FR2922648A1 - Utilisation de la proteine 8c2 pour le diagnostic in vitro d'infections a mycoplasma pneumoniae - Google Patents

Abstract

L'invention a pour objet l'utilisation de la protéine 8C2, de séquence polypeptidique ID SEQ N degres 2, ou des fragments ou des variants de ladite protéine, l'utilisation des séquences codant pour lesdites protéines dans le domaine du diagnostic in vitro d'une infection à Mycoplasma pneumoniae.

Description

La présente invention concerne l'utilisation d'un nouveau polypeptide et d'un nouveau polynucléotide dans le domaine du diagnostic sérologique d'infection à Mycoplasma pneumoniae.

Mycoplasma pneumoniae est une bactérie à croissance intracellulaire dépourvue de paroi qui envahit les cellules de l'épithélium respiratoire. Elle est responsable d'infections respiratoires aiguës fréquemment rencontrées chez l'enfant à partir de cinq ans et chez l'adulte jeune.

Il peut s'agir de pneumonies atypiques à évolution favorable parfois associées à d'autres manifestations ORL, cutanées, hématologiques, neurologiques ou plus souvent de trachéobronchites. Mycoplasma pneumoniae serait responsable de 15 à 20% des pneumopathies communautaires se manifestant à l'état endémique avec de petites poussées épidémiques tous les quatre à sept ans (Bébéar C, Bébéar C.M et de Barbeyrac B. dans Freney J, Renaud F, Hansen W, Bollet C, Précis de bactériologie clinique, ed. ESKA, Paris, 2000) . Il existe un premier pic d'incidence chez les enfants de 5 à 15 ans, chez qui Mycoplasma pneumoniae serait responsable de près de 40% des pneumonies communautaires dont près de 20% nécessitent une hospitalisation. Le second pic d'incidence concerne l'adulte après 50 ans, avec des chiffres s'élevant progressivement avec l'âge jusqu'à dépasser 30% (Brunner H, Mycoplasma pneumoniae infections. Isr. J Med Sci. (1981), 17: 516-523 ; Ghosh et al. Surveillance of Mycoplasma pneumoniae infections in Scotland 1986-1991. J Infect. (1992), 25: 221-227 ; Waites et al. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen. Clin.Microbiol.Rev. (2004), 17: 697-728) . Le délai important entre la primo-infection chez l'enfant et la réinfection chez l'adulte montre que l'infection chez l'enfant confère à l'individu une protection immunitaire efficace contre la réinfection. Il a été également observé une association clinique entre M. pneumoniae et asthme chez les enfants, même si la nature de la corrélation n'est pas encore clairement établie (Hansbro PM et al., Rote of atypical bacterial infection of the lung in predisposition/protection of asthma. Pharmacology et Therapeutics (2004), 101: 193-210) .

Il semblerait qu'il existe une sous-estimation fréquente des infections aiguës, voire chroniques, à M. pneumoniae chez les enfants à travers des pathologies telles que l'asthme ou les pneumopathies communautaires.

Mycoplasma pneumoniae pénètre dans l'organisme par voie aérienne (inhalation de gouttelettes, contacts directs avec des sujets infectés) en adhérant aux cellules de l'épithélium respiratoire. Ce contact engendre un stress oxydatif à l'origine de l'altération du mouvement ciliaire et de la formation de lésions cellulaires. Une réaction inflammatoire locale se forme. La réaction immunologique peut entraîner l'apparition d'infiltrats et parfois même d'auto-anticorps. Certains antigènes membranaires de M. pneumoniae sont en effet semblables à des antigènes retrouvés au niveau du cerveau et du pancréas (Waites KB, Talkington DF. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen, Clin Microbiol Rev, 2004) . De nombreux agents infectieux qu'ils soient viraux ou bactériens peuvent être à l'origine d'une pneumonie et la symptomatologie respiratoire ne permet guère de différencier les infections à M. pneumoniae de celles provoquées par d'autres agents de pneumonies atypiques. Le début de la maladie est progressif après une incubation de 15 à 20 jours. La maladie se manifeste par de la fièvre, un malaise, des céphalées, des myalgies et rachialgies et surtout une toux sèche et opiniâtre. L'état général est peu altéré et l'examen physique pauvre en symptômes, contrastant avec l'importance des images radiologiques des poumons. La maladie est généralement régressive avec le temps ; cependant la convalescence est longue et la toux persistante. M. pneumoniae peut également causer diverses complications extrapulmonaires en se dispersant au niveau d'autres organes : pleurésies, éruptions cutanées, sinusites, myocardites, péricardites, atteintes articulaires, anémie hémolytique, manifestations nerveuses, infections génitales (Waites KB, Talkington DF. Mycoplasma pneumoniae and its role as a human pathogen, Clin Microbiol Rev, 2004) .

Le traitement des infections à M. pneumoniae repose sur un choix probabiliste en fonction de l'âge, surtout chez les enfants, et de critères cliniques et radiologiques dont aucun n'est ni très spécifique ni très sensible.

L'absence de paroi rend cette bactérie insensible à la pénicilline et autres bêta-lactamines habituellement prescrites en cas de pneumonie d'origine bactérienne. Ainsi, les antibiotiques fréquemment utilisés dans les infections à M. pneumoniae sont les tétracyclines, les fluoroquinolones, les macrolides et apparentés. Cependant, des cas de résistance aux fluoroquinolones et macrolides ont déj à pu être observés (Matsuoka, et al. Characterization and Molecular analysis of Macrolide-Resistant Mycoplasma pneumoniae clinical isolates obtained in Japan. Antimicrob Agents Chemother, 2004, 48, 12 : 4624-4630 ; Gruson D. et al. In vitro development of resistance to six and four fluoroquinolones in Mycoplasma pneumoniae and Mycoplasma hominis respectively. Antimicrob Agents Chemother, 2005, 49, 3 : 1190-1193) . Ces problèmes de résistance rendent le diagnostic d'infection à M. pneumoniae essentiel pour que l'antibiothérapie soit appropriée et administrée précocement.

