EP0253862A1 - Population de lymphocytes t4 specifiques du virus lav, leur procede d'obtention et leur application a la production de ce virus - Google Patents

Population de lymphocytes t4 specifiques du virus lav, leur procede d'obtention et leur application a la production de ce virus

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EP0253862A1
EP0253862A1 EP19870900826 EP87900826A EP0253862A1 EP 0253862 A1 EP0253862 A1 EP 0253862A1 EP 19870900826 EP19870900826 EP 19870900826 EP 87900826 A EP87900826 A EP 87900826A EP 0253862 A1 EP0253862 A1 EP 0253862A1
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EP
European Patent Office
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lymphocytes
virus
lav
cells
population
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19870900826
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Claude Chermann
Marie-Thérèse Nugeyre
Uriel Hazan
Françoise Barre-Sinoussi
Ammar Achour
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
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    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2812—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD4
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    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells

Definitions

  • T4 lymphocytes specific for the LAV virus their process for obtaining and their application to the production of this virus.
  • the invention relates to populations of T4 lymphocytes specific for the LAV virus, to methods for obtaining these populations and to their use for the production of this virus.
  • the invention also relates to an in vitro diagnostic method for studying the course of the disease due to infection with the LAV virus and / or discrimination between asymptomatic carriers of anti-LAV antibodies and people with lymphadenopathy syndromes (ALS) or suffering from para-AIDS or AIDS proper, that is to say, the disease known under the full name of "acquired immunodeficiency syndrome".
  • ALS lymphadenopathy syndromes
  • T4 extends to all cells carrying the T4 phenotype.
  • T4 cells will be considered in the context of the present application to extend both to non-permanent human lymphocytes and to cells belonging to permanent lines carrying the above-mentioned T4 phenotype. , such as lines known under the designations CEM, H9, HUT, MOLT, etc.
  • the LAV virus, the etiologic agent of the above-mentioned diseases, and various variants of this virus have been completely identified in the European patent application filed on September 14, 1984 in the name of INSTITUT PASTEUR and under the title "Antigens , means and method for the prognosis of diag ⁇ ly phadénopathie and syndrome immunodépres- sion acquired "under the priority of UK patent application No. 83 24800 filed 15 September 1983. for example, we can cite the LAV virus strains deposited in the National Collection of Micro- Cultures organizations of the Pasteur Institute of Paris under the numbers 1-232, 1-240, 1-241 or 1-502. We also know that similar viruses have been isolated in the United States of America.
  • LAV virus also called HIV (English abbreviation of "Human Immunodeficiency Virus”) according to the nomenclature rules recently adopted to designate LAV viruses and all viruses with equivalent properties.
  • T4 lymphocytes also known as "3Leu cells" form the main target of the virus.
  • These lymphocytes are recognizable by monoclonal antibodies, for example those sold by the company Ortho Pharmaceutical Cor ⁇ poration under the designation 0KT4. Nal monoclo ⁇ these antibodies have been described more particularly in European Patent Application No. 18 794 filed on 25 April 1980. It has also been determined that these monoclonal antibodies re ⁇ knew more particularly a molecular weight of 62,000 dalton protein (C. Terhorst et al. Science (1980), 209, 520-521). This protein has been called “T4 antigen” by the above authors. It will hereinafter also be designated as "T4 protein". In what follows, the monoclonal antibodies specific for this protein will be called "anti-T4 antibodies”.
  • One of the aims of the present invention is to provide the means which allow this discrimination between people carrying anti-LAV antibodies, but in fact still still asymptomatic and people already sick.
  • T4 lymphocytes are infectable by the LAV virus (Science, 1984, 225, p. 59-63, Klatzmann et al). But until now it was not established that T4 lymphocytes not infected with HIV (LAV) in TJ tests of the type which had been carried out by KLAZMANN et al or other researchers had structural elements , at the very least phenotypes allowing them to be distinguished from those which had been • infected. 5
  • LAV HIV
  • the invention is based on the discovery that in fact T4 lymphocytes susceptible to infection by an HIV actually had characteristics distinct from T4 lymphocytes which were not. Those cells which are infectable will be called T4X cells in the following 0, while the cells also carrying the T4 phenotype, but which are not infectious and are not even recognized by the aforementioned virus, will be called T4Y cells.
  • T4X cells in the following 0, while the cells also carrying the T4 phenotype, but which are not infectious and are not even recognized by the aforementioned virus, will be called T4Y cells.
  • the invention has also made it possible to show that the T4X cells and the T4Y cells seem to differ from the receptor for the virus. In fact, as will be seen in the remainder of this description, the T4X cells, once separated from the T4Y cells, form populations which can be infected "at 100 V by the virus.
  • the method according to the invention for separating T4X cells T4Y which takes advantage of this discovery, is characterized in that it comprises a stage of incubation of an initial population of T4 cells in the presence of inactivated LAV virus, which has been shown to be able to form a complex with the cells.
  • T4X A second step in the process consists in separating the T4X cells on which the inactivated virus is fixed, from the T4Y cells which have proved not to form a complex with the inactivated virus.
  • an additional stage of incubation in the absence of an inactivated virus is necessary.
  • the method according to the invention takes advantage of two additional properties of T4X lymphocytes. They are recognizable both by the virulent LAV virus and by the inactivated forms of this virus.
  • T4X cells on which had previously been fixed inactivated LAV virus (including inactivated virus by heat, for example by treatment at a temperature of 56 ° C ⁇ 3 ° C), are maintained in in incubation in the absence of virus, internalization seems to occur, since after a certain time, the T4X cells regain their ability to fix, again, an inactivated or virulent virus.
  • a first type of application is concerned with the in vitro diagnosis of the absence or on the contrary of the presence of the infection, in particular when the latter has not manifested itself by apparent clinical symptoms.
  • the invention also aims to allow monitoring of the progress of the infection in progress.
  • a second type of application is concerned with obtaining populations of substantially homogeneous T4X cells, usable in particular for the production of large quantities of virus or as cell culture - a particularly sensitive test for the study of cytopathogenicity - of new isolates of HIV or, in the case where this cytopathogenicity has been recognized, for the study of the capacity of substances presumed to have - an antiviral effect of inhibiting the capacity of the infectious virus to infect these cell cultures - tests.
  • compositions containing HIV antigens in particular from biological samples, for example from human sera
  • detection after incubation of the mixture formed during and under conditions suitable for allowing infection, of any infectious activity within the test culture.
