FR2886312A1 - Nouvelles proteines permettant la mise en evidence in vitro et la prevention des infections a streptococcus pyogenes - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet de nouveaux polynucléotides, comprenant la séquence ID SEQ N°1 ou des parties ou des variants de ladite séquence, de nouveaux polypeptides codés par ces polynucléotides, des vecteurs d'expression comprenant lesdits polynucléotides et des cellules hôtes comprenant lesdits vecteurs d'expression. Ces polynucléotides et ces polypeptides sont utilisables dans le domaine du diagnostic in vitro et/ou la production de vaccins contre Streptococcus pyogenes.

Description

La présente invention concerne l'identification de nouveaux polypeptides

et polynucléotides, des vecteurs d'expression comprenant lesdits polynucléotides, des cellules hôtes comprenant lesdits vecteurs d'expression,

leur production et leur utilisation dans le domaine du diagnostic et/ou la production de vaccins contre Streptococcus pyogenes.

Les streptocoques sont des bactéries à Gram positif, regroupant de nombreuses espèces. On différencie classiquement les espèces sur la base du type d'hémolyse qu'elles produisent. Le groupe a-hémolytique ou non hémolytique comprend les espèces produisant une hémolyse marquée par une zone verdâtre autour des colonies sur un milieu contenant du sang, ou ne produisant aucune hémolyse.

Ce groupe comprend les espèces commensales de la flore buccale (Streptococcus mitis, S. sanguis, S. mutons,...) et une espèce pathogène majeure, S. pneumoniae ou pneumocoque. Le groupe 3-hémolytique comprend les espèces capables de lyser complètement les globules rouges, ce qui forme une zone transparente autour des colonies sur un milieu contenant du sang. La distinction des espèces dans ce groupe peut se faire selon la classification de Lancefield, basée sur des différences antigéniques au niveau des polysaccharides de la paroi (15 groupes de A à 0). Les principales espèces pathogènes sont S. pyogenes (groupe A) et S. agalactiae (groupe B).

S. pyogenes est un pathogène très fréquent chez l'homme. La bactérie est à l'origine de la plupart des pharyngites bactériennes (40% des cas chez l'enfant, 25% chez l'adulte) et des infections cutanées. Elle est responsable de la scarlatine, de l'impétigo, et elle peut engendrer des infections sévères et des chocs toxiques. Les infections à S. pyogenes peuvent donner lieu à de graves complications post-streptococciques qui surviennent à distance de l'infection aiguë. Les symptômes de pharyngites dues à S. pyogenes peuvent être facilement confondus avec ceux de pharyngites virales. Or, l'angine à S. pyogenes nécessite impérativement un traitement antibiotique en raison de la gravité des complications postinfectieuses potentielles. Le diagnostic de la bactérie, pourtant très peu effectué en routine, est essentiel pour éviter le risque de complications post-infectieuses ainsi que la prescription non fondée d'antibiotiques en cas d'étiologie virale.

S. pyogenes, dont le réservoir est strictement humain, colonise le pharynx et la peau. La bactérie se propage par voie aérienne ou par contact direct avec des personnes atteintes de pharyngite ou de lésions cutanées. On distingue les infections streptococciques suppurées, qui peuvent être non invasives ou invasives, et les complications post- streptococciques, survenant à distance de l'infection, qui ne sont pas directement liées à la dissémination de la bactérie.

Les infections non invasives, représentant plus de 80% des maladies dues à S. pyogenes, sont essentiellement cutanées ou muqueuses. Les pharyngites ou angines sont les manifestations les plus fréquentes des infections streptococciques aiguës. S. pyogenes est la principale bactérie responsable des angines érythémateuses ou érythémato--pultacées qui touchent surtout les enfants à partir de 4 ans et les jeunes adultes. La scarlatine est une angine streptococcique accompagnée d'une atteinte muqueuse (énanthème) et cutanée (exanthème) due à la toxine érythrogène sécrétée par certaines souches de S. pyogenes. Parmi les infections cutanées, l'impétigo, très contagieux chez l'enfant, peut être provoqué soit par S. pyogenes, soit par Staphylococcus aureus, les deux espèces pouvant aussi être associées. Les autres infections des voies aériennes supérieures liées à S. pyogenes sont les sinusites, les mastoïdites et les otites moyennes aiguës.

Une infection à S. pyogenes est jugée invasive lorsque le microorganisme a été isolé à partir d'un site normalement stérile (sang, liquide céphalorachidien) en présence ou en l'absence d'une manifestation clinique sévère, cu à partir d'un site non stérile (gorge, expectoration, vagin, lésions cutanées superficielles) en présence de manifestations cliniques sévères. Les infections invasives sont souvent d'origines cutanées comme l'érysipèle (inflammation aiguë des téguments), la cellulite (inflammation aiguë de la peau et des tissus sous-cutanés), la fasciite nécrosante (infection des muscles et des aponévroses appelée aussi " maladie mangeuse de chair 1'). Les septicémies proviennent souvent d'une infection de plaies, mais peuvent avoir un point de départ pulmonaire ou génital.