A l'heure actuelle, le diagnostic direct est réalisé par culture ou réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ; quant au diagnostic indirect, des tests sérologiques existent tels que les agglutinines froides, la réaction de fixation du complément, l'immunofluorescence indirecte, l'agglutination passive et les tests ELISA. Toutefois, il n'existe pas de test de diagnostic de référence pour la détection d'infections à M. pneumoniae. La culture de M. pneumoniae peut être réalisée à partir de prélèvements de gorge, d'aspirations nasopharyngées chez l'enfant et de lavages bronchoalvéolaires, mais elle est longue (2 à 3 semaines) et fastidieuse. Rarement pratiquée en routine, elle est plutôt réservée aux laboratoires de référence. Cependant, lorsqu'elle est positive, elle est spécifique à 100%. La persistance de la bactérie pouvant aller jusqu'à plusieurs semaines après l'infection, des tests complémentaires, comme le dosage d'anticorps spécifiques, sont nécessaires pour confirmer le diagnostic d'une infection active. L'amplification génique par PCR, à partir de prélèvements du tractus respiratoire, est une méthode plus rapide et plus sensible que la culture (sur 100 prélèvements positifs en PCR seulement 60 sont positifs en culture). Différents systèmes ont été proposés : amplification de séquences au hasard, amplification du gène de l'adhésine ou encore du gène codant l'ARN 16S. Cette approche est sensible (78-92%), permettant la détection de 10 à 100 cfu avec une bonne spécificité (92-100%) (Loens K, Goossens H and Ieven M., Molecular Diagnosis of Mycoplasma pneumoniae respiratory tract infections, J. Clin. Microbiol., 2003). Cependant, la technique n'est pas standardisée et il n'existe, sur le marché, aucun kit de détection permettant de la mettre en oeuvre. Par ailleurs, cette technique reste très coûteuse et trop complexe à utiliser en routine dans la plupart des laboratoires de microbiologie clinique. Les sérologies sont les méthodes les plus utilisées dans le diagnostic d'infection à M. pneumoniae, notamment en cas d'absence de prélèvements comme, par exemple, des aspirations nasopharyngées ou des lavages bronchoalvéolaires. A la suite d'une infection à M. pneumoniae, le système immunitaire d'un individu non immunodéprimé répond rapidement par la production d'anticorps atteignant un pic au bout de 3 à 6 semaines pour ensuite décliner graduellement sur une période allant de quelques mois à quelques années. La production d'immunoglobulines M (IgM), spécifiques de M. pneumoniae, apparaît 7 à 10 jours après le début de l'infection. Leur mise en évidence est souvent la preuve d'une infection récente, surtout chez les jeunes enfants qui n'ont pas eu d'expositions répétées à la bactérie. Cependant, chez l'adulte ayant eu une exposition répétée, l'infection à M. pneumoniae ne provoque pas de montée rapide d'IgM et, dans ce cas, les tests sérologiques commercialisés pour mettre en évidence une réponse IgM peuvent être pris en défaut. De même, la réponse IgM pouvant persister pendant des mois, voire des années, le taux d'anticorps IgM ne reflète pas forcément une infection récente. Dans certains cas, la réinfection conduit à une augmentation du taux d'IgG et c'est pourquoi il est préconisé de rechercher en parallèle une réponse IgG et IgM. Les IgA sont produits tôt au cours de l'infection mais leur niveau de production décroît plus rapidement que celui des IgG et des IgM. Ils peuvent être de bons indicateurs d'une infection récente pour toutes les classes d'âges, même après de multiples réinfections (Waites K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, D.F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor : F.S. Nolte., 2001, ASM press : 1-30) . I1 existe différentes techniques sérologiques, souvent complémentaires, pour diagnostiquer une infection à M. pneumoniae. Les principaux tests sont, comme indiqué plus haut, la recherche d'agglutinines froides, la réaction de fixation du complément, l'immunofluorescence indirecte, les tests d'agglutination passive et les tests ELISA.

La présence d'agglutinines froides, évocatrice à un titre >64, est parfois constatée dans les infections à M. pneumoniae mais elle n'est ni constante ni caractéristique. Cette technique autrefois utilisée n'est donc plus recommandée dans la recherche d'infection à M. pneumoniae. La réaction de fixation du complément (RFC), qui utilise une préparation antigénique effectuée à partir du micro-organisme entier, a longtemps été utilisée. Le test mesure le taux d'IgM et d'IgG simultanément sans les différencier. Un titre >64, est évocateur d'une infection. La technique est lourde, peu sensible et peut donner lieu à des réactions croisées ou à des résultats ininterprétables (sérums anticomplémentaires ). La recherche d'anticorps spécifiques peut se faire par immunofluorescence indirecte. Le sérum à tester, mis au contact d'antigènes de M. pneumoniae, est révélé par des anticorps anti-IgM ou anti-IgG humaines, conjugués à un fluorochrome. Cette technique existe sous forme de kit commercialisé mais nécessite un microscope à fluorescence. La lecture des lames est longue et fastidieuse et l'interprétation des résultats reste délicate.

Des tests d'agglutination passive pour la détection d'IgM et/ou d'IgG sont commercialisés. Ils mettent en évidence une reconnaissance par des anticorps, contenus dans le sérum du patient, d'antigènes (extraits de M. pneumoniae) fixés à des particules de latex, de gélatine ou encore d'érythrocytes dans le cas du test d'hémagglutination indirecte (IHA). La technique nécessite au moins deux sérums pour mettre en évidence une augmentation du titre d'anticorps et ne présente pas d'avantages par rapport à la technique ELISA (Waites K.B., C.M.

