FR2945125A1 - Methode de diagnostic des infections a propionibacterium acnes - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une méthode de diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium chez un individu, comprenant la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, dans un échantillon biologique de l'individu.

Description

Méthode de diagnostic des infections à Propionibacterium acnes

Domaine technique La présente invention concerne une méthode de diagnostic des infections à 5 Propionibacterium acnes.

Arrière-plan technique Propionibacterium acnes est un bacille à Gram positif non sporulé, catalase et indole positifs, se développant en anaérobiose, parfois en micro-aérophilie et 1 o immobile. Cette bactérie fait partie de la flore humaine naturelle, commensale de la peau, de la conjonctive, de l'oreille externe, de la cavité buccale, du tractus haut respiratoire et occasionnellement de l'intestin et du vagin. P acnes est notamment associé au processus inflammatoire dans les lésions acnéiques. Cette bactérie est aussi à l'origine d'infections post-opératoires, notamment en cas de présence 15 d'implant, potentiellement sévères. Cette bactérie a été rendue responsable, seule ou associée à d'autres bactéries aérobies ou anaérobies, d'infections dentaires, de parodites, de conjonctivites, d'endophtalmies, d'abcès cérébraux, d'empyèmes sous-duraux, d'infections pulmonaires, de péritonites, d'ostéomyélites, d'arthrites septiques et d'endocardites en particulier sur prothèse, et de méningites sur 20 shunts. Ces infections surviennent le plus souvent (70% des cas) chez des patients diabétiques, présentant une immunodépression, cancéreux, ayant subi une opération chirurgicale ou porteurs de matériel prothétique ou de cathéter. On estime que 2,8 à 12% des infections ostéo-articulaires sont issues d'infections de prothèse de hanche, genou, épaule (Brook et al. (1991) Rev. Infect. 25 Dis. 13:168-172). Une autre étude a montré qu'un tiers des arthrites à P. acnes serait dû à des infections sur prothèse (Brook et al. (1993) Am. J. Med. 94:21-28). Les mécanismes de contamination de la plaie opératoire sont vraisemblablement des contaminations par la flore cutanée du patient, ou une contamination aéroportée (patient ou équipe chirurgicale). On peut également penser à une 30 hypothétique persistance sur les surfaces. Il a pu être montré qu'une insuffisance du traitement d'air en salle d'intervention pouvait être un facteur d'infection du site opératoire en orthopédie. (Berthelot et al. (2006) Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 27:987-990).

Le diagnostic d'infection due à cette bactérie est souvent difficile car la clinique peut être paucisymptomatique. Il repose actuellement sur la culture du micro-organisme. En général, les aspirations sont considérées comme les meilleurs échantillons pour la culture, sauf si une biopsie tissulaire est réalisable.

Propionibacterium acnes se cultive sur différents milieux de culture usuels à 37°C en condition anaérobie. La culture est relativement lente, nécessitant souvent 48 heures avant l'apparition des colonies, il est donc conseillé de conserver les cultures pendant 5 jours. Quelquefois la culture peut durer 15 à 20 jours. L'identification repose sur la production d'indole et de catalase, la 1 o fermentation du glucose et du glycérol. Toutefois, il a pu être montré que d'autres bactéries anaérobies sont souvent retrouvées lors des cultures rendant le diagnostic d'infection à P. acnes plus difficile. La difficulté de diagnostic dans le cas de prélèvements plurimicrobiens réside dans le fait qu'il faille recourir à divers milieux sélectifs. 15 Par ailleurs, P. acnes est un contaminant commun des hémocultures. Sa mise en évidence peut être liée à une contamination lors du prélèvement ou de la culture. D'après différentes études (Brook et al. (1991) Rev Infect Dis 13:168-172, Lutz et al. (2005) Eur J Clin Microbiol Infect 24:739-744), la contamination peut aller de 17 à 88% des prélèvements, ce qui augmente le risque d'apparition de 20 faux positifs. Ainsi en plus de données cliniques, le nombre de cultures positives ainsi que les résultats de la coloration de l'examen direct doivent être prises en compte pour le diagnostic de l'infection par la bactérie. En outre, un bon prélèvement clinique pour la mise en évidence d'infection 25 sur prothèse ostéo-articulaire correspond donc à des prélèvements profonds et nombreux car la probabilité d'infection augmente avec le nombre de prélèvements positifs c'est-à-dire 2 à 3. Il n'existe donc pas, actuellement, de technique de diagnostic de l'infection à P. acnes autre que la culture qui est lente, très difficile, et qui nécessite plusieurs 30 prélèvements profonds. C'est donc l'objet de la présente invention que de proposer des techniques alternatives pour le diagnostic des infections à P. acnes.

