FR2871159A1 - Nouvelles proteines permettant, notamment, la mise en evidence in vitro et la prevention des infections a staphylocoques a coagulase negative - Google Patents
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Abstract
L'invention a pour objet de nouveaux polynucléotides, comprenant la séquence ID SEQ N°1 ou des parties ou des variants de ladite séquence, de nouveaux polypeptides codés par ces polynucléotides, des vecteurs d'expression comprenant lesdits polynucléotides et des cellules hôtes comprenant lesdits vecteurs d'expression. Ces polynucléotides et ces polypeptides sont utilisables dans le domaine du diagnostic in vitro et/ou la production de vaccins contre Staphylococcus epidermidis.
Description
La présente invention concerne l'identification de nouveaux
polynucléotides et polypeptides, leur production et leur utilisation dans le domaine du diagnostic et/ou la production de vaccins contre Staphylococcus epidermidis.
Pendant longtemps, Staphylococcus aureus a été considéré comme la seule espèce pathogène de staphylocoque chez l'homme, alors que les autres espèces de staphylocoques, regroupées sous le terme "staphylocoques à coagulase négative" (SCN), étaient le plus souvent considérées comme de simples contaminants. Ce n'est que récemment qu'a été établie l'importance des SCN comme cause majeure d'infections nocosomiales. Ces infections siègent principalement au niveau de prothèses et de dispositifs implantables chez des patients fragilisés ou immunodéprimés.
Staphylococcus epidermidis est l'espèce de SCN la plus fréquemment isolée et l'une des principales causes d'infections nocosomiales. Staphylococcus epidermidis représente, en effet, de 74 à 92% des souches de SCN isolées à l'hôpital.
Staphylococcus epidermidis est une bactérie présente normalement et en grandes quantités au niveau de la peau et des muqueuses. La nature hydrophobe de la surface de cette bactérie facilite son adhérence sur des matériaux synthétiques et la formation de biofilms augmente sa résistance aux antibiotiques. La bactérie exprime un grand nombre de facteurs de pathogénicité, ce qui explique probablement en grande partie l'importance de son rôle en pathologie humaine.
La quasi totalité des infections causées par Staphylococcus epidermidis sont les infections sur matériel étranger, cathéters ou autres matériels implantables: Staphylococcus epidermidis est responsable de 50 à 70% des infections liées à un cathéter et de 40% des infections sur prothèses ostéoarticulaires ou sur matériel d'ostéosynthèse.
Des centaines de milliers de prothèses articulaires sont posées annuellement dans le monde et des millions de personnes en portent une. D'après la Société Française d'Orthopédie, le nombre de prothèses de hanche posées par an avoisine 100000 et celui de prothèses de genou est proche de 25000.
L'infection profonde du site opératoire est une complication rare mais sévère de l'arthroplastie qui peut mener à l'enlèvement de la prothèse ou à une perte de fonctionnalité de l'articulation. L'incidence des infections sur prothèses articulaires varie de 0,2 à 15% pour les premières intentions et de 1 à 40% lorsqu'il s'agit de reprises.
Le diagnostic est établi par la culture de prélèvements per-opératoires ou de liquide d'aspiration. Le diagnostic est indispensable à la mise en route d'un traitement chirurgical et médical (antibiothérapie adaptée). Ceci implique un geste chirurgical sous anesthésie générale. De plus, les critères microbiologiques et les méthodes de culture ne sont pas standardisés.
Un problème majeur est que les SCN, qui infectent le plus souvent les dispositifs médicaux implantables, sont des organismes commensaux de la peau. Dans cette situation, il est souvent impossible de décider, sur la simple identité du germe, s'il s'agit d'une infection sur prothèse articulaire ou d'une contamination.