Bébéar, J.A. Robertson, D.F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor : F.S. Nolte, 2001, ASM press : 1-30) . Les techniques ELISA permettent de détecter indépendamment des IgG ou des d'IgM. Des préparations d'extraits bactériens, de protéines purifiées comme l'adhésine Pi, de glycolipides, de peptides synthétiques ont été utilisés, ces préparations étant fixées à un support solide. Le sérum des patients est incubé avec la phase solide antigénique, et des anticorps anti-IgG ou anti-IgM humaines, conjugués à une enzyme, réagissent avec les anticorps du sérum liés à l'antigène. Le complexe est mis en évidence par l'hydrolyse d'un substrat de l'enzyme aboutissant à un produit coloré. Le choix de l'ELISA (IgM et/ou IgG) dépend de l'âge du patient et du nombre de sérums pouvant être testés. La présence d'IgM est très évocatrice chez l'enfant et l'adolescent mais plus rarement observée chez l'adulte. Il est préférable de rechercher des anticorps spécifiques sur deux sérums prélevés à 10-15 jours d'intervalle, pour mettre en évidence une séroconversion (augmentation x 4 du titre d'anticorps). En résumé, les pratiques courantes ne répondent toujours pas aux attentes médicales pour établir, de façon certaine, le diagnostic d'infections à M. pneumoniae chez l'enfant ou l'adulte. Bien que les tests sérologiques semblent être les plus adaptés, dans de nombreux cas le diagnostic d'une infection active reste difficile à différencier de celui d'une infection passée (Waites K.B., C.M. Bébéar, J.A. Robertson, D.F. Talkington, and G.E. Kenny. Laboratory diagnosis of mycoplasmal infections. Cumitech of American Society for Microbiology, coordinating editor : F.S. Nolte., 2001, ASM press : 1-30, Talkington DF, Shott S, Fallon MT, Schwartz SB and Thacker WL. Analysis of eight commercial enzyme immunoassay tests for detection of antibodies to Mycoplasma pneumoniae in human serum, Clin. Diagn. Lab. Immunol., 2004) . Le génome de M. pneumoniae a été séquencé en 1996 et réannoté en 2000 (Himmelreich R., Hilbert H., Plagens H., Pirkl E., Li BC., Hermann R. Complete sequence analysis of the genome of the bacteria Mycoplasma pneumoniae. Nucleic acid research, Vol 22, No 24, 4420-4449. Dandekar T., Huynen M., Doerks T., Sanchez-Pulido L., Snel B., Suyama M., Yuan YP, Hermann R., Bork P. Reannotating the Mycoplasma pneumoniae genome sequence : adding value, function and reading frames. Nucleic acid research, Vol 28, No 17, 3278-3288. ) Il a pu être identifié 688 phases ouvertes de lecture. A l'issue de recherches sélectives, les inventeurs de la présente invention ont identifié, à partir du génome de M. pneumoniae, un nouveau polypeptide appelé 8C2, de séquence polypeptidique ID SEQ N°2 dont les utilisations possibles sont décrites ci-après. Bien que la séquence ADN de ce polypeptide ait été identifiée lors du séquençage du génome, l'état des connaissances ne permettait, en aucun cas, de mettre en évidence l'antigénicité dudit polypeptide. Les inventeurs ont dû mettre en place un crible sélectif afin d'identifier les propriétés antigéniques uniques de la protéine 8C2. La protéine 8C2 est une enzyme appelée "formamidopyrimidine DNA glycosylase". Il s'agit d'une protéine cytoplasmique impliquée dans les mécanismes de réparation de l'ADN et retrouvée chez d'autres micro-organismes. La présente invention a comme objectifs de résoudre les déficiences des tests sérologiques actuels et de permettre le diagnostic de M. pneumoniae chez des patients, enfants ou adultes, souffrant de pneumopathie ou d'asthme.

Définitions Les définitions suivantes sont données afin de faciliter la compréhension de certains termes utilisés dans cette description.

On entend par "polynucléotide", un polyribonucléotide ou un polydésoxyribonucléotide qui peut être un ADN ou un ARN modifié ou non. Le terme polynucléotide inclut, sans limitation, un ADN simple brin ou double brin, un ADN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin, un ADN qui est un mélange de régions simple brin, double brin et/ou triple brin, un ARN simple brin ou double brin, un ARN composé d'un mélange d'une ou plusieurs région(s) simple brin et d'une ou plusieurs région(s) double brin et les molécules hybrides comprenant un ADN et un ARN qui peuvent comprendre des régions simple brin, double brin et/ou triple brin ou un mélange de régions simple brin et double brin. Le terme polynucléotide peut aussi comprendre un ARN et/ou un ADN comprenant une ou plusieurs régions triple brin. Les brins, dans de telles régions, peuvent provenir de la même molécule ou de molécules différentes. Par conséquent, les ADN ou ARN, ayant des squelettes modifiés pour la stabilité ou d'autres raisons, sont inclus dans le terme polynucléotide. On entend également par polynucléotide, les ADN et ARN contenant une ou plusieurs bases modifiées. On entend par "base modifiée", par exemple, les bases inhabituelles telles que l'inosine. Le terme polynucléotide vise également les polynucléotides de forme modifiée chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement. Les polynucléotides comprennent également les polynucléotides courts tels que les oligonucléotides. On entend par "polypeptide", un peptide, un oligopeptide, un oligomère ou une protéine comprenant au moins deux acides aminés joints l'un à l'autre par une liaison peptidique normale ou modifiée.

Le terme polypeptide comprend les chaînes courtes, appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et les chaînes longues, appelées protéines. Un polypeptide peut être composé d'acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par les gènes humains. Un polypeptide peut également être composé d'acides aminés modifiés par des processus naturels, tels que le processus de maturation post-traductionnel ou par des procédés chimiques, qui sont bien connus de l'homme du métier. Le même type de modification peut être présent à plusieurs endroits du polypeptide et n'importe où dans le polypeptide : dans le squelette peptidique, dans la chaîne d'acides aminés ou encore aux extrémités carboxy- ou aminoterminales.

Un polypeptide peut être ramifié suite à une ubiquitination ou être cyclique avec ou sans ramification. Ce type de modifications peut être le résultat de processus de post-traduction naturels ou synthétiques, qui sont bien connus de l'homme du métier.

On entend, par exemple, par modifications d'un polypeptide, l'acétylation, l'acylation, l'ADP- ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé nucléotidique, la fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé lipidique, la fixation covalente d'un phosphatidylinositol, la réticulation covalente ou non-covalente, la cyclisation, la formation de pont disulfure, la déméthylation, la formation de cystéine, la formation de pyroglutamate, la formylation, la gamma-carboxylation, la glycosylation, la formation d'ancre au GPI, l'hydroxylation, l'iodisation, la méthylation, la myristoylation, l'oxydation, le processus protéolytique, la phosphorylation, la prénylation, la racémisation, la sénéloylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés, telle que l'arginylation ou l' ubiquitination. ( PROTEINS STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2nd Ed., T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) and Wold, F., Posttranslational Protein Modifications : Perspectives and Prospects, pgs 1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983) ; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626-646 (1990) and Rattan et al., Protein Synthesis : Posttranslational Modifications and Aging, Ann. N.Y. Acad.