  • T4X lymphocytes it may not be necessary to carry out the terminal incubation step of T4X lymphocytes in the absence of inactivated virus. This is in particular the case if, to fix the virus on its cellular receptor, a virus which is both inactivated and labeled is used. Thanks to the labeling, it then becomes possible to count, within an initial population of T4 lymphocytes, the relative proportions of T4X cells and T4Y cells that the initial population contained, by means of any appropriate detection device or adapted to the type of marking used.
  • a suitable device consists, for example, of a cell sorter if it is desired to separate the T4X from the T4Y.
  • a preferred embodiment of this method consists in using the LAV virus labeled with fluorescein and a fluorescence microscope.
  • a variant of the process consists in using LAV coupled to an enzyme (peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, etc.) by a bifunctional agent which does not modify the recognition of the cellular receptor by the viral antigen (glutaraldehyde or diaminobenzidine for example) and revealed the "LAV-T4X" complex by well-known immunoenzymatic techniques such as Elisa, taking advantage of the modification of the radiation absorption properties of a substrate after hydrolysis of the latter by the enzyme coupled to the LAV virus.
  • an enzyme peroxidase, ⁇ -galactosidase, alkaline phosphatase, etc.
  • a bifunctional agent which does not modify the recognition of the cellular receptor by the viral antigen (glutaraldehyde or diaminobenzidine for example) and revealed the "LAV-T4X" complex by well-known immunoenzymatic techniques such as Elisa, taking advantage of the modification of the radiation absorption properties
  • T4X lymphocytes represent in a healthy subject approximately 10 to 15% of the initial population of T4 lymphocytes.
  • experience shows that the relative proportion of T4X cells vis-à-vis T4Y cells is modified in people testifying to clinical signs characteristic of ALS or AIDS.
  • any other mode of separation of the T4X lymphocytes retaining the inactivated virus can be used, for example when the latter is not itself labeled.
  • the lymphocytes on which the inactivated virus is fixed can be detected by anti-LAV antibodies.
  • the detection of these antibodies can be direct, in particular if they are labeled with a fluorescent, radioactive or enzyme label, or indirect, for example using labeled anti-immunoglobulins.
  • the invention therefore provides a method for in vitro measurement of the T4X / T4Y lymphocyte ratio from any biological sample, in particular from blood originating from a person subjected to the diagnosis. Determining such a ratio makes it possible, even in persons carrying anti-LAV antibodies, to ensure that in principle these persons carrying antibodies are not threatened in the short term by the disease, in other words, do not have ALS or AIDS. On the contrary, if the ratio is changed, it can be assumed that the disease is developing. In such a case, the invention further enables the determination of the stage of development of the disease and, if the measurements are repeated over time, of its evolution, in particular in correlation with the variations in this ratio in the direction a decrease.
  • the invention therefore provides means allowing the desired real discrimination between asymptomatic people and already sick people.
  • the invention therefore also provides new parameters which can effectively be substituted for the old ones, as regards the recognition of the installation of the disease.
  • T4 / T8 lymphocyte ratio could hardly be used for this screening, due to its small relative variation, at least until a very advanced stage of the disease
  • monitoring of the T4X / T4Y ratio allows now a close monitoring of the evolution of the disease, therefore the choice of the most effective therapy.
  • Yet another method of measurement comprises, for example, the study of the variation in the proportions of lymphocytes which, within an initial population of T4 lymphocytes which have been brought into contact beforehand with inactivated virus, are recognized. by anti-T4 antibodies.
  • This test takes advantage of the disturbance in the recognition property possessed by anti-T4 antibodies for T4 lymphocytes, when the latter have previously been exposed to the LAV virus. It has in fact been observed that, if a population of T4 lymphocytes is incubated in the presence of anti-T4 antibodies, these tend to bind to all the T4 cells. The binding of anti-T4 antibodies is reduced when T4 lymphocytes are previously incubated in the presence of LAV virus.
  • T4X lymphocytes and T4Y lymphocytes it is possible, by respective counts of T4X lymphocytes and T4Y lymphocytes to determine the T4X / T4Y ratio mentioned above.
  • T4X lymphocytes after separation of the T4X lymphocytes, in particular under the conditions indicated below and internalization of the inactivated virus in the T4X lymphocytes, it is possible to assess their relative proportion by bringing them into contact with a preparation of inactivated LAV virus and labeled, for example with fluorescein, then measure the intensity of fluorescence emitted which is correlated to the number of T4X lymphocytes present.
  • T4X lymphocytes also "control" the manifestations of certain functions of the T4Y lymphocytes, if we judge by the observed inhibition of the expression of the phenotype T4 and the IL-2 receptor (called "TAC”), of all T4 lymphocytes in people already with advanced AIDS.
  • TAC phenotype T4 and the IL-2 receptor
  • the invention also applies to the separation of T4X and T4Y lymphocytes, as indicated above.
  • Such a method is more particularly interesting to implement on populations of T4 cells belonging to permanent lines (CEM, H9, etc.) in order to obtain permanent T4X cells all infectable by the LAV virus, so that virus production yields can be amplified.
  • a preferred embodiment of this method for obtaining T4X cells comprises bringing a population of T4 lymphocytes into contact with a fixed inactivated virus on a solid support. This contacting is then carried out in a heterogeneous medium consisting of a fluid phase containing the initial population of T4 cells and a solid phase retaining the inactivated virus.
  • the T4X cells are first fixed on the solid support by the intermediary of the virus, which allows the separation of the two phases. After internalization of the inactivated virus, an at least partial "dropout" of the T4X lymphocytes from the solid support is then observed. These T4X lymphocytes can then be collected.
  • the solid support of this process preferably consists of magnetic latex beads or agarose polyacrylamide beads of the type described in French patent application no . 75 36889 published under no . 2 334 106 in the name of 1 ' PASTOR INSTITUTE.
  • magnetic latex beads the separation is easily carried out using a magnet.
  • a preliminary incubation of the initial population of T4 cells is carried out in the presence of inactivated virus, then these T4 lymphocytes are brought into contact with anti-antibody -T4, or the like, fixed on a suitable insoluble support.
  • T4Y cells whose receptors for anti-T4 antibodies are not masked by the inactivated LAV virus, therefore bind to the solid support by means of anti-T4 antibodies, while T4X cells are bound to the LAV virus. inactivated remain in sus ⁇ pension in the fluid.
  • T4X cells After separation of the two phases, in particular by simple decantation and internalization of the virus inactivated by T4X cells, a population of T4X cells is obtained, all of which are infectable by the LAV virus.