Il est donc extrêmement difficile, par les outils actuels, de poser le diagnostic d'une infection à Staphylococcus epidermidis, alors qu'une telle infection implique un traitement lourd et coûteux. Ce traitement consiste, en effet, en un débridement chirurgical extensif et méticuleux. Le traitement d'une prothèse infectée a un coût estimé à plus de 50000 dollars par événement. La mortalité associée à l'intervention chirurgicale, en cas d'infection de prothèse, est de 0,4 à 1,2% pour les patients de 65 ans et de 2 à 7% pour les patients de 80 ans.
Il existe donc dans ce domaine un très grand besoin en une technique de diagnostic sérologique afin de réaliser des test rapides, peu coûteux et peu invasifs.
Les autolysines de la famille des ATL (par exemple, AtlE de Staphylococcus epidermidis) se comportent comme des adhésines et font donc potentiellement partie des facteurs de pathogénicité des staphylocoques. Elles ont un rôle physiologique essentiel dans la croissance bactérienne et sont produites en grande quantité. Au sein de ces autolysines, les domaines centraux portent la fonction "adhésine" et sont spécifiques de chaque espèce. Aussi, ces domaines possèdent des caractéristiques importantes en vue de leur utilisation dans le diagnostic biologique d'infections bactériennes.
L'invention a donc identifié de nouveaux polynucléotides et de nouveaux polypeptides dans les domaines centraux des autolysine At1E et décrit leurs utilisations.
Définitions Les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans cette description.
On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un 25 ARN modifié ou non.
Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins dans de telles régions peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent les ADN ou ARN avec des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres raisons sont inclus dans le terme polynucléotides. On entend également par polynucléotide, les ADNs et ARNs contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides.
On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée.
Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les 20 chaînes longues, appelées protéines.
Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide: dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou aminoterminales.
Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturel ou synthétique, qui sont bien connus de l'homme du métier.
On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés telles que l'arginylation ou l'ubiquitination. (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48- 62 (1992)).
On entend par "isolé", modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel, c'est-à-dire que le polynucléotide ou le polypeptide présent dans la nature a été modifié ou isolé de son environnement naturel, ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé", mais le même polynucléotide ou polypeptide séparé des matériaux coexistants dans son état naturel est "isolé".
On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, In D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).
Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100.
Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polynucléotide ID SEQ N 1 est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des nucléotides de la séquence ID SEQ N 1 peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou jusqu'à 5% du nombre total de nucléotides de la séquence ID SEQ N 1 peuvent être insérés dans ladite séquence. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements. Par analogie, un polypeptide ayant une identité d'au moins 95% avec le polypeptide ID SEQ N 2 est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dans la séquence ID SEQ N 2 peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou jusqu'à 5% du nombre total d'acides aminés de la séquence ID SEQ N 2 peuvent être insérés dans ladite séquence. Ces altérations de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxy-terminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou plusieurs emplacements.(Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987).
La "similarité" est, quant à elle, calculée de la même façon que l'identité, excepté que les acides aminés non identiques mais présentant des caractéristiques physico-chimiques communes sont considérés comme identiques.
On entend par "cellule hôte", une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène.
On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification.
On entend par "fonction", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide.
La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un antigène de Staphylococcus epidermidis et la 5 fonction d'un polynucléotide conforme à l'invention est celle de coder ce polypeptide.
On entend par "antigène", tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène.
On entend par "analogie structurale" une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe).(BIOCHEMISTRY, 4eme Ed, L. Stryer, New York, 1995).
On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction.
Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique.
Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s), délétion(s), fusion(s) ou troncation(s) ou plusieurs de ces modifications, prises en combinaison. Un variant nonnaturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.
On définit comme "séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique", un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes.
On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%.
Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.
On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines.
Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide.
Le terme "immunospécifique" appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur.
Comme indiqué plus haut, l'invention a pour objet de nouveaux polynucléotides, polypeptides, vecteurs d'expression comprenant lesdits polynucléotides et cellules hôtes comprenant lesdits vecteurs d'expression, leur production, et leur utilisation dans la production d'anticorps, le domaine du diagnostic in vitro et/ou la production de vaccins contre Staphylococcus epidermidis.