Sci. 663 : 48-62 (1992)) . On entend par "isolé", modifié par la main de l'homme à partir de l'état naturel, c'est-à-dire que le polynucléotide ou le polypeptide présent dans la nature a été modifié ou isolé de son environnement naturel, ou les deux. Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide naturellement présent dans un organisme vivant n'est pas "isolé", mais le même polynucléotide ou polypeptide séparé coexistants dans son état naturel est

par "pourcentage d'identité" entre deux polynucléotidiques ou polypeptidiques, le ou d'acides aminés identiques à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement 20 statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons entre deux séquences polynucléotidiques ou polypeptidiques sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière 25 optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par "fenêtre de comparaison" pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. Cette comparaison peut être réalisée grâce à un programme, par exemple le programme EMBOSS-Needle (alignement global 30 Needleman-Wunsch) à l'aide de la matrice BLOSUM62/Open Gap 10.0 et Extension Penalty de 0,5 (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol. 48, 443-453 et Kruskal, J.B. (1983), An overview of sequence comparison, In D. Sankoff and J.B. Kruskal, (ed), Time warps, strind edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, pp. 1-44 Addison Wesley) . 35 Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux des matériaux "isolé".

On entend séquences pourcentage entre les de nucléotides deux séquences séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100. Un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95% avec le polypeptide ID SEQ N°2 est un polypeptide comportant, au plus, 5 acides aminés modifiés sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence. En d'autres termes jusqu'à 5% des acides aminés dans la séquence ID SEQ N°2 peuvent être délétés ou substitués par un autre acide aminé ou la séquence peut comporter jusqu'à 5% d'acides aminés en plus par rapport au nombre total d'acides aminés de la séquence ID SEQ N°2. Ces altérations de la séquence peuvent être situées aux positions amino et/ou carboxy-terminales de la séquence d'acides aminés ou à un endroit quelconque entre ces positions terminales, en un ou plusieurs emplacements. (Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993 ; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994 ; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987) . Par analogie, un polynucléotide ayant une identité d'au moins 95% avec le polynucléotide ID SEQ N°1 est donc un polynucléotide comportant, au plus, 5 nucléotides modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à la séquence dudit polynucléotide. En d'autres termes, jusqu'à 5% des nucléotides du polynucléotide ID SEQ N°1 peuvent être délétés ou substitués par un autre nucléotide, ou un polynucléotide peut comporter jusqu'à 5% de nucléotides en plus par rapport au nombre total de nucléotides du polynucléotide ID SEQ N°1. Ces modifications peuvent être positionnées aux extrémités 3' et/ou 5', ou à un endroit quelconque entre ces extrémités, en un seul ou plusieurs emplacements. On entend par "fragment de polypeptide", un polypeptide comprenant au moins "n" acides aminés consécutifs issus du polypeptide ID SEQ N°2, où, selon les séquences, n sera égal à 7 acides aminés ou plus (par exemple, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50 ou plus acides aminés). De préférence, lesdits fragments comportent un épitope de la séquence ID SEQ N°2. Ces épitopes de type B ou T peuvent être déterminés par un logiciel (par exemple, PEOPLE [Alix, 1999] , PREDITOP [Pellequer et Westhof, 1993] ou TEST [Zao et al., :MD ) ou expérimentalement par des techniques classiques [par exemple, par cartographie d'épitope ou protéolyse ménagée]. On entend par "fragment de polynucléotide", un polynucléotide comprenant au moins "n" nucléotides consécutifs issus du polynucléotide ID SEQ N°1, où, selon les séquences, n sera égal à 21 nucléotides ou plus (par exemple, 22, 23, 24, 25, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 90, 120, 150 ou plus nucléotides).

On entend par "cellule hôte", une cellule qui a été transformée ou transfectée, ou est capable de transformation ou de transfection, par une séquence polynucléotidique exogène. On entend par "amorces spécifiques", de courtes séquences nucléotidiques capables de s'hybrider de façon spécifique, grâce à la complémentarité des bases, sur le brin d'ADN ou sur son brin complémentaire. On entend par "milieu de culture", le milieu dans lequel on purifie le polypeptide de l'invention. Ce milieu peut être constitué par le milieu extracellulaire et/ou le lysat cellulaire. Des techniques bien connues de l'homme du métier permettent également à ce dernier de redonner la conformation active au polypeptide, si la conformation dudit polypeptide a été altérée lors de l'isolation ou de la purification. On entend par "fonction", l'activité biologique d'un polypeptide ou d'un polynucléotide. La fonction d'un polypeptide conforme à l'invention est celle d'un antigène de M. pneumoniae, et la fonction d'un polynucléotide conforme à l'invention est celle de coder ce polypeptide. On entend par "antigène", tout composé qui, seul ou en association avec un adjuvant ou porteur, est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique. Cette définition comprend également tout composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène.

On entend par "analogie structurale", une analogie aussi bien de la structure primaire (séquence) que de la structure secondaire (éléments structuraux), de la structure tertiaire (structure tridimensionnelle) ou de la structure quaternaire (association de plusieurs polypeptides dans un même complexe) (BIOCHEMISTRY, 4ème Ed, L. Stryer, New York, 1995) . On entend par "variant" d'un polynucléotide dit initial ou d'un polypeptide dit initial, respectivement, un polynucléotide ou un polypeptide qui en diffère par au moins un nucléotide ou un acide aminé, mais qui garde les mêmes propriétés intrinsèques, c'est-à-dire la même fonction. Une différence dans la séquence polynucléotidique du variant peut altérer ou non la séquence d'acides aminés du polypeptide qu'il code, par rapport à un polypeptide initial. Néanmoins, par définition, ces variants doivent conférer la même fonction que la séquence polynucléotidique initiale, par exemple, coder un polypeptide ayant une fonction antigénique.

Le polynucléotide ou le polypeptide variant diffère généralement du polynucléotide initial ou du polypeptide initial par une substitution, addition, délétion, fusion ou troncation, ou par plusieurs de ces modifications prises en combinaison. Un variant non-naturel d'un polynucléotide initial ou d'un polypeptide initial peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe. On définit comme "séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique", un polynucléotide qui peut être hybridé avec cette séquence polynucléotidique dans des conditions stringentes. On entend généralement, mais pas nécessairement, par "conditions stringentes", les conditions chimiques qui permettent une hybridation lorsque les séquences polynucléotidiques ont une identité d'au moins 80%. Ces conditions peuvent être obtenues selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.