Les complications aseptiques post-streptococciques sont caractérisées par un syndrome inflammatoire survenant jusqu'à six semaines après le début d'une infection symptomatique ou non. La glomérulo-néphrite aiguë (GNA), survenant 10 à 21 jours après une infection à S. pyogenes, est particulièrement fréquente chez l'enfant et se caractérise cliniquement par un syndrome néphritique aigu. Le rhumatisme articulaire aigu (RAA) est une complication grave quoique rare, qui survient chez le sujet jeune, 1 à 5 semaines après un épisode infectieux aigu à S.pyogenes, exclusivement localisé aux muqueuses et non à la peau. Le RAA est caractérisé par une arthrite des grosses articulations et tire toute sa gravité lors d'une atteinte spécifique des valves cardiaques qui laisse des séquelles irréversibles. Le RAA est de nature dysimmunitaire, en rapport avec la parenté antigénique entre certains tissus et certains éléments de la paroi streptococcique ("mimétisme moléculaire"). A l'origine le syndrome du choc toxique est principalement associé aux infections cutanées les plus graves et surtout à la fasciite nécrosante. Il se manifeste au départ par de la fièvre, des myalgies et une douleur au niveau de la lésion et évolue rapidement (dans les 48 heures) vers l'apparition de dyspnée, de confusion et d'hypotension. La mortalité est importante: 30 à 50 %. Le mécanisme est lié à une réaction immunitaire anormale suite à la libération de toxines à activité superantigénique, incluant la toxine érythrogène. Le choc toxique streptococcique est proche du choc toxique observé avec Staphylococcus aureus (Cunningham MW., Pathogenesis of group A streptococcal infections, Clin. Microbiol. Rev. 2000) . Les facteurs de virulence de S. pyogenes sont multiples. Ils comprennent des facteurs d'adhésion et des structures antiphagocytaires, ainsi qu'un grand nombre de toxines et d'enzymes. Les protéines de surface sont nombreuses et interviennent dans la fixation des bactéries sur les muqueuses pharyngées ou sur la peau. La protéine M a un rôle dans l'adhérence des bactéries et joue aussi un rôle majeur dans l'inhibition de la phagocytose. L'extrémité de la protéine M comprend un site antigénique utilisé pour la sérotypie. Il existe environ 100 types différents de protéine M. L'immunisation contre un streptocoque, par exemple à l'occasion d'une angine due à une souche de streptocoque de type M1, ne protège pas contre la réinfection par une souche de streptocoque d'un autre sérotype (M2, M3, ou M4). Les souches de type Ml sont les plus fréquentes et le plus souvent isolées de syndrome de choc toxique (Bisno Al., Brito M.O., Collins C.M., Molecular basis of group A streptococcal virulence, Lancet Infect. Dis. 2003). Des vaccins contenant la protéine M font l'objet de recherches intensives. Cependant, des épitopes de la protéine pourraient engendrer des anticorps dirigés contre des tissus du coeur ou du rein et générer des maladies auto-immunes (Kraus W., Seyer J.M., Beachey E.H., Vimentin-cross-reactive epitope of type 12 streptococcal M protein. Myosin recognize the sequence GLN-LYSSER-LYS-GLN in M protein, Infect Immun. 1989; Kraus W., Dale J.B., Beachey E.H., Identification of an epitope of type 1 streptococcal M protein that is shared with a 43-kDa protein of human myocardium and renal glomeruli, J. Immunol. 1990). D'autres vaccins à partir d'antigènes, tels que la C5a peptidase, sont aussi à l'étude.

L'épidémiologie des streptocoques de groupe A (SGA) peut être réalisée selon deux modes: la sérotypie de la protéine M comme décrite précédemment et une classification basée sur les différences de séquence de la région variable du gène emm (Cunningham M.W., Pathogenesis of group A streptococcal infections, Clin. Microbiol. Rev. 2000; Schlegel L., Bouvet A. dans Freney J., Renaud F., Hansen W., Bollet C., Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000) . S. pyogenes reste jusqu'à présent toujours sensible à la pénicilline qui constitue le premier choix thérapeutique. Les macrolides sont choisis en cas d'allergie aux pénicillines, mais il y a actuellement 3 à 20% de souches résistantes et ce taux augmente régulièrement. Parmi les différents types d'angines, seule l'angine à S. pyogenes nécessite un traitement antibiotique en raison de la gravité des complications post-infectieuses potentielles. Ce risque conduit, en pratique courante, à traiter toutes les angines par antibiotiques car, jusqu'à présent, le diagnostic simple et rapide de ce type d'angines n'est pas réalisé avant prescription. Ceci a pour conséquence de participer au développement de résistances aux antibiotiques et d'entraîner des dépenses de santé inutiles. Le diagnostic rétrospectif des infections à S. pyogenes a aussi un rôle important dans la détection des complications post-streptococciques.

