WO1998029450A1 - Peptides antigeniques reagissant avec les anticorps anti-ovaire - Google Patents

Peptides antigeniques reagissant avec les anticorps anti-ovaire Download PDF

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WO1998029450A1
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Colette Jolivet-Reynaud
Gilbert Faure
Pascal Dalbon
Michel Jolivet
Marie-Christine Bene
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/36—Gynecology or obstetrics

Definitions

  • the present invention relates to immunology and its direct incidence in endocrinology, both in humans and in animals. More particularly, this incidence concerns the reproductive system. It is indeed through pathologies such as spontaneous repeat abortions, anti-phospholipid antibody syndrome, pre-psyche, that dysimmunity mechanisms have been observed in obstetrics and gynecology.
  • IVF in vitro fertilization
  • the inventors of the present invention have surprisingly discovered that a well-defined peptide sequence, which corresponds to the level of its primary structure to part of the ⁇ subunit of FSH, exhibits an antigenic and immunogenic character vis-à-vis against anti-ovary antibodies, as defined above.
  • ovarian autoimmunity is today mainly approached using animal tissue substrates and on animal ovarian extracts (4).
  • the ovarian extract used by MONCAYO et al. was of animal, bovine origin.
  • the recognized antigens have not been shown to be the same in humans and in cattle.
  • an antigenic peptide capable of replacing the ovarian extracts is provided, as well as the follicular stimulation hormone (FSH or gonadotropin A) which remains a product which is difficult to purify, and only available on the market in recombinant forms.
  • FSH or gonadotropin A the follicular stimulation hormone
  • the first object of the invention is an oligopeptide consisting of the reference peptide sequence Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys (SEQ ID NO: 5), or any peptide sequence, functional variant of said reference sequence, in the sense that the first has antigenicity and / or immunogenicity to anti-ovary antibodies equivalent to the antigenicity and / or immunogenicity of the second.
  • a functional variant of said reference sequence is advantageously obtained by modifying the hydrocarbon residue of at least one of the amino acids of said reference sequence, while retaining an antigenicity identical or similar to that of said reference sequence, or well by modifying the hydrocarbon residue of at least one of the amino acids of said reference sequence, while substantially retaining the hydrophilic / hydrophobic nature of said hydrocarbon residue.
  • equivalent activity is meant an activity, antigenic and / or immunogenic, identical or similar, even if there may be differences in degree in the antigenic and / or immunogenic responses.
  • oligopeptide of the invention can thus consist of a peptide sequence corresponding to the formula:
  • Xaal represents threonine
  • Xaa2 represents glutamine
  • Xaa3 represents cysteine
  • Xaa4 represents histidine
  • Xaa5 represents cysteine
  • Xaa6 represents glycine
  • Xaa7 represents lysine
  • Xaa8 represents cysteine, said sequence being identified by SEQ ID NO: 5, or a peptide sequence, functional variant of
  • said functional variant sequence corresponds to the formula
  • Xaal represents threonine or the NH 2 -CH (R1) COOH unit
  • RI is an oxygenated hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5,
  • Xaa2 represents glutamine or the NH 2 -CH (R2) COOH unit
  • R2 is an oxygenated and / or amino hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5, Xaa3 represents cysteine or the NH 2 -CH (R3) COOH unit where
  • R3 is a sulfur-containing hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5, Xaa4 represents histidine or the NH 2 -CH (R4) COOH unit where
  • R4 is an amino hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5
  • Xaa5 represents cysteine or the NH 2 -CH (R5) COOH unit where R5 is a sulfur-containing hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5,
  • Xaa6 represents glycine or the NH 2 -CH (R6) COOH unit where R6 is a hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5,
  • Xaa7 represents lysine or the NH 2 -CH (R7) COOH unit where R7 is an amino hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5,
  • Xaa8 represents cysteine or the NH -CH (R8) COOH unit
  • R8 is a sulfur-containing hydrocarbon radical conferring on said variant sequence an antigenicity identical or similar to that of SEQ ID NO: 5.
  • the radicals RI and / or R2 and / or R3 and / or R4 and / or R5 and / or R6 and / or R7 and / or R8 constituting said units are respectively chosen from radicals conferring on said units a hydrophilicity / hydrophobicity identical or similar to that of the respectively corresponding amino acids.
  • oligopeptide sequence SEQ ID No. 5 As functional variants of the peptide sequence SEQ ID No. 5, there may be mentioned, for example, the oligopeptide consisting of the peptide sequence SEQ ID No. 1.
  • Example 2 below effectively demonstrates identical activity for the oligopeptides SEQ ID No. 1 and 5.
  • the oligopeptides SEQ ID No. 2, 3 and 4 having a lower activity than the oligopeptides mentioned above, are considered in the present invention as functional variants. Indeed, insofar as their antigenic and immunogenic activity vis-à-vis anti-ovary antibodies is weaker but useful all the same, for example in mixture with other oligopeptides of same activity, in a diagnostic kit, these oligopeptides are functional variants of SEQ ID No. 5.
  • oligopeptides described at the end of the description are: - SEQ ID No. 1: linear sequence of 16 amino acids corresponding to the amino acid sequence 78-93 of the ⁇ chain of FSH,
  • - SEQ ID No. 2 sequence of 16 amino acids, bridged by a disulfide bond in position 5 and 7, corresponding to the amino acid sequence 78-93 of the ⁇ chain of FSH
  • - SEQ ID N ° 3 sequence of 16 amino acids, bridged by a disulfide bond in position 5 and 10, corresponding to the amino acid sequence 78-93 of the ⁇ chain of FSH
  • - SEQ ID N ° 4 sequence of 16 amino acids, bridged by a disulfide bond in position 7 and 10, corresponding to the amino acid sequence 78-93 of the ⁇ chain of FSH
  • the surprising character of the invention is that the oligopeptides of the invention, such as those represented by SEQ ID Nos. 1 and 5, whose primary structure of amino acids corresponds respectively to amino acids 78-93 and 80-87 of FSH ⁇ chain, however probably having a different spatial structure from that of the FSH ⁇ chain, exhibit antigenic and / or immunogenic activity vis-à-vis anti-ovarian antibodies.
  • the oligopeptide has the peptide sequence identified by SEQ ID No. 5.
  • 1 Oligopeptide has the peptide sequence identified by SEQ ID No. 1.
  • 1 Oligopeptide has the peptide sequence identified by SEQ ID No. 2 or 3 or 4, as identified at the end of the description.