Résumé de l'invention La présente invention découle de l'identification, par les inventeurs, que les protéines 15B2, 17B6, 18D4, 15B1, 14B5, 14C4 de P. acnes (représentées respectivement par SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12) étaient particulièrement adaptées au diagnostic sérologique des infections à P. acnes. Ainsi, la présente invention concerne une méthode, notamment in vitro, pour déterminer si un individu est infecté par une bactérie du genre Propionibacterium, comprenant la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ IDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO: 10, et SEQ ID NO : 12, dans un échantillon biologique de l'individu. Dans un mode de réalisation de la méthode de diagnostic telle que définie ci-dessus, la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, comprend la mise en contact de l'échantillon biologique avec: (i) au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins un anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO:12.

La présente invention concerne également l'utilisation : (i) d'au moins une protéine comprenant ou constituée une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) d'au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) d'au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins un anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO: 12, pour le diagnostic in vitro des infections par une bactérie du genre Propionibacterium. La présente invention concerne également un kit comprenant : (i) au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, pour son utilisation dans le diagnostic des infections par une bactérie du genre Propionibacterium. La présente invention concerne également l'utilisation d'un ligand de capture, notamment un anticorps, dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 4, SEQ I D NO : 6, SEQ I D NO : 8, SEQ I D NO : 10, et SEQ I D NO : 12 pour le diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium. Autrement dit, la présente invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium chez un individu, dans laquelle on détecte la présence d'au moins un antigène de ladite bactérie du genre Propionibacterium dans un échantillon biologique de l'individu à l'aide d'un ligand de capture, notamment un anticorps, dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ IDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO: 10, et SEQ ID NO : 12.

La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, comprenant à titre de substance active : (i) au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, ou au moins un anticorps tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Description détaillée de l'invention Comme on l'entend ici l'expression bactérie du genre Propionibacterium 1 o se réfère à toutes les espèces ou sous-espèces comprises dans ce genre. On préfère toutefois que la bactérie du genre Propionibacterium soit P. acnes, P. avidum, P. granulosum ou P. propionicum. Comme on l'entend ici l'expression "infecté" ou "infection" concerne des individus porteurs d'une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci- 15 dessus. De préférence, les individus infectés présentent un ou plusieurs sites de multiplication des bactéries du genre Propionibacterium. Les infections par des bactéries du genre Propionibacterium peuvent être la conséquence d'une intervention chirurgicale pour la pose d'un matériel étranger. Ainsi, comme on l'entend ici, l'individu a de préférence subi une intervention chirurgicale, et, en 20 particulier, a subi l'implantation d'une prothèse, telle qu'une prothèse articulaire, notamment sélectionnée dans le groupe constitué d'une prothèse du genou et une prothèse de hanche. Comme on l'entend ici, l'expression échantillon biologique inclut à la fois l'échantillon tel que prélevé et l'échantillon ayant été soumis à divers traitement, 25 notamment pour le rendre apte à son utilisation dans les procédés et méthodes selon l'invention. L' échantillon biologique selon l'invention peut être de tout type susceptible de contenir des anticorps dirigés contre une bactérie du genre Propionibacterium ou de contenir des antigène issus d'une bactérie du genre Propionibacterium, on préfère toutefois que l'échantillon biologique soit 30 sélectionné dans le groupe constitué d'un échantillon de sang, d'un échantillon de sérum, d'un échantillon de plasma, d'un échantillon de tissu lymphoïde associé à une muqueuse, d'un échantillon de liquide céphalo-rachidien, d'un échantillon de liquide articulaire, d'un échantillon de liquide pleural, d'un échantillon de salive, et d'un échantillon d'urine. Comme on l'entend ici, l'expression déterminer si un individu est infecté par une bactérie du genre Propionibacterium comprend la pose d'un diagnostic ou le diagnostic d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci-dessus chez individu. Elle comprend également le suivi d'individus ayant subi une intervention chirurgicale, notamment en vue d'implanter, de nettoyer ou de remplacer une prothèse. Elle comprend en outre le suivi d'une infection par une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci-dessus, 1 o notamment dans le cadre d'un traitement thérapeutique visant à lutter contre l'infection ; on préfère alors que l'individu soit en cours de traitement antibiotique. Comme on l'entend ici, les expressions protéine constituée d'une séquence ou protéine représentée par une séquence sont synonymes. La protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le 15 groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12; la protéine homologue de celle-ci, ou les fragments de ces dernières, tels que définis ci-dessus peuvent être composé des 20 acides aminés naturels ou d'acides aminés que ces 20 acides aminés codés. Ils peuvent également être composé d'acides aminés modifiés par des processus 20 naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits de la chaîne polypeptidique et n'importe où dans la chaîne polypeptidique : dans le squelette peptidique, dans les groupes latéraux ou encore aux extrémités carboxy- ou amino-terminales. Ils 25 peuvent être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la 30 fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, la palmitoylation, la glypiation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou l'ubiquitination. (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C.

Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182 : 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663 : 48-62 (1992)). Par ailleurs, lorsqu'ils sont obtenus par voie recombinante la protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ IDNO:2,SEQIDNO:4,SEQIDNO:6,SEQIDNO:8,SEQIDNO: 10, et SEQ ID NO : 12, la protéine homologue de celle-ci, ou les fragments de ces dernières, tels que définis ci-dessus, peuvent également comprendre des séquences utiles pour la purification des protéines (des étiquettes de purification), telles que des étiquettes polyhistidine, et éventuellement une séquence 2o permettant de cliver ces étiquettes, par exemple des sites de coupures par des protéases. De préférence, une protéine comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, comprend 350, 400, 500, ou 1000 25 acides aminés au maximum. Plus préférablement, les protéines comprenant une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12, sont respectivement constituées de SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 4 ou SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 15, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID 30 NO : 16, SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 17, et SEQ ID NO : 12 ou SEQ ID NO : 18. De préférence les protéines comprenant ou constituées de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 sont respectivement codées par des acides nucléiques comprenant ou constitués de SEQ I D NO : 1 , SEQ I D NO : 3, SEQ I D NO : 5, SEQ I D NO : 7, SEQ ID NO : 9, et SEQ ID NO : 11. Le pourcentage d'identité selon l'invention peut être calculé par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. De préférence, le pourcentage d'identité correspond au nombre d'acides aminés identiques obtenus pour un alignement apparié optimal (c'est-à-dire l'alignement maximisant le nombre d'acides aminés identiques) d'une séquence d'une protéine homologue avec SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, divisé par le nombre total d'acides aminés de la plus grande des deux séquences alignées. L'alignement peut être réalisé manuellement ou à l'aide de programmes d'ordinateur tels que le programme EMBOSS-Needle program (Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Bibi. 48:443-453). De préférence, le pourcentage d'identité selon l'invention est d'au moins 85%, plus préférablement d'au moins 90%, et encore plus préférablement d'au moins 95%. De préférence, le fragment selon l'invention comprend au moins 20 acides aminés, plus préférablement au moins 30 acides aminés, et encore plus préférablement au moins 40 acides aminés. De préférence également, le fragment selon l'invention comprend 100 acides aminés au plus, plus préférablement 80 acides aminés au plus, et encore plus préférablement 60 acides aminés au plus. De préférence également, le fragment selon l'invention est constitué d'une portion de SEQ ID NO : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12 ou d'une portion de séquences présentant au moins 85%, plus préférablement au moins 90%, et encore plus préférablement d'au moins 95% de SEQ ID NO : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12. Comme on l'entend ici, la protéine homologue définie ci-dessus ou le fragment défini ci-dessus, est tel qu'il puisse être lié par au moins un anticorps dirigé contre une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12. En d'autres termes, la protéine homologue définie ci-dessus ou le fragment défini ci-dessus comprennent au moins un des épitopes d'une protéine constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12. En conséquence, la protéine homologue définie ci-dessus ou le fragment défini ci-dessus devraient de préférence être tels qu'ils procurent au moins 70%, plus préférablement au moins 80% et encore plus préférablement au moins 90%, de la sensibilité respectivement procurée par une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, mesurée dans les mêmes conditions. 1 o Comme on l'entend ici, le terme sensibilité est défini comme le pourcentage d'individus infectés par une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci-dessus, de préférence par P. acnes, dont les échantillons biologiques selon l'invention, notamment des échantillons de sérum, contiennent des anticorps dirigés contre une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID 15 NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12 détectables selon l'invention. La détermination de la sensibilité procurée par un antigène peut être réalisée comme cela est indiqué dans l'Exemple 1 suivant. De préférence, les anticorps détectés dans les échantillons biologiques 20 selon l'invention sont des IgG. Par ailleurs, comme cela apparaîtra clairement à l'homme du métier, un anticorps dirigé contre au moins une protéine représentée par une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 vise tout anticorps 25 de l'individu capable de reconnaître une protéine constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, c'est-à-dire un anticorps spécifique de cette protéine, mais qui peut également reconnaître : - une protéine plus grande comprenant SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ 30 ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12; ou - une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; - un fragment d'au moins 10 acides aminés de la protéine homologue ou d'une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12. La détection d'anticorps dirigés contre une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12 dans les échantillons biologiques, ou la détection d'antigènes d'une bactérie du genre Propionibacterium telle que définie ci-dessus à l'aide d'un ligand de capture, notamment un anticorps, dirigé, de préférence spécifiquement, contre une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, peut être aisément mise en oeuvre par l'homme du métier. S'agissant de la détection d'anticorps dirigés contre une protéine comprenant ou constituée de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, ou SEQ ID NO: 12 dans les échantillons biologiques, elle peut être réalisée, comme cela a été vu ci-dessus, à l'aide (i) d'au moins une protéine comprenant ou constituée d'une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (ii) d'au moins une protéine homologue comprenant ou constituée d'une séquence partageant au moins 80% d'identité avec une séquence sélectionnée dans le groupe constitué de SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10, et SEQ ID NO : 12 ; ou (iii) d'au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés. Les éléments décrits en (i), (ii) et (iii) constituent alors des ligands de capture des anticorps présents dans les échantillons biologiques. Dans le cas de la détection d'antigènes de Propionibacterium à l'aide d'un ligand de capture dirigé, de préférence spécifiquement, contre une protéine 3o représentée par SEQ I D NO : 2, SEQ I D NO : 4, SEQ I D NO : 6, SEQ I D NO : 8, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 12, le ligand de capture peut être de tout type, mais on préfère qu'il soit un anticorps, un aptamère, ou un peptide obtenu par phage display , et en particulier on préfère qu'il soit un anticorps.

