WO2010128232A2 - Méthode de diagnostic des infections à propionibacterium acnes - Google Patents

Méthode de diagnostic des infections à propionibacterium acnes Download PDF

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WO2010128232A2
WO2010128232A2 PCT/FR2010/050765 FR2010050765W WO2010128232A2 WO 2010128232 A2 WO2010128232 A2 WO 2010128232A2 FR 2010050765 W FR2010050765 W FR 2010050765W WO 2010128232 A2 WO2010128232 A2 WO 2010128232A2
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Camille Cyncynatus
Julie ROGÉ
Hélène NUYTTENS
Damien Thomas
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Ingen Biosciences
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for diagnosing Propionibacterium acne infections.
  • Propionibacterium acnes is a non-spore positive Gram positive bacillus, catalase and indole positive, developing in anaerobiosis, sometimes micro-aerophilic and motionless.
  • This bacterium is part of the natural human flora, commensal to the skin, the conjunctiva, the outer ear, the oral cavity, the upper respiratory tract and occasionally the intestine and vagina.
  • P acnes is particularly associated with the inflammatory process in acne lesions. This bacterium is also at the origin of post-operative infections, especially in the presence of implants, potentially severe.
  • This bacterium has been made responsible, alone or in combination with other aerobic or anaerobic bacteria, dental infections, periodontitis, conjunctivitis, endophthalmitis, cerebral abscess, subdural empyema, pulmonary infections , peritonitis, osteomyelitis, septic arthritis and endocarditis especially on prosthesis, and meningitis on shunts. These infections occur most often (70% of cases) in patients with diabetes, immunosuppression, cancer, surgery, prosthetic equipment or catheters.
  • a good clinical sample for the detection of infection on osteo-articular prosthesis corresponds to deep and numerous samples because the probability of infection increases with the number of positive samples that is to say 2 to 3.
  • P. acnes proteins 15B2, 17B6, 18D4, 15B1, 14B5, 14C4 represented respectively by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12 ) were particularly suitable for the serological diagnosis of P. acnes infections.
  • the detection of antibodies directed against at least one protein represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12, comprises contacting the biological sample with:
  • At least one protein comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12; or
  • the present invention also relates to the use of:
  • the present invention also relates to the use of a capture ligand, in particular an antibody, directed against a protein represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 for the in vitro diagnosis of infection with a bacterium of the genus Propionibacterium.
  • the present invention also relates to a method for in vitro diagnosis of an infection with a bacterium of the genus Propionibacterium in an individual, in which the presence of at least one antigen of said bacterium of the genus Propionibacterium is detected in a biological sample.
  • a capture ligand in particular an antibody, directed against a protein represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, comprising as active substance:
  • Propionibacterium bacteria refers to all species or subspecies included in this genus. It is preferred, however, that the bacterium of the genus Propionibacterium be P. acnes, P. avidum, P. granulosum or P. propionicum.
  • the term "infected” or “infection” refers to individuals carrying a bacterium of the genus Propionibacterium as defined above.
  • the infected individuals Preferably, the infected individuals have one or more sites for propagating bacteria of the genus Propionibacterium. Infections with bacteria of the genus Propionibacterium may be the result of surgery for the placement of foreign material.
  • the individual has preferably undergone surgery, and in particular has undergone implantation of a prosthesis, such as a joint prosthesis, especially selected from the group consisting of a knee prosthesis and a hip prosthesis.
  • the method according to the invention is implemented in order to determine whether an individual suffers from an infection with a bacterium of the genus Propionibacterium, said infection being chosen from an infection on a prosthesis (in particular an articular), osteo-articular infection, post-operative infection (especially when placing foreign material such as prosthesis), dental infection, periodontitis, conjunctivitis, endophthalmitis, cerebral abscess, empyema -ural, pulmonary infection, peritonitis, osteomyelitis, septic arthritis, endocarditis (especially on prosthesis), meningitis (especially on shunts) and acne vulgaris.
  • a prosthesis in particular an articular
  • osteo-articular infection in particular an articular
  • post-operative infection especially when placing foreign material such as prosthesis
  • dental infection periodontitis, conjunctivitis, endophthalmitis, cerebral abscess, empyema -ural, pulmonary infection, peritonitis, osteomyelitis,
  • the individual may furthermore be a diabetic individual, suffering from immunodepression, suffering from cancer and / or carrying prosthetic material or catheter.
  • acne especially acne vulgaris
  • biological sample includes both the sample as taken and the sample that has been subjected to various treatments, in particular to make it suitable for use in the methods and methods of the present invention. 'invention.
  • the "biological sample” according to the invention can be of any type likely to contain antibodies directed against a bacterium of the genus Propionibacterium or to contain antigen derived from a bacterium of the genus Propionibacterium, it is preferred, however, that the biological sample is selected from the group consisting of a blood sample, a serum sample, a plasma sample, a lymphoid tissue sample associated with a mucosa, a cerebrospinal fluid sample, a sample of joint fluid, a sample of pleural fluid, a saliva sample, and a urine sample.
  • the term "determine whether an individual is infected with a bacterium of the genus Propionibacterium" includes the setting of a diagnosis or diagnosis of an infection with a bacterium of the genus Propionibacterium as defined above in the individual. It also includes the follow-up of individuals who have undergone surgery, particularly to implant, clean or replace a prosthesis. It further comprises monitoring infection with a bacterium of the genus Propionibacterium as defined above, particularly as part of a therapeutic treatment to fight against infection; it is then preferred that the individual be in the course of antibiotic treatment.
  • protein consisting of a sequence or “protein represented by a sequence” are synonymous.
  • the protein comprising or consisting of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12; the homologous protein thereof, or the fragments thereof, as defined above may be composed of the 20 natural amino acids or amino acids that these 20 amino acids encoded. They may also be composed of amino acids modified by natural processes, such as the post-translational maturation process or by chemical processes, which are well known to those skilled in the art. The same type of modification may be present at several points in the polypeptide chain and anywhere in the polypeptide chain: in the peptide backbone, in the side groups or at the carboxy or amino terminal ends. They can be branched following a ubiquitination or be cyclic with or without branching. This type of modification may be the result of natural or synthetic posttranslation processes, which are well known to those skilled in the art.