  • a second object of the present invention is an antigenic compound capable of being recognized by anti-ovary antibodies, or an immunogenic compound capable of inducing the production of anti-ovary antibodies, said compound responding at least to any one of the following definitions: a compound having a peptide sequence comprising the sequence of the oligopeptide described above, and preferably comprising the sequence SEQ ID NO: 5; in particular, such a compound has a peptide sequence which comprises or consists of SEQ ID NO: 1, as identified at the end of the description;
  • Immunogenicity is representative of the antigenicity or immunogenicity of crude ovarian antigens, the primary structure of said compound comprising a peptide sequence corresponding to the sequence of amino acids 78-93 of the ⁇ chain of FSH in mankind or of any animal species, said sequence being i munodominant and being recognized by the anti-ovary antibodies of said human race or of said species.
  • Another subject of the invention is an antigenic or immunogenic composition vis-à-vis anti-ovary antibodies, comprising an antigenic or immunogenic compound as defined above.
  • a third subject of the invention is a method for detecting and / or quantifying anti-ovary antibodies in a biological sample, comprising the step consisting in bringing said biological sample into contact with at least one peptide or a compound of l invention, and to observe the formation of an antigen-antibody complex between said peptide or compound and an anti-ovary antibody.
  • the formation of the aforementioned complex can be detected by various conventional bioassay formats known to those skilled in the art, such as the techniques immunocytochemical, i munoenzymatic (ELISA), techniques by competition and "sandwich".
  • ELISA immunocytochemical, i munoenzymatic
  • the biological sample is advantageously chosen from blood serum, follicular fluid, peritoneal fluid, cervical mucus and saliva.
  • the observation step of the formation of an antigen-antibody complex is preferably carried out according to the immunoenzymatic technique called ELISA, which has made it possible to obtain results perfectly correlated with those obtained by the reference technique for the skilled person, namely, indirect immunofluorescence.
  • ELISA immunoenzymatic technique
  • the last objects of the invention are, on the one hand, a reagent for detecting and / or quantifying anti-ovary antibodies comprising at least one peptide or compound of the invention, and, on the other hand, a kit for detection and / or quantification of anti-ovary antibodies comprising at least said reagent.
  • a peptide sequence, a functional variant of the reference peptide sequence (SEQ ID NO: 5) is an amino acid sequence, known as modified, which differs from the sequence (SEQ ID NO: 5) by modifications which confer on said variant sequence functional, an antigenicity identical or similar to that of the reference sequence.
  • the modifications of said sequence may relate to its size, as well as to each of the amino acids which constitute it.
  • Such modifications are chosen in particular from substitutions, deletions and additions of amino acids in the sequence of the first oligopeptide, but also from the replacement of an amino acid of the L series with an amino acid of the D series, a modification of the side chains of amino acids, modification of peptide bonds such as carba, retro, inverso, retro-inverso, reduced or methylene-oxy bonds, provided that these modifications do not lead to any significant alteration of the antigenic properties of said sequence vis-à-vis anti-ovary antibodies.
  • an amino acid of SEQ ID NO: 5 can be replaced by another amino acid with the same hydrophilicity / hydrophobicity or comparable hydrophilicity / hydrophobicity.
  • the skilled person who routinely uses the techniques at his disposal, in particular automated peptide synthesis techniques and techniques for determining the antigenicity of a peptide such as ELISA tests, is in a first position step, to synthesize a modified sequence as defined above, and, in a second step, to test the antigenicity of the peptide obtained. If the latter has an antigenicity at least substantially equivalent to that of said reference sequence, it meets the definition of functional variant sequence of said reference sequence.
  • a person skilled in the art can in particular refer to Examples 2 and 3 below, which describe a protocol to be followed in order to compare the antigenicity of two peptides, with respect to AOAs.
  • a compound of the invention comprises a sequence of a variable number of amino acids, comprising at least the sequence of an oligopeptide of the invention. It may in particular consist of a protein, a glycoprotein, a fusion protein, a fusion peptide. It can also be fixed on a solid support.
  • An oligopeptide or a polypeptide of the invention can be obtained by any production route and in particular chemical synthesis or genetic recombination.
  • the objects of the invention are also of interest, apart from the search for hypotheses physiopathogenic to certain clinical situations, as previously stated. Indeed, the provision of a reliable test for assessing anti-ovary antibodies may have other diagnostic and therapeutic applications.
  • the gonadal axis is the most fragile axis of the endocrine axes.
  • the achievement of gonadal function may be the first sign of the disease.
  • an exploration of anti-ovarian antibodies may be the first sign of early autoimmune oophoritis.
  • FIG. 1 represents the increase in the levels of anti-peptide antibodies SEQ ID NO: 1,
  • - Figure 2 shows the increase in anti-peptide antibody levels SEQ ID NO: 1, after the first IVF attempt and the increase in IgM SEQ ID NO: 1, after the subsequent IVF attempts
  • - Figure 3 represents the comparative evolution of anti-ovary and anti-peptide antibodies SEQ ID NO: 1, before and after puncture in a population of women suffering from tubal sterility
  • the concentration of molecules to be adsorbed was determined by chessboard tests for each antigen. It is approximately 1 ⁇ g per well.
  • the antigens are fixed to the solid phase overnight at + 4 ° C at the rate of 100 ⁇ l per well of the antigen solution in carbonate-bicarbonate buffer.
  • the plate is empty.
  • the solid phase sites which are not yet occupied are saturated during an incubation of one hour at 37 ° C. with 200 ⁇ l per well of 5% of milk powder reconstituted in PBS.
  • the samples to be tested are diluted in PBS supplemented with 0.5% BSA and 0.2% Tween 20: dilution 1/50 for the search for anti-ovary and anti-yellow body antibodies.
  • the plate is emptied and washed 3 times in PBS.
  • the samples are distributed at the rate of 100 ⁇ l per well.
  • the plate is incubated for 45 minutes at 37 ° C.
  • the anti-isotypes are diluted in the same solution as that which was used for the dilution of the samples:
  • the plate is again emptied and washed 3 times in PBS.
  • the anti-isotypes are then distributed at the rate of 100 ⁇ l per well.
  • the plate is incubated for 45 minutes at 37 ° C.
  • the development solution is prepared extemporaneously, as follows for a plate:
  • the reaction is stopped with 50 ⁇ l of SO 4 H.
  • the plate is read with a spectrophotometer, at 492 nm using the Multiskan II reader.
  • the results are first expressed in optical density (OD) then calculated in ratios compared to a sample of controls at the limit of positivity. Any ratio greater than 1 is considered positive.