  • This population of T4X cells also has the characteristic that essentially all of its lymphocytes carry a receptor for the virulent or inactivated LAV, a receptor which appears distinct from the receptors for the monoclonal antibodies 0KT4, since these do not distinguish between the T4X and T4Y lymphocytes between them.
  • the invention also relates to a process for the production of the LAV virus by infection of populations essentially made up of T4X cells maintained in culture and by recovery of the viruses produced by these cells.
  • It also relates to a sensitive method for detecting the infectious nature or not of a biological preparation presumed to contain LAV or HIV antigens, for example from a sample of a biological fluid (for example serum) originating from a carrier of anti-LAV antibodies, this process consisting in bringing this sample into contact with said population of T4X, in carrying out the incubation of the mixture over time and under conditions allowing possible infection of these T4X lymphocytes by a LAV or HIV virus, and to detect possible infection of T4X lymphocytes, for example by the manifestation of reverse transcriptase activity in the event of a positive response and, if necessary, the complete destruction over time of this population of T4X.
  • a biological fluid for example serum
  • this process can be implemented under similar conditions either with a viral preparation whose character infec ⁇ vis-à-vis human lymphocytes must be determined, or with a preparation of retroviruses whose infectious nature for humans had already been recognized, but this in the presence of active principles of possible drugs, the possible ability of which to inhibit the infectious action of this retrovirus to be tested.
  • the viral preparation may be that which had been obtained from a patient affected (or likely to be affected) by AIDS, in order to determine which of the drugs which could be the more efficient in order to get at least one remission of the development of the disease in the affected patient.
  • the unbound FITC was then removed by gel filtration on a molecular sieve of Sephadex G25 from Pharmacia or Biorad (which retains the isothiocyanate).
  • the virus thus labeled is then inactivated by treatment at a temperature of 56 "C ⁇ 1 * C.
  • T4 cells previously fractionated using specific monoclonal antibodies.
  • LAV-FITC at 2.5 mg / ml for 60 minutes at 0 + 4 * C. After three washes with cold PBS, the cells are then observed using a fluorescence microscope and used for sorting .
  • Table I summarizes the results obtained. It can be seen that in a population of previously fractionated T4 lymphocytes, only 10% are recognized by FITC-LAV. However, less than 0.5% of a population of fractionated T8 cells are labeled with this virus. Similarly, we find that B lymphocytes and onocytes are not or are poorly recognized by FITC-LAV, also confirming that these cells have very few receptors for the virus.
  • the cells latex beads contact is made in 7 incubating 10 T4 cells with 200 mcg of latex having fixed the virus for 15 minutes at 0 + 4 ° C in a PBS solution containing 5% fetal calf serum, 1 % biotic anti- Q (penicillin, streptomycin, neomycin mixture, marketed by Gibco) and 0.1% sodium azide. Then using a magnet, the beads on which the T4X cells are fixed are separated from the supernatant containing the population T Y.
  • T4 lymphocytes 7,210 T4 (T4) lymphocytes are centrifuged for 10 minutes at
  • the pellet is taken up in 2 ml of PBS containing 5% FCS,
  • the cells were incubated with 0.75 g of purified virus, sterile filtered and previously inactivated for 30 minutes at 56 ° C; Incubation takes place at 4 ° C for 10 minutes (cells and virus should be at 4 ° C upon contact) the cells are then centri ⁇ Fugees 2 times at 450 g for 10 minutes at 4 ° C and the cu ⁇ batch is taken up in 4 ml of PBS 5% FCS. iii) Separation of cells:
  • T4X cells T4X cells. It is also possible to recover the T4Y cells, for example after washing 4 times in PBS containing 1% of FCS by syringe jets. The cells fixed on the 0KT4 are detached, these cells then forming the desired population of T4Y lymphocytes.

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Abstract

Population de cellules portant le phénotype T4 des lymphocytes T4, caractérisée en ce qu'elle est constituée essentiellement par des lymphocytes T4X possédant un site de fixation spécifique du virus LAV et en ce qu'elle est exempte de lymphocytes T4Y et ne possédant apparemment pas de récepteur pour ce virus. L'invention concerne aussi un procédé d'obtention de ces cellules T4X par séparation de ces dernières du reste des cellules T4Y. En outre l'invention concerne un diagnostic in vitro permettant la discrimination entre porteurs asymptomatiques d'anticorps anti-LAV et personnes présentant des syndromes de lymphadénopathies (SLA) ou atteintes de para-SIDA ou de SIDA et, en cas de réponse positive, le procédé de l'invention permet le suivi de l'évolution de l'infection produite par le virus LAV. Enfin les populations de lymphocytes T4X, et plus particulièrement celles appartenant à des lignées permanentes, sont applicables à la production du virus LAV.

Description

Population de lymphocytes T4 spécifiques du virus LAV, leur procédé d'obtention et leur application à la pro¬ duction de ce virus.
L'invention concerne des populations de lympho¬ cytes T4 spécifiques du virus LAV, des procédés d'obten¬ tion de ces populations et leur utilisation pour la pro¬ duction de ce virus.
L'invention concerne également une méthode de diagnostic in vitro permettant l'étude de l'évolution de la maladie due à l'infection par le virus LAV et/ou la discrimination entre porteurs asymptomatiques d'anticorps anti-LAV et des personnes présentant des syndromes de lymphadénopaties (SLA) ou atteintes de para-SIDA ou de SIDA proprement dit, c'est-à-dire la maladie connue sous le nom complet de "syndrome d'i munodéficience acquise" .
Pour la commodité du langage, il sera fait réfé¬ rence dans ce qui suit aux cellules T4, étant entendu que la désignation T4 s'étend à toutes les cellules portant le phenotype T4. D'une façon générale, l'expression "cellules T4" sera considérée dans le cadre de la présente demande comme s'étendant aussi bien aux lymphocytes humains non permanents, qu'aux cellules appartenant à des lignées per¬ manentes portant le susdit phenotype T4, telles que des lignées connues sous les désignations CEM, H9, HUT, MOLT, etc..