Les méthodes utilisées actuellement pour le diagnostic d'infections à S. pyogenes sont: la culture, la recherche d'antigènes ou d'acides nucléiques spécifiques pour le diagnostic direct et la recherche d'anticorps spécifiques pour le diagnostic indirect.

La culture est la technique de référence pour le diagnostic d'infection à S. pyogenes. La culture d'un frottis de gorge permet le diagnostic d'une infection avec une sensibilité (proportion de malades infectés et diagnostiqués) de 95% pour une spécificité (proportion de témoins donnés négatifs par le diagnostic) de 99%. (Kellogg J.A., Suitability of throat culture procedures for detection of group A streptococci and as reference standards for evaluation of streptococcal antigen detection kits, J. Clin. Microbiol., 1990). Le frottis peut aussi être réalisé à partir d'une plaie. Des colonies de S. pyogenes apparaissent après 18 h d'incubation en atmosphère aérobie, anaérobie, ou enrichie en CO2, sur un milieu contenant du sang (Schlegel L., Bouvet A. dans Freney J., Renaud F., Hansen W., Ballet C., Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000). La sensibilité de la technique peut varier en fonction de l'endroit du prélèvement et des conditions d'incubation (Bisno Al., Gerber M.A., Gwaltney J.M. Jr, Kaplan E.L., Schwartz R.H., Diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis: a practice guideline, Clin. Infect. Dis. 1997). L'inconvénient majeur de la technique est le délai d'obtention des résultats.

Dans les années 1980, des tests permettant la détection rapide d'antigènes à partir de prélèvements de gorge ont été développés. Ces tests reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement des polysaccharides de la paroi bactérienne. Les premiers tests utilisaient une technique d'agglutination sur latex longue et peu sensible. Depuis, de nouveaux tests plus performants utilisant des techniques de co-agglutination, d'immunotest enzymatique ou encore d'immunotest par détection optique ont été mis sur le marché. La plupart de ces tests ont une bonne spécificité (= 95%) mais une sensibilité variable allant de 62 à 96% comparées à la culture, avec une interprétation des résultats qui n'est pas toujours évidente. C'est pourquoi il est recommandé de contrôler par la culture (Chapin K.C., Blake P., Wilson C.D., Performance characteristics and utilization of rapid antigen test, DNA probe, and culture for detection of group a streptococci in an acute care clinic, J. Clin. Microbiol. 2002; Bisno Al., Gerber M.A., Gwaltney J.M. Jr, Kaplan E.L., Schwartz R.H., Diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis: a practice guideline, Clin. Infect. Dis. 1997; Bourbeau P.P., Role of the microbiology laboratory in diagnosis and management of pharyngitis, J. Clin. Microbiol. 2003; Gerber M.A., Shulman S.T. Rapid diagnosis of pharyngitis caused by group A streptococci, Clin. Microbiol. Rev. 2004) . Les tests de détection rapide les plus récents pour le diagnostic d'infections à S. pyogenes emploient deux méthodes de biologie moléculaire différentes. La première est basée sur l'hybridation d'une sonde simple brin d'ADN marquée (traceur chimioluminescent) spécifique d'une séquence d'ARN ribosomale unique chez S. pyogenes. Ce test a une sensibilité comprise entre 86% et 94,8% avec une spécificité supérieure à 95%, comparées à celles de la culture. Le second test utilise la PCR en temps réel pour amplifier une séquence d'ADN spécifique de S. pyogenes. Ce test a une sensibilité de 93% avec une spécificité de 98%, comparées à celles de la culture. Ces tests se font, respectivement, en 2 heures et 1,5 heure. Ils nécessitent un équipement lourd et restent destinés à des laboratoires spécialisés (Bourbeau P.P., Role of the microbiology laboratory in diagnosis and management of pharyngitis, J Clin Microbiol. 2003; Chapin K. C., Blake P., Wilson C.D., Performance characteristics and utilization of rapid antigen test, DNA probe, and culture for detection of group a streptococci in an acute care clinic, J. Clin. Microbiol. 2002; Gerber M. A., Shulman S.T. Rapid diagnosis of pharyngitis caused by group A streptococci, Clin. Microbiol. Rev. 2004) . Le sérodiagnostic des infections à S. pyogenes est basé sur la réponse humorale contre des produits extracellulaires de la bactérie: streptolysine 0, DNase B, hyaluronidase, NADase et streptokinase. Elle est utilisée pour confirmer l'étiologie streptococcique de manifestations cliniques évoquant un syndrome post- streptococcique. La réponse classiquement examinée est celle dirigée contre la streptolysine 0 et, un peu moins fréquemment, celle contre l'antidésoxyribonucléase B. Les kits commercialisés testent la capacité d'un sérum à inhiber l'action hémolytique de la streptolysine 0, c'est- à-dire la présence d'anticorps spécifiques antistreptolysine O (ASLO). Les ASLO apparaissent environ 10 jours après une infection aiguë, atteignent un pic vers le 30ème jour et se stabilisent à un taux résiduel après 6 mois. Un deuxième dosage après traitement antibiotique peut permettre d'apprécier l'efficacité du traitement (diminution des taux). Une grande partie de la population possédant des ASLO à des titres faibles, on ne considère comme significatifs que les titres supérieurs à 200 unités. Le taux des ASLO peut rester normal dans 20 à 30% des infections à S. pyogenes et n'est guère modifié au cours des attein-:es cutanées. Le titrage des ASLO n'est donc ni sensible ni spécifique et seule la constatation de titres élevés ou d'une ascension des taux en quelques jours a une signification clinique. Il est donc conseillé de tester en parallèle la présence d'anticorps dirigés contre d'autres enzymes. Le titre des anticorps anti-NADase, atteignant un pic 6 à 8 semaines après le début de l'infection, est souvent plus élevé après une pharyngite qu'après une infection cutanée. En revanche les anticorps antihyaluronidase sont élevés après une infection cutanée, alors que les anti-DNase B augmentent après les deux types d'infections. Les anticorps observés pendant des complications post-streptococciques peuvent refléter le site primaire de l'infection. Les réponses dirigées contre d'autres antigènes protéiques (protéines R et T) ou non protéiques (composants du peptidoglycane, polysaccharides) ont été observées mais ne sont pas utilisées dans le diagnostic d'infection. La recherche d'anticorps IgM ou IgA spécifiques de la bactérie n'est pas non plus utilisée dans le sérodiagnostic. Pourtant leur présence peut être révélatrice d'une infection active ou récente puisque les IgM sont les premiers anticorps synthétisés au début de la réponse immunitaire et les IgA, retrouvés dans les sécrétions, ont une durée de vie très courte (en général moins de 7 jours) (Cunningham M.W., Pathogenesis of group A streptococcal infections, Clin. Microbiol. Rev. 2000) . Entre un quart et un tiers seulement de l'ensemble des enfants se plaignant d'un mal de gorge ont effectivement un prélèvement de gorge positif par culture à un streptocoque de groupe A (SGA) (Bisno AL, Stevens DL. Streptococcus pyogenes (2000) In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (Hrsg) Mandell, Douglas, and Bennett's principles and practice of infectious diseases, 5th Edition, Philadelphia: Churchill Livingstone, Chapter 186, S 2101-2117). Sur cet ensemble, seulement environ la moitié des patients possède une infection effectivement significative d'un point de vue immunologique (c'est-à-dire donnant lieu à une augmentation significative du titre d'anticorps spécifique des streptocoques), le reste des patients étant probablement des porteurs asymptomatiques, n'ayant donc pas de risque de complications et ne nécessitant pas de traitement particulier et notamment antibiotique. De plus, même si une culture négative supprime la nécessité d'un traitement, elle ne permet pas de différencier une phase aiguë d'un portage asymptomatique (Bisno AL, Stevens DL. Streptococcus pyogenes (2000) In: Mandell GL, Bennett JE, Dolin R (Hrsg) Mandell, Douglas, and Bennett's principles and practice of infectious diseases, 5th Edition, Philadelphia: Churchill Livingstone, Chapter 186, S 2101-2117). La sensibilité des tests sérologiques actuels est inférieure à celle de la culture et il est recommandé, en cas de sérologie négative chez l'enfant, de confirmer le diagnostic par une culture. Il résulte donc de l'absence de tests sérologiques efficaces, une préconisation excessive d'antibiotiques.

En définitive, les pratiques courantes ne répondent toujours pas aux attentes médicales pour établir simplement et rapidement le diagnostic d'infections à S. pyogenes. Les tests de détection rapide d'antigènes manquent de sensibilité et doivent être suivis d'une culture dans de nombreux cas. Les tests utilisant la biologie moléculaire nécessitent un équipement important et sont réservés aux laboratoires spécialisés. Le sérodiagnostic manque de sensibilité. De plus, aucune technique de sérodiagnostic n'utilise actuellement d'antigènes purifiés spécifiques de S. pyogenes et aucune ne permet un diagnostic précoce de l'infection.

Les inventeurs de la présente invention ont identifié, à partir du génome de S. pyogenes souche MGAS 8332, un antigène constitué par une protéine qu'ils ont appelée H11, de séquence polypeptidique ID SEQ N 2. La protéine appelée H11 est une protéine qui partage 60% d'identité avec une amidase (hydrolase de la paroi cellulaire) du bactériophage Dp-1. Les inventeurs de la présente invention ont ainsi identifié de nouveaux polynucléotides et de nouveaux polypeptides dont les utilisations possibles sont décrites ci-après.

Définitions Les définitions suivantes sont données afin de faciliter a compréhension de certains termes utilisés dans cette description.

On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non.

Le tjerme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins dans de telles régions peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent, les ADN ou ARN, ayant des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres raisons, sont inclus dans le terme polynucléotides. On entend également par polynucléotide, les ADN et ARN contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par base modifiée, par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides.

On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée.

Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les chaînes longues, appelées protéines.

Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide: dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou amino-terminales.

Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier.

On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou 1'ubiquitination. (PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626- 646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48-62 (1992)) . On entend par "isolé", modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel, c'est-à-dire que le polynucléotide ou le polypeptide présent dans la nature a été modifié ou isolé de son environnement naturel, ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé", mais le même polynucléotide ou polypeptide séparé des matériaux coexistants dans son état naturel est "isolé".

On entend par "pourcentage d'identité" entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques le pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, ln D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules: the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley).

Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100.

Un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polypeptide ID SEQ N 2 est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dans la séquence ID SEQ N 2 peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou la séquence peut comporter jusqu'à 5% d'acides aminés en plus, par rapport au nombre total d'acides aminés de la séquence ID SEQ N 2. Ces altérations de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxy-terminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou plusieurs emplacements. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987) . Par analogie, un premier polynucléotide ayant une identité d'au moins 95% avec un second polynucléotide est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à la séquence dudit second polynucléotide. En d'autres termes jusqu'à 5% des nucléotides dudit second polynucléotide peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou ledit premier polynucléotide peut comporter jusqu'à 5% de nucléotides en plus, par rapport au nombre total de nucléotides du second polynucléotide. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements.

On entend par "cellule hôte", une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène.

On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification.

On entend par "fonction", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un

antigène de S. pyogenes et celle du polynucléotide conforme à l'invention est de coder ce polypeptide.

On entend par "antigène", tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène.

On entend par "analogie structurale" une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe) (BIOCHEMISTRY, 4ème Ed, L. Stryer, New York, 1995).

On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction.

Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique.

Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une (ou plusieurs) substitution(s), addition(s), délétion(s), fusion(s) ou troncation(s) ou plusieurs de ces modifications, prises en combinaison. Un variant nonnaturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.

On définit comme "séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique", un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes.

On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes" les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%.

Ces conditions peuvent être obtenues selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.

On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés, ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines. Il est aussi possible d'utiliser à la place des anticorps d'autres molécules immunospécifiques, par exemple des récepteurs de cellule T (TCR) comme récemment décrit (Li et al. 2005. Directed evolution of human T-cell receptors with picomolar affinities by phage display. Nat Biotechnol. 23:349-54) ou des molécules sélectionnées pour leur fixation spécifique, par exemple par évolution dirigée (voir par exemple Conrad et Scheller. 2005. Considerations on antibody-phage display methodology. Comb Chem High Throughput Screen. 8:117-26).

Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné, suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide.

Le terme "immunospécifique" appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur.

Par sérum "positif", on entend un sérum contenant des anticorps produits à la suite d'une infection à Streptococcus pyogenes, identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) de l'invention.Comme indiqué plus haut, l'invention a pour objet de nouveaux polynucléotides, polypeptides, vecteurs d'expression comprenant ledit polynucléotide et cellules hôtes comprenant ledit vecteur d'expression, leur production, et leur utilisation dans la production d'anticorps, le domaine du diagnostic in vitro et/ou la production de vaccins contre S. pyogenes.

Les polynucléotides La présente invention a notamment pour objet un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 (appelée H11 et extraite à partir du génome de S. pyogenes). L'invention vise également un polynucléotide isolé comprenant: a) une partie de la séquence ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou avec la partie de séquence telle que définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou à la partie de séquence définie sous a) ou à la séquence définie sous b).

La présente invention concerne aussi un polynucléotide isolé, comprenant la séquence ID SEQ N 1, codant pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

Les polynucléotides de l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou 10 d'ARN.

Les polynucléotides conformes à l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' noncodantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non- traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm.

Les vecteurs d'expression et les cellules hôtes La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention.

De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus.

Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier.

Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre.

La présente invention a aussi pour objet une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant conforme à l'invention.

L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection.

Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus, des cellules de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales, telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127,. BHK, HEK 293 ou encore des cellules végétales.

Les polypeptides La présente invention a aussi pour objet un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 (appelée protéine H11), codée par la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1. La présente invention vise également un polypeptide isolé comprenant: a) une partie de la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% 35 d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou avec la partie de séquence définie sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2.

La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci- dessus, dans lequel une cellule hôte définie précédemment est cultivée et ledit polypeptide est isolé du milieu de culture.

Le polypeptide peut être purifié à partir des cellules hôtes, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion.

Les anticorps La présente invention a aussi pour objet un procédé d'obtention d'anticorps immunospécifiques, ainsi que les anticorps immunospécifiques pour les polypeptides conformes à l'invention, tels que définis précédemment.

Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon les méthodes bien connues de l'homme du métier.

Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV.

Sérologie La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'anticorps dirigés contre S. pyogenes.

L'invention vise également l'utilisation d'anticorps, selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques la présence d'antigènes de S.pyogenes.

L'invention vise, en outre, l'utilisation de polypeptides et d'anticorps selon l'invention, pour détecter, périodiquement, in vitro, respectivement, les anticorps dirigés contre S. pyogenes et les antigènes de S. pyogenes et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et de l'effet d'un traitement appliqué à un patient.

Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum).

Le diagnostic in vitro d'une infection à S. pyogenes est effectué, par exemple, par des tests classiques de réactions immunologiques, tels que ELISA ou Western Blot. Ces tests utilisent l'un des polypeptides selon l'invention qui vient se fixer, de manière spécifique, aux anticorps sériques contre S. pyogenes présents dans les échantillons biologiques.

Isotypes d'anticorps et affinité Les immunoglobulines (ou anticorps) sont constituées de deux chaînes polypeptidiques différentes: deux chaînes légères (L) d'isotypes [kappa] ou [lambda], et deux chaînes lourdes (H) d'isotypes [gamma], [alpha], [mu], [delta] ou [epsilon]. Ces quatre chaînes sont liées covalemment par des ponts disulfures. Les deux types de chaînes H ou L possèdent des régions qui contribuent à la fixation des antigènes et sont très variables d'une immunoglobuline à une autre. Ces régions déterminent l'affinité des anticorps pour leur Ligand.

Les isotypes des chaînes lourdes permettent de définir la classe de l'immunoglobuline; il existe donc 5 isotypes d'anticorps (IgA, IgM, IgD, IgE et IgG). Des sous-classes, par exemple IgGl, IgG2, IgG3 et IgG4 sont définies par des différences de séquence de la chaîne lourde. Les différentes classes d'immunoglobulines ont des propriétés physicochimiques propres et leur synthèse dépend directement des phases et des niveaux d'activation de la réponse immunitaire.

Chez l'homme, les IgG représentent la principale classe d'immunoglobulines: leur concentration sérique chez l'adulte varie de 8 à 16 g/l. Leur demi-vie plasmatique est d'environ 3 semaines.

Les IgA constituent la deuxième classe d'immunoglobulines sériques, après les IgG, en terme de concentration (2 à 4 g/l). En revanche, elles représentent la classe prépondérante des immunoglobulines dans les sécrétions (sécrétions respiratoires, salivaires, digestives..., lait colostrum, larmes). Sur le plan structural, les IgA ont la particularité de se présenter sous plusieurs formes moléculaires: - dans le sérum, les IgA peuvent se présenter sous forme de monomères (forme prépondérante) ou sous forme de dimères associés à une chaîne J (chaîne de jonction). La chaîne J est un peptide riche en cystéine de 137 acides aminés (poids moléculaire: 15000 Da), d'origine plasmocytaire; la sous-classe IgAl est prépondérante dans le sérum; - dans les sécrétions, les IgA, appelées IgA sécrétoires, sont sous forme de dimères; elles sont donc associées à une chaîne J, mais elles comportent également un composant sécrétoire. Les IgA produites par les lymphocytes B sont captées par les cellules épithéliales, par un récepteur (polyIgR) situé au pôle basal de la cellule. C'est pendant le transfert de l'IgA à travers la cellule épithéliale, vers le pôle apical de la cellule, que le composant sécrétoire (poids moléculaire: 70000 Da), ou pièce sécrétoire, est ajouté. Le rôle de la pièce sécrétoire est de protéger les IgA sécrétoires vis-àvis des enzymes protéolytiques présents dans les sécrétions.

Comme les IgA, les IgM peuvent se présenter sous 2 formes moléculaires distinctes: - une forme monomérique: c'est la forme sous laquelle les IgM sont synthétisées et insérées dans la 10 membrane des lymphocytes B; - une forme pentamérique: c'est la forme sous laquelle les IgM sont sécrétées. Les 5 monomères de base sont reliés par des ponts disulfures. De plus, une chaîne J relie l'extrémité de 2 monomères.

Les IgD représentent moins de 1% des immunoglobulines sériques. Elles sont habituellement coexprimées avec les IgM à la surface des lymphocytes B où elles semblent jouer un rôle de récepteur pour les antigènes.

Les IgE ne sont présentes, chez un sujet normal, qu'à 20 l'état de traces.

Cinétique d'apparition des anticorps et affinité La cinétique d'apparition d'anticorps spécifiques et d'un isotype donné est aujourd'hui encore mal comprise. D'une façon générale, les cellules B dites naïves synthétisent différents IgM qui constituent un large répertoire de molécules capables de fixer des antigènes (Steven A. Frank., Immunology and Evolution of Infectious Disease. (2002). Princeton University Press, Princeton, USA) . Ainsi, lors de la première exposition à un antigène, celui-ci va se fixer avec une faible affinité à différents IgM du système immunitaire. Cette intéraction va néanmoins stimuler la division de la cellule B naïve correspondante. La division est d'autant plus rapide que l'affinité de l'IgM est forte ce qui permet une sélection initiale des meilleurs clones. De plus, lors de la division les réarrangements génétiques permettent l'augmentation de l'affinité des anticorps. La région constante des immunoglobulines change également afin de produire des IgG dans le système circulatoire et des IgA à la surface des muqueuses (Steven et Frank 2002. Immunology and Evolution of Infectious Disease. Princeton University Press, Princeton, USA) . Il peut donc être déduit par l'homme de l'art que la présence d'une ou plusieurs classes d'anticorps et l'affinité particulière des anticorps ont différentes implications d'un point de vue du diagnostic médical dans la différentiation des infections récurrentes ou non, d'une infection active, aiguë, chronique, latente et récente.

Les kits L'invention a également pour objet des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins l'un des polypeptides conformes à l'invention ainsi que des kits de diagnostic in vitro comprenant au moins l'un des anticorps conformes à l'invention.

Les vaccins La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon l'invention ou un polynucléotide ou un vecteur recombinant ou une cellule hôte selon l'invention.

Partie expérimentale A) Protocole d'obtention des antigènes Clonage de la séquence codant pour la protéine H11 Le gène codant pour les séquences de la protéine H11, qui est un antigène, est obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie S. pyogenes (souche MGAS 8332, ATCC BAA-572) en utilisant comme couple d'amorces.

l'oli.gonucléotide sens contenant la séquence: 5'-GTAGTAGATACCGAAAAAGC 3' ; et l'oli.gonucléotide antisens contenant la séquence: 5'AATTGGTTTTTTAGTTGCGG -3' Le fragment ainsi amplifié correspondant est cloné dans un vecteur selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ce vecteur permet la production de la protéine clonée sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside (en abrégé IPTG). La protéine clonée correspond à la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

Expression de la protéine H11 Une souche d'Escherichia coli est transformée par le vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises à cultiver une nuit à 30 C, sous agitation, dans 30 ml de milieu Luria Bertani (LB, J. Miller, "A short Course In Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline à une concentration finale de 100 pg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/506me dans un volume final de 1 litre de milieu LB additionné d'ampicilline à une concentration finale de 100 pg/ml et incubée à 30 C, sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,1 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (10 minutes à 1400xg et à 4 C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5.

Purification Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (en abrégé Tris) -HC1 20 mM, à pH 8,0, contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées par du lysozyme (0,2 g/1) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) 12,5 mM, de DNase, RNase et PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). La suspension est incubée minutes à 4 C puis centrifugée 10 minutes à 4 C à 15500xg. Le culot est congelé à - 20 C pendant au moins une nuit.

Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Mes 25 mM à pH 6,0, puis soniquées 4 fois secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4 C pendant 30 minutes, le surnageant est filtré sur membrane de porosité 0,22 pm. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SP- Sépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon Tris HC1 20 mM, à pH 8,0, en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/1. La solution est laissée au moins une nuit à 4 C, puis centrifugée 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume le plus faible possible (en général 300 pl de tampon Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM, pH 8, 0, contenant du NaCl 100 mM puis déposé sur une colonne de gel filtration, par exemple SuperdexHR75- 10/30, Amersham). Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20 C jusqu'à leur utilisation dans les tests.

Les concentrations des protéines sont déterminées spectrophotométriquement à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee L., Grimsley G. Et Gray T. , (1995), Protein Science 4, 2411-2423). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par électrophorèse SDS-PAGE et par spectrométrie de masse.

B) Test de diagnostic in vitro Il a été utilisé des sérums ayant un titre ASLO 25 positif (collection du laboratoire).

Les sérums témoins correspondaient à des sérums de donneurs de sang (collection du laboratoire).

La fixation, sur la protéine H1l recombinante purifiée (obtenue comme décrit précédemment), des anticorps présents dans les sérums a été évaluée soit par des tests en Western Blot soit par la technique ELISA.

Protocole du test en Western blot Après transfert, sur une membrane de nitrocellulose, de la protéine purifiée H11, la membrane est saturée 30 minutes à l'aide d'une solution de "tampon salin phosphate" (PBS) contenant 3% de lait demi-écrémé. Après trois lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (soit 1/300ème) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps anti-immunoglobulines G et/ou A et/ou M humaines de chèvre (par exemple 170-6462, Biorad), marqués à la phosphatase alcaline, sont ajoutés simultanément ou indépendamment, pendant une période de 30 minutes après avoir été dilués selon le protocole du fournisseur dans du tampon PBS contenant 3% de lait demiécrémé. Trois nouveaux lavages sont réalisés, puis du phosphate de 5bromo-4-chloro-3-indolyle et du nitroblue tetrazolium sont ajoutés selon les indications du fournisseur jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat "positif" correspond à une précipitation du substrat sur la membrane à la position de H11.

Protocole du test en ELISA Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4 C en présence de 0,5 pg d'antigène purifié (protéine recombinante H11) dans du "tampon salin phosphate" (PBS).

Après quatre lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure à 37 C par du PBSTween contenant 5% de lait demi-écrémé (250 pl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés, puis 100 pl de chaque sérum positif, à la dilution 1/200ème (anti-IgA), 1/300ème (anti-IgM) et 1/40000ème pour (anti-IgGAM) dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé, sont ajoutés dans chaque puits. La plaque est ensuite laissée à 25 C pendant 30 minutes,. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps antiimmunoglobulines G et/ou A et/ou M humaines de chèvre marqués à la phosphatase alcaline sont ajoutés (simultanément ou indépendamment) pendant 30 minutes à 25 C après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS-Tween contenant 5% de lait demi-écrémé.

Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de substrat [phosphate de p-nitrophényle (en abrégé, pNPP) par exemple A-3469, Sigma] sont ajoutés. L'absorbance à 405 nm de chacun des puits est mesurée après une incubation de 30 minutes à 37 C.

Résultats et interprétation Un résultat type obtenu est présenté dans le tableau ci-après, sachant que les sérums dits "positifs" dans ce tableau sont ceux contenant des anticorps contre S. pyogenes identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) de l'invention, par ELISA.

Tableau de résultats du test en ELISA Nombre de sérums de malades 30 infectés par S. pyogenes, diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums de donneurs 36 de sang utilisés comme témoins Types d'anticorps Sérums de malades Sérums de secondaires utilisés donneurs de sang "positifs" infectés par S. pyogenes "positifs" anticorps secondaires 17/30 soit 57% 0/36 soit 0% anti-IgAGM anticorps secondaires 10/30 soit 33% 0/36 soit 0% anti-IgM anticorps secondaires 11/30 soit 36% 0/36 soit 0% anti-IgA Somme de tous les sérums 26/30 soit 86% 0/36 soit 0% "positifs" identifiés par les différents isotypes d'anticorps secondaires Des résultats similaires peuvent être obtenus par Western Blot.

D'après le tableau, on constate que, par le test ELISA ou par le test Western blot avec l'antigène H11 selon l'invention, on identifie 57% des infections à S. pyogenes en utilisant des anticorps secondaires antiIgAGM et, respectivement, 33% et 36% des infections en utilisant des anticorps secondaires anti-IgM et anti-IgA. La présence d'IgM et d'IgA pourrait être la preuve d'une infection active. L'antigène H11 pourrait donc être un marqueur d'infection permettant un diagnostic plus précoce que celui donné par les tests classiques de recherche d'anticorps ASLO. L'analyse des sérums de malades infectés par S. pyogenes soumis au diagnostic selon l'invention montre que les sérums "positifs" sont différents selon les anticorps secondaires utilisés. L'addition de tous les sérums "positifs" identifiés par les différents isotypes d'anticorps secondaires permet de diagnostiquer in vitro au total au moins 86% des infections à S. pyogenes, grâce à l'antigène selon l'invention. Il est donc démontré, d'une part, l'existence chez l'homme d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de x2 est inférieure à 0,05) vis-à-vis de la protéine H11 au cours des infections à S. pyogenes et, d'autre part, que la protéine H11 est pertinente pour le diagnostic sérologique et le suivi de ce type d'infections, la vaccination de patients contre S. pyogenes.

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Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Polynucléotide isolé comprenant: a) la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1, ou b) une partie de la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou c) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N 1 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 1, ou d) une séquence polynucléotidique complémentaire à une séquence polynucléotidique telle que définie sous a), b) ou c).

2. Polynucléotide isolé selon le point a) de la revendication 1, caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

3. Vecteur recombinant comprenant un polynucléotide 20 selon la revendication 1 ou 2.

4. Cellule hôte comprenant un vecteur recombinant selon la revendication 3.

5. Procédé de préparation d'un polypeptide, caractérisé en ce qu'il consiste à cultiver une cellule hôte selon la revendication 4 et à isoler ledit polypeptide du milieu de culture.

6. Polypeptide isolé comprenant: a) la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2, ou b) une partie de la séquence d'acides aminés 30 ID SEQ N 2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N 2, ou c) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 ou avec la partie de séquence telle que définie sous b), et ayant la même fonction que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2.

7. Anticorps immunospécifique pour un polypeptide selon la revendication 6.

8. Utilisation des polypeptides selon la revendication 6 pour détecter, in vitro, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Streptococcus pyogenes dans des échantillons biologiques.

9. Utilisation des anticorps selon la revendication 7 pour détecter, in vitro, la présence d'antigènes de Streptococcus pyogenes dans des échantillons biologiques.

10. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant à titre de principe actif au moins un polypeptide selon la revendication 6, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.

11. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant au moins un polynucléotide selon l'une des revendications 1 ou 2, ou un vecteur recombinant selon la revendication 3 ou une cellule hôte selon la revendication 4.

12. Kit pour l'utilisation selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits polypeptides ou l'un desdits polynucléotides codant pour lesdits polypeptides.

13. Kit pour l'utilisation selon la revendication 9, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits 25 anticorps.