  • FSH the peptides consisting of the sequence of amino acids 78-93 and 80-87 of the ⁇ chain of FSH, identified respectively by SEQ ID N ° 1 and 5, are recognized by both by sera containing anti-ovary antibodies and by 2 anti ⁇ -FSH monoclonal antibodies (bioMérieux property, 22A3G7; 5H3E8) which have the characteristic of being immunoreactive with metrodine and ovarian extracts while an anti-monoclonal antibody ⁇ -FSH (bioMérieux property, 7G5A1) does not recognize that metrodine does not react with this sequence.
  • the immunoenzymatic technique used is that described in Example 1.
  • the patients included in the study were all on IVF protocol. Their average age was 32.7 + 4.2 years. The mean duration of infertility was 4.8 + 2.8 years.
  • the serum was collected on the eighth day of stimulation and in 84 cases, the serum was collected 15 days after the puncture.
  • this threshold is lower than that defined for AOA IgA (1.7 for oocytes and embryos). - Depending on the outcome of the attempt
  • the average levels of anti-peptide antibodies SEQ ID NO: 1 were compared according to whether the assay of the plasma HCG (chorionic gonadotropin) was positive (biological pregnancy) or negative (absence of implantation). As shown in Figure 4, lower average antibody levels were found when the HCG was positive.
  • follicular puncture stimulates the appearance of anti-peptide antibodies SEQ ID NO: 1, and patients with such antibodies in their serum are less likely to get pregnant after IVF.

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Abstract

Oligopeptide consistant en la séquence peptidique de référence Thr Gln Cys His Cys Gly Lys Cys (SEQ ID NO: 5), ou toute séquence peptidique, variante fonctionnelle de ladite séquence de référence, composé antigénique ou immunogène comprenant un tel oligopeptide et applications, notamment à la détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire, dans un échantillon biologique.

Description

Peptides antigeniques réagissant avec les anticorps anti-ovaire
La présente invention concerne 1 ' immunologie et son incidence directe en endocrinologie, aussi bien chez l'homme que chez l'animal. Plus particulièrement, cette incidence concerne le système reproducteur. C'est en effet par le biais de pathologies telles que avortements spontanés à répétition, syndrome des anticorps anti- phospholipides, préécla psie, que des mécanismes dysimmunitaires ont été observés en gynécologie- obstétrique.
Le développement des techniques de fécondation in vitro (FIV) a largement contribué à améliorer la compréhension des mécanismes de la fécondation humaine. Cette technique se heurte cependant parfois à des échecs inattendus. Le rôle de réactions immunitaires défavorables générées par la technique elle-même a été envisagé, en raison des traumatismes importants infligés à l'ovaire au cours de la stimulation hormonale et des ponctions folliculaires susceptibles de libérer des quantités importantes de matériel potentiellement antigénique dans la cavité péritonéale.
Des travaux antérieurs ont mis en évidence des éléments antigeniques au niveau des thèques, constituants de l'ovaire, et la présence d'anticorps sériques dirigés contre les cellules des thèques ovariennes ou contre le corps jaune, a été rapportée dans différents contextes pathologiques (insuffisance surrénalienne, insuffisance ovarienne plus ou moins associée à une polyendocrinopathie) (6). En outre, SHIVERS et al. (1) ont montré que des anticorps fabriqués contre des antigènes ovariens, dits anticorps anti-ovaire (AOA) inhibaient la fécondation in vitro chez le hamster. Le document de SAXENA et RATHNAM (" Chemical synthetesis of peptide fragments of the hormone-specific beta-subunit of human follicule-stimulating hormone ", Biochemistry, vol.24, N°3, 1985, pp 813-816) divulgue la synthèse chimique de peptides afin de déterminer les déterminants antigeniques spécifiques de l'hormone FSH humaine. Ce sont les peptides V3 + C2 ( correspondant aux acides aminés 76-118 de la sous-unité β de la FSH) et VI + Cl (correspondant aux acides aminés 1-33 de la sous- unité β de la FSH) qui sont présentés comme étant les déterminants antigeniques de l'hormone FSH, lesquels sont réactifs envers les anticorps des hormones LH et TSH, ce qui prouve une homologie des sites antigeniques pour les trois hormones FSH, LH et TSH. Le document de SANTA-COLOMA et al. (" Serine analogues of hFSH-beta- (33-53 ) and hFSH-beta- (81-95) inhibit hFSH binding to receptor ", Biochemical and Biophysical Research Communications , vol.184, N°3, 15 Mai 1992, pp 1273-1279) divulgue des peptides synthétiques, correspondant aux acides aminés 33-53 et 81-95 de la sous- unité β de la FSH, contenant des groupes sulfydryles libres, qui permettent d'inhiber la liaison de l'hormone FSH à son récepteur et qui présentent également une activité agoniste partielle sur ledit récepteur de la FSH. II est précisé que les 4 résidus cystéine ne sont pas essentiels à la liaison au récepteur mais sont importants pour l'activité agoniste partielle de ces peptides sur le récepteur.
Le document de TANG et al. (" Prématuré ovarian failure: a search for circulating factors against gonadotrophin receptors, American Journal of Obstretics and Gynecology, vol.146, N°7, 1 Août 1983, pp 813-821) présente une étude effectuée sur neuf patientes présentant une ménopause précoce. Cette étude suggère que des facteurs actifs contre le récepteur de la gonadotrophine ne semblent pas être impliqués chez la majorité des patientes présentant un défaut prématuré des ovaires. Par contre, un facteur actif contre le récepteur FSH, qui peut être un anticorps, est suggéré comme pouvant être présent chez les patientes présentant une ménopause précoce et une auto-immunité.
Les inventeurs de la présente invention ont découvert de façon surprenante qu'une séquence peptidique bien définie, qui correspond au niveau de sa structure primaire à une partie de la sous-unité β de la FSH, présentait un caractère antigénique et immunogène vis-à-vis des anticorps anti-ovaire, tels que définis précédemment .
Au cours de travaux précédents, les auteurs de la présente invention ont mis en évidence l'existence d'une corrélation entre le taux d'anticorps anti-ovaire observé et les échecs des tentatives de FIV (2) .
Les auteurs se sont alors intéressés aux antigènes potentiellement impliqués dans la génération de ces réponses auto-immunes, et ont d'abord isolé et caractérisé un peptide immunodominant réagissant avec les anticorps anti-ovaire, puis démontré l'intérêt de ce peptide dans la détection des AOA.