Le virus LAV, agent étiologigue des susdites af¬ fections, et divers variants de ce virus ont été complè¬ tement identifiés dans la demande de brevet européen dé¬ posée le 14 septembre 1984 au nom de 1 'INSTITUT PASTEUR et sous le titre "Antigènes, moyens et méthode pour le diag¬ nostic de ly phadénopathie et du syndrome d'immunodépres- sion acquise", sous la priorité de la demande de brevet britannique n* 83 24800 déposée le 15 septembre 1983. A titre d'exemple, on peut citer les souches de virus LAV déposées à la Collection Nationale des Cultures de Micro- organismes de 1 ' Institut Pasteur de Paris sous les numéros 1-232, 1-240, 1-241 ou 1-502. On sait par ailleurs que des virus similaires ont été isolés aux Etats-Unis d'Amérique. Ils ont été dénommés ARV (Jay LEVY et al., Science, 1984, 225. p. 840-884) et HTLV-III (Science, 1984, vol. 224, 497-500). Quoi qu'il en soit, il sera fait référence dans ce qui suit au virus LAV, également dénommé HIV (abrévia¬ tion anglaise de "Human Immunodeficiency Virus" (virus d'immunodéficience humaine)) selon les règles de nomen¬ clature récemment adoptées pour désigner des virus LAV et tous les virus doués de propriétés équivalentes.
Il avait déjà été reconnu que les lymphocytes T4 (aussi connus sous la désignation "cellules 3Leu") for¬ maient la principale cible du virus. Ces lymphocytes sont reconnaissables par des anticorps monoclonaux, par exemple ceux commercialisés par la firme Ortho Pharmaceutical Cor¬ poration sous la désignation 0KT4. Ces anticorps monoclo¬ naux ont été décrits plus particulièrement dans la demande de brevet européen n* 18.794 déposée le 25 avril 1980. Il a également été établi que ces anticorps monoclonaux re¬ connaissaient plus particulièrement une protéine de poids moléculaire de 62.000 daltons (C. Terhorst et coll.Science (1980), 209, 520-521). Cette protéine a été dénommée "an¬ tigène T4" par les susdits auteurs. Elle sera ci-après encore désignée comme "protéine T4". Dans ce qui suit les anticorps monoclonaux spécifiques de cette protéine seront appelés "anticorps anti-T4".
Cette propriété de reconnaissance spécifique des lymphocytes T4 par le virus LAV a été utilisée pour la mise au point d'un procédé et de compositions à base d'an¬ ticorps anti-T4, visant à bloquer la pénétration des virus LAV dans les lymphocytes T, donc le développement du pro¬ cessus infectieux (demande de brevet français n* 84 14172 déposée le 14 septembre 1984 au nom de 1' INSTITUT PASTEUR) . On sait, d'autre part, que le rapport du nombre des lymphocytes T4 au nombre des lymphocytes T8 (qui ne sont affectés qu'à un moindre degré par le virus LAV) tend à diminuer chez certains patients atteints du para-SIDA (lymphadénopathies, etc.) et chez les malades atteints du SIDA. Au dernier stade de la maladie, les lymphocytes T4 ont presque disparu du sang circulant. On peut faire l'hy¬ pothèse qu'il s'ensuit une réduction, sinon une dispari¬ tion des autres fonctions des lymphocytes T4, notamment celles liées à la production par eux d'un médiateur so- luble ou lymphokine, 1 'interleukine-2 (IL-2). Il en résul¬ te alors une perturbation des fonctions immunoprotectrices attribuables aux autres lymphocytes, notamment des lympho¬ cytes T8 cytotoxiques, et de leur capacité à se multi¬ plier.
On a rappelé dans ce qui précède un certain nombre de phénomènes qui peuvent être observés, au niveau des lymphocytes, chez des personnes déjà sujettes à un proces¬ sus infectieux. Or l'expérience montre que ces malades ne constituent vraisemblablement qu'une proportion minoritai¬ re de l'ensemble des personnes qui ont été en contact avec le virus LAV. Il est en effet bien connu que de nombreuses personnes porteuses d'anticorps anti-LAV, ne présentent heureusement pas les signes cliniques des SLA ou du SIDA, et sont apparemment en bonne santé. Mais il est difficile de distinguer parmi ces personnes celles qui vont rester en bonne santé et celles chez lesquelles la maladie évo¬ lue. En effet des rapports lymphocytes T4/lymphocytes T8 qui peuvent conserver l'apparence de la normale chez des personnes déjà atteintes, ne permettent pas la discrimi¬ nation entre personnes porteuses d'anticorps anti-LAV réellement en bonne santé et personnes entrant dans la phase précoce de la maladie. On conçoit que ces observa¬ tions soient génératrices d'angoisse chez les premières et rendent difficiles le suivi de l'évolution de la maladie chez les secondes .
Un des buts de la présente invention est de four¬ nir les moyens qui permettent cette discrimination entre personnes porteuses d'anticorps anti-LAV, mais en fait toujours encore asymptomatiques et personnes déjà malades.
En effet, il a déjà été montré que seulement une certaine proportion des lymphocytes T4 est infectable par le virus LAV (Science, 1984, 225 , p. 59-63, Klatzmann et al). Mais jusqu'à ce jour il n'était pas établi que les lymphocytes T4 non infectés par un HIV (LAV) dans les TJ essais du type de ceux qui avaient été réalisés par KLAZMANN et al ou d'autres chercheurs présentaient des éléments de structure, à tout le moins des phénotypes permettant de les distinguer de ceux qui avaient été • infectés. 5
L'invention repose sur la découverte qu'en fait les lymphocytes T4 susceptibles d'être infectés par un HIV avaient effectivement des caractéristiques distinctes des lymphocytes T4 qui ne 1 ' étaient pas . Celles des cellules qui sont infectables seront appelées cellules T4X dans ce 0 qui suit, alors que les cellules également porteuses du phenotype T4, mais qui ne sont pas infectables et même ne sont pas reconnues par le virus susdit, seront appelées cellules T4Y. L'invention a en outre permis de montrer que 5 les cellules T4X et les cellules T4Y semblent se différen¬ cier au niveau même du récepteur pour le virus. En effet, comme il sera vu dans la suite de cet exposé, les cellules T4X, une fois séparées des cellules T4Y, forment des populations infectables "à 100 V par le virus. 0 Le procédé selon l'invention de séparation des cellules T4X et T4Y qui met à profit cette découverte est caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'incubation d'une population initiale de cellules T4 en présence de virus LAV inactivé, qui s'est avéré pouvoir former un com¬ 5 plexe avec les cellules T4X. Une seconde étape du procédé consiste à séparer les cellules T4X sur lesquelles le vi¬ rus inactivé est fixé, des cellules T4Y qui se sont avé¬ rées ne pas former de complexe avec le virus inactivé. De préférence, si l'on veut récupérer des cellules T4X in¬ fectables par le virus, une étape supplémentaire d'incu¬ bation en l'absence de virus inactivé est nécessaire.