On entend par "anticorps", les anticorps monoclonaux, polyclonaux, chimériques, simple chaîne, humanisés, ainsi que les fragments Fab, incluant les produits d'un Fab ou d'une banque d'expression d'immunoglobulines. Un anticorps immunospécifique peut être obtenu par administration à un animal d'un polypeptide donné, suivie d'une récupération des anticorps produits par ledit animal, par extraction depuis ses fluides corporels. On peut également administrer à l'animal un variant dudit polypeptide, ou des cellules hôtes exprimant ce polypeptide. Le terme "immunospécifique" appliqué au terme anticorps, vis-à-vis d'un polypeptide donné, signifie que l'anticorps possède une meilleure affinité pour ce polypeptide que pour d'autres polypeptides connus de l'art antérieur. Par "affinité, on entend à la fois une complémentarité structurale et une complémentarité des liaisons de faible énergie entre deux molécules au sens d'une définition communément admise (voir, par exemple, Klotz IM. Ligand- 2 5 protein binding affinities. In Protein Function, a Practical Approach (T.E. Creighton, Ed). 1989 ; 25-35. IRL Press, Oxford, ou encore Ajay, Murcko MA. Computational methods to predict binding free energy in ligand-receptor complexes. J. Med Chem. 1995; 38:4953-67). L'affinité peut être mesurée par les techniques classiques de la biochimie (ELISA, compétition, fluorescence,...) bien connues de la personne du métier. 30 Par sérum "positif", on entend un sérum contenant anticorps, produits à la suite d'une infection M. pneumoniae, identifiés par leur liaison avec polypeptide (antigène) de l'invention. On entend par "sensibilité", la proportion de malades 35 infectés, diagnostiqués selon l'art antérieur et donnés positifs par le diagnostic selon l'invention. des à le On entend par "spécificité", la proportion de donneurs de sang, testés comme témoins, soumis au diagnostic selon l'invention et donnés négatifs par le diagnostic selon l'invention.

On entend par "kit de diagnostic", un ensemble contenant au moins l'un des produits tels que définis selon l'invention (polypeptide, polynucléotide, anticorps) et un diluant convenable, rassemblés dans un contenant approprié fait dans un matériau adapté. Ce contenant peut rassembler les différents moyens complémentaires nécessaires au test sérologique (par exemple, des réactifs marqués, des tampons, des solutions qui contiennent des ions adaptés, etc...) ainsi que les instructions requises pour réaliser le test.

La présente invention a pour objet l'utilisation, dans le domaine du diagnostic in vitro d'infections à M. pneumoniae et/ou dans la production de vaccins contre M. pneumoniae, de polypeptides tels que définis selon l'invention, de polynucléotides codant pour lesdits polypeptides, de vecteurs d'expression comprenant lesdits polynucléotides, de cellules hôtes comprenant lesdits vecteurs d'expression et d'anticorps immunospécifiques desdits polypeptides Utilisation de polypeptides L'identification du polypeptide utilisable selon l'invention est le résultat d'un crible et d'études approfondies que les séquences issues des programmes de génomique de M. pneumoniae ne laissaient pas envisager. La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N°2 (appelé protéine 8C2), codé par la séquence polynucléotidique ID SEQ N°1. La présente invention vise également l'utilisation d'un polypeptide isolé comprenant . a) un fragment de la séquence d'acides aminés ID SEQ N°2 ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N°2, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence d'acides aminés ID SEQ N°2, ou avec le fragment de séquence défini sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N°2. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'un polypeptide tel que défini ci-dessus, qui consiste à cultiver une cellule hôte telle que définie précédemment et à isoler ledit polypeptide du milieu de culture. Le polypeptide peut être purifié à partir du milieu de culture, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que la précipitation à l'aide d'agents chaotropiques comme les sels, en particulier le sulfate d'ammonium, l'éthanol, l'acétone ou l'acide trichloroacétique, ou de moyens tels que l'extraction à l'acide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie sur phosphocellulose, la chromatographie par interaction hydrophobe, la chromatographie d'affinité, la chromatographie sur hydroxylapatite ou les chromatographies d'exclusion. Utilisation de polynucléotides La présente invention a notamment pour objet l'utilisation d'un polynucléotide isolé comprenant la séquence polynucléotidique ID SEQ N°1, codant pour le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés ID SEQ N°2. L'invention vise également l'utilisation d'un polynucléotide isolé comprenant : a) un fragment de la séquence ID SEQ N°1 ayant la 30 même fonction que la séquence ID SEQ N°1, ou b) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité, de préférence au moins 80% d'identité, et mieux au moins 90% d'identité, avec la séquence polynucléotidique ID SEQ N°1, ou avec le fragment de séquence tel que défini 35 sous a), et ayant la même fonction que la séquence ID SEQ N°1, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique ID SEQ N°1 ou au fragment de séquence défini sous a) ou à la séquence définie sous b). Ainsi, des polynucléotides utilisables selon l'invention peuvent comprendre des variants ou des fragments de la séquence polynucléotidique ID SEQ N°1. Les polynucléotides utilisables selon l'invention peuvent être obtenus par les méthodes standard de synthèse d'ADN ou d'ARN.

Les polynucléotides utilisables selon l'invention peuvent également comprendre des séquences polynucléotidiques comme les séquences 5' et/ou 3' non- codantes, telles que, par exemple, des séquences transcrites, des séquences non-traduites, des séquences signal d'épissage, des séquences polyadénylées, des séquences de liaison avec des ribosomes ou encore des séquences qui stabilisent l'ARNm. Utilisation de vecteurs d'expression et de cellules hôtes La présente invention a aussi pour objet l'utilisation du polypeptide tel que défini selon l'invention et qui est préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide.

De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus. Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence polynucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par des méthodes bien connues de l'homme du métier. Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences polynucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences polynucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide tel que défini selonl'invention et la traduction d'un polypeptide tel que défini selon l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en oeuvre. La présente invention a aussi pour objet l'utilisation d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant tel que défini selon l'invention. L'introduction du vecteur recombinant dans une cellule hôte peut être effectuée selon des méthodes bien connues de l'homme du métier telles que la transfection par phosphate de calcium, la transfection par lipides cationiques, l'électroporation, la transduction ou l'infection.

Les cellules hôtes peuvent être, par exemple, des cellules bactériennes telles que des cellules de streptocoques, de staphylocoques, d'Escherichia coli ou de Bacillus subtilis, des cellules de champignons telles que des cellules de levure et des cellules d'Aspergillus, des cellules de Streptomyces, des cellules d'insectes telles que des cellules de Drosophilia S2 et de Spodoptera Sf9, des cellules animales telles que les cellules CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293, ou encore des cellules végétales. Le polypeptide peut être purifié à partir du milieu de culture des cellules hôtes, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier,et rappelées plus haut.. Utilisation des anticorps selon l'invention L'invention vise également l'utilisation d'anticorps, immunospécifiques pour un polypeptide tel que défini selon l'invention, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'antigènes issus d'une infection par M. pneumoniae.