L'importance de cette détection a été mise en évidence, dans différentes pathologies entraînant des stérilités, par les auteurs de la présente invention.
En examinant les taux d'AOA en pré- et post- ponction folliculaire, ceux-ci ont observé, chez des femmes en première tentative de FIV, un taux d'AOA supérieur au taux de femmes témoins, alors que pour ces femmes un protocole "FIV avait été préconisé dans différents cas de stérilité, à savoir des stérilités d'origine tubaire, d'origine idiopathique, résultant d'une endométriose ou liées à des troubles sévères de 1 Ovulation. La détection des anticorps anti-ovaire dans une pathologie de stérilité, après une ou plusieurs tentatives vaines de FIV, peut devenir déterminante dans la conduite à tenir concernant ces échecs. Les auteurs ont en effet démontré l'efficacité d'une corticothérapie sur l'issue favorable d'une tentative de FIV (3). L'étude de l'auto-immunité ovarienne est aujourd'hui essentiellement approchée à l'aide de substrats tissulaires animaux et sur des extraits ovariens animaux (4). L'extrait ovarien utilisé par MONCAYO et al. était d'origine animale, bovine. Il n'a pas été démontré que les antigènes reconnus étaient effectivement les mêmes dans l'espèce humaine et chez les bovins.
Selon la présente invention, on apporte un peptide antigénique susceptible de remplacer les extraits ovariens, ainsi que l'hormone de stimulation folliculaire (FSH ou gonadotrophine A) qui reste un produit difficile à purifier, et seulement disponible sur le marché sous des formes recombinantes.
Les études immunochimiques effectuées par les auteurs ont donc permis de détecter un oligopeptide immunodominant vis-à-vis des AOA, appartenant à la chaîne beta de la FSH.
Ainsi le premier objet de l'invention est un oligopeptide consistant en la séquence peptidique de référence Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys (SEQ ID NO: 5) , ou toute séquence peptidique, variante fonctionnelle de ladite séquence de référence, au sens où la première présente une antigénicité et/ou une immunogénicité vis-à- vis d'anticorps anti-ovaire équivalente à 1 ' antigénicité et/ou 1 ' immunogénicité de la seconde. Une variante fonctionnelle de ladite séquence de référence est avantageusement obtenue en modifiant le reste hydrocarboné d'au moins l'un des acides aminés de la dite séquence de référence, tout en conservant une antigénicité identique ou similaire à celle de ladite séquence de référence, ou bien en modifiant le reste hydrocarboné d'au moins l'un des acides aminés de ladite séquence de référence, tout en conservant substantiellement le caractère hydrophile/hydrophobe dudit reste hydrocarboné.
Par activité équivalente on entend une activité, antigénique et/ou immunogène, identique ou similaire, même s'il peut exister des différences de degré dans les réponses antigeniques et/ou immunogènes .
Un oligopeptide de l'invention peut ainsi consister en une séquence peptidique répondant à la formule :
Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8, formule dans laquelle :
Xaal représente la thréonine,
Xaa2 représente la glutamine, Xaa3 représente la cystéine,
Xaa4 représente l'histidine,
Xaa5 représente la cystéine,
Xaa6 représente la glycine,
Xaa7 représente la lysine, et Xaa8 représente la cystéine, ladite séquence étant identifiée par SEQ ID NO: 5, ou une séquence peptidique, variante fonctionnelle de
SEQ ID NO: 5.
De préférence, ladite séquence variante fonctionnelle répond à la formule
Xaal-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8, formule dans laquelle :
Xaal représente la thréonine ou l'unité NH2-CH(R1) COOH où
RI est un radical hydrocarboné oxygéné conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5,
Xaa2 représente la glutamine ou l'unité NH2-CH (R2) COOH où
R2 est un radical hydrocarboné oxygéné et/ou aminé conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5, Xaa3 représente la cystéine ou l'unité NH2-CH (R3) COOH où
R3 est un radical hydrocarboné soufré conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5, Xaa4 représente l'histidine ou l'unité NH2-CH(R4) COOH où
R4 est un radical hydrocarboné aminé conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5, Xaa5 représente la cystéine ou l'unité NH2-CH (R5) COOH où R5 est un radical hydrocarboné soufré conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5,
Xaa6 représente la glycine ou l'unité NH2-CH (R6) COOH où R6 est un radical hydrocarboné conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5,
Xaa7 représente la lysine ou l'unité NH2-CH (R7) COOH où R7 est un radical hydrocarboné aminé conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5,
Xaa8 représente la cystéine ou l'unité NH -CH (R8) COOH où
R8 est un radical hydrocarboné soufré conférant à ladite séquence variante une antigénicité identique ou similaire à celle de SEQ ID NO: 5. De manière avantageuse, les radicaux RI et/ou R2 et/ou R3 et/ou R4 et/ou R5 et/ou R6 et/ou R7 et/ou R8 constitutifs desdites unités sont respectivement choisis parmi des radicaux conférant auxdites unités une hydrophilicité/hydrophobicité identique ou similaire à celle des acides aminés respectivement correspondants.
Il ressort des connaissances générales de l'homme du métier de l'immunologie et de la synthèse peptidique, que le caractère hydrophile/hydrophobe des unités constitutives des protéines/peptides revêt de 1 ' importance dans le pouvoir antigénique de ces derniers. Par ailleurs, de nombreux ouvrages de biochimie générale (5) , ont classé les 20 acides aminés en fonction de leur caractère plus ou moins hydrophobe/hydrophile. On considère selon la présente invention, que le choix des radicaux RI à R8 dans la formule ci-dessus peut être effectué par l'homme du métier précité à l'appui des ouvrages mentionnés, et qu'il dispose en outre de protocoles expérimentaux de routine pour déterminer le caractère hydrophile/hydrophobe de l'unité constitutive qu'il aura retenue.
Bien entendu, d'autres paramètres physico- chimiques des acides aminés peuvent être utilisés pour déterminer des séquences variantes, comme à titre d'exemple la constante pKa .
Comme variantes fonctionnelles de la séquence peptidique SEQ ID N°5, on peut citer par exemple 1 ' oligopeptide consistant en la séquence peptidique SEQ ID N°l. L'exemple 2 ci-après démontre effectivement une activité identique pour les oligopeptides SEQ ID N° 1 et 5. Les oligopeptides SEQ ID N°2, 3 et 4, ayant une activité plus faible que les oligopeptides cités précédemment, sont considérés dans la présente invention comme des variantes fonctionnelles. En effet, dans la mesure où leur activité antigénique et immunogène vis-à- vis des anticorps anti-ovaire est plus faible mais utile tout de même, par exemple en mélange avec d'autres oligopeptides de même activité, dans une trousse de diagnostic, ces oligopeptides sont des variants fonctionnelles de la SEQ ID N° 5.