En effet le procédé selon l'invention met à profit deux propriétés supplémentaires des lymphocytes T4X. Ils sont reconnaissables aussi bien par le virus LAV virulent que par les formes inactivées de ce virus. En outre, lors¬ que les cellules T4X, sur lesquelles avait au préalable été fixé le virus LAV inactivé (notamment par un virus inactivé à la chaleur, par exemple par traitement à une température de 56*C ± 3*C), sont maintenues en incubation en l'absence de virus, une internalisation semble se pro¬ duire, puisqu'au bout d'un certain temps, les cellules T4X retrouvent leur aptitude à fixer, de nouveau, un virus inactivé ou virulent.
Ces diverses constatations sont à l'origine de plusieurs types d'applications possibles. Un premier type d'application s'intéresse au diagnostic in vitro de l'absence ou au contraire de la présence de l'infection, en particulier lorsque celle-ci ne s' est pas manifestée par des symptômes cliniques apparents. Dans ce dernier cas, l'invention a encore pour but de permettre le suivi de l'évolution de l'infection en cours. Un second type d'application s'intéresse à l'obtention de populations de cellules T4X sensiblement homogènes, utilisables notamment pour la production de quantités importantes de virus ou comme culture celluèlaire - test particulièrement sensible pour l'étude de la cytopathogénicité - de nouveaux isolats de HIV ou, pour le cas où cette cytopathogénicité a été reconnue, pour l'étude de la capacité de substances pré¬ sumées avoir -un effet antiviral d'inhiber la capacité du virus infectieux à infecter ces cultures cellulaires- tests. Elles permettent également - cas dans lequel on peut se trouver ramener à des essais de diagnostic in vitro - l'étude du caractère infectieux de compositions contenant des antigènes de HIV (notamment de prélèvements biologiques, par exemple de sérums humains) par mise en contact de ces prélèvements avec ces cultures cellu¬ laires-tests et la détection, après incubation du mélange formé pendant et dans les conditions propres à permettre l'infection, d'une éventuelle activité infectieuse au sein de la culture-test.
Dans le premier type d'application envisagé ci- dessus, il peut n'être pas nécessaire de procéder à l'éta¬ pe d'incubation terminale des lymphocytes T4X en l'absence de virus inactivé. Tel est en particulier le cas si, pour fixer le virus sur son récepteur cellulaire, on utilise un virus à la fois inactivé et marqué. Grâce au marquage, il devient alors possible de compter au sein d'une population initiale de lymphocytes T4, les proportions relatives de cellules T4X et de cellules T4Y que contenait la popula¬ tion initiale, au moyen de tout dispositif de détection approprié ou adapté au type de marquage utilisé. Un dispo¬ sitif approprié consiste par exemple en un trieur de cel¬ lules si on veut séparer les T4X des T4Y.
Un mode préféré de réalisation de ce procédé con¬ siste à utiliser du virus LAV marqué à la fluorescéine et un microscope à fluorescence.
Une variante du procédé consiste à utiliser du LAV couplé à une enzyme (peroxydase, β-galactosidase, phospha- tase alcaline, etc.) par un agent bifonctionnel ne modi¬ fiant pas la reconnaissance du récepteur cellulaire par l'antigène viral (glutaraldéhyde ou la diaminobenzidine par exemple) et a révélé le complexe "LAV-T4X" par les technigues immunoenzymatiques bien connues telles que l'Elisa, mettant à profit la modification des propriétés d'absorption de radiations d'un substrat après hydrolyse de ce dernier par l'enzyme couplée au virus LAV.
Cette méthode a permis de constater de façon re¬ productible que les lymphocytes T4X représentent chez un sujet sain environ de 10 à 15 % de la population initiale des lymphocytes T4. Au contraire, et c'est là un résultat nouveau essentiel auquel l'invention a permis d'aboutir, l'expérience montre que la proportion relative des cellu¬ les T4X vis-à-vis des cellules T4Y est modifiée chez des personnes témoignant de signes cliniques caractéristiques des SLA ou du SIDA. Naturellement, on peut avoir recours à tout autre mode de séparation des lymphocytes T4X retenant le virus inactivé, par exemple lorsque celui-ci n'est pas lui-même marqué. Par exemple les lymphocytes sur lesquels le virus inactivé est fixé peuvent être détectés par des anticorps anti-LAV. La détection de ces anticorps peut être directe, notamment s'ils sont marqués par un marqueur fluorescent, radioactif ou enzy atique, ou indirecte, par exemple à l'aide d 'anti-immunoglobulines marquées.
L'invention fournit donc une méthode de mesure in vitro du rapport lymphocytes T4X/T4Y à partir de tout échantillon biologique, notamment de sang provenant d'une personne soumise au diagnostic. La détermination d'un tel rapport permet, même chez des personnes porteuses d'anti¬ corps anti-LAV, de s'assurer qu'en principe ces personnes porteuses d'anticorps ne sont pas menacées à brève échéan¬ ce par la maladie, en d'autres termes ne sont pas attein¬ tes de SLA ou de SIDA. Au contraire, si le rapport est modifié, on peut présumer de ce que la maladie est en train de se développer. Dans un tel cas, l'invention per¬ met encore la détermination du stade de développement de la maladie et, si les mesures sont répétées dans le temps, de son évolution, notamment en corrélation avec les varia¬ tions de ce rapport dans le sens d'une diminution.
Pour la première fois, l'invention fournit donc des moyens permettant la discrimination réelle souhaitée entre les personnes asymptomatiques et les personnes déjà malades. L'invention fournit donc encore de nouveaux pa¬ ramètres efficacement substituables aux anciens, ,pour ce qui est de la reconnaissance de l'installation de la ma¬ ladie. Alors qu'antérieurement le rapport lymphocytes T4/lymphocytes T8 ne pouvait guère être utilisé pour faire ce dépistage, en raison de sa faible variation relative, au moins jusqu'à un stade très avancé de la maladie, la surveillance du rapport T4X/T4Y permet maintenant une sur¬ veillance étroite de l'évolution de la maladie, par consé¬ quent le choix de la thérapeutique la plus efficace.