  • a polypeptide by modification of a polypeptide is meant acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent attachment of flavin, covalent attachment of a heme, covalent attachment of a nucleotide or a nucleotide derivative, the covalent attachment of a lipid or a lipid derivative, the covalent attachment of a phosphatidylinositol, covalent or non-covalent crosslinking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation , cysteine formation, pyroglutamate formation, formylation, gamma-carboxylation, glycosylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodization, methylation, myristoylation, palmitoylation, glypiation, oxidation, proteolytic process, phosphorylation, prenylation, racemization, seneloylation, sulfation, amino acid addition, such as arginy
  • the protein comprising or consists of a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12, the homologous protein thereof, or the fragments thereof, as defined above, may also comprise sequences useful for the purification of proteins ( purification), such as polyhistidine labels, and optionally a sequence for cleaving these labels, for example protease cleavage sites.
  • a protein comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 , comprises 350, 400, 500, or 1000 amino acids maximum.
  • the proteins comprising a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 , consist respectively of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 17, and SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 18.
  • the proteins comprising or consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 , consist respectively of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 17,
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 are respectively encoded by nucleic acids comprising or consisting of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, and SEQ ID NO: 1 1.
  • the percentage identity according to the invention can be calculated by many methods well known to those skilled in the art.
  • the percent identity corresponds to the number of identical amino acids obtained for optimal matched alignment (i.e., alignment maximizing the number of identical amino acids) of a sequence of a protein homologous with SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12, over their entire length, divided by the number total amino acids of the larger of the two aligned sequences.
  • Alignment can be done manually or using computer programs such as the EMBOSS-Needle program (Needleman & Wunsch (1970) J. Mol Biol., 48: 443-453).
  • the identity percentage is preferably calculated using the EMBOSS :: needle (global) program with the Blosum62 matrix and the following parameters: "Gap Open” equal to 10.0, "Gap Extend” equal to 0.5.
  • the percent identity according to the invention is at least 85%, more preferably at least 90%, and still more preferably at least 95%.
  • the "fragment” according to the invention comprises at least 20 amino acids, more preferably at least 30 amino acids, and still more preferably at least 40 amino acids.
  • the "fragment” according to the invention comprises at most 100 amino acids, more preferably at most 80 amino acids, and still more preferably 60 amino acids at most.
  • the "fragment” according to the invention consists of a portion of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2,
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 or a portion of sequences having at least 85%, more preferably at least 90%, and still more preferably at least 95% of SEQ ID NO: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12.
  • the homologous protein defined above or the fragment defined above is such that it can be bound by at least one antibody directed against a protein represented by a sequence selected from the group consisting of of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12.
  • the homologous protein defined below. above or the fragment defined above comprise at least one of the epitopes of a protein consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12. Accordingly, the homologous protein defined above or the fragment defined above should preferably be such as to provide at least 70%, more preferably at least 80% and even more preferably at least 90%, of the sensitivity respectively. provided by a protein comprising or consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12, measured under the same conditions .
  • the term "sensitivity" is defined as the percentage of individuals infected with a bacterium of the genus Propionibacterium as defined above, preferably by P. acnes, including the biological samples according to the invention, including serum samples, contain antibodies directed against a protein comprising or consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 detectable according to the invention.
  • the determination of the sensitivity afforded by an antigen can be performed as indicated in the following Example 1.
  • the antibodies detected in the biological samples according to the invention are IgG.
  • an antibody directed against at least one protein represented by a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12 refers to any antibody of the individual capable of recognizing a protein consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12, that is to say an antibody specific for this protein, but which can also recognize:
  • a larger protein comprising SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12; or a homologous protein comprising or consisting of a sequence sharing at least 80% identity with a sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, and SEQ ID NO: 12; a fragment of at least 10 amino acids of the homologous protein or of a protein comprising or consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO:
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 in biological samples, or the detection of antigens of a bacterium of the genus
  • Propionibacterium as defined above using a capture ligand, in particular an antibody, directed, preferably specifically, against a protein represented by SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, or SEQ ID NO: 12 can be easily implemented by those skilled in the art.
  • the capture ligand can be of any type, but it is preferred that it be an antibody, an aptamer, or a peptide obtained by "phage display And in particular it is preferred that it be an antibody.
  • a detection ligand which may be specific for either fixed antibodies or antigens, or capture ligands, may be used.
  • the detection ligand can be of any type, but it is preferred that it be an antibody, an aptamer, or a peptide obtained by "phage display", and in particular it is preferred that it be an antibody.
  • the detection ligand is labeled.
  • labeled refers to both direct labeling and indirect labeling (eg, via another ligand itself directly labeled).
  • the labeling may be radioisotopic, enzymatic or luminous (for example using a chromophore or a fluorophore).
  • capture ligands and detection ligands are well known to those skilled in the art and can be implemented according to various well-known formats, in solid or homogeneous phase, in one or two stages, at the same time. using a sandwich or competitive method.
  • the capture ligand is immobilized on a solid phase, such as the walls of a well of a microtiter plate or paramagnetic beads.
  • an "antibody”, when it is a capture ligand or a detection ligand, may belong to any species, and is especially a human, mouse antibody , rat, goat or camelidae.
  • the antibody may also be a chimeric antibody, i.e. an antibody consisting of parts from different species.
  • the preferred chimeric antibodies are called humanized, in which the constant parts (in particular CH and CL) are of human origin and the variable parts (VH and VL) or the CDRs of the variable parts are of another species, the mouse for example .
  • the antibody can be produced by any method known to those skilled in the art, for example by immunization of an animal or by recombinant or chemical methods.
  • antibody as used herein also includes antibody fragments that comprise at least one of the paratopes of the antibody, namely, especially Fab, F (ab ') 2, and scFv fragments. .
  • the antibody may be a polyclonal antibody, especially a monospecific polyclonal antibody, or a monoclonal antibody.
  • “Aptamers” are well known to those skilled in the art. They can be of nucleotide nature as described in particular by Ellington et al. (1990) Nature 346: 818-22 and Bock et al. (1992) Nature 355: 564-6, or of peptide nature, as described, in particular, by Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78: 426-30.