Les oligopeptides décrits en fin de description sont: - SEQ ID N°l: séquence linéaire de 16 acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés 78-93 de la chaîne β de la FSH,
- SEQ ID N°2: séquence de 16 acides aminés, pontée par une liaison disulfure en position 5 et 7, correspondant à la séquence d'acides aminés 78-93 de la chaîne β de la FSH, - SEQ ID N°3: séquence de 16 acides aminés, pontée par une liaison disulfure en position 5 et 10, correspondant à la séquence d'acides aminés 78-93 de la chaîne β de la FSH, - SEQ ID N°4: séquence de 16 acides aminés, pontée par une liaison disulfure en position 7 et 10, correspondant à la séquence d'acides aminés 78-93 de la chaîne β de la FSH,
- SEQ ID N° 5: séquence linéaire de 8 acides aminés correspondant à la séquence d'acides aminés 80-87 de la chaîne β de la FSH.
Le caractère surprenant de 1 ' invention est que les oligopeptides de l'invention, tels que ceux représentés par SEQ ID N°l et 5, dont la structure primaire des acides aminés correspond respectivement aux acides aminés 78-93 et 80-87 de la chaîne β de la FSH, présentant pourtant vraisemblablement une structure spatiale différente de celle de la chaîne β de la FSH, présentent une activité antigénique et/ou immunogène vis-à-vis des anticorps anti-ovaire.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, 1 ' oligopeptide a la séquence peptidique identifiée par SEQ ID N° 5.
Dans un autre mode de réalisation préféré selon l'invention, 1 Oligopeptide a la séquence peptidique identifiée par SEQ ID N° 1.
Dans encore un autre mode de réalisation selon l'invention, 1 Oligopeptide a la séquence peptidique identifiée par SEQ ID N° 2 ou 3 ou 4, telles qu'identifiées en fin de description.
Un second objet de la présente invention est un composé antigénique susceptible d'être reconnu par les anticorps anti-ovaire, ou un composé immunogène susceptible d'induire la production d'anticorps anti- ovaire, ledit composé répondant au moins à l'une quelconque des définitions suivantes : - un composé ayant une séquence peptidique comprenant la séquence de 1 ' oligopeptide décrit ci-dessus, et de préférence comprenant la séquence SEQ ID NO: 5 ; en particulier, un tel composé a une séquence peptidique qui comprend ou qui consiste en SEQ ID NO: 1, telle qu'identifiée en fin de description;
- un composé consistant en la FSH ou un variant fonctionnel de la FSH ;
- un composé consistant en la chaîne β de la FSH ; - un composé dont 1 ' antigénicité ou
1 ' immunogénicité est représentative de 1 ' antigénicité ou 1 ' immunogénicité des antigènes ovariens bruts, la structure primaire dudit composé comprenant une séquence peptidique correspondant à la séquence des acides aminés 78-93 de la chaîne β de la FSH du genre humain ou de toute espèce animale, ladite séquence étant i munodominante et étant reconnue par les anticorps anti-ovaire dudit genre humain ou de ladite espèce.
Un autre objet de l'invention est une composition antigénique ou immunogène vis-à-vis des anticorps antiovaire, comprenant un composé antigénique ou immunogène tel que défini précédemment.
Une application d'un oligopeptide ou d'un composé de l'invention, réside dans la détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire. Ainsi un troisième objet de l'invention est un procédé de détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire dans un échantillon biologique, comprenant l'étape consistant à mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un peptide ou un composé de l'invention, et à observer la formation d'un complexe antigène-anticorps entre ledit peptide ou composé et un anticorps anti-ovaire.
La formation du complexe précité peut être détectée par différents formats de bio-essais classiques, connus de l'homme du métier, tels que les techniques immunocytochimiques, i munoenzymatiques (ELISA) , techniques par compétition et "sandwich".
Conformément à ce procédé, l'échantillon biologique est avantageusement choisi parmi le sérum sanguin, le liquide folliculaire, le liquide péritonéal, la glaire cervicale et la salive.
L'étape d'observation de la formation d'un complexe antigène-anticorps est préférentiellement effectuée selon la technique immunoenzymatique dite ELISA, qui a permis d'obtenir des résultats parfaitement corrélés ceux obtenus par la technique de référence pour l'homme du métier, à savoir 1 ' immunofluorescence indirecte.
Enfin les derniers objets de l'invention sont d'une part, un réactif de détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire comprenant au moins un peptide ou un composé de l'invention, et d'autre part, un kit de détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire comprenant au moins ledit réactif.
Avant de présenter les intérêts de 1 ' invention et de la décrire plus en détail, certains termes utilisés dans le présent texte sont ci-après définis.
Une séquence peptidique, variante fonctionnelle de la séquence peptidique de référence (SEQ ID NO: 5) est une séquence d'acides aminés, dite modifiée, différant de la séquence (SEQ ID NO: 5) par des modifications qui confèrent à ladite séquence variante fonctionnelle, une antigénicité identique ou similaire à celle de la séquence de référence. Les modifications de ladite séquence peuvent concerner sa taille, ainsi que chacun des acides aminés qui la constituent. De telles modifications sont notamment choisies parmi les substitutions, les délétions et les additions d'acides aminés dans la séquence du premier oligopeptide, mais aussi parmi le remplacement d'un acide aminé de la série L par un acide aminé de la série D, une modification des chaînes latérales des acides aminés, une modification des liaisons peptidiques telles que des liaisons carba, rétro, inverso, rétro-inverso, réduites ou méthylène-oxy, à la condition que ces modifications n'entraînent aucune altération significative des propriétés antigeniques de ladite séquence vis-à-vis des anticorps anti-ovaire.
A titre d'exemple de substitution, et comme mentionné précédemment, on peut remplacer un acide aminé de SEQ ID NO: 5 par un autre acide aminé de même hydrophilicité/hydrophobicité ou d 'hydrophilicité/hydro phobicité comparable.