Un autre mode de mesure encore comprend par exem¬ ple 1 'étude de la variation des proportions des lympho¬ cytes qui, au sein d'une population initiale de lymphocy¬ tes T4 mis en contact préalablement avec du virus inacti¬ vé, sont reconnus par les anticorps anti-T4. Ce test met à profit la perturbation de la propriété de reconnaissance que possèdent les anticorps anti-T4 pour les lymphocytes T4, lorsque ces derniers ont auparavant été mis en pré¬ sence de virus LAV. Il a en effet été constaté que, si l'on incube une population de lymphocytes T4 en présence d'anticorps anti-T4, ceux-ci tendent à se fixer sur toutes les cellules T4. La fixation des anticorps anti-T4 est di¬ minuée lorsque des lymphocytes T4 sont préalablement incu¬ bés en présence de virus LAV. On peut donc, par comptages respectifs des lymphocytes T4X et des lymphocytes T4Y dé¬ terminer le rapport T4X/T4Y sus-indiqué. En variante, on peut, après séparation des lymphocytes T4X, notamment dans les conditions indiquées plus loin et internalisation du virus inactivé dans les lymphocytes T4X, évaluer leur pro¬ portion relative par leur mise en contact avec une prépa¬ ration de virus LAV inactivé et marqué, par exemple à la fluorescéine, puis mesurer l'intensité de fluorescence émise que l'on corrèle au nombre de lymphocytes T4X pré¬ sents. Ces tests soutiennent l'hypothèse (en même temps qu'il confirme ce qui a été montré plus haut, en ce qui concerne la proportion des lymphocytes T4X au sein d'une population de lymphocytes T4 chez un sujet sain) qu'il existe à la surface d'environ 10 % des lymphocytes T4 un récepteur qui reconnaît spécifiquement le LAV et que, lorsque ce dernier y est fixé, il masque le site de recon¬ naissance des lymphocytes T4 par les anticorps anti-T4. Cette constatation semble attribuable au fait que l'anti¬ corps anti-T4 masque ce qui pourrait être le récepteur spécifique du LAV sur les lymphocytes T4X infectables, constatation qui trouve sa confirmation dans le fait que, à l'inverse, la fixation des anticorps anti-T4 sur les lymphocytes T4 empêche toute fixation du virus LAV sur les lymphocytes T4X.
De l'ensemble des constatations qui précèdent, il semble découler que les lymphocytes T4X "commandent" éga¬ lement les manifestations de certaines fonctions des lym¬ phocytes T4Y, si l'on en juge par l'inhibition observée de l'expression du phenotype T4 et du récepteur pour 1 ' IL-2 (appelé "TAC"), de l'ensemble des lymphocytes T4 chez des personnes déjà à un stade avancé du SIDA.
L'invention s'applique également à la séparation des lymphocytes T4X et T4Y, comme indiqué plus haut.
Un tel procédé est plus particulièrement intéres¬ sant à mettre en oeuvre sur des populations de cellules T4 appartenant à des lignées permanentes (CEM, H9, etc.) afin d'obtenir des cellules T4X permanentes toutes infectables par le virus LAV, de sorte que les rendements de produc¬ tion du virus peuvent être amplifiés.
Divers modes de réalisations de ce procédé peuvent être mis en oeuvre.
Un mode de réalisation préféré de ce procédé d'ob¬ tention de cellules T4X comprend la mise en contact d'une population de lymphocytes T4 avec un virus inactivé fixé sur un support solide. Cette mise en contact est alors ré¬ alisée en milieu hétérogène constitué d'une phase fluide contenant la population initiale de cellules T4 et d'une phase solide retenant le virus inactivé. Les cellules T4X sont tout d'abord fixées sur le support solide par l'in¬ termédiaire du virus, ce qui permet la séparation des deux phases. Après internalisation du virus inactivé, on obser¬ ve alors un "décrochage" au moins partiel des lymphocytes T4X du support solide. Ces lymphocytes T4X peuvent alors être recueillis. Le support solide de ce procédé est de préférence constitué de billes de latex magnétiques ou de billes de polyacrylamide agarose du type de celles décri¬ tes dans la demande de brevet français n* 75 36889 publiée sous le n* 2 334 106 au nom de 1 ' INSTITUT PASTEUR. Dans le cas de billes de latex magnétiques, la séparation est aisément réalisée à l'aide d'un aimant.
Dans un mode de réalisation du procédé selon l'in¬ vention, on réalise une incubation préalable de la popula¬ tion initiale de cellules T4 en présence de virus inacti¬ vé, puis on met en contact ces lymphocytes T4 avec des an¬ ticorps anti-T4, ou analogues, fixés sur un support inso¬ luble adéquat. Les cellules T4Y, dont les récepteurs aux anticorps anti-T4 ne sont pas masqués par le virus LAV inactivé, se fixent par conséquent sur le support solide par l'intermédiaire des anticorps anti-T4, tandis que les cellules T4X fixées .au virus LAV inactivé restent en sus¬ pension dans le fluide. Après séparation des deux phases, notamment par simple décantation et internalisation du virus inactivé par les cellules T4X, on obtient ainsi une population de cellules T4X, toutes infectables par le virus LAV. Cette population de cellules T4X présente encore la caractéristique qu'essentiellement la totalité de ses lymphocytes portent un récepteur pour le LAV vi¬ rulent ou inactivé, récepteur qui parait distinct des récepteurs pour les anticorps monoclonaux 0KT4, puisque ceux-ci ne distinguent pas les lymphocytes T4X et T4Y entre eux.
L'invention concerne également un procédé de pro¬ duction du virus LAV par infection de populations essen¬ tiellement constituées de cellules T4X maintenues en cul¬ ture et par récupération des virus produits par ces cel¬ lules.
Elle concerne aussi un procédé sensible de dé¬ tection du caractère infectieux ou non d'une préparation biologique présumée contenir des antigènes de LAV ou HIV, par exemple d'un prélèvement d'un fluide biologique (par exemple de sérum) provenant d'un porteur d'anticorps anti- LAV, ce procédé consistant à mettre en contact ce prélè¬ vement avec ladite population de T4X, à réaliser l'incu¬ bation du mélange pendant le temps et dans des conditions permettant l'infection éventuelle de ces lymphocytes T4X par un virus LAV ou HIV, et à détecter l'infection possible des lymphocytes T4X, par exemple grâce à la manifestation d'une activité reverse transcriptase en cas de réponse positive et, le cas échéant, la destruction complète à terme de cette population de T4X.
A l'inverse, comme déjà dit plus haut, ce procédé peut être mis en oeuvre dans des conditions semblables soit avec une préparation virale dont le caractère infec¬ tieux vis-à-vis de lymphocytes humains doit être déter¬ miné, soit avec une préparation de rétrovirus dont le caractère infectieux pour l'homme avait déjà été reconnu, mais ce en présence de principes actifs de médicaments éventuels, dont doit être testée l'éventuelle capacité à inhiber l'action infectieuse de ce rétrovirus. Dans un cas particulier de cette dernière application, la préparation virale peut être celle qui avait été obtenue à partir d'un patient affecté (ou susceptible d'être affecté) par un SIDA, afin de déterminer celui des médicaments qui pour¬ rait être le plus efficace en vue d'obtenir au moins une rémission du développement de la maladie chez le malade concerné.
