formée d'un motif tryptophane W, ou d'un peptide de 3 ou 4 acides aminés comportant un motif W, couplé à du glutaraldéhyde.
De préférence ledit peptide répond à la séquence SEQ ID N°l C-x-W-y, dans laquelle « x » représente K, A, S, V, T, R, I, E, D, N ou G, et « y » représente D, S, T, E, N, K, G, Q, R ou I, l'un ou l'autre de « x » ou de « y » pouvant être absent .
Une séquence représentative, SEQ ID N°2, est du type CKWD. Selon une disposition avantageuse, ledit produit de couplage est greffé à des billes de latex. Cette formulation permet de développer une technique rapide d'agglutination sur les sérums de patients ou d'animaux atteints, respectivement, de THA ou de TAA.
Selon une autre disposition, utilisée avantageusement avec la précédente, le produit de couplage est greffé sur des plaques ELISA, permettant de développer une technique quantitative des taux d'anticorps « anti-trypanosomes » chez les patients ou animaux atteints de THA ou TAA.
Selon encore une autre disposition, le produit de couplage tel que défini ci-dessus est greffé sur de la poly-L-lysine déposée au fond de plaques ELISA.
Cette disposition permet d'avoir un système entièrement synthétique, que ce soit pour le développement sous forme de billes ou de test ELISA.
L'invention vise également un kit de dépistage de THA ou de TAA, caractérisé en ce qu'il comprend
- au moins une construction antigénique telle que définie ci-dessus, avec éventuellement
un ou plusieurs réactifs pour la réaction antigène/anticorps et/ou des solutions tampons et/ou des réactifs pour la détection, la quantification ou la visualisation des complexes antigènes/anticorps lorsqu'ils sont présents.
Le kit ci-dessus comprend avantageusement, selon une disposition supplémentaire de l'invention, les réactifs pour réaliser un test de révélation immuno-enzymatique, notamment un test ELISA indirect ou un test ELISA d'inhibition, faisant entrer en compétition un anticorps monoclonal anti-WE avec les anticorps anti-WE des sérums d'hôtes infectés.
Dans une variante de réalisation, la construction antigénique est fixée à un support.
L'invention vise en outre une méthode de dépistage de THA ou de TAA, caractérisée en ce qu'elle comprend
. la mise en contact d'un échantillon de sérum d'un patient ou d'un animal avec une construction antigénique telle que définie ci-dessus, avantageusement en utilisant un kit tel que décrit ci-dessus,
. la révélation d'une réaction immunologique du type antigène-anticorps. Dans la variante où la construction antigénique est fixée à des billes de latex, la mise en contact avec l'échantillon de sérum conduit à une agglutination du sérum si le patient ou l'animal est respectivement atteint de THA ou de TAA. Cette méthode diagnostique séro logique permet d'effectuer un dépistage de masse, la détermination du stade et le suivi des THA et des TAA. Elle présente l'avantage d'une grande sensibilité et d'une forte spécificité en évitant les réactions croisées avec d'autres infections (faux positifs) et de faux négatifs (séronégatifs au CATT en parasita logie).
Ce nouveau test diagnostique sérologique, bon marché, stable et facile à manipuler, associé le cas échéant à un test ELISA indirect ou ELISA d'inhibition basé sur les anticorps anti-WE et qui a prouvé son efficacité, pourra être employé pour un diagnostic de masse et de stade (détermination des titres anticorps des patients aux stades 1 et 2) de la THA ou de la TAA sur le terrain, avec une grande spécificité. Ce test est particulièrement approprié pour un dépistage spécifique de la trypanosomose africaine humaine ou animale.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés à titre illustratif dans les exemples qui suivent de réalisation de l'invention. Dans ces exemples, il est fait référence aux figures 1 à 5, qui représentent, respectivement,
les Figures 1A à 1C, l'encombrement stérique natif de la séquence CKWD (Fig. 1A), une séquence type-support inerte avec fonction amine-glutaraldéhyde-W (Fig. 1B), et une séquence fixée sur une plaque ELISA (Fig. 1C)
les Figure 2 et 3 les résultats de test diagnostique, respectivement, sur sérum humain et sang,
la figure 4, un graphe de résultats obtenus avec des sérums animaux infectés par différentes espèces de Trypanosomes ;
la Figure 5, les taux d'anticorps anti-W dans le sérum de malades atteints de THA (stades 1 et 2).
Exemple 1 : synthèse de produits de couplage W-glutaraldéhyde ou C-x-W-y-glutaraldéhyde Fabrication des billes de latex couplées
A 100 μΐ d'haptène (tryptophane ou peptide) à la concentration de 5 mg/ml dans un tampon acétate 1,5 M pH 8,3, on ajoute sous vortex pendant 10 secondes environ 100 μΐ de glutaraldéhyde 5 %.
Sans attendre, on ajoute 50 μΐ de billes de latex aminés (Sigma) et on laisse réagir pendant au moins 10 mn sous agitation lente.