L'homme du métier compétent, qui utilise en routine les techniques à sa disposition, notamment les techniques de synthèse peptidique automatisée et les techniques de détermination de 1 ' antigénicité d'un peptide telles que les tests ELISA, est à même, dans une première étape, de synthétiser une séquence modifiée telle que définie ci-dessus, et, dans une seconde étape, de tester 1 ' antigénicité du peptide obtenu. Si ce dernier présente une antigénicité au moins substantiellement équivalente à celle de ladite séquence de référence, il répond à la définition de séquence variante fonctionnelle de ladite séquence de référence. L'homme du métier peut en particulier se reporter aux Exemples 2 et 3 ci-après, qui décrivent un protocole à suivre pour comparer 1 ' antigénicité de deux peptides, vis-à-vis des AOA.
Un composé de l'invention comprend une séquence d'un nombre variable d'acides aminés, comprenant au moins la séquence d'un oligopeptide de l'invention. Il peut notamment consister en une protéine, une glycoprotéine, une protéine de fusion, un peptide de fusion. Il peut en outre être fixé sur un support solide.
Un oligopeptide ou un polypeptide de l'invention, peut être obtenu par toute voie d'obtention et notamment synthèse chimique ou recombinaison génétique. Les objets de l'invention présentent également un intérêt, en dehors de la recherche d'hypothèses physiopathogéniques à certaines situations cliniques, telles qu'énoncées précédemment. En effet, la mise à disposition d'un test fiable d'appréciation des anticorps anti-ovaire peut avoir d'autres applications diagnostiques et des applications thérapeutiques.
L'axe gonadique est l'axe le plus fragile des axes endocriniens. Dans diverses polyendocrinopathies, l'atteinte de la fonction gonadique peut être le premier signe de la maladie. Devant des irrégularités des cycles menstruels, une exploration des anticorps anti-ovaire peut être le premier signe d'une ovarite auto-i mune débutante.
Deux autres groupes de pathologie sont directement concernés par ce type d'exploration. Il s'agit du groupe des ménopauses précoces et du groupe des dystrophies ovariennes.
Ces groupes sont très hétérogènes dans leurs mécanismes et la détection et/ou quantification d'anticorps anti-SEQ ID NO: 1 permet d'identifier des sous-groupes plus homogènes avec des implications thérapeutiques possibles.
Dans le domaine de la stérilité, les patientes atteintes de stérilité dite "idiopathique" peuvent bénéficier de ce type d'analyse, au même titre que la recherche d'autres auto-anticorps. L ' endométriose, maladie aux mécanismes encore inconnus de nos jours, survient manifestement chez des patientes au terrain particulier. De nombreux autoanticorps ont été objectivés chez des patientes atteintes de cette maladie. Le mécanisme de la stérilité n'est pas toujours évident chez ces patientes. La recherche des anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1 y est d'un grand intérêt tant sur le plan physiopathologique que sur le plan thérapeutique.
En effet, la recherche de tels auto-anticorps peut également avoir des implications thérapeutiques directes. Les caractéristiques et avantages des objets de la présente invention ressortiront des Exemples 1 à 4 ci- après, à l'appui des figures 1 à 4, selon lesquelles :
- la figure 1 représente l'augmentation des taux d'anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1,
- la figure 2 représente l'augmentation des taux d'anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1, après la première tentative de FIV et l'augmentation des IgM SEQ ID NO: 1, après les tentatives de FIV ultérieures, - la figure 3 représente l'évolution comparée des anticorps anti-ovaire et anti-peptide SEQ ID NO: 1, avant et après ponction dans une population de femmes atteintes de stérilité tubaire, et
- la figure 4 met en évidence les taux supérieurs d'anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1, en l'absence de grossesse biologique mesurée sur l'augmentation des taux d'HCG (colonnes pleines).
EXEMPLE 1 : Technique immunoenzymatique de dosage des anticorps anti-ovaire
a) Réactifs
- Antigène
Ovaire Corps jaune
FSH (Métrodine0 , Serono, Levallois-Perret , France) Peptides SEQ ID NOs: 1 à 5
- Tampon carbonate-bicarbonate 0,1 M, pH 9.6
- Tampon Phosphate Saline (PBS) 0,001 M, pH 7.4 (PBS) - Tween 20 (Sigma, St Louis, MO, USA)
- Lait écrémé en poudre Gloria
- Albumine de sérum bovin (BSA) (Sigma)
- Anti-immunoglobulines humaines (IgG, IgA, IgM) conjuguées à la peroxydase (Miles, Napperville, MA, USA) - Tampon phosphate-acide citrique 0,1 M, pH 5,5 - Eau oxygénée à 30 volumes (Gifrer Barbezat, Décines, France)
- Ortho Phénylène Diamine (OPD) (Sigma)
- Acide sulfurique 2 N (Prolabo, Paris, France)
b) Matériel
- Plaques Maxisorp (Nunc, Roskilde, Danemark)
- Balance de précision (Sartorius, Osi, Paris, France)
- Spectrophotomètre Multiskan II équipé d'un filtre de 492 nm (Flow laboratories, Helsinki, Finlande)
- Logiciel Titersoft (Flow Laboratories)
c) Méthode
La concentration de molécules à adsorber a été déterminée par des essais en échiquier pour chaque antigène. Elle est d'environ 1 μg par puits.
La fixation des antigènes sur la phase solide se réalise en une nuit à + 4°C à raison de 100 μl par puits de la solution d'antigène en tampon carbonate-bicarbonate. La plaque est vidée. Les sites de la phase solide encore non occupés sont saturés lors d'une incubation d'une heure à 37°C avec 200 μl par puits de 5 % de lait en poudre reconstitué dans du PBS.
Les échantillons à tester sont dilués dans le PBS additionné de 0,5 % de BSA et 0,2 % de Tween 20 : dilution au 1/50 pour la recherche d'anticorps anti-ovaires et anti-corps jaune. La plaque est vidée et lavée 3 fois en PBS. Les échantillons sont distribués à raison de 100 μl par puits. La plaque est incubée 45 minutes à 37°C. Les anti-isotypes sont dilués dans la même solution que celle qui a servi pour la dilution des échantillons :
- 1/10 000 pour les anti-IgG
- 1/5 000 pour les anti-IgA - 1/5 000 pour les anti-IgM. La plaque est à nouveau vidée et lavée 3 fois en PBS. Puis les anti-isotypes sont distribués à raison de 100 μl par puits. La plaque est incubée 45 minutes à 37°C. La solution de révélation est préparée extemporanément, comme suit pour une plaque :
- 12 ml de tampon de phosphate-acide citrique
- 6 mg d'OPD
- 12 ml d'H202.