Les techniques préférées de mise en oeuvre des procédés et méthodes et les résultats obtenus selon l'in¬ vention sont indiquées à titre d'exemples dans la descrip¬ tion détaillée qui suit :
1) Marquage du virus LAV par de la fluorescéine.
1 ml de virus LAV (concentration protéique 5 g/- l) purifié par ultracentrifugation sur gradient de sac¬ charose 30-60 % , a été incubé 90 minutes à 25"C à l'obscu¬ rité en présence de 1 ml d'isothiocyanate de fluorescéine (FITC) à 2,5 mg/ml en tampon carbonate pH 9,2.
Le FITC non lié a ensuite été éliminé par gel filtration sur tamis moléculaire de Sephadex G25 de Pharmacia ou Biorad (qui retient 1'isothiocyanate) .
Le virus ainsi marqué est ensuite inactivé par un traitement à une température de 56"C ± 1*C.
2) Utilisation du virus LAV marqué à la fluorescéine pour étudier la population de lymphocytes T4X reconnue par le virus et pour séparer cette population à l'aide d'un trieur de cellules ou de toute autre méthode. Dans le cas d'un marquage du LAV par une enzyme, la séparation de cette population T4X se fait par utilisation d'un immuno- adsorbant.
Le marquage des cellules T4, préalablement frac- tionnées à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques, est
5 effectué en incubant 5.10 de ces cellules avec 25 μl de
LAV-FITC à 2,5 mg/ml pendant 60 minutes à 0 + 4*C. Après trois lavages par du PBS froid, les cellules sont alors observées à l'aide d'un microscope à fluorescence et uti¬ lisées pour le triage.
Le tableau I résume les résultats obtenus. On constate que dans une population de lymphocytes T4 préa¬ lablement fractionnés, seulement 10 % sont reconnus par FITC-LAV. Par contre, moins de 0,5 % d'une population de cellules T8 fractionnées sont marquées par ce virus. De même, on constate que des lymphocytes B et des onocytes ne sont pas ou sont peu reconnus par FITC-LAV, confirmant aussi que ces cellules présentent très peu de récepteurs pour le virus.
Dans les lignées continues (CEM ou Hg ) utilisées pour produire le virus LAV en grandes quantités, on ob¬ serve la présence de 10 à 28 % de cellules possédant le récepteur pour le virus constituant ainsi la population T4X.
A titre d'exemple, les lignées CEM clone 11 et CEM clone 13 ont été déposées à la Collection Nationale des Cultures de Micro-organismes de 1 ' Institut Pasteur de Paris sous les numéros 1-416 et 1-417 respectivement. TABLEAU I
Marcrua e de différentes cellules par du LAV-FITC
Cellules % cellules fluorescentes *
Monocytes 1 B 0,5
CEM 12
CEM clone 11 10, 4
CEM clone 13 11
HQ 28
* Moyenne d'au moins six expériences.
Afin de confirmer la spécificité d'un tel marqua¬ ge, des expériences de blocage par différentes concen¬ trations de virus froid ont été réalisées et les résultats sont résumés au tableau II. Pour ces expériences, des cellules T4 ont été mises en contact avec des concen¬ trations variables de virus purifié froid pendant une heure à O + 4"C, puis lavées et marquées par FITC-LAV dans les conditions préalablement décrites. Les résultats montrent qu'il existe une compétition pour la reconnaissance de la cellule cible entre le virus froid et le virus marqué, indiquant la spécificité de la fixation de FITC-LAV sur le récepteur par le virus à la surface de la cellule.
TABLEAU II Expérience de blocage par du virus froid
Concentration FITC-LAV % cellules T4 du virus LAV (5 mg/ml) fluorescentes froid (mg/ml)
11
0,005 + 10
0,05 + 9,5
0,1 + 8,5
0,5 5,3
1 + 1,8
2,5 + 0,1
5 + 0,1
Enfin, avant d'envisager un triage des deux populations cellulaires, il a été vérifié qu'il était possible d'obtenir les mêmes résultats avec un virus FITC-LAV inactivé par chauffage pendant 30 minutes à 56*C. Les résultats indiqués dans le tableau III montrent que 1 'inactivation de FITC-LAV ne modifie en rien la spécifi¬ cité du marquage. Par ailleurs, il a été également vérifié que les cellules T4X peuvent être infectées par une prépa¬ ration virale virulente non fluorescente dès la première heure après le marquage par FITC-LAV inactivé, ce dernier étant internalisé, suivant un processus d' endocytose, par les cellules T4X. Cette internalisation est accompagnée de là. d :?I-Λ1ition de la fluorescence. g TABLEAU III
Reconnaissance de la cellule cible T4 par FITC-LAV inactivée par la chaleur
% cellules fluorescentes 0 FITC-LAV cellules T4 cellules T8
non chauffé
5 chauffé 30 minutes
56*C 16
3) Séparation des populations T4X et T4Y à l'aide de billes magnétiques. 0 La méthode précédente ne permettant pas d'obtenir une quantité importante de cellules, il a été développé une autre méthode de séparation utilisant des billes magnétiques de latex sur lesquelles une préparation de virus LAV purifié et inactivé par la chaleur a été fixée 5 de manière covalente.
Le contact cellules-billes de latex est réalisé en 7 incubant 10 cellules T4 avec 200 μg de latex, ayant fixé le virus, pendant 15 minutes à 0 + 4*C dans une solution de PBS contenant 5 % de sérum de veau foetal, 1 % d'anti- Q biotiques (mélange pénicilline, streptomycine, néomycine, commercialisé par Gibco) et 0,1 % d'azide de sodium. Puis à l'aide d'un aimant, on sépare les bille sur lesquelles sont fixées les cellules T4X du surnageant contenant la population T Y. 5 Puis en marquant les deux populations cellulaires obtenues, à l'aide de FITC-LAV, il a ainsi été démontré que moins de 0,3 % de la population du surnageant T4Y pouvait être marquée par FITC-LAV et que la population T4X représentait environ 1.0 à 15 % de la population initiale de lymphocytes T4.
Par ailleurs, après infection de la population T4Y par une préparation virale virulente non marquée, il n'a pu être obtenu jusqu'à ce jour une replication du virus LAV, ce qui suggère bien que seule la population T4X est infectable par le virus LAV.