La réaction est arrêtée par addition de 100 μΐ de NaBH4 1M et laisser le mélange pendant 10 mn encore sous agitation lente. Le mélange est dialysé contre de l'eau distillée additionnée de NaBH4 (lspatule/51) toute la journée en changeant l'eau de dialyse 2 à 3 fois, puis environ 14h (toute la nuit) avec de l'eau seilement, pour éliminer l'excès de NaBH4.
A titre illustratif, on rapporte sur les Figures 1A et 1B les formules chimiques développées planes de la séquence épitopique native et des séquences chimiques utilisées selon l'invention qui montrent clairement que la construction de l'invention reproduit la configuration moléculaire de l'épitope d'intérêt.
Fabrication des plaques ELISA
Par puits de plaque ELISA (Nunc, PolySorp ou MaxiSorp), on ajoute 200 μΐ d'un mélange de ΙΟΟμΙ d'haptène (tryptophane ou peptide, 5 mg/ml dans un tampon acétate 1,5 M pH 8,3) et de 100 μΐ de glutaraldéhyde 5 % ajouté sous vortex pendant 10 secondes environ. On laisse réagir pendant au moins 30 mn sous agitation lente.
On arrête la réaction par addition de 100 μΐ de NaBH4 1M et on laisse le mélange pendant 10 mn encore sous agitation lente.
Les plaques sont lavées (5 fois 1 heure) avec de l'eau distillée additionnée de NaBH4 (lspatule/51), puis environ 14 heures (toute la nuit) avec de l'eau seulement, pour éliminer l'excès de NaBH4.
Une construction avec un motif Poly-L-lysine fixé sur une plaque LISA est donnée à titre illustratif sur la Figure 1C.
Exemple 2 : test diagnostique sur sérum humain (ou animal) avec billes de latex
Pour le dépistage rapide, 20 μΐ de billes de latex conjugués sont mélangés avec 20 μΐ de sérums dilués ou non ou 20 μΐ de sang total. Au bout de 5 à 10 mn, comme illustré sur les Figures 2 (avec sérum) et 3 (avec sang), on observe un anneau caractéristique de la positivité de la réaction. A défaut la réaction est considérée comme négative.
Exemple 3 : test diagnostique associant un test ELISA pour le diagnostique de stade
Les résultats obtenus sont illustrés par la Fig L'utilisation des plaques ELISA avec des sérums de patients atteints de THA montre une augmentation des taux d'anticorps anti-WE lors du passage en stade 2 (atteinte neurologique).
Références bibliographiques
- Semballa et al, expérimental Parasitology 115 (2007) 173-180
- Okomo-Assoumou et al, Ann. J. Trop. Med. Hyg., 1995, pp 461-467 pistage de la trypanosomose humaine ou animale.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Construction antigénique renfermant un épitope trytophane, caractérisée en ce qu'elle est formée d'un motif tryptophane W, ou d'un peptide de 3 ou 4 acides aminés comportant un motif W, couplé à du glutaraldéhyde.
2 - Construction antigénique selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit peptide répond à la séquence SEQ ID N°l C-x-W(-y), dans laquelle « x » représente K, A, S, V, T, R, I, E, D, N ou G, et « y » représente D, S, T, E, N, K, G, Q, R ou I , l'un de « x » ou « y » pouvant être absent .
3 - Construction antigénique selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit peptide répond à la séquence SEQ ID N°2 CKWD.
4 - Construction antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit produit de couplage est greffé à des billes de latex ou de la poly-L- lysine.
5 - Construction antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit produit de couplage est greffé sur des plaques ELISA.
6 - Construction selon la revendication 5, caractérisée en ce que les plaques ELISA comportent de la poly-L-lysine.
7 - Kit de dépistage de la trypanosomose humaine ou animale, caractérisé en ce qu'il comprend
au moins une construction antigénique selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, avec éventuellement
un ou plusieurs réactifs pour la réaction antigène/anticorps et/ou des solutions tampons et/ou des réactifs pour la détection, la quantification ou la visualisation des complexes antigènes/anticorps lorsqu'ils sont présents.
8 - Kit selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les réactifs pour réaliser un test de révélation immuno-enzymatique, notamment un test ELISA indirect ou un test ELISA d'inhibition, faisant entrer en compétition un anticorps monoclonal anti- WE avec les anticorps anti-WE des sérums d'hôtes infectés.
9 - Kit selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que la construction antigénique est fixée sur un support.
10- Kit selon l'une quelconque des revendications 7 à 9, caractérisée en ce qu'il est utilisé pour le dépistage de la trypanosomose africaine humaine ou animale.
11 - Méthode de dépistage de THA ou de TAA, caractérisée en ce qu'elle comprend
. la mise en contact d'un échantillon de sérum d'un patient ou d'un animal avec une construction antigénique telle que définie ci-dessus, avantageusement en utilisant un kit selon l'une quelconque des revendications 7 à 10,
. la révélation d'une réaction immunologique du type antigène-anticorps.
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