Après 3 nouveaux lavages de la plaque, 100 μl de solution de révélation sont distribués dans chaque puits.
Après apparition d'une coloration jaune plus ou moins intense, la réaction est arrêtée avec 50 μl d'H S04. La plaque est lue au spectrophotomètre, à 492 nm à l'aide du lecteur Multiskan II. Les résultats sont d'abord exprimés en densité optique (D.O.) puis calculés en ratios par rapport à un échantillon de témoins à la limite de la positivité. Tout ratio supérieur à 1 est considéré comme positif.
EXEMPLE 2 : Sélection de peptides antigeniques
Les inventeurs ont d'abord découvert que la FSH, puis les peptides consistant en la séquence des acides aminés 78-93 et 80-87 de la chaîne β de la FSH , identifiés respectivement par SEQ ID N° 1 et 5, sont reconnus à la fois par des sérums contenant des anticorps anti-ovaires et par 2 anticorps monoclonaux anti β-FSH (propriété bioMérieux, 22A3G7; 5H3E8) qui ont la caractéristique d'être immunoréactifs avec la métrodine et des extraits ovariens tandis qu'un anticorps monoclonal anti β-FSH (propriété bioMérieux, 7G5A1) ne reconnaissant que la métrodine ne réagit pas avec cette séquence.
Etant donné que la séquence des acides aminés 78- 93 de la chaîne β de la FSH contient 3 cystéines, on a synthétisé 4 peptides de 16 acides aminés correspondant aux différentes possibilités de pont disulfure. Ces quatre peptides sont identifiés par les références respectivement SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, et décrits en fin de description. Ces quatre peptides obtenus sous forme lyophilisée, ont été, après reconstitution et dialyse, utilisés comme antigènes dans une série de tests ELISA vis à vis de 30 sérums de patientes.
Par ailleurs, ces mêmes sérums ont été testés contre les antigènes ovariens bruts.
La technique immuno-enzymatique utilisée est celle décrite à l'Exemple 1.
Les résultats de la corrélation obtenue entre la réactivité des sérums vis-à-vis de l'antigène ovarien et celle des mêmes sérums vis-à-vis de chacun des peptides testés, et exprimés par une valeur de r, sont rapportés dans le tableau I suivant:
Tableau I
Figure imgf000018_0001
On constate que les meilleurs coefficients de corrélation sont obtenus pour les IgM d'une part (ce qui avait déjà été noté avec la FSH commerciale) et pour le peptide SEQ ID NO: 1 d'autre part.
Les mêmes résultats que ceux obtenus pour le peptide SEQ ID N°l ont été obtenus avec le peptide SEQ ID N°5, la FSH et la chaîne β de la FSH. EXEMPLE 3 : Antigénicité du peptide SEQ ID NO: 1
Deux centre quatre-vingt quinze sérums ont été testés en double, à l'aide de la méthode immuno- enzymatique décrite ci-dessus, avec, d'une part, l'extrait ovarien total et, d'autre part, le peptide SEQ ID NO: 1. Pour chaque antigène, les trois isotypes d ' immunoglobulines IgG, IgA et IgM ont été étudiés.
a) Population étudiée
Les patientes incluses dans l'étude étaient toutes en protocole de FIV. Leur moyenne d'âge était de 32,7+4,2 ans. La durée moyenne de la stérilité était de 4,8+2,8 ans.
L'étiologie de la stérilité ayant conduit le couple en FIV, était dans 24,9% des cas d'origine tubaire, dans 18,2% des cas d'origine masculine, dans 8,6% d'origine idiopathique, dans 3,8% des cas due à une dystrophie ovarienne (PCO) , dans 2,8% des cas due à une endométriose. Dans 41,7% au moins deux des étiologies précédentes étaient regroupées, formant les étiologies mixtes.
Dans 209 cas, le sérum a été prélevé au huitième jour de la stimulation et dans 84 cas, le sérum a été collecté 15 jours après la ponction.
b) Résultats
Les résultats de la corrélation obtenue entre la réactivité des sérums vis-à-vis de l'antigène ovarien brut et celle des mêmes sérums vis-à-vis du peptide SEQ ID NO: 1 testé, et exprimés par une valeur de r, sont rapportés dans le tableau II suivant: Tableau II
Figure imgf000020_0001
On observe une corrélation entre IgG AOA et IgG
SEQ ID NO: 1 (r = 0,18, p = 0,002) ainsi qu'entre IgM AOA et IgM SEQ ID NO: 1 (r = 0,27, p<0, 00001). Par contre, on n'observe pas de corrélation entre IgA AOA et IgA
SEQ ID NO: 1 (r = 0,10, p = 0,06).
EXEMPLE 4 : Applications des peptides de l'invention
- Quels que soient le nombre de tentatives de FIV pratiquées et l'étiologie de la stérilité confondues, une élévation des anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1, après la ponction, a été observée, avec une différence statistiquement significative pour les IgM SEQ ID NO: 1 (p = 0,005) (cf Figure 1).
- Selon le nombre de tentatives de FIV pratiquées, avant et après ponction, et conformément à la Figure 2, on observe :
* chez les patientes en première tentative de FIV, une augmentation des anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1, après la ponction folliculaire, quel que soit 1 ' isotype considéré,
* chez les patientes multiponctionnées, une diminution des IgG et des IgA SEQ ID NO: 1 en post-ponction et une élévation des IgM SEQ ID NO: 1 très nette et statistiquement significative (p = 0,01).
- Selon l'étiologie de la stérilité et avant et après ponction Pour l'étiologie d'origine tubaire retenue car elle sert de référence en matière de FIV (IgA p = 0,04 et IgM p = 0,027), on observe une élévation incontestable des AOA d' isotypes A et M, après la ponction, mais une élévation des anti-peptide SEQ ID NO: 1, plus nette et statistiquement significative pour ces mêmes isotypes (cf figure 3) .
- Selon le nombre d ' ovocytes et d'embryons obtenus La présence d'anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1 apparaît délétère pour l'obtention d ' ovocytes et d'embryons. On a tenté de définir un seuil limite selon 1 ' isotype considéré en pré-ponction. Sur 151 dosages (un certain nombre de tentatives n'ont pas été jusqu'à la ponction folliculaire) , on a pu déterminer ce seuil pour les IgA SEQ ID NO: 1 à 0,75, pour les ovocytes (9.4 vs 11.8 ovocytes), et à 0,60, pour les embryons (3.1 vs 4.9 embryons) .