L'invention vise, en outre, l'utilisation d'anticorps tels que définis selon l'invention, pour détecter, périodiquement, in vitro, les antigènes de M. pneumoniae et ainsi suivre l'évolution de la pathologie et de l'effet d'un traitement appliqué à un patient. Les anticorps immunospécifiques peuvent être obtenus par administration d'un polypeptide tel que défini selon l'invention, d'un de ses fragments, d'un analogue ou d'un fragment épitopique ou d'une cellule exprimant ce polypeptide, à un mammifère, de préférence non humain, selon des méthodes bien connues de l'homme du métier. Pour la préparation d'anticorps monoclonaux, on peut utiliser des méthodes usuelles de production d'anticorps, à partir de lignées cellulaires, telles que la technique des hybridomes, la technique des triomes, la technique des hybridomes de cellules B humaines et la technique des hybridomes EBV. Sérologie Les échantillons biologiques testés peuvent être du sang, de l'urine, de la salive, du liquide de ponction de sérologie (par exemple liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou liquide articulaire) ou l'un de leurs constituants (par exemple, le sérum). Les kits L'invention a également pour objet des kits de diagnostic in vitro comprenant, d'une part : . au moins l'un des polypeptides tels que définis selon l'invention, ou . au moins l'un des polynucléotides codant pour 30 lesdits polypeptides, • ou au moins l'un des anticorps tels que définis selon l'invention, et, d'autre part, au moins un diluant (par exemple, un tampon, une solution saline...) et une notice 35 d'instructions d'utilisation.

Les vaccins La présente invention concerne également une composition pharmaceutique, utilisable comme vaccin, renfermant à titre de principe actif au moins un des polypeptide, polynucléotide, vecteur recombinant ou cellule hôte tel que défini selon l'invention, et un excipient pharmaceutiquement acceptable (par exemple, une solution stérile aqueuse ou non, pouvant contenir un antioxydant ou un tampon ou un soluté rendant la composition isotonique aux fluides corporels). Partie expérimentale A l'issue d'un crible par Western blot, il a été découvert que la protéine 8C2 (ID SEQ N°2) a une utilité dans le diagnostic des infections à M. pneumoniae alors que d'autres protéines, telles que la protéine putative supernatant glycerol 3 P transport system ATP binding protein , appelée ici 13G6 (ID SEQ N°4), et la protéine ATP dependant protease binding subunit homolog , appelée ici 10D2 (ID SEQ N°6), qui sont des protéines membranaires, ne présentent pas les mêmes propriétés antigéniques que 8C2. Ces protéines sont codées par des gènes, dont la séquence est connue et accessible dans les banques de données.

A) Protocole d'obtention des antigènes A.1) Clonage de la séquence codant pour les polypeptides ID SEQ N°2, ID SEQ N°4 et ID SEQ N°6. Les gènes codant pour les séquences de polypeptide ID SEQ N°2, ID SEQ N°4 et ID SEQ N°6 sont tous obtenus par amplification par PCR à partir de l'ADN génomique de la bactérie M. pneumoniae (souche M129-B7, ATCC 29342), mais en utilisant différents couples d'amorce : - pour le gène codant pour la séquence du polypeptide ID SEQ N°2, appelé 8C2 : • l'oligonucléotide sens contenant la séquence : 5'-CCTGAACTACCTGAAGTT-3' ; et • l'oligonucléotide antisens contenant la séquence : 5'-ACGCTGTATTTGACACT-3'. - pour le gène codant pour la séquence du polypeptide ID SEQ N°4, appelé 13G6 : • l'oligonucléotide sens contenant la séquence : 5'-CAACACGACATTAATTGCT -3' ; et • l'oligonucléotide antisens contenant la séquence : 5'-AGTAAGCTTTAATGTTGGCCT -3'. - pour le gène codant pour la séquence du polypeptide 10 ID SEQ N°6, appelé 10D2 : • l'oligonucléotide sens contenant la séquence : 5'-AACTTTGAAAGCATTAAC -3' ; et • l'oligonucléotide antisens contenant la séquence : 5'-TTTAGATTTAACCTTATTGGCTA -3'. 15 Les fragments correspondants, ainsi amplifiés, sont clonés dans des vecteurs selon les techniques classiques bien connues de l'homme du métier. Ces vecteurs permettent la production des protéines clonées sous contrôle d'un promoteur inductible par l'isopropyl-thiogalactoside (en 20 abrégé, IPTG). Les protéines clonées correspondent aux séquences d'acides aminés ID SEQ N° 2, ID SEQ N° 4 et ID SEQ N° 6. A.2) Expression de la protéine Une souche d'Escherichia coli est transformée par le 25 vecteur d'expression précédemment décrit. Les bactéries sélectionnées sont mises en culture une nuit à 30°C sous agitation dans 50 ml de milieu Luria Bertani (LB, J.Miller, A short course in Bacteria Genetics , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992) contenant de l'ampicilline et du chloramphénicol, tous 30 deux, à une concentration finale de 100 pg/ml. Le lendemain, la culture est diluée au 1/50`me dans un volume final de 1 litre de milieu LB auquel on a ajouté de l'ampicilline et du chloramphénicol, tous deux, à une concentration finale de 100 pg/ml et la culture est incubée 35 à 30°C sous agitation. Lorsque la turbidité de la culture atteint une valeur d'absorbance à 600 nm (en abrégé, A600) d'environ 0,7, la production de la protéine est induite par l'IPTG à une concentration finale de 0,5 mM. Les bactéries sont récoltées par centrifugation (6 minutes à 5240 tours/min à 4°C) lorsque la turbidité de la culture atteint une A600 d'environ 1,5.