Pour déterminer si des anticorps ou des antigènes ont été fixés par un ligand de capture on peut utiliser un ligand de détection, qui peut être spécifique soit des anticorps ou des antigènes fixés, soit des ligands de capture. Le ligand de détection peut être de tout type, mais on préfère qu'il soit un anticorps, un aptamère, ou un peptide obtenu par phage display , et en particulier on préfère qu'il soit un anticorps. De préférence, le ligand de détection est marqué. Comme on l'entend ici, le terme marqué se réfère à la fois à un marquage direct et à un marquage indirect (par exemple par le biais d'un autre ligand lui-même marqué directement). Le marquage peut être de type radioisotopique, enzymatique ou lumineux (par exemple à l'aide d'un chromophore ou d'un fluorophore). Les méthodes faisant appel à des ligands de capture et des ligands de détection sont bien connues de l'homme du métier et peuvent être mises en oeuvre selon différents formats bien connus, en phase solide ou homogène, en une ou deux étapes, à l'aide d'une méthode sandwich ou par compétition. De préférence, le ligand de capture est immobilisé sur une phase solide, telle que les parois d'un puits d'une plaque de microtitration ou des billes paramagnétiques. Comme on l'entend ici, un "anticorps", lorsqu'il s'agit d'un ligand de capture ou d'un ligand de détection, peut appartenir à n'importe quelle espèce, et est notamment un anticorps humain, de souris, de rat, de chèvre ou de camelidae.