Les polynucléotides La présente invention a notamment pour objet un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 (appelée E4 et extraite à partir du génome de Staphylococcus epidermidis).
L'invention vise également un polynucléotide isolé comprenant: a) une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou avec la partie de séquence telle que définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou à la partie de séquence définie sous a) ou à la séquence définie sous b).
Un polynucléotide conforme à l'invention est, par exemple, la séquence polynucléotidique ID SEQ N 3 comprenant les nucléotides 1 à 552 de la séquence ID SEQ N 1 et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1.
Un autre polynucléotide conforme à l'invention est, par exemple, la séquence polynucléotidique ID SEQ N 5 (appelée F2 et extraite à partir du génome de Staphylococcus aureus), variant de la séquence ID SEQ N 1.
D'autres variants sont, par exemple, des séquences polynucléotidiques codant pour des protéines de la famille des autolysines (par exemple, la séquence, variant de la séquence ID SEQ N 1, codant pour une partie de la protéine At1C présente dans la bactérie Staphylococcus caprae) ou codant pour des protéines d'une autre famille mais comprenant des domaines centraux, variants de la séquence ID SEQ N 3 (par exemple, les séquences décrites dans Marino M, Banerjee M, Jonquieres R, Cossart P et Ghosh P, GW domains of the Listeria monocytogenes invasion protein InlB are SH3- like and mediate binding to host ligands, EMBO J. 2002 Nov 1; 21(21) : 5623-34). Ainsi, des polynucléotides conformes à l'invention peuvent comprendre des variants de l'une des séquences polynucléotidiques ID SEQ N 1 ou ID SEQ N 3.
La présente invention concerne aussi un polynucléotide isolé, comprenant la séquence ID SEQ N 1, codant pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou un polynucléotide isolé, comprenant la séquence ID SEQ N 3, codant pour la séquence d'acides aminés ID SEQ N 4, ou un polynucléotide isolé, comprenant la séquence ID SEQ N 5, codant pour la séquence d'acides aminés ID SEQ N 6.
Les polynucléotides de l'invention peuvent être 15 obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou d'ARN.
Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non-codantes, telles que, par 20 exemple, des séquences transcrites, des séquences non- traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm.
Les vecteurs d'expression et les cellules hôtes La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention.
De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus.
2871159 12 Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier.
Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre.
La présente invention a aussi pour objet une cellule 15 hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention.
L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l' électroporation, la transduction ou l'infection.
Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus, des cellules de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 ou encore des cellules végétales.
Les cellules hôtes peuvent être utilisées, par exemple, pour exprimer un polypeptide selon l'invention ou en tant que produit actif dans des compositions pharmaceutiques.
Les polypeptides La présente invention a aussi pour objet un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (appelée protéine E4), codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1. La présente invention vise également un polypeptide isolé comprenant: a) une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou avec la partie de séquence définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2.
Un polypeptide conforme à l'invention est, par exemple, la séquence d'acides aminés ID SEQ N 4, codée par la séquence ID SEQ N 3, comprenant les acides aminés 1 à 184 de la séquence ID SEQ N 2 et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2.
Un autre polypeptide conforme à l'invention est, par exemple, la séquence ID SEQ N 6 (appelée protéine F2), codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N 5, qui présente 63,1% d'identité et 77,6% de similarité avec la séquence ID SEQ N 2.
D'autres variants des séquences ID SEQ N 2 ou ID SEQ N 4 sont, par exemple, une partie de la protéine AtlC codée par la bactérie Staphylococcus caprae ou une autre famille de protéines codée par des domaines centraux (par exemples ceux décrits dans Marino M, Banerjee M, Jonquieres R, Cossart P et Ghosh P., GW domains of the Listeria monocytogenes invasion protein InlE are SH3-like and mediate binding to host ligands, EMBO J. 2002 Nov 1; 21 (21) : 5623-34).
Ainsi, des polypeptides conformes à l'invention 35 peuvent comprendre des variants de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou de la séquence ID SEQ N 4.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.
Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion.
Les anticorps La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'anticorps immunospécifiques, ainsi que les anticorps immunospécifiques pour les polypeptides conformes à l'invention, tels que définis précédemment.
Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.
Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV.
Sérologie La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'anticorps dirigés contre Staphylococcus epidermidis.
L'invention vise également l'utilisation d'anticorps, selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des 5 échantillons biologiques la présence d'antigènes de Staphylococcus epidermidis et suivre, par ce moyen, l'effet d'un traitement appliqué à un patient.
Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de 10 sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum).
Les vaccins La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'invention ou un polynucléotide ou un vecteur recombinant ou une cellule hôte selon l'invention.
Partie expérimentale A) Protocole d'obtention des antigènes Clonage de la séquence codant les protéines E4 et F2 Les gènes codant pour les séquences des protéines E4 et F2, qui sont des antigènes, sont obtenus par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique des bactéries Staphylococcus epidermidis (souche WHO 12, ATCC 12228) et Staphylococcus aureus (souche MU50, ATCC 700699) en utilisant, respectivement, comme couple d'amorce: É pour l'antigène E4 l'oligonucléotide sens contenant la séquence: 5'-AAAAAGCAGGCTTAGGAACTAATAATAAGTTAACTGTG-3' ; etl'oligonucléotide antisens contenant la séquence: 5'-AGAAAGCTGGGTTATGATTGAGCGTCAGTACTG-3' É pour l'antigène F2 35 l'oligonucléotide sens contenant la séquence: 5'-AAA.AAGCAGGCTCAACTGGTAAATTAACAGTTGC-3' ; et l'oligonucléotide antisens contenant la séquence: 5'-AGAAAGCTGGGTTATTTGGCAGCTGATGTAGTTGG-3' Le fragment ainsi amplifié correspondant est cloné dans un vecteur selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur permet la production des protéines clonées sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl- thiogalactoside (IPTG). Les protéines clonées correspondent aux acides aminés 500 à 995 de la protéine mature AtlE Staphylococcus epidermidis et 409 à 904 de la protéine mature Atl de Staphylococcus aureus.
Expression des protéines Une souche d'Escherichia coli est transformée par les vecteurs d'expression précédemment décrits. Les bactéries sélectionnées sont mises à cultiver une nuit à 30 C sous agitation dans 30 ml de milieu Luria Bertani (LB, J. Miller, "A short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline à une concentration finale de 100 gg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50ème dans un volume final de 1 litre de milieu LB additionné d'ampicilline à une concentration finale de 100 g/ml qui est incubée à 30 C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,1 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (10 minutes à 1400xg et à 4 C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5.
Purification Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HC1 20 mM à pH 8,0 contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées par du lysozyme (0,2 g/1) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) 12,5 mM, de DNase, RNase et PMSF. La suspension est incubée 30 minutes à 4 C puis centrifugée 10 minutes à 4 C à 15500xg. Le culot est congelé à -20 C pendant au moins une nuit.
Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Mes 25 mM à pH 6,0, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4 C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22 m. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SPSépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon Mes 25 mM à pH 6,0 en 20 volumes de colonne Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/1. La solution est laissée au moins une nuit à 4 C puis centrifugée 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume le plus faible possible (en général 300 l de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM pH 8,0 contenant du NaCl 100 mM puis déposé sur une colonne de gel filtration, par exemple SuperdexHR75-10/30, Amersham). Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20 C jusqu'à leur utilisation dans les tests.
Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee L., Grimsley G. Et Gray T. , (1995), Protein Science 4, 2411-2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par élecrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse.
B) Test de diagnostic in vitro Protocole du test 1l a été utilisé des sérums provenant de patients ayant eu une infection ostéoarticulaire documentée (collection du laboratoire) . - à SCN (au moins trois prélèvements per-opératoires positifs) ; - à Staphylococcus aureus (au moins un prélèvement per-opératoire positif) ; - à des bactéries autres que des staphylocoques (au moins trois prélèvements per-opératoires positifs).