A.3) Purification Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon Tris-HC1 20 mM pH 8 contenant du saccharose à 0,5 mM, puis traitées avec du lysozyme (0,1 g/50 ml) en présence d'acide éthylènediaminotétraacétique (EDTA) 250 mM. La suspension est incubée 30 minutes à 4°C puis centrifugée à cette température pendant 10 minutes à 15500xg. Le culot est congelé à -20°C pendant au moins une nuit. Après décongélation, les bactéries sont reprises dans un tampon Mes [acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique] 25 mM à pH 6,0, puis soniquées 4 fois 20 secondes dans la glace. Après centrifugation à 15500xg à 4°C pendant 30 minutes, les culots sont repris dans 10 ml de tampon Mes (25 mM à pH 6,0, urée 8 M, R mercaptoéthanol 20 mM). Puis la suspension est centrifugée 20 minutes à 14000 tours/min à température ambiante (TA). Le surnageant est à nouveau centrifugé 30 minutes à TA à 14000 tours/min, puis filtré sur membrane de porosité 0,22 pm. Le filtrat est alors déposé sur une colonne échangeuse de cation (par exemple, SP-Sépharose 12 ml, Amersham Biosciences). Après lavage de la colonne, la protéine est éluée par un gradient linéaire de 0 à 1 M de NaCl dans du tampon Mes 25 mM à pH 6,0 en 20 volumes de colonne. Les fractions contenant la protéine sont rassemblées et les protéines sont précipitées par du sulfate d'ammonium à une concentration finale de 0,6 g/1. La solution est laissée au moins une nuit à 4°C puis centrifugée 30 minutes à 20800xg. Le culot est alors repris dans un volume le plus faible possible (en général 300 pl) de tampon (Na2HPO4/NaH2PO4 50 mM pH 8,0 contenant du NaCl 100 mM) puis déposé sur une colonne de gel filtration (par exemple SuperdexHR75-10/30, Amersham). Les fractions éluées contenant la protéine sont rassemblées et du glycérol est ajouté à une concentration finale de 20%. Les protéines purifiées sont alors stockées à -20°C jusqu'à leur utilisation dans les tests. Les concentrations des protéines sont déterminées par spectrophotométrie à partir des coefficients d'absorption calculés par la méthode de Pace (Pace CN, Vajdos F., Fee L., Grimsley G. Et Gray T., (1995), Protein Science 4,2411-24:n). La pureté des protéines est vérifiée par analyse par électrophorèse SDS-PAGE. B) Test de diagnostic in vitro Pour réaliser les tests de diagnostic, il a été utilisé des sérums provenant de patients, enfants et adultes, ayant eu une infection documentée à M. pneumoniae (collection du laboratoire ; c'est-à-dire : titres IgM et/ou IgG et/ou RFC positifs et/ou PCR positif et/ou culture positive). Les sérums témoins correspondent à des sérums de donneurs de sang n'ayant pas eu une infection à M. pneumoniae après caractérisation (collection du laboratoire) ; c'est-à-dire : titres IgM et IgG et IgA en ELISA négatifs et RFC négatifs. La fixation, sur la protéine recombinante purifiée 8C2, 13G6 ou 10D2 (obtenue comme décrit précédemment), des anticorps présents dans les sérums a été évaluée soit par des tests en Western Blot soit par la technique ELISA.

Exemple B.1 : Protocole de test, en Western Blot, pour les polypeptides tels que définis selon l'invention Après transfert, sur une membrane de nitrocellulose, de la protéine purifiée 8C2, ou 13G6, ou 10D2, la membrane est saturée pendant 45 minutes à l'aide d'une solution de tampon salin phosphate (PBS) contenant 3% de lait demi-écrémé. Après trois lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, la membrane est mise en présence du sérum testé à la dilution adéquate (1/500) dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi- écrémé, pendant 45 minutes. Après trois nouveaux lavages, des anticorps anti- immunoglobulines G et A et M humaines de chèvre (par exemple 170 -1042, Biorad), marqués à la phosphatase alcaline, sont ajoutés pendant une période de 45 minutes après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS contenant 3% de lait demi-écrémé. Trois nouveaux lavages sont effectués puis du phosphate de 5-bromo-4-chloro-3-indolyle et du nitroblue tétrazolium sont ajoutés selon les indications du fournisseur jusqu'à l'obtention du résultat. Un résultat positif correspond à la fixation de l'anticorps anti- immunoglobuline humaine à un complexe composé du polypeptide, tel que défini selon l'invention, fixé à la membrane et de l'anticorps sérique humain le reconnaissant spécifiquement, ce qui se traduit par une coloration localisée au niveau dudit complexe. Exemple B. 2 : Protocole du test ELISA Les plaques ELISA sont laissées pendant une nuit à 4°C en présence de 0,5 pg d'antigène purifié (protéine 8C2, 13G6 ou 10D2 recombinante) dans du tampon salin phosphate (PBS). Après quatre lavages par du PBS contenant du polyoxyéthylène sorbitan (Tween) à 0,05%, les plaques sont saturées une heure et demie à 37°C par du PBS-Tween contenant 4% d'albumine de sérum bovin (BSA) (250 pl par puits). Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 p1 de chaque sérum à tester ou témoin sont ajoutés à la dilution 1/100 dans du tampon PBS-BSA 4%, dans chaque puits. La plaque est ensuite incubée à 37°C pendant 30 minutes. Après quatre nouveaux lavages, des anticorps antiimmunoglobulines G et/ou A et/ou M humaines marqués à la peroxydase (par exemple 31415, Pierce) sont ajoutés (simultanément et/ou indépendamment) pendant 30 minutes à 37°C après avoir été dilués, selon le protocole du fournisseur, dans du tampon PBS-BSA 4%. Quatre nouveaux lavages sont réalisés puis 100 pl de substrat tétrabenzimidine (TMB) (par exemple HD979505, Pierce) sont ajoutés par puits. Après incubation pendant environ 15 minutes, 100 pl d'acide sulfurique sont ajoutés dans chaque puits. L'absorbance à 450 nm de chaque puits est alors mesurée après 5 minutes.

Sont considérés comme positifs en ELISA, les sérums identifiés par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention. C) Résultats et interprétations Des résultats types obtenus sont présentés à travers les exemples 1 à 3. Les sérums de patients (enfants et/ou adultes) considérés comme positifs sont ceux contenant des anticorps dirigés contre M. pneumoniae, identifiés, par ELISA, par leur liaison avec les polypeptides (antigènes) tels que définis selon l'invention.

Exemple 1 Tableau de résultats (ELISA) obtenus chez des patients adultes et/ou enfants atteints de pneumopathie, en utilisant le polypeptide 8C2 (ID SEQ N°2) et des anti-IgG comme anticorps secondaires Nombre de sérums positifs parmi les 60 sérums de patients (enfants et adultes) infectés par 45 (soit 75%) M. pneumoniae diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi les 28 sérums de patients enfants infectés par M. pneumoniae 20 (soit 71,4%) diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi les 32 sérums de patients adultes infectés par M. pneumoniae 25 (soit 78,1%) diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi 4 (soit 4,2%) les 96 sérums de donneurs de sang témoins Des résultats significatifs peuvent également être obtenus en utilisant des anticorps anti-IgA et anti-IgM comme anticorps secondaires.

De même des résultats similaires peuvent être obtenus par Western Blot.