L'anticorps peut également être un anticorps chimérique, c'est-à-dire un anticorps constitué de parties provenant de différentes espèces. Les anticorps chimériques préférés sont dits humanisés, dans lesquels les parties constantes (notamment CH et CL) sont d'origine humaine et les parties variables (VH et VL) ou les CDR des parties variables sont d'une autre espèce, la souris par exemple. L'anticorps peut être produit par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple par immunisation d'un animal ou par de méthodes recombinantes ou chimiques. En outre, le terme anticorps comme on l'entend ici, comprend également les fragments d'anticorps qui comprennent au moins un des paratopes de l'anticorps, à savoir notamment les fragments Fab, F(ab')2, et scFv. L'anticorps peut être un anticorps polyclonal, notamment un anticorps polyclonal monospécifique, ou un anticorps monoclonal. Les "aptamères" sont bien connus de l'homme du métier. Ils peuvent être de nature nucléotidique comme décrit notamment par Ellington et al. (1990) Nature 346:818-22 et Bock et al. (1992) Nature 355:564-6, ou de nature peptidique, comme décrits, notamment, par Hoppe-Seyler et al. (2000) J. Mol Med. 78:426-30. La méthode dite du "phage display" est une méthode de sélection de ligands polypeptidiques exprimés sur la capside d'un bactériophage et codés par une séquence nucléotidique insérée dans le gène codant la capside. Cette méthode est bien connue de l'homme du métier et est notamment décrite par Scott & Smith (1990) Science 249:386-390, et Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597. De préférence, le polypeptide obtenu par phage display est un 1 o polypeptide du type scFv (pour single-chain variable fragment ), comme cela est notamment décrit par Winter et al. (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455. Le terme spécifique ou spécifiquement , lorsqu'il se réfère à la liaison d'un ligand avec une première cible, signifie que le ligand peut se lier à la première cible sans pour autant se lier à une deuxième cible qui ne ressemble pas 15 structurellement à la première cible. Résumé des séquences mentionnées dans la présente description : Description des séquences SEQ ID NO : séquence nucleotidique 15B2 1 séquence protéique 15B2 2 séquence nucleotidique 17B6 3 séquence protéique 17B6 4 séquence nucleotidique 18D4 5 séquence protéique 18D4 6 séquence nucleotidique 15B1 7 séquence protéique 15B1 8 séquence nucleotidique 14B5 9 séquence protéique 14B5 10 séquence nucleotidique 14C4 11 séquence protéique 14C4 12 séquence protéique 15B2 + étiquette His 13 séquence protéique 17B6 + étiquette His 14 séquence protéique 18D4 + étiquette His 15 séquence protéique 15B1 + étiquette His 16 séquence protéique 14B5 + étiquette His 17 séquence protéique 14C4 + étiquette His 18 séquence nucleotidique 14H4 19 séquence protéique 14H4 20 séquence protéique 14H4 + étiquette His 21 Exemples

Matériels et méthodes 1. Protocole d'obtention des antigènes

1.1. Clonage de la séquence codant les polypeptides SEQ ID NO : 13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 21 Les gènes codant les séquences des polypeptides SEQ ID NO : 2, 4, 6, 8, 10, 12, ou 20 sont amplifiés par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie P. acnes (souche KPA171202) en utilisant, respectivement, des amorces spécifiques des séquences SEQ ID NO : 1, 3, 5, 7, 9, 11 ou 19 ; ces amorces sont choisies par l'homme de l'art de façon à encadrer la séquence d'ADN et à l'amplifier spécifiquement (par exemple SEQ ID NO : 1, 3, 5, 7, 9, 11, ou 19).

Les fragments correspondants, ainsi amplifiés, sont clonés dans des vecteurs selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ces vecteurs permettent la production des protéines clonées sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside (IPTG). Les protéines clonées correspondent aux polypeptides SEQ ID NO :13, 14, 15, 16, 17, 18 ou 21 (15B2, 17B6, 18D4, 15B1, 14B5, 14C4 ou 14H4 respectivement).