  • phage display is a method of selecting polypeptide ligands expressed on the capsid of a bacteriophage and encoded by a nucleotide sequence inserted in the gene encoding the capsid. This method is well known to those skilled in the art and is described in particular by Scott & Smith (1990) Science 249: 386-390, and Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597.
  • the polypeptide obtained by phage display is a polypeptide of the scFv ("single-chain variable fragment") type, as described in particular by Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455.
  • the genes coding for the sequences of the polypeptides SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, or 20 are amplified by PCR from the genomic DNA of the P. acnes bacterium (strain KPA171202) using, respectively primers specific for SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11 or 19; these primers are chosen by those skilled in the art so as to frame the DNA sequence and amplify it specifically (for example SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 1 1, or 19) .
  • the corresponding fragments, thus amplified, are cloned into vectors according to standard techniques well known to those skilled in the art.
  • the cloned proteins correspond to the polypeptides SEQ ID NO: 13, 14, 15, 16, 17, 18 or 21 (15B2, 17B6, 18D4, 15B1, 14B5, 14C4 or 14H4 respectively).
  • An Escherichia coli strain is transformed by the previously described expression vector.
  • the selected bacteria are cultured overnight at 30 ° C. with stirring in 50 ml of Luria Bertani medium (LB, J.Miller, "A short course in
  • the cells After centrifugation, the cells are resuspended in a buffer
  • the pellet is frozen at -20 ° C. for at least one night.
  • the bacteria are taken up in 20 mM Triethanolamine buffer at pH 8.0, 300 mM NaCl, 5 mM EDTA and 6 M urea, then sonicated 4 times 20 seconds in ice. After centrifugation at 15500xg at 40 ° C. for 30 minutes, the supernatant is filtered on a membrane with a porosity of 0.22 ⁇ m. The filtrate is then deposited on a gel filtration column (for example, Superdex 75 HL 26/60, GE Healthcare).
  • a gel filtration column for example, Superdex 75 HL 26/60, GE Healthcare.
  • the fractions collected are pooled and then after desalting are deposited on a HiLoad Q column column (GE Healthcare) in 20 mM Triethanolamine buffer pH8, 6 M urea, 20 mM ⁇ mercaptoethanol.
  • the proteins are then eluted by performing a linear gradient of 0 to 1 M NaCl in buffer in 20 mM Triethanolamine buffer pH8, 6 M urea, 20 mM ⁇ mercaptoethanol in 20 column volumes.
  • the fractions containing the protein are pooled and then diluted in 20 mM triethanolamine buffer pH8, 6 M urea containing 30% glycerol and 20 mM ⁇ mercaptoethanol.
  • the purified proteins are then stored at -20 ° C.
  • control sera correspond to serums of blood donors.
  • the membrane After transfer to purified recombinant proteins (obtained as described above) on a nitrocellulose membrane, the membrane is saturated for 45 minutes with a solution of phosphate buffered saline (PBS) containing 3% of semi-skimmed milk. After washing three times with PBS containing 0.05% polyoxyethylene sorbitan (Tween), the membrane is placed in the presence of the serum tested at the appropriate dilution (1/500) in PBS buffer containing 3% of semi-skimmed milk during 45 minutes. After three further washes, alkaline phosphatase-labeled goat anti-human immunoglobulin G and A and M antibodies (e.g.
  • a "positive" result corresponds to the binding of the anti-human immunoglobulin antibody to a compound complex of the polypeptide according to the invention attached to the membrane and of the human serum antibody specifically recognizing it, which results in a localized coloration. at the level of said complex.
  • test protocol ELISA ELISA plates are left overnight at 4 ⁇ O in the presence of 0.5 ug of purified antigen (protein 15B2, 17B6, 18D4, 15B1, 14b5, 14C4, 14H4) in "phosphate buffered saline" (PBS). After four washes with PBS containing polyoxyethylene sorbitan (Tween) 0.05%, plates were saturated for one hour and a half 37 ⁇ O with PBS-Tween containing 4% bovine serum albumin (BSA) (250 ⁇ l per well).
  • PBS polyoxyethylene sorbitan
  • TMB tetrabenzimidine substrate
  • SUB sulfuric acid
  • the performances of the ELISA tests using the polypeptides identified according to the invention as well as the combinations of polypeptides according to the invention were evaluated by the method of analysis by discriminant function, analysis very close to the analysis of variance.
  • This method known to those skilled in the art makes it possible to determine the variables that make it possible to discriminate between the two groups of patients or control individuals.
  • the method consists of determining whether the two groups differ according to the average of the variable and using the latter to predict the group.
  • the sera of patients considered to be positive are those containing antibodies directed against P. acnes identified, by ELISA, by their binding with the polypeptides (antigens) as defined according to the invention.
  • polypeptides of the invention for the detection of antibodies in sera (ELISA)
  • the panel of samples tested consists of sera from patients suffering from osteoarticular infections on prosthesis whose infection with P. acnes was diagnosed positive after culturing samples from said patients.
  • the panel of control individuals consists of blood donor sera.
  • Table 1 shows the results obtained according to the invention for the polypeptides 15B2 (SEQ ID NO: 13), 15B1 (SEQ ID NO: 16), 14B5 (SEQ ID NO: 17), 14C4 (SEQ ID NO: 18), 14H4 (SEQ ID NO: 21) with secondary antibodies recognizing immunoglobulin G present in sera from sick patients or control individuals.
  • Table 1 Results (ELISA) obtained using anti-IgG as secondary antibodies
  • polypeptides of the invention can be used for the detection of P. acnes infections on osteoarticular prostheses.
  • other polypeptides also derived from P. acnes such as 14H4 presented here (SEQ ID NO: 21) absolutely do not allow the detection of such infections.
  • Table 3 Results (ELISA) obtained using different polypeptides according to the invention.
  • % Decrease (D0 S i - DO S 2ous 3 ) / D0 S i
  • the observation of the decrease or increase, over time, of the ELISA values, obtained by detecting the immunoglobulins (antibodies) present in the sera, by their attachment to the polypeptides of the invention indicates their healing or the evolution of the infection.