Il faut remarquer que ce seuil est plus bas que celui défini pour les IgA AOA (1,7 pour les ovocytes et les embryons) . - Selon l'issue de la tentative
On a comparé les taux moyens d'anticorps anti- peptide SEQ ID NO: 1 selon que le dosage de l'HCG (gonadotrophine chorionique) plas atique était positif (grossesse biologique) ou négatif (absence de nidation) . Conformément à la Figure 4, on a retrouvé des taux d'anticorps en moyenne plus bas lorsque l'HCG était positif.
Ces résultats démontrent que le peptide SEQ ID NO: 1 permet de détecter de façon sensible et spécifique des anticorps présentant des variations parallèles à celles des anticorps dirigés contre l'extrait ovarien total.
En outre la ponction folliculaire stimule l'apparition d'anticorps anti-peptide SEQ ID NO: 1, et les patientes présentant de tels anticorps dans leur sérum ont moins de chances d'obtenir une grossesse après FIV.
LISTE DE SEQUENCES
(1) INFORMATIONS GENERALES:
(i) DEPOSANT:
(A) NOM: BIO MERIEUX
(B) RUE: CHEMIN DE L'ORME
(C) VILLE: MARCY L'ETOILE (E) PAYS: FRANCE
(F) CODE POSTAL: 69280
(ii) TITRE DE L' INVENTION: Détection des anti-corps anti-ovaire
(iϋ) NOMBRE DE SEQUENCES: 5
(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT:
(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:
Val Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 16 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(ix) CARACTERISTIQUE: liaison disulfure entre la cystéine en position 5 et la cystéine en position 7.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:
Val Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 16 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(ix) CARACTERISTIQUE: liaison disulfure entre la cystéine en position 5 et la cystéine en position 10.
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:
Val Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:
(A) LONGUEUR: 16 acides aminés
(B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linaire (ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(ix) CARACTERISTIQUE: liaison disulfure entre la cystéine en position 7 et la cystéine en position 10.
( i) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4:
Val Ala Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys Asp Ser Asp Ser Thr Asp 1 5 10 15
(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5:
(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 8 acides aminés (B) TYPE: acide aminé
(C) NOMBRE DE BRINS: simple
(D) CONFIGURATION: linaire
(ii) TYPE DE MOLECULE: peptide
(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5;
Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys 1 5 8
BIBLIOGRAPHIE (1) C.A. SHIVERS and B.S. DUNBAR, (1977) Autoantibodies to zona pellucida: a possible cause of infertility in women. Science, 197: 1087-1190 (2) P. BARBARINO-MONNIER et al., Fertility and Sterility, vol. 56, N° 5 (1991) 928-932
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(5) A.L. LEHNINGER, Traduction de la seconde édition de : Biochemistry, the molecular basis of cell structure and function, Chapitre 4 : Les Protéines : Les aminoacides constitutifs, p 69 à 74 (1979)
(6) R. MONCAYO et H.E. MONCAYO, Journal of Internai Medicine (L993), 234:371-378.

Claims

REVENDICATIONS
1. Oligopeptide consistant en la séquence peptidique de référence Thr Gin Cys His Cys Gly Lys Cys (SEQ ID NO: 5) , ou toute séquence peptidique, variante fonctionnelle de ladite séquence de référence, au sens où la première présente une antigénicité, et/ou une immunogénicité vis-à-vis d'anticorps anti-ovaire, équivalente à 1 ' antigénicité et/ou 1 ' immunogénicité de la seconde.
2. Oligopeptide dont la séquence peptidique est une variante fonctionnelle de ladite séquence de référence selon la revendication 1, obtenue en modifiant le reste hydrocarboné d'au moins l'un des acides aminés de la dite séquence de référence, tout en conservant une antigénicité identique ou similaire à celle de ladite séquence de référence.
3. Oligopeptide dont la séquence peptidique est une variante fonctionnelle de ladite séquence de référence selon la revendication 1, obtenue en modifiant le reste hydrocarboné d'au moins l'un des acides aminés de ladite séquence de référence, tout en conservant substantiellement le caractère hydrophile/hydrophobe dudit reste hydrocarboné.
4. Oligopeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence peptidique identifiée par SEQ ID NO: 5.
5. Oligopeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il consiste en une séquence peptidique choisie dans le groupe consistant en SEQ ID
N°l, SEQ ID N°2, SEQ ID N°3 et SEQ ID N°4.
6. Oligopeptide selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il consiste en la séquence identifiée par SEQ ID N°l.
7. Composé antigénique susceptible d'être reconnu par les anticorps anti-ovaire, ayant une séquence peptidique comprenant la séquence de 1 ' oligopeptide selon la revendication 1.
8. Composé immunogène susceptible d'induire la production d'anticorps anti-ovaire, ayant une séquence peptidique comprenant la séquence de 1 ' oligopeptide selon la revendication 1.
9. Composé selon l'une quelconque des revendications 7 et 8 , caractérisé en ce qu'il comporte une séquence peptidique qui comprend ou qui consiste en SEQ ID NO: 1.
10. Composé selon les revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il consiste en la FSH, un variant fonctionnel de la FSH ou en la chaîne β de la FSH.
11. Composé antigénique ou immunogène dont 1 'antigénicité ou 1 ' immunogénicité est représentative de
1 ' antigénicité ou 1 ' immunogénicité des antigènes ovariens bruts, caractérisé en ce que la structure primaire dudit composé comprend une séquence peptidique correspondant à la séquence des acides aminés 78-93 de la chaîne β de la FSH du genre humain ou de toute espèce animale, ladite séquence étant immunodominante et étant reconnue par les anticorps anti-ovaire dudit genre humain ou de ladite espèce.
12. Composition antigénique ou immunogène vis-à- vis des anticorps anti-ovaire, comprenant un composé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11.
13. Procédé de détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire dans un échantillon biologique, comprenant l'étape consistant à mettre en contact ledit échantillon biologique avec au moins un oligopeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou un composé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, et à observer la formation d'un complexe antigène-anticorps entre ledit oligopeptide ou composé et un anticorps anti- ovaire.
14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'échantillon biologique est choisi parmi le sérum sanguin, le liquide folliculaire, le liquide péritonéal, la glaire cervicale et la salive.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'on observe la formation d'un complexe antigène- anticorps selon une technique immuno-enzymatique.
16. Réactif de détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire comprenant au moins un oligopeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou un composé selon l'une quelconque des revendications 7 à 11.
17. Kit de détection et/ou quantification d'anticorps anti-ovaire comprenant au moins un réactif selon la revendication 16.
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