1.2. Expression des protéines Une souche d'Escherichia col/ est transformée par le vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises en culture une nuit à 30°C sous agitation dans 50 ml de milieu Luria Bertani (LB, Miller, A short course in Bacteria Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant, respectivement, de l'ampicilline et du chloramphénicol à une concentration finale de 100 pg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50ème dans un volume final de 1 litre de milieu LB auquel on a ajouté, respectivement, de l'ampicilline et du chloramphénicol à une concentration finale de 100 pg/ml, et elle est incubée à 30°C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (en abrégé, A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,5 mM. Les bactéries 15 sont récoltées par centrifugation (6 minutes à 5240 tours/min à 4°C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5.

1.3. Purification Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 20 mM, pH 8, contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées avec du lysozyme (0,1 g / 50 ml) en présence de 250 mM d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA). La suspension est incubée pendant 30 minutes à 4°C puis centrifugée pendant 10 minutes à 4°C à 15500xg. Le culot est congelé à -20°C pendant au moins une nuit. Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Triéthanolamine 20 mM à pH 8,0, NaCl 300 mM, EDTA 5 mM et urée 6 M, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4°C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22 m.

Le filtrat est alors déposé sur une colonne de gel filtration (par exemple, Superdex 75 HL 26/60, GE Healthcare). Les fractions collectées sont rassemblées puis après dessalage sont déposées sur une colonne HiLoad Q column (GE Healthcare) dans un tampon Triéthanolamine 20 mM pH8, urée 6 M, 20 mM R mercaptoéthanol. Les protéines sont ensuite éluées en effectuant un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon dans un tampon Triéthanolamine 20 mM pH8, urée 6 M, 20 mM R mercaptoéthanol en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées puis diluées dans du tampon triéthanolamine 20 mM pH8, urée 6 M contenant 30 % de glycérol et 20 mM R mercaptoéthanol. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20°C jusqu'à leur utilisation dans les tests. Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee L., Grimsley G. Et Gray T., (1995), Protein Science 4, 2411-2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse 3o par électrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse. . Test de diagnostic in vitro

Pour réaliser les tests de diagnostic, des sérums provenant de patients caractérisés positifs par culture de prélèvements ont été utilisés.

Les sérums témoins, correspondent à des sérums de donneurs de sang. La fixation, sur les protéines recombinantes purifiées (obtenues comme décrit précédemment), des anticorps présents dans les sérums a été évaluée soit par des tests en Western blot soit par la technique ELISA. 2.1. Protocole de test de Western blot Après transfert sur une membrane de nitrocellulose des protéines recombinantes purifiées (obtenues comme décrit précédemment), la membrane est saturée pendant 45 minutes à l'aide d'une solution de tampon salin phosphate (PBS) contenant 3% de lait demi-écrémé. Après trois lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (1/500) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G et A et M humaines de chèvre (par exemple 170-1042, Biorad), marqués à la phosphatase alcaline, sont ajoutés en une période de 45 minutes après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé. Trois nouveaux lavages sont effectués puis du phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle et du nitroblue tetrazolium sont ajoutés, selon les indications du fournisseur, jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat positif correspond à la fixation de l'anticorps anti-immunoglobuline humaine à un complexe composé du polypeptide selon l'invention fixé à la membrane et de l'anticorps sérique humain le reconnaissant spécifiquement, ce qui se traduit par une coloration localisée au niveau dudit complexe.