Les sérums témoins correspondaient à des sérums de donneurs de sang (collection du laboratoire).
La fixation des anticorps présents dans les sérums a été évaluée par des tests ELISA. Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4 C en présence de 0,5 g d'antigène purifié (protéine recombinante E4) dans du "tampon salin phosphate" (PBS). Après quatre lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure à 37 C par du PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé (250 l par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés, puis 100 pl de chaque sérum positif, à la dilution adéquate (soit 1/3000eme pour E4) dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé, sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite laissée à 25 C pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps simultanément antiimmunoglobulines G ou G, A, M humaines de chèvre marqués à la phosphatase alcaline (par exemple 170-6462, Biorad) sont ajoutés pendant 30 minutes à 25 C après avoir été dilué selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi écrémé. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 l de substrat (phosphate de pnitrophényle), pNPP, par exemple A-3469, Sigma) sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm de chacun des puits est mesurée après une incubation de 30 minutes à 37 C.
Résultats et interprétation Les essais ont été réalisés sur des protéines recombinantes issues de trois purifications indépendantes. Un résultat type obtenu est présenté dans le tableau ci-après, sachant que les sérums dits "positifs" dans ce tableau sont ceux contenant des anticorps contre Staphylococcus epidermidis identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) de l'invention:
Tableau de résultats
Nombre de sérums de malades 29 infectés par Staphylococcus epidermidis, diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Sérums "positifs" parmi les 12, soit 41,4% 29 testés Sérums de donneurs de sang 88 comme témoins Sérums "positifs" parmi les 10, soit 11,4% 88 testés D'après le Tableau, on constate que plus de 40% des infections à Staphylococcus epidermidis ont été identifiées in vitro grâce aux antigènes selon l'invention. Il est donc démontré d'une part, l'existence d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de x2 pour un seuil fixé à la moyenne plus 2 écarts types des sérums des donneurs de sang est inférieure à 0,05) vis-à-vis de la protéine E4 au cours des infections ostéoarticulaires sur matériel étranger à Staphylococcus epidermidis et, d'autre part, que la protéine E4, selon l'invention, est un antigène pertinent pour le diagnostic sérologique de ce type d'infection.
Claims (17)
1. Polynucléotide isolé comprenant: a) la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou b) une partie de la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou d) une séquence polynucléotidique complémentaire à une séquence polynucléotidique telle que définie sous a), b) ou c).
2. Polynucléotide isolé selon le point b) de la revendication 1, comprenant la séquence polynucléotidique ID SEQ N 3.
3. Polynucléotide isolé selon le point c) de la revendication 1, comprenant la séquence polynucléotidique 20 ID SEQ N 5.
4. Polynucléotide isolé selon le point a) de la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.
5. Polynucléotide isolé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 4.
6. Polynucléotide isolé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'il code pour la séquence d'acides 30 aminés ID SEQ N 6.
7. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications précédentes.
8. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 7.
9. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une cellule hôte selon la revendication 8 et à isoler ledit polypeptide du milieu de culture.
10. Polypeptide isolé comprenant: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou c) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.
11. Polypeptide isolé selon le point b) de la revendication 10, comprenant la séquence d'acides aminés 15 ID SEQ N 4.
12. Polypeptide isolé selon le point c) de la revendication 10 comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 6.
13. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide
selon l'une quelconque des revendications 10 à 12.
14. Utilisation des polypeptides selon l'une quelconque des revendications 10 à 12 pour détecter, in vitro, la présence d'anticorps à Staphylococcus epidermidis dans des échantillons biologiques.
15. Utilisation des anticorps selon la revendication 13 pour détecter, in vitro, la présence d'antigènes Staphylococcus epidermidis dans des échantillons biologiques.
16. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.
17. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant au moins un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, ou un vecteur recombinant selon la revendication 7 ou une cellule hôte selon la revendication 8.
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