  • the use of the polypeptides of the invention thus makes it possible to carry out therapeutic follow-ups, that is to say (i) to evaluate the effect of a treatment and (ii) to follow the evolution of the infection. in a patient.

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Abstract

La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium chez un individu, comprenant la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, et SEQ ID NO: 12, dans un échantillon biologique de l'individu.

Description

Méthode de diagnostic des infections à Propionibacterium acnés
Domaine technique
La présente invention concerne une méthode de diagnostic des infections à Propionibacterium acnés.
Arrière-plan technique
Propionibacterium acnés est un bacille à Gram positif non sporulé, catalase et indole positifs, se développant en anaérobiose, parfois en micro-aérophilie et immobile. Cette bactérie fait partie de la flore humaine naturelle, commensale de la peau, de la conjonctive, de l'oreille externe, de la cavité buccale, du tractus haut respiratoire et occasionnellement de l'intestin et du vagin. P acnés est notamment associé au processus inflammatoire dans les lésions acnéiques. Cette bactérie est aussi à l'origine d'infections post-opératoires, notamment en cas de présence d'implant, potentiellement sévères. Cette bactérie a été rendue responsable, seule ou associée à d'autres bactéries aérobies ou anaérobies, d'infections dentaires, de parodontites, de conjonctivites, d'endophtalmies, d'abcès cérébraux, d'empyèmes sous-duraux, d'infections pulmonaires, de péritonites, d'ostéomyélites, d'arthrites septiques et d'endocardites en particulier sur prothèse, et de méningites sur shunts. Ces infections surviennent le plus souvent (70% des cas) chez des patients diabétiques, présentant une immunodépression, cancéreux, ayant subi une opération chirurgicale ou porteurs de matériel prothétique ou de cathéter.
On estime que 2,8 à 12% des infections ostéo-articulaires sont issues d'infections de prothèse de hanche, genou, épaule (Brook et al. (1991 ) Rev. Infect. Dis. 13:168-172). Une autre étude a montré qu'un tiers des arthrites à P. acnés serait dû à des infections sur prothèse (Brook et al. (1993) Am. J. Med. 94:21 -28). Les mécanismes de contamination de la plaie opératoire sont vraisemblablement des contaminations par la flore cutanée du patient, ou une contamination aéroportée (patient ou équipe chirurgicale). On peut également penser à une hypothétique persistance sur les surfaces. Il a pu être montré qu'une insuffisance du traitement d'air en salle d'intervention pouvait être un facteur d'infection du site opératoire en orthopédie. (Berthelot et al. (2006) Infect.
Control. Hosp. Epidemiol. 27:987-990).
Le diagnostic d'infection due à cette bactérie est souvent difficile car la clinique peut être paucisymptomatique. Il repose actuellement sur la culture du micro-organisme. En général, les aspirations sont considérées comme les meilleurs échantillons pour la culture, sauf si une biopsie tissulaire est réalisable. Propionibacterium acnés se cultive sur différents milieux de culture usuels à 37<O en condition anaérobie. La culture est relativement lente, nécessitant souvent 48 heures avant l'apparition des colonies, il est donc conseillé de conserver les cultures pendant 5 jours. Quelquefois la culture peut durer 15 à 20 jours. L'identification repose sur la production d'indole et de catalase, la fermentation du glucose et du glycérol.
Toutefois, il a pu être montré que d'autres bactéries anaérobies sont souvent retrouvées lors des cultures rendant le diagnostic d'infection à P. acnés plus difficile. La difficulté de diagnostic dans le cas de prélèvements plurimicrobiens réside dans le fait qu'il faille recourir à divers milieux sélectifs. Par ailleurs, P. acnés est un contaminant commun des hémocultures. Sa mise en évidence peut être liée à une contamination lors du prélèvement ou de la culture. D'après différentes études (Brook ét al. (1991 ) Rev Infect Dis 13:168-172, Lutz ét al. (2005) Eur J Clin Microbiol Infect 24:739-744), la contamination peut aller de 17 à 88% des prélèvements, ce qui augmente le risque d'apparition de faux positifs. Ainsi en plus de données cliniques, le nombre de cultures positives ainsi que les résultats de la coloration de l'examen direct doivent être prises en compte pour le diagnostic de l'infection par la bactérie.
En outre, un bon prélèvement clinique pour la mise en évidence d'infection sur prothèse ostéo-articulaire correspond donc à des prélèvements profonds et nombreux car la probabilité d'infection augmente avec le nombre de prélèvements positifs c'est-à-dire 2 à 3.
Il n'existe donc pas, actuellement, de technique de diagnostic de l'infection à P. acnés autre que la culture qui est lente, très difficile, et qui nécessite plusieurs prélèvements profonds. C'est donc l'objet de la présente invention que de proposer des techniques alternatives pour le diagnostic des infections à P. acnés.
Résumé de l'invention
La présente invention découle de l'identification, par les inventeurs, que les protéines 15B2, 17B6, 18D4, 15B1 , 14B5, 14C4 de P. acnés (représentées respectivement par SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12) étaient particulièrement adaptées au diagnostic sérologique des infections à P. acnés.
Ainsi, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, pour déterminer si un individu est infecté par une bactérie du genre Propionibacterium, comprenant la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, dans un échantillon biologique de l'individu.
Dans un mode de réalisation de la méthode de diagnostic telle que définie ci- dessus, la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, comprend la mise en contact de l'échantillon biologique avec:
(i) au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou
(ii) au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins un anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12. La présente invention concerne également l'utilisation :
(i) d'au moins une protéine comprenant ou constituée une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) d'au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) d'au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins un anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, pour le diagnostic in vitro des infections par une bactérie du genre Propionibacterium. La présente invention concerne également un kit comprenant :
(i) au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ
ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou
(iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ
ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, pour son utilisation dans le diagnostic des infections par une bactérie du genre Propionibacterium.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un ligand de capture, notamment un anticorps, dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 pour le diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium. Autrement dit, la présente invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium chez un individu, dans laquelle on détecte la présence d'au moins un antigène de ladite bactérie du genre Propionibacterium dans un échantillon biologique de l'individu à l'aide d'un ligand de capture, notamment un anticorps, dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active :
(i) au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, ou au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Description détaillée de l'invention
Comme on l'entend ici l'expression « bactérie du genre Propionibacterium » se réfère à toutes les espèces ou sous-espèces comprises dans ce genre. On préfère toutefois que la bactérie du genre Propionibacterium soit P. acnés, P. avidum, P. granulosum ou P. propionicum.
Comme on l'entend ici l'expression "infecté" ou "infection" concerne des individus porteurs d'une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci-dessus. De préférence, les individus infectés présentent un ou plusieurs sites de multiplication des bactéries du genre Propionibacterium. Les infections par des bactéries du genre Propionibacterium peuvent être la conséquence d'une intervention chirurgicale pour la pose d'un matériel étranger. Ainsi, comme on l'entend ici, l'individu a de préférence subi une intervention chirurgicale, et, en particulier, a subi l'implantation d'une prothèse, telle qu'une prothèse articulaire, notamment sélectionnée dans le groupe constitué d'une prothèse du genou et une prothèse de hanche.
Dans un mode de réalisation préféré, la méthode selon l'invention est mise en œuvre afin de déterminer si un individu souffre d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium, ladite infection étant choisie parmi une infection sur prothèse (en particulier articulaire), une infection ostéo-articulaire, une infection post-opératoire (en particulier lors de la pose d'un matériel étranger tel qu'une prothèse), une infection dentaire, une parodontite, une conjonctivite, une endophtalmie, un abcès cérébral, un empyème sous-dural, une infection pulmonaire, une péritonite, un ostéomyélite, une arthrite septique, une endocardite (en particulier sur prothèse), une méningite (en particulier sur shunts) et l'acné vulgaire. L'individu peut en outre être un individu diabétique, présentant une immunodépression, souffrant d'un cancer et/ou porteur de matériel prothétique ou de cathéter. Dans un mode de réalisation particulier selon l'invention, l'acné (en particulier l'acné vulgaire) peut être exclue du champ des infections pour lesquelles on cherche à savoir si elles sont liées à la présence d'une bactérie du genre Propionibacterium par le biais des méthodes selon la présente invention.
Comme on l'entend ici, l'expression « échantillon biologique » inclut à la fois l'échantillon tel que prélevé et l'échantillon ayant été soumis à divers traitement, notamment pour le rendre apte à son utilisation dans les procédés et méthodes selon l'invention. L'« échantillon biologique » selon l'invention peut être de tout type susceptible de contenir des anticorps dirigés contre une bactérie du genre Propionibacterium ou de contenir des antigène issus d'une bactérie du genre Propionibacterium, on préfère toutefois que l'échantillon biologique soit sélectionné dans le groupe constitué d'un échantillon de sang, d'un échantillon de sérum, d'un échantillon de plasma, d'un échantillon de tissu lymphoïde associé à une muqueuse, d'un échantillon de liquide céphalo-rachidien, d'un échantillon de liquide articulaire, d'un échantillon de liquide pleural, d'un échantillon de salive, et d'un échantillon d'urine. Comme on l'entend ici, l'expression « déterminer si un individu est infecté par une bactérie du genre Propionibacterium » comprend la pose d'un diagnostic ou le diagnostic d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci-dessus chez individu. Elle comprend également le suivi d'individus ayant subi une intervention chirurgicale, notamment en vue d'implanter, de nettoyer ou de remplacer une prothèse. Elle comprend en outre le suivi d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci-dessus, notamment dans le cadre d'un traitement thérapeutique visant à lutter contre l'infection ; on préfère alors que l'individu soit en cours de traitement antibiotique.
Comme on l'entend ici, les expressions « protéine constituée d'une séquence » ou « protéine représentée par une séquence » sont synonymes.
La protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12; la protéine homologue de celle-ci, ou les fragments de ces dernières, tels que définis ci-dessus peuvent être composé des 20 acides aminés naturels ou d'acides aminés que ces 20 acides aminés codés. Ils peuvent également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits de la chaîne polypeptidique et n'importe où dans la chaîne polypeptidique : dans le squelette peptidique, dans les groupes latéraux ou encore aux extrémités carboxy- ou amino-terminales. Ils peuvent être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de posttraduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier.
On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, la palmitoylation, la glypiation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and WoId, F., Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, pgs 1 - 12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Académie Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 : 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663 : 48-62 (1992)). Par ailleurs, lorsqu'ils sont obtenus par voie recombinante la protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, la protéine homologue de celle-ci, ou les fragments de ces dernières, tels que définis ci- dessus, peuvent également comprendre des séquences utiles pour la purification des protéines (des étiquettes de purification), telles que des étiquettes polyhistidine, et éventuellement une séquence permettant de cliver ces étiquettes, par exemple des sites de coupures par des protéases.
De préférence, une protéine comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, comprend 350, 400, 500, ou 1000 acides aminés au maximum. Plus préférablement, les protéines comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, sont respectivement constituées de SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 17, et SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 18. De préférence les protéines comprenant ou constituées de SEQ ID NO : 2, SEQ
ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 sont respectivement codées par des acides nucléiques comprenant ou constitués de SEQ ID
NO : 1 , SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, et SEQ ID NO : 1 1 .
Le pourcentage d'identité selon l'invention peut être calculé par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. De préférence, le pourcentage d'identité correspond au nombre d'acides aminés identiques obtenus pour un alignement apparié optimal (c'est-à-dire l'alignement maximisant le nombre d'acides aminés identiques) d'une séquence d'une protéine homologue avec SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, sur la totalité de leur longueur, divisé par le nombre total d'acides aminés de la plus grande des deux séquences alignées. L'alignement peut être réalisé manuellement ou à l'aide de programmes d'ordinateur tels que le programme EMBOSS-Needle program (Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453). Le pourcentage d'identité est de préférence calculé en utilisant le programme EMBOSS::needle (global) avec la matrice Blosum62 et les paramètres suivants: "Gap Open" égal à 10.0, "Gap Extend" égal à 0.5. De préférence, le pourcentage d'identité selon l'invention est d'au moins 85%, plus préférablement d'au moins 90%, et encore plus préférablement d'au moins 95%. De préférence, le « fragment » selon l'invention comprend au moins 20 acides aminés, plus préférablement au moins 30 acides aminés, et encore plus préférablement au moins 40 acides aminés. De préférence également, le « fragment » selon l'invention comprend 100 acides aminés au plus, plus préférablement 80 acides aminés au plus, et encore plus préférablement 60 acides aminés au plus. De préférence également, le « fragment » selon l'invention est constitué d'une portion de SEQ ID NO : SEQ ID NO : 2,
SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12 ou d'une portion de séquences présentant au moins 85%, plus préférablement au moins 90%, et encore plus préférablement d'au moins 95% de SEQ ID NO : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12. Comme on l'entend ici, la protéine homologue définie ci-dessus ou le fragment défini ci-dessus, est tel qu'il puisse être lié par au moins un anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12. En d'autres termes, la protéine homologue définie ci-dessus ou le fragment défini ci- dessus comprennent au moins un des épitopes d'une protéine constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12. En conséquence, la protéine homologue définie ci-dessus ou le fragment défini ci-dessus devraient de préférence être tels qu'ils procurent au moins 70%, plus préférablement au moins 80% et encore plus préférablement au moins 90%, de la sensibilité respectivement procurée par une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, mesurée dans les mêmes conditions.
Comme on l'entend ici, le terme « sensibilité » est défini comme le pourcentage d'individus infectés par une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci- dessus, de préférence par P. acnés, dont les échantillons biologiques selon l'invention, notamment des échantillons de sérum, contiennent des anticorps dirigés contre une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12 détectables selon l'invention. La détermination de la sensibilité procurée par un antigène peut être réalisée comme cela est indiqué dans l'Exemple 1 suivant. De préférence, les anticorps détectés dans les échantillons biologiques selon l'invention sont des IgG.
Par ailleurs, comme cela apparaîtra clairement à l'homme du métier, « un anticorps dirigé contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 » vise tout anticorps de l'individu capable de reconnaître une protéine constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, c'est-à-dire un anticorps spécifique de cette protéine, mais qui peut également reconnaître :
- une protéine plus grande comprenant SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12; ou une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; - un fragment d'au moins 10 acides aminés de la protéine homologue ou d'une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO
: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12.
La détection d'anticorps dirigés contre une protéine représentée par SEQ ID NO :
2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12 dans les échantillons biologiques, ou la détection d'antigènes d'une bactérie du genre
Propionibacterium telle que définie ci-dessus à l'aide d'un ligand de capture, notamment un anticorps, dirigé, de préférence spécifiquement, contre une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, peut être aisément mise en œuvre par l'homme du métier.
S'agissant de la détection d'anticorps dirigés contre une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12 dans les échantillons biologiques, elle peut être réalisée, comme cela a été vu ci-dessus, à l'aide (i) d'au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) d'au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) d'au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés. Les éléments décrits en (i), (ii) et (iii) constituent alors des ligands de capture des anticorps présents dans les échantillons biologiques.
Dans le cas de la détection d'antigènes de Propionibacterium à l'aide d'un ligand de capture dirigé, de préférence spécifiquement, contre une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, le ligand de capture peut être de tout type, mais on préfère qu'il soit un anticorps, un aptamère, ou un peptide obtenu par « phage display », et en particulier on préfère qu'il soit un anticorps.
Pour déterminer si des anticorps ou des antigènes ont été fixés par un ligand de capture on peut utiliser un ligand de détection, qui peut être spécifique soit des anticorps ou des antigènes fixés, soit des ligands de capture. Le ligand de détection peut être de tout type, mais on préfère qu'il soit un anticorps, un aptamère, ou un peptide obtenu par « phage display », et en particulier on préfère qu'il soit un anticorps. De préférence, le ligand de détection est marqué. Comme on l'entend ici, le terme « marqué » se réfère à la fois à un marquage direct et à un marquage indirect (par exemple par le biais d'un autre ligand lui-même marqué directement). Le marquage peut être de type radioisotopique, enzymatique ou lumineux (par exemple à l'aide d'un chromophore ou d'un fluorophore).
Les méthodes faisant appel à des ligands de capture et des ligands de détection sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être mises en œuvre selon différents formats bien connus, en phase solide ou homogène, en une ou deux étapes, à l'aide d'une méthode sandwich ou par compétition. De préférence, le ligand de capture est immobilisé sur une phase solide, telle que les parois d'un puits d'une plaque de microtitration ou des billes paramagnétiques.
Comme on l'entend ici, un "anticorps", lorsqu'il s'agit d'un ligand de capture ou d'un ligand de détection, peut appartenir à n'importe quelle espèce, et est notamment un anticorps humain, de souris, de rat, de chèvre ou de camelidae. L'anticorps peut également être un anticorps chimérique, c'est-à-dire un anticorps constitué de parties provenant de différentes espèces. Les anticorps chimériques préférés sont dits humanisés, dans lesquels les parties constantes (notamment CH et CL) sont d'origine humaine et les parties variables (VH et VL) ou les CDR des parties variables sont d'une autre espèce, la souris par exemple. L'anticorps peut être produit par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par immunisation d'un animal ou par de méthodes recombinantes ou chimiques. En outre, le terme « anticorps » comme on l'entend ici, comprend également les fragments d'anticorps qui comprennent au moins un des paratopes de l'anticorps, à savoir notamment les fragments Fab, F(ab')2, et scFv. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal, notamment un anticorps polyclonal monospécifique, ou un anticorps monoclonal.
Les "aptamères" sont bien connus de l'homme du métier. Ils peuvent être de nature nucléotidique comme décrit notamment par Ellington et al. (1990) Nature 346:818- 22 et Bock et al. (1992) Nature 355:564-6, ou de nature peptidique, comme décrits, notamment, par Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78:426-30.
La méthode dite du "phage display" est une méthode de sélection de ligands polypeptidiques exprimés sur la capside d'un bactériophage et codés par une séquence nucléotidique insérée dans le gène codant la capside. Cette méthode est bien connue de l'homme du métier et est notamment décrite par Scott & Smith (1990) Science 249:386- 390, et Marks et al. (1991 ) J. Mol. Biol. 222:581 -597. De préférence, le polypeptide obtenu par phage display est un polypeptide du type scFv (pour « single-chain variable fragment »), comme cela est notamment décrit par Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455.
Le terme « spécifique » ou « spécifiquement », lorsqu'il se réfère à la liaison d'un ligand avec une première cible, signifie que le ligand peut se lier à la première cible sans pour autant se lier à une deuxième cible qui ne ressemble pas structurellement à la première cible.
Tous les articles, revues, demandes de brevet, brevets et manuels mentionnés ici sont incorporées par référence au texte de la présente demande. Bien qu'ayant des significations distinctes, les termes « comprenant », « contenant », « comportant » et « consistant en » ont été utilisés de manière interchangeable dans la description de l'invention, et peuvent être remplacés l'un par l'autre.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans en limiter la portée.
Résumé des séquences mentionnées dans la présente description
Figure imgf000013_0001
Exemples
Matériels et méthodes
1. Protocole d'obtention des antigènes
1.1. Clonage de la séquence codant les polypeptides SEQ ID NO : 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 21
Les gènes codant les séquences des polypeptides SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 20 sont amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie P. acnés (souche KPA171202) en utilisant, respectivement, des amorces spécifiques des séquences SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 ou 19 ; ces amorces sont choisies par l'homme de l'art de façon à encadrer la séquence d'ADN et à l'amplifier spécifiquement (par exemple SEQ ID NO : 1 , 3, 5, 7, 9, 1 1 , ou 19). Les fragments correspondants, ainsi amplifiés, sont clones dans des vecteurs selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ces vecteurs permettent la production des protéines clonées sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside (IPTG). Les protéines clonées correspondent aux polypeptides SEQ ID NO :13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 21 (15B2, 17B6, 18D4, 15B1 , 14B5, 14C4 ou 14H4 respectivement).
1.2. Expression des protéines
Une souche d'Escherichia coli est transformée par le vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises en culture une nuit à 3O0C sous agitation dans 50 ml de milieu Luria Bertani (LB, J.Miller, « A short course in
Bacteria Genetics », CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant, respectivement, de l'ampicilline et du chloramphénicol à une concentration finale de 100 μg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50eme dans un volume final de 1 litre de milieu LB auquel on a ajouté, respectivement, de l'ampicilline et du chloramphénicol à une concentration finale de 100 μg/ml, et elle est incubée à 3O0C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (en abrégé, A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par NPTG à une concentration finale de 0,5 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (6 minutes à 5240 tours/min à 4°C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1 ,5. 1.3. Purification
Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon
Tris-HCI 20 mM, pH 8, contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées avec du lysozyme (0,1 g / 50 ml) en présence de 250 m M d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA). La suspension est incubée pendant 30 minutes à 40C puis centrifugée pendant
10 minutes à 40C à 15500xg. Le culot est congelé à -200C pendant au moins une nuit.
Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Triéthanolamine 20 m M à pH 8,0, NaCI 300 mM, EDTA 5 mM et urée 6 M, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 40C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22 μm. Le filtrat est alors déposé sur une colonne de gel filtration (par exemple, Superdex 75 HL 26/60, GE Healthcare). Les fractions collectées sont rassemblées puis après dessalage sont déposées sur une colonne HiLoad Q column (GE Healthcare) dans un tampon Triéthanolamine 20 mM pH8, urée 6 M, 20 mM β mercaptoéthanol. Les protéines sont ensuite éluées en effectuant un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCI dans du tampon dans un tampon Triéthanolamine 20 mM pH8, urée 6 M, 20 mM β mercaptoéthanol en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées puis diluées dans du tampon triéthanolamine 20 mM pH8, urée 6 M contenant 30 % de glycérol et 20 mM β mercaptoéthanol. Les protéines purifiées sont alors stockées à -2O0C jusqu'à leur utilisation dans les tests. Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee L., Grimsley G. Et Gray T., (1995), Protein Science 4, 241 1 -2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par électrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse.
2. Test de diagnostic in vitro
Pour réaliser les tests de diagnostic, des sérums provenant de patients caractérisés positifs par culture de prélèvements ont été utilisés. Les sérums témoins, correspondent à des sérums de donneurs de sang.
La fixation, sur les protéines recombinantes purifiées (obtenues comme décrit précédemment), des anticorps présents dans les sérums a été évaluée soit par des tests en Western blot soit par la technique ELISA. 2.1. Protocole de test de Western blot
Après transfert sur une membrane de nitrocellulose des protéines recombinantes purifiées (obtenues comme décrit précédemment), la membrane est saturée pendant 45 minutes à l'aide d'une solution de tampon salin phosphate (PBS) contenant 3% de lait demi-écrémé. Après trois lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (1/500) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G et A et M humaines de chèvre (par exemple 170-1042, Biorad), marqués à la phosphatase alcaline, sont ajoutés en une période de 45 minutes après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé. Trois nouveaux lavages sont effectués puis du phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle et du nitroblue tetrazolium sont ajoutés, selon les indications du fournisseur, jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat « positif » correspond à la fixation de l'anticorps anti- immunoglobuline humaine à un complexe composé du polypeptide selon l'invention fixé à la membrane et de l'anticorps sérique humain le reconnaissant spécifiquement, ce qui se traduit par une coloration localisée au niveau dudit complexe.
2.2. Protocole du test ELISA Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4<O en présence de 0,5 μg d'antigène purifié (protéines 15B2, 17B6, 18D4, 15B1 , 14B5, 14C4, 14H4) dans du « tampon salin phosphate » (PBS). Après quatre lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure et demie à 37<O par du PBS-Tween contenant 4% d'albumine de sérum bovin (BSA) (250 μl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 μl de chaque sérum « positif » ou témoin sont ajoutés, à la dilution 1/100 dans du tampon PBS-BSA 4%, dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée à 37<€ pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G humaines de chèvre marqués à la peroxydase (par exemple 31415, Pierce) sont ajoutés (simultanément et/ou indépendamment) en 30 minutes à 37<O après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS-BSA 4%. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 μl de substrat tétrabenzimidine (TMB) (par exemple HD979505, Pierce) sont ajoutés par puits. Après incubation pendant environ 15 minutes, 100 μl d'acide sulfurique sont ajoutés dans chaque puits. L'absorbance à 450 nm de chaque puits est alors mesurée après 5 minutes. Sont considérés comme « positif » en ELISA, les sérums identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention.