4) Description du procédé de fixation des anticorps mono¬ clonaux sur boîte de Pétri et séparation des cellules T4X. i) Préparation des plaques : les boîtes sont incubées à température ambiante pendant
1 heure avec 6 ml d ' une solution contenant 10 μg/ml d ' an-
-2 ticorps 0KT4 en milieu Tris 510 mol/1 pH 9,5, stérilisé par filtration ;
- on lave 4 fois en tampon PBS stérile ; on ajoute 5 ml par boîte de PBS contenant 1 % de sérum de veau foetal (FCS) et on incube pendant au moins 1 heure à température ambiante. ii) Préparation des cellules :
7 210 lymphocytes T4 (T4) sont centrifugés 10 minutes à
450 g et à 4*C ; le culot est repris dans 2 ml de PBS contenant 5 % FCS,
7 pour obtenir un milieu contenant 10 cellules/ml.
Les cellules sont incubées avec 0,75 g de virus purifié, stérilisé par filtration et inactivé au préalable pendant 30 minutes à 56*C ; l'incubation a lieu à 4*C pendant 10 minutes (cellules et virus doivent être à 4'C au moment du contact) ; les cellules sont ensuite centri¬ fugées 2 fois à 450 g pendant 10 minutes à 4*C, et le cu¬ lot est repris dans 4 ml de PBS 5 % FCS. iii) Séparation des cellules :
6 4 ml de milieu contenant 510 cellules/ml sont répartis dans la boîte ; on incube pendant 40 minutes à 4*C. La boite est remuée doucement, puis on incube encore pendant 30 minutes à 4"C ; le surnageant est ensuite décanté doucement et la boite lavée 4 fois avec du PBS contenant
1 % FCS doucement : les cellules ne s ' étant pas fixées sur les anticorps 0KT4 sont récupérées. Celles-ci forment alors la population de cellules T4X. On peut également ré¬ cupérer les cellules T4Y, par exemple après lavage 4 fois en PBS contenant 1 % de FCS par des jets de seringue. Les cellules fixées sur 1 ' 0KT4 sont décrochées, ces cellules formant alors la population recherchée de lymphocytes T4Y.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Population de cellules portant le phenotype T4 des lymphocytes T4, caractérisée en ce qu'elle est consti¬ tuée essentiellement par des lymphocytes T4 possédant un récepteur du virus LAV, à l'état virulent ou inactivé, ce site étant susceptible d'être masqué par des anticorps anti-T4, cette population étant essentiellement exempte de lymphocytes T4 non infectables par le LAV et ne possédant pas de récepteur pour le virus LAV, à l'état virulent ou inactivé.
2 - Population de cellules selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ces cellules sont constituées par des lymphocytes T4 normaux.
3 - Population selon la revendication 1 caracté¬ risée en ce que les cellules appartiennent à des lignées de cellules permanentes portant le phenotype T4 susdit.
4 - Procédé d'obtention de lymphocytes portant le phenotype T4 infectables par le virus LAV, essentiellement à l'exclusion de cellules portant le même phenotype mais non infectables par le LAV, caractérisé en ce que, partant d'une population de cellules portant ledit phenotype T4 et contenant à la fois des cellules infectables par le LAV (T4X) et des cellules à phenotype T4 non infectables par le LAV (T4Y) , on met en contact cette population avec du virus LAV et l'on sépare les unes des autres les cellules qui ont fixé le virus LAV de celles qui ne l'ont pas fixé.
5 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le virus de préférence inactivé est fixé sur un support insoluble, et en ce que la population initiale de cellules en suspension dans un fluide est amenée au con¬ tact du virus inactivé fixé, et en ce que l'on sépare en¬ suite la phase solide retenant les lymphocytes T4X fixés de la phase fluide contenant les cellules T4Y non fixées et, après une incubation des lymphocytes T4X pendant un temps nécessaire à 1 ' internalisation du virus inactivé, on récupère les lymphocytes T4X.
6 - Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le virus inactivé est à l'état de suspension dans un milieu fluide, en ce que l'on met en contact la population de cellules à séparer avec cette suspension de virus, et en ce que, pour opérer la séparation susdite, on met en contact la population de cellules avec des anti¬ corps anti-T4 eux-mêmes fixés sur un support solide, et on récupère les cellules qui ne sont pas retenues par les anticorps anti-T4 fixés sur le support solide.
7 - Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 à la détermination de la propor¬ tion de lymphocytes T4X au sein d'une population de lym¬ phocytes T4 contenus dans un fluide biologique provenant d'une personne porteuse d'anticorps anti-LAV, en vue du diagnostic des SLA ou du SIDA chez ces personnes, un diag¬ nostic positif étant corrélé à une diminution de la popu¬ lation T4X ou du rapport du nombre des lymphocytes T4X au nombre des lymphocytes T4Y, lesquels se comportent comme s'ils étaient dépourvus de récepteurs pour le virus LAV.
8 - Procédé de diagnostic in vitro des lymphadé¬ nopathies SLA ou du SIDA chez une personne dont le sérum contient des anticorps anti-LAV, ce procédé comprenant la mise en contact d'une population de lymphocytes T4 conte¬ nue dans un fluide biologique provenant de ladite per¬ sonne, avec le virus LAV inactivé, la détection de la proportion des cellules retenant le virus inactivé et la détermination du rapport du nombre des lymphocytes (T4X) ayant fixé le virus au nombre des lymphocytes (T4Y) qui ne l'ont pas fixé, un diagnostic d'évolution de la maladie étant corrélé à une diminution de la proportion de lympho¬ cytes T4X au sein de ladite population de lymphocytes T4 ou à une diminution du rapport T4X/T4Y vis-à-vis de la normale. 9 - Procédé selon la revendication 8, caractéri¬ sé en ce que le virus LAV inactivé est marqué et en ce que la mesure du rapport T4X/T4Y nécessaire au diagnostic in vitro est appréciée par la proportion de marqueur retenue.
10 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur est immunofluorescent et en ce que l'on apprécie la valeur du rapport T4X/T4Y par l'intensité d' immunofluorescence du marqueur au sein de la population de lymphocytes T4X.
11 - Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que le marqueur est immunoenzymatique et en ce que l'on apprécie la valeur du rapport T4X/T4Y par la modifi¬ cation des propriétés d'absorption des radiations d'un substrat lorsque ce dernier est hydrolyse par le marqueur.
12 - Procédé de production de virus LAV caractéri¬ sé par l'infection d'une population de lymphocytes T4X selon la revendication 3, de culture de cette population dans un milieu approprié et récupération du virus LAV pro¬ duit.
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