3o 2.2. Protocole du test ELISA Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4°C en présence de 0,5 pg d'antigène purifié (protéines 15B2, 17B6, 18D4, 15B1, 14B5, 14C4, 14H4) dans du tampon salin phosphate (PBS). Après quatre lavages par du PBS 17 contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure et demie à 37°C par du PBS-Tween contenant 4% d'albumine de sérum bovin (BSA) (250 pl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de chaque sérum positif ou témoin sont ajoutés, à la dilution 1/100 dans du tampon PBS-BSA 4%, dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps antiimmunoglobulines G humaines de chèvre marqués à la peroxydase (par exemple 31415, Pierce) sont ajoutés (simultanément et/ou indépendamment) en 30 minutes à 37°C après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans 1 o du tampon PBS-BSA 4%. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de substrat tétrabenzimidine (TMB) (par exemple HD979505, Pierce) sont ajoutés par puits. Après incubation pendant environ 15 minutes, 100 pl d'acide sulfurique sont ajoutés dans chaque puits. L'absorbance à 450 nm de chaque puits est alors mesurée après 5 minutes. 15 Sont considérés comme positif en ELISA, les sérums identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention. Les performances des tests ELISA utilisant les polypeptides identifiés selon l'invention ainsi que les combinaisons de polypeptides selon l'invention ont été évaluées par la méthode d'analyse par fonction discriminante, analyse très proche 20 de l'analyse de variance. Cette méthode connue de l'homme du métier permet de déterminer les variables qui permettent de discriminer entre les deux groupes de patients ou individus témoins. La méthode consiste à déterminer si les deux groupes diffèrent suivant la moyenne de la variable et d'utiliser cette dernière pour prédire le groupe. 25 Des résultats types obtenus sont présentés dans les différents exemples ci-après. Les sérums de patients considérés comme positifs sont ceux contenant des anticorps dirigés contre P. acnes identifiés, par ELISA, par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention. 30 Exemple 1 Utilisation des polypeptides de l'invention pour la détection d'anticorps dans les sérums (ELISA) Le panel d'échantillons testés est constitué de sérums de patients souffrant d'infections ostéo-articulaires sur prothèse dont l'infection à P. acnes a été diagnostiquée positive après mise en culture de prélèvements issus desdits patients. Le panel d'individus témoins est constitué de sérums de donneurs de sang. 1 o Le tableau 1 présente les résultats obtenus selon l'invention pour les polypeptides 15B2 (SEQ ID NO : 13), 15B1 (SEQ ID NO : 16), 14B5 (SEQ ID NO : 17), 14C4 (SEQ ID NO : 18), 14H4 (SEQ ID NO : 21) avec des anticorps secondaires reconnaissant les immunoglobulines G présentes dans des sérums de patients malades ou d'individus témoins. 15 Tableau 1 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant des anti-IgG comme anticorps secondaires Polypeptide testé Proportion de sérums Proportion de sérums "positifs" parmi les 14 "négatifs" parmi les 94 sérums de malades infectés sérums de donneurs de par P. acnes diagnostiqués sang testés comme témoins positifs par mise en culture de prélèvements 15B2 71.4% 14) 91.5% SEQ ID NO : 13 (10 parmi (86 parmi 94) 15B1 42.9% SEQ ID NO : 16 (6 parmi 14) 14B5 71.4% 14) SEQ ID NO : 17 (10 parmi 1404 71.4% 14) SEQ ID NO : 18 (10 parmi 14H4 0% 91.5% SEQ ID NO : 21 (0 parmi 14) (86 parmi 94) D'après le Tableau 1, on constate que les polypeptides de l'invention 20 peuvent être utilisés pour la mise en évidence d'infections à P. acnes sur prothèses ostéo-articulaires. En revanche, d'autres polypeptides également issus de P. acnes, comme 14H4 présenté ici (SEQ ID NO : 21), ne permettent absolument pas la mise en évidence de telles infections.

Exemple 2 Utilisation des polypeptides de l'invention pour le suivi thérapeutique de patients

Tableau 2 : Présentation des patients et sérums de suivi Patient Sérum Moment du prélèvement par rapport à l'intervention chirurgicale Patient 1 Si Per-opératoire S2 2 mois après l'opération Patient 2 Si Per-opératoire S2 2 mois après l'opération S3 9 mois après l'opération Patient 3 Si Per-opératoire S2 2 mois après l'opération Tableau 3 : Résultats (ELISA) obtenus en utilisant différents polypeptides selon l'invention. Pourcentage de diminution observé entre les 2 sérums en fonction du Sérums polypeptide testé 17E6 18D4 1465 14C4 SEQ ID NO : 14 SEQ ID NO : 15 SEQ ID NO : 17 SEQ ID NO : 18 Patient 1 S1-S2 27% 19% ns ns Patient S1-S2 Ns 21% 16% 17% 2 S2-S3 18% 38% 38% 52% Patient S1-S2 12% 13% 15% 13% 3 (ns, non significatif , <10%) Le calcul du pourcentage de diminution a été effectué comme suit : 0/0 Diminution = (DOsi - DOs2oUs3)/ DOsi

Chez des patients en convalescence, la constatation de la diminution ou de l'augmentation, au cours du temps, des valeurs ELISA, obtenues en détectant les immunoglobulines (anticorps) présents dans les sérums, par leur fixation aux polypeptides de l'invention, indique leur guérison ou l'évolution de l'infection. L'utilisation des polypeptides de l'invention permet donc de réaliser des suivis thérapeutiques, c'est-à-dire (i) d'évaluer l'effet d'un traitement et (ii) de suivre l'évolution de l'infection chez un patient.

Il est ainsi démontré, d'une part, l'existence, chez l'homme, d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de x2 est inférieure à 0,05) vis-à-vis des polypeptides identifiés selon l'invention au cours des infections à P. acnes et, d'autre part, que les protéines 15B2, 17B6, 18D4, 15B1, 14B5, et 14C4 sont pertinentes pour le diagnostic sérologique d'infections à P. acnes de type ostéo-articulaire sur prothèse.

Claims (10)

1. REVENDICATIONS1. Méthode in vitro pour déterminer si un individu est infecté par une bactérie du genre Propionibacterium, comprenant la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, dans un échantillon biologique de l'individu.
2. 2. Méthode selon la revendication 1, dans laquelle la bactérie du genre Propionibacterium est P. acnes, P. avidum, P. granulosum ou P. propionicum.
3. 3. Méthode selon la revendication 1 ou 2, dans laquelle les anticorps sont des IgG.
4. 4. Méthode selon l'une des revendications 1 à 3, dans laquelle l'individu a subi l'implantation d'une prothèse articulaire.
5. 5. Méthode selon l'une des revendications 1 à 4, dans laquelle l'individu a subi l'implantation d'une prothèse articulaire sélectionnée dans le groupe constitué d'une prothèse du genou et une prothèse de hanche. 20
6. 6. Méthode selon l'une des revendications 1 à 5, dans laquelle l'échantillon biologique est sélectionné dans le groupe constitué d'un échantillon de sang, d'un échantillon de sérum, d'un échantillon de plasma, d'un échantillon de tissu lymphoïde associé à une muqueuse, un échantillon de liquide céphalo-rachidien, un échantillon de liquide articulaire, un échantillon de liquide pleural, un 25 échantillon de salive, et un échantillon d'urine.
7. 7. Méthode selon l'une des revendications 1 à 6, dans laquelle la détection d'anticorps dirigés contre au moins une protéine représentée par SEQ ID NO : 2, comprend la mise en contact de l'échantillon biologique avec: 30 (i) au moins une protéine comprenant SEQ ID NO : 2 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant une séquence partageant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO : 2 ; ou 15(iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par SEQ ID NO : 2.
8. 8. Méthode selon l'une des revendications 1 à 7, dans laquelle l'individu est en cours de traitement antibiotique.
9. 9. Utilisation : (i) d'au moins une protéine comprenant SEQ ID NO : 2 ; ou (ii) d'au moins une protéine homologue comprenant une séquence partageant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO : 2 ; ou (iii) d'au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée 20 par SEQ ID NO : 2, pour le diagnostic in vitro des infections par une bactérie du genre Propionibacterium.
10. 10. Kit comprenant : 25 (i) au moins une protéine comprenant SEQ ID NO : 2 ; ou (ii) au moins une protéine homologue comprenant une séquence partageant au moins 80% d'identité avec SEQ ID NO : 2 ; ou (iii) au moins un fragment de la protéine définie en (i) ou de la protéine homologue définie en (ii), le fragment comprenant au moins 10 acides 30 aminés ; sous réserve que la protéine homologue définie en (ii) ou que le fragment défini en (iii) puisse être lié par au moins anticorps dirigé contre une protéine représentée par SEQ ID NO : 2,24 pour son utilisation dans le diagnostic des infection par une bactérie du genre Propionibacterium.