Les performances des tests ELISA utilisant les polypeptides identifiés selon l'invention ainsi que les combinaisons de polypeptides selon l'invention ont été évaluées par la méthode d'analyse par fonction discriminante, analyse très proche de l'analyse de variance. Cette méthode connue de l'homme du métier permet de déterminer les variables qui permettent de discriminer entre les deux groupes de patients ou individus témoins. La méthode consiste à déterminer si les deux groupes diffèrent suivant la moyenne de la variable et d'utiliser cette dernière pour prédire le groupe.
Des résultats types obtenus sont présentés dans les différents exemples ci-après. Les sérums de patients considérés comme positifs sont ceux contenant des anticorps dirigés contre P. acnés identifiés, par ELISA, par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention.
Exemple 1
Utilisation des polypeptides de l'invention pour la détection d'anticorps dans les sérums (ELISA)
Le panel d'échantillons testés est constitué de sérums de patients souffrant d'infections ostéo-articulaires sur prothèse dont l'infection à P. acnés a été diagnostiquée positive après mise en culture de prélèvements issus desdits patients. Le panel d'individus témoins est constitué de sérums de donneurs de sang.
Le tableau 1 présente les résultats obtenus selon l'invention pour les polypeptides 15B2 (SEQ ID NO : 13), 15B1 (SEQ ID NO : 16), 14B5 (SEQ ID NO : 17), 14C4 (SEQ ID NO : 18), 14H4 (SEQ ID NO : 21 ) avec des anticorps secondaires reconnaissant les immunoglobulines G présentes dans des sérums de patients malades ou d'individus témoins. Tableau 1 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-lgG comme anticorps secondaires
Figure imgf000018_0001
D'après le Tableau 1 , on constate que les polypeptides de l'invention peuvent être utilisés pour la mise en évidence d'infections à P. acnés sur prothèses ostéo- articulaires. En revanche, d'autres polypeptides également issus de P. acnés, comme 14H4 présenté ici (SEQ ID NO : 21 ), ne permettent absolument pas la mise en évidence de telles infections.
Exemple 2
Utilisation des polypeptides de l'invention pour le suivi thérapeutique de patients
Tableau 2 : Présentation des patients et sérums de suivi
Moment du prélèvement par rapport à
Patient Sérum l'intervention chirurgicale
S1 Per-opératoire
Patient 1
S2 2 mois après l'opération
S1 Per-opératoire
Patient 2 S2 2 mois après l'opération
S3 9 mois après l'opération
S1 Per-opératoire
Patient 3
S2 2 mois après l'opération
Tableau 3 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant différents polypeptides selon l'invention.
Figure imgf000019_0001
(ns, non significatif , <10%)
Le calcul du pourcentage de diminution a été effectué comme suit
% Diminution = (D0Si - DOS2ous3)/ D0Si Chez des patients en convalescence, la constatation de la diminution ou de l'augmentation, au cours du temps, des valeurs ELISA, obtenues en détectant les immunoglobulines (anticorps) présents dans les sérums, par leur fixation aux polypeptides de l'invention, indique leur guérison ou l'évolution de l'infection. L'utilisation des polypeptides de l'invention permet donc de réaliser des suivis thérapeutiques, c'est-à-dire (i) d'évaluer l'effet d'un traitement et (ii) de suivre l'évolution de l'infection chez un patient.
Il est ainsi démontré, d'une part, l'existence, chez l'homme, d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de χ2 est inférieure à 0,05) vis-à- vis des polypeptides identifiés selon l'invention au cours des infections à P. acnés et, d'autre part, que les protéines 15B2, 17B6, 18D4, 15B1 , 14B5, et 14C4 sont pertinentes pour le diagnostic sérologique d'infections à P. acnés de type ostéo-articulaire sur prothèse.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode in vitro pour déterminer si un individu est infecté par une bactérie du genre 5 Propionibacterium, comprenant la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, dans un échantillon biologique de l'individu. 0
2. Méthode selon la revendication 1 , dans laquelle la bactérie du genre Propionibacterium est P. acnés, P. avidum, P. granulosum ou P. propionicum.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les anticorps sont des IgG. 5
4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'individu a subi l'implantation d'une prothèse articulaire.
5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'individu a subi l'implantation d'une prothèse articulaire sélectionnée dans le groupe constitué d'une O prothèse du genou et une prothèse de hanche.
6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle l'échantillon biologique est sélectionné dans le groupe constitué d'un échantillon de sang, d'un échantillon de sérum, d'un échantillon de plasma, d'un échantillon de tissu lymphoïde associé à une muqueuse, 5 un échantillon de liquide céphalo-rachidien, un échantillon de liquide articulaire, un échantillon de liquide pleural, un échantillon de salive, et un échantillon d'urine.
7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le O groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ
ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, comprend la mise en contact de l'échantillon biologique avec:
(i) au moins une protéine comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID5 NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12.
8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle l'individu est en cours de traitement antibiotique.
9. Utilisation :
(i) d'au moins une protéine comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID
NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou
(ii) d'au moins une protéine homologue comprenant une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 8,
SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou
(iii) d'au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, pour le diagnostic in vitro des infections par une bactérie du genre Propionibacterium.
10. Kit comprenant :
(i) au moins une protéine comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant une séquence partageant au moins 80% d'identité à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8,
SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou
(iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ
ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, pour son utilisation dans le diagnostic des infection par une bactérie du genre Propionibacterium.
1 1. Utilisation d'un anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 pour le diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium.
12. Composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active :
(i) au moins une protéine comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou
(ii) au moins une protéine homologue comprenant une séquence partageant au moins 80% d'identité à une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, ou au moins un anticorps tel que défini dans la revendication 1 1 , en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
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