Exemple 2 Tableau de résultats (ELISA) obtenus chez des patients adultes et/ou enfants atteints de pneumopathie, en utilisant le polypeptide 13G6 (ID SEQ N°4) et des anti-IgG comme anticorps secondaires Nombre de sérums positifs parmi les 60 sérums de patients (enfants et adultes) infectés par 13 (soit 21,7%) M. pneumoniae diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi les 28 sérums de patients enfants infectés par M. pneumoniae 11 (soit 39,2%) diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi les 32 sérums de patients adultes infectés par M. pneumoniae 2 (soit 6,2%) diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi 4 (soit 4,2%) les 96 sérums de donneurs de sang témoins Exemple 3 Tableau de résultats (ELISA) obtenus chez des patients adultes et/ou enfants atteints de pneumopathie, en utilisant le polypeptide 10D2 (ID SEQ N°6) et des anti-IgG comme anticorps secondaires Nombre de sérums positifs parmi les 60 sérums de patients (enfants et adultes) infectés par 8 (soit 13,3%) M. pneumoniae diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi les 28 sérums de patients enfants infectés par M. pneumoniae 5 (soit 17,8%) diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi les 32 sérums de patients adultes infectés par M. pneumoniae 3 (soit 9%) diagnostiqués selon l'art antérieur et soumis au diagnostic selon l'invention Nombre de sérums positifs parmi 9 (soit 9,4%) les 96 sérums de donneurs de sang témoins D'après les tableaux de résultats, on constate, par le test ELISA, que les protéines 13G6 et 10D2 ont de mauvaises performances (spécificité et/ou sensibilité) et ne peuvent être utilisées dans le cadre du diagnostic sérologique d'une infection à M. pneumoniae. En revanche, il est possible d'identifier in vitro et avec une spécificité de 95,8 %, au moins 75 % de pneumopathies causées par M. pneumoniae quel que soit l'âge du patient, au moins 71,4% des infections à M. pneumoniae chez des patients enfants, et au moins 78,1% des infections à M. pneumoniae chez des patients adultes grâce à l'utilisation, selon l'invention, du polypeptide 802. Un taux important d'anticorps anti-8C2 est donc retrouvé chez la plupart des enfants testés. Cet antigène peut, par suite, conférer aux individus infectés une protection immunitaire durable contre la réinfection. En conséquence, l'antigène 8C2 pourrait être utilisé pour la vaccination en prévention des infections à M. pneumoniae.

Il est ainsi démontré, d'une part, l'existence chez l'homme d'une réponse anticorps significative (la probabilité associée à un test de x2 est inférieure à 0,05) vis-à-vis de la protéine 8C2 au cours des infections à M. pneumoniae et, d'autre part, que la protéine 8C2 est pertinente pour le diagnostic sérologique de ce type d'infection, à travers des pathologies telles que la pneumopathie.

Claims (11)

REVENDICATIONS

1. Utilisation du polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N°2 pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae.

2. Utilisation pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, d'un polypeptide comprenant : a) un fragment de la séquence d'acides aminés telle que définie selon la revendication 1 et ayant la même fonction antigénique que ledit polypeptide, ou b) une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec la séquence d'acides aminés telle que définie selon la revendication 1 ou avec un fragment de séquence identifié sous a), et ayant la même fonction antigénique que ledit polypeptide.

3. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le polypeptide est préparé par culture d'une cellule hôte comprenant un vecteur recombinant ayant, inséré, un polynucléotide codant pour ledit polypeptide et par isolement dudit polypeptide depuis ledit milieu de culture.

4. Utilisation selon la revendication 3, quand elle dépend de la revendication 1, caractérisée en ce que le polynucléotide est de séquence ID SEQ N°1.

5. Utilisation d'un polynucléotide de séquence ID SEQ N°1 pour le codage d'un polypeptide de séquence ID SEQ N° 2 apte à détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae.

6. Utilisation d'un polynucléotide comprenant : a) un fragment de la séquence telle que définie selon la revendication 5 et ayant la même fonction de codage pour un polypeptide antigénique que ladite séquence, oub) une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec une séquence polynucléotidique telle que définie selon la revendication 5 ou avec un fragment de séquence tel que défini sous a), et ayant la même fonction de codage pour un polypeptide antigénique que ladite séquence, ou c) une séquence polynucléotidique complémentaire à la séquence polynucléotidique telle que définie selon la revendication 5 ou sous les points a) ou b) ci-dessus, pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae.

7. Utilisation d'anticorps pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'antigènes issus d'une infection par Mycoplasma pneumoniae, caractérisée en ce que lesdits anticorps sont immunospécifiques pour un polypeptide tel que défini dans les revendications 1 à 3.

8. Kit de diagnostic pour détecter, in vitro, dans des échantillons biologiques, la présence d'anticorps produits à la suite d'une infection à Mycoplasma pneumoniae, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits polypeptides ou l'un desdits polynucléotides, tels qu'identifiés dans l'une quelconque des revendications 1 à 6, associé à au moins un diluant.

9. Kit de diagnostic pour l'utilisation selon la revendication 7, caractérisé en ce qu'il comprend au moins l'un desdits anticorps associé à au moins un diluant.

10. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant, à titre de principe actif, au moins : a) un polypeptide de séquence d'acides aminés ID SEQ N°2, ou b) un polypeptide dont la séquence est un fragment de la séquence d'acides aminés telle que définie sous a) et ayant la même fonction antigénique que ladite séquence, ou c) un polypeptide dont la séquence est une séquence d'acides aminés ayant au moins 60% d'identité avec laséquence d'acides aminés telle que définies sous a) ou avec le fragment de séquence tel que défini sous b), et ayant la même fonction antigénique que ladite séquence, ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.

11. Composition pharmaceutique, notamment vaccin, comprenant, à titre de principe actif, au moins : a) un polynucléotide de séquence ID SEQ N°1, ou b) un polynucléotide dont la séquence est un fragment de la séquence polynucléotidique telle que définie sous a) et ayant la même fonction de codage pour un polypeptide antigénique que ladite séquence, ou c) un polynucléotide dont la séquence est une séquence polynucléotidique ayant au moins 60% d'identité avec la séquence polynucléotidique telle que définie sous a) ou avec un fragment de séquence tel que défini sous b), et ayant la même fonction de codage pour un polypeptide antigénique que ladite séquence, ou d) un polynucléotide dont la séquence est une séquence polynucléotidique complémentaire à l'une des séquences polynucléotidiques telles que définies sous a), b) ou c) ainsi qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable.