FR2952649A1 - Applications therapeutiques et diagnostiques contre les trypanosomoses animales africaines - Google Patents

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'identification des séquences nucléotidique et peptidique d'une nouvelle protéine de la poche flagellaire spécifique des parasites trypanosomes africains, et son utilisation pour des applications diagnostiques et thérapeutiques et notamment en tant que vaccin pour l'immunisation des animaux non humains ou encore en tant que cible thérapeutique pour la lutte contre la trypanosomose animale africaine (TAA).

Description

APPLICATIONS THERAPEUTIQUES ET DIAGNOSTICS CONTRE LES TRYPANOSOMOSES ANIMALES AFRICAINES
La présente invention se rapporte à l'identification des séquences nucléotidique et peptidique d'une nouvelle protéine de la poche flagellaire spécifique des parasites trypanosomes africains, et son utilisation pour des applications diagnostiques et thérapeutiques et notamment en tant que vaccin pour l'immunisation des animaux non humains ou encore en tant que cible thérapeutique pour la lutte contre la trypanosomose animale africaine (TAA).
La TAA est une des maladies les plus importantes en Afrique quant à ses conséquences économiques. Elle est causée par plusieurs espèces de protozoaires parasites du genre Trypanosoma. Ces parasites sont transmis par un insecte vecteur du genre Glossina ou mouches tsé-tsé. La maladie qui est aussi appelée Nagana, concerne des espèces variées de mammifères mais est d'un point du vue économique particulièrement importante chez le bétail. Les espèces les plus virulentes sont Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax et dans une moindre mesure Trypanosoma brucei. Elle est endémique dans les zones infestées de mouches tsé-tsé dont la répartition s'étend sur plus de 10 millions de km2. Ce sont ainsi 37 pays au sud du Sahara qui sont affectés ce qui représente les régions les plus productives en élevage de bovins dont le Mozambique, la Namibie, le Zimbabwe et l'Afrique du Sud où une récente épidémie a entraîné dans le Zululand une prévalence d'infection supérieure à 15% chez le bétail. La TAA est caractérisée par de la fièvre, une forte anémie et une perte de poids ce qui entraîne une forte dégradation de l'état général de l'animal qui est alors très amaigri et n'a plus aucune valeur économique, sa productivité (lait, viande, force de traction) étant fortement compromise. On estime qu'en Afrique 50 millions de bovins et 70 millions de petits ruminants sont exposés, coûtant au continent entre 1,3 et 5 milliards de dollars par an. Cette maladie demeure donc un obstacle majeur au développement de ces pays. Le genre Trypanosoma comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas. Seul le sous-genre Trypanozoon comporte, outre des espèces infectantes pour les animaux, deux espèces infectantes pour l'homme chez qui elles provoquent la maladie du sommeil. Les autres sous-genres comprennent des espèces qui infectent les animaux sauvages et domestiques et ne sont jamais infectantes pour l'homme mais peuvent avoir des répercussions indirectes importantes pour sa santé. Le sous genre Trypanozoon est constitué de trypanosomes polymorphes (forme longue et forme courte ou trapue), avec flagelle libre facultatif et kinétoplaste petit et en position subterminale (postérieur). Les espèces de ce sous-genre sont Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi et T. equiperdum. T. brucei comprend trois sous-espèces : T. b. brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodesiense, qui sont très proches sur les plans morphologique, antigénique et biochimique, qui se distinguent par leurs caractères infectieux, leur pathogénicité et leur distribution géographique. T. brucei et ses sous-espèces sont transmis par les glossines. T. evansi est transmis au bétail, aux chevaux et aux chameaux par des mouches piqueuses autres que les glossines (Tabanidae) en Afrique, en Amérique du Sud et dans le Sud Est Asiatique. T. equiperdum n'a pas d'hôte invertébré (transmission sexuelle chez les chevaux). Ces deux dernières espèces débordent largement des régions à glossines et sont cosmopolites. Leur morphologie est semblable à celle de T. brucei mais elles sont monomorphes (formes longues uniquement). Les trypanosomes appartenant au sous-genre Duttonella ont une forme de massue ou de gourdin, avec l'extrémité postérieure arrondie et large, le corps se rétrécissant vers l'extrémité antérieure. Le kinétoplaste est volumineux, arrondi et en position terminale; la membrane ondulante peu développée, étroite, se termine en flagelle libre. T. vivax et T. uniforme, espèces parasites des ruminants sauvages et domestiques. Ils peuvent être transmis par voie mécanique ou par les glossines, dont ils colonisent exclusivement la trompe et le proventricule. Les trypanosomes du sous-genre Nannomonas sont de petite taille (8 à 24 µm), ils n'ont de flagelle libre à aucun stade de leur développement. Le kinétoplaste de taille moyenne se trouve en position subterminale ou marginale. L'extrémité postérieure est arrondie et la membrane ondulante étroite. La pathogénicité est importante pour le bétail, le porc et le chien en Afrique. Le développement chez la glossine prend place dans l'estomac et le proboscis exclusivement. Les principales espèces sont T. congolense et T. simiae. Ces trypanosomes sont de petite taille, avec extrémité postérieure arrondie, kinétoplaste en position marginale, membrane ondulante étroite. Ils n'ont pas de flagelle libre. Les ruminants domestiques en Afrique sont essentiellement infectés par trois espèces de trypanosomes pathogènes, T. congolense, T. vivax, ou T. brucei qui sont responsables d'une pathologie dénommée Nagana. D'autres animaux sont infectés par une autre espèce de trypanosome pathogène, T. evansi, qui est responsable d'une pathologie dénommée Surra. Les trypanosomes sont caractérisés par une grande diversité génétique, qui concerne l'infectivité, la virulence, la pathogénicité, la transmissibilité, et la sensibilité aux produits trypanocides. T. congolense est l'agent principal de la trypanosomose bovine en Afrique, par sa fréquence et sa pathogénicité. Il s'adapte également à diverses espèces animales non humaines, et peut ainsi parasiter indifféremment les bovidés, les porcins, les ovins, les caprins, les équidés et les canidés.
T. brucei et notamment la sous-espèce Trypanosoma brucei gambiense est probablement la plus connue puisqu'elle est responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil chez l'homme en Afrique occidentale et centrale. La sous-espèce Trypanosoma brucei brucei est un parasite des animaux domestiques et sauvages dans toute l'Afrique, mais elle n'est pas infectieuse pour l'homme en raison de l'effet lytique sur les formes sanguines de ces trypanosomes, de la protéine Apolipoprotéine L présente dans le sérum humain. La troisième sous-espèce est Trypanosoma brucei rhodesiense qui est l'agent de la maladie du sommeil dans sa forme aigüe en Afrique. Egalement, la sous-espèce T. evansi est transmise aux bovidés, chevaux et dromadaires, et a des répercussions économiques importantes en Afrique notamment pour les élevages des bovins et des buffles. Enfin, T. vivax est un parasite essentiellement des ongulés en Afrique tropicale et la transmission est assurée par les taons ou les tabanidés. Les trypanosomes présentent un cycle de vie complexe qui inclut différentes formes morphologiques. Ils présentent en général un corps fusiforme. Ils possèdent un flagelle qui est relié au corps par une membrane ondulante. Ils se reproduisent de manière asexuée par fission binaire. Lors de l'infection, la glossine (glossina sp.) ou mouche tsé-tsé injecte dans le derme de l'hôte à l'endroit de la piqure, les formes métacycliques infectieuses présentes dans les pièces buccales. Les parasites se multiplient dans le derme au point de l'inoculation. Une réaction locale liée à la multiplication des parasites dans le derme se produit, et les parasites donnent naissance aux formes sanguines. Ce stade peut durer de 1 à 3 semaines par exemple dans le cas de T. congolense. Ensuite, les parasites envahissent le sang, le système lymphatique, notamment les ganglions lymphatiques, ainsi que les différents organes, tels le foie, la rate, le coeur, les reins, et les testicules, qui montrent alors d'importantes lésions. La glossine s'infecte et se nourrit sur les animaux parasités, et donc une fois infectée, elle reste infectieuse durant toute sa vie. Dans le cas de T. brucei et T. congolense, le trypanosome subit chez l'insecte un cycle complexe impliquant une dédifférenciation dans l'intestin en formes procycliques non-infectieuses. Dans les glandes salivaires, ou les pièces buccales, les trypanosomes se transforment en formes epimastigotes, adhérentes, qui se multiplient activement. Leur différenciation conduit au stade infectieux représenté par les formes métacycliques, qui ne se divisent plus. Le cycle de T. vivax ne comporte pas de stade procyclique. Il débute par l'attachement flagellaire des formes sanguines ingérées par la glossine. Elles se différencient en formes epimastigotes, qui prolifèrent puis se différencient en formes métacycliques infectieuses. La durée totale du cycle chez la glossine est d'environ 5 à 10 jours pour T. vivax, 18 jours pour T. congolense, et 30 jours pour T. brucei.
Les sources d'infection des animaux domestiques sont les autres animaux domestiques ou les animaux sauvages malades ou porteurs sains. L'existence de réservoir provient du fait que certaines espèces sont peu réceptives à l'infection, et peu sensibles à la maladie. Les vecteurs potentiels varient en fonction de l'espèce de trypanosome considérée.
T. congolense et T. brucei sont exclusivement transmis par des vecteurs biologiques comme les mouches tsé-tsé, mais T. vivax peut être également transmis par des vecteurs mécaniques tels que les mouches piqueuses (tabanidés ou stomoxes). T. evansi est exclusivement transmis par des vecteurs mécaniques. L'efficacité de la transmission dépend du taux d'infection des glossines et des interactions hôte-vecteurs. De façon générale, les trypanosomes infectieux pour l'animal donnent des taux d'infection plus élevés que les trypanosomes infectant l'homme, ce qui contribue à la très large distribution de la trypanosomose animale. L'analyse des trypanosomes par microscopie électronique montre l'existence d'un manteau d'environ 15 nm recouvrant la totalité du corps cellulaire du parasite. Ce manteau est présent uniquement à la surface des formes sanguines et métacycliques. Il est essentiellement constitué d'une glycoprotéine appelée VSG (Antigène Variable de Surface) et d'autres protéines membranaires en faibles quantités. Les VSGs forment ainsi une structure très dense constituant une barrière physique entre la membrane plasmique et l'hôte. La structure 3D prédit que seule une faible partie de la protéine est exposée à la surface du parasite. Ainsi le principal rôle du manteau serait de masquer les antigènes membranaires non variables du parasite en présentant quelques motifs immunodominants aux défenses immunitaires de l'hôte. Le manteau protège par ailleurs les formes sanguines contre la lyse par activation de la voie alterne du complément. A l'heure actuelle, le contrôle de la maladie repose essentiellement sur le contrôle des vecteurs par l'utilisation d'insecticides dont l'impact environnemental est loin d'être négligeable. Au niveau de l'infection, le contrôle de la trypanosomose repose exclusivement sur l'utilisation de médicaments, car ces parasites échappent aux défenses immunitaires de l'hôte en exprimant à leur surface des antigènes variables. Ce phénomène de variation antigénique a donc pour l'instant ruiné tous les efforts de développement d'un nouveau vaccin anti-parasite. Seules quelques molécules à effet limité dirigées contre l'agent pathogène, le trypanosome, et appelées trypanocides sont disponibles. Ces traitements par chimiothérapie présentent de nombreuses limites. En effet, le traitement de la TAA fait appel à quelques produits trypanocides découverts pour la plupart il y a plusieurs décennies. Ces produits ont tous des effets secondaires importants et de nombreuses souches de parasites résistants ou multirésistants sont apparues.
Concernant le diagnostic, des techniques rapides, fiables, peu coûteuses et utilisables sur le terrain manquent également. Différentes techniques sont actuellement utilisées mais présentent également de nombreuses limitations. Le diagnostic clinique qui se limite généralement à une suspicion repose sur l'observation de symptômes qui sont généralement peu spécifiques. En effet des infections avec d'autres parasites pouvant provoquer certains symptômes comparables sont fréquentes dans ces régions. La mise en évidence, directe ou après enrichissement, des trypanosomes dans le sang, suc ganglionnaire et autres est réalisée par examen microscopique de préparation (état frais ou coloration au Giemsa), elle permet de confirmer une trypanosomose mais est peu sensible.
Les techniques moléculaires telles que la PCR sont onéreuses et demandent trop d'investissement notamment dans le cadre d'études épidémiologiques. Les techniques sérologiques sont basées sur des lysats totaux, sont difficilement standardisables sont sensibles mais peu spécifiques. La recherche d'antigènes spécifiques par des méthodes de type ELISA n'a pas pour l'instant abouti.
Dans ce contexte, la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques permettant le développement d'un vaccin « anti-pathologie » destiné à réduire les effets néfastes que la parasitémie a sur l'animal ou de nouvelles molécules trypanocides est une priorité.
Résumé de l'invention Le Demandeur a identifié et obtenu un nouveau matériel génétique codant pour une protéine dénommée FLP80 localisée au niveau de la poche flagellaire et du compartiment d'endocytose précoce des formes sanguines des Trypanosomes, tels que T. congolense. Le principal domaine d'application envisagé est la lutte contre la trypanosomose animale en Afrique. En effet, la nouvelle protéine FLP80 est utile pour la vaccination et dans la lutte voir l'éradication des trypanosomes africains, permettant ainsi à terme l'exploitation du bétail et le développement des pays se trouvant en zone endémique. Selon l'invention, les séquences nucléotidiques et peptidiques nouvellement caractérisées sont utilisées pour la production de tests de diagnostic, pour la préparation de compositions vaccinales et pharmaceutiques. Les séquences selon la présente invention sont également utiles comme sondes pour la détection des infections par des trypanosomes africains. La protéine et tout fragment polypeptide antigénique de cette protéine sont par ailleurs utiles pour la production d'anticorps spécifiques des parasites, à des fins de diagnostic ou d'immunisation passive. Enfin, la protéine FLP80 constitue une cible thérapeutique de choix pour le développement d'agents trypanocides ou d'inhibiteurs compétitifs.35 Brève description des Figures Figure 1 : représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de la poche flagellaire FLP80 ; Figure 2: représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de la poche flagellaire FLP80 ; Figure 3 : représente une analyse par Western blot de l'expression de FLP80 au cours du cycle parasitaire dans les formes procycliques (PCF), épimastigotes (EMF), et les formes sanguines (BSF) par rapport l'expression de la tubuline (TUB) au cours des trois stades parasitaires.
Description détaillée de l'invention La présente invention a pour objet une molécule d'ADN ou d'ARN, codant pour de nouvelle protéine de la poche flagellaire, dénommée FLP80, spécifique des trypanosomes africains. Cette nouvelle molécule d'ADN ou d'ARN comprend au moins une séquence nucléotidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID NO :1, une séquence complémentaire, une séquence anti-sens, ou une séquence équivalente à la séquence SEQ ID No: 1, et notamment une séquence comprenant une identité d'au moins 80%, 85%, 90% ou 95% avec la séquence SEQ ID NO: 1, ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hydrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes d'hybridation.
On entend par conditions stringentes d'hybridation, une hybridation à une température de 65°C pendant une nuit dans une solution contenant 0,1% de SDS, 0,7% de lait en poudre écrémé et 6X de SSC, suivie de lavages à température ambiante dans du 2X SSC - 0,1% SDS et à 65°C dans du 0,2X SSC - 0,1% SDS. L'invention concerne également des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à la séquence SEQ ID NO : 1, et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN, pour une séquence d'environ 30 à 100 nucléotides contigus, ou environ 30 à 50, et de préférence au moins 30 nucléotides contigus, ayant au moins 50%, au moins 60%, au moins 70%, ou encore au moins 80% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO :1, ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hydrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes d'hybridation. Par séquence nucléotidique, on entend au moins un brin d'ADN ou son brin complémentaire, soit un brin d'ARN ou son brin anti-sens ou l'ADN complémentaire correspondant. La séquence d'ADN selon SEQ ID NO: 1 correspond à la séquence de l'ARN 6 messager, étant entendu que la thymine (T) dans l'ADN est remplacé par l'uracile (U) dans l'ARN Selon l'invention, deux séquences nucléotidiques sont dites équivalentes l'une par rapport à l'autre, du fait de la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de l'espèce à partir de laquelle elles ont été identifiées, ou induite, ainsi que des séquences homologues, l'homologie étant définie ci-après. Par variabilité, on entend toute modification, spontanée ou induite d'une séquence, notamment par substitution, et/ou insertion, et/ou délétion de nucléotides et/ou de fragments nucléotidiques, et/ou extension et/ou raccourcissement de la séquence à l'une au moins des extrémités, ou bien une variabilité non naturelle pouvant résulter des techniques de génie génétique utilisées. Cette variabilité peut se traduire par des modifications de toute séquence dis départ, considérée comme référence, et pouvant être exprimées par un degré d'homologie par rapport à ladite séquence de référence. L'homologie caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques (ou peptidiques) comparés; elle se mesure par le pourcentage d'identité qui est notamment déterminé comparaison directe de séquences nucléotidiques (ou peptidiques), par rapport à des séquences nucléotidiques (ou peptidiques) de référence. L'invention a également pour objet une protéine, dénommée FLP80, présentant une masse moléculaire apparente d'environ 45 kDa, ainsi que les fragments peptidiques antigéniques ou un équivalent immunologique de ladite protéine. La protéine FLP80 est spécifique du parasite Trypanosoma congolense. Elle a été identifiée dans un extrait de protéines membranaires des formes sanguines du parasite par une analyse de spectrométrie de masse. La séquence de la protéine flagellaire FLP80 comprend 411 acides aminés, et est représentée dans la séquences SEQ ID No: 2. L'analyse de la séquence montre la présence d'un peptide signal et d'un domaine transmembranaire en positions 354 à 379. La séquence est riche en cystéines mais aucun motif particulier n'est présent. Par ailleurs, le Demandeur a montré que la protéine FLP80 est exprimée de façon différentielle au cours du cycle du trypanosome. En effet, comme cela est montré dans la partie expérimentale, à l'Exemple 2 ci-dessous, la protéine FLP80 n'est pas détectée dans les formes procycliques (PCF), mais elle est détectée dans les formes épimastigotes (EMF) à un poids moléculaire d'environ 65kDa et dans les formes sanguines (BSF) à un poids moléculaire de 75kDa. Un traitement à l'aide de déglycosidases a permis de montrer que la différence de taille entre le poids moléculaire observé en western-blot et le poids moléculaire théorique est due à une forte glycosylation de la protéine. De plus, FLP80 est particulièrement abondante dans les formes sanguines. Plus précisément, FLP80 est présente en 2,7.105 exemplaires par cellule. Son immunolocalisation dans les formes sanguines montre que la protéine se trouve au niveau de la poche flagellaire et du compartiment d'endocytose (Exemple 3). Cette protéine est exprimée dans les formes sanguines du parasite, elle est donc présente tout au long de l'infection, ce qui représente un avantage par rapport aux candidats vaccinaux ou diagnostics développés jusqu'à présent qui ont été mis en évidence uniquement dans les formes parasitaires se trouvant dans l'insecte. En effet, il n'est pas sûr que de tels candidats soient exprimés au cours de l'infection, alors que la présence du candidat dans le sang de l'hôte mammifère infecté est un préalable nécessaire à son utilisation notamment pour l'établissement d'un test diagnostic.
Par équivalent immunologique, on entend tout polypeptide ou peptide susceptible d'être immunologiquement reconnus par les anticorps dirigés contre la protéine FLP80. L'invention concerne par ailleurs tout fragment de la protéine FLP80, et plus particulièrement tout fragment peptidique antigénique spécifiquement reconnu par des antisera anti-trypanosomes africains. La protéine et lesdits fragments protéiques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité. Les peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique, lyse de la protéine FLP80, ou par des techniques de recombinaison génétique. Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet une nouvelle stratégie antiparasitaire, selon laquelle la protéine FLP80 est utilisée en tant que cible thérapeutique.
Plus précisément, cette nouvelle stratégie antiparasitaire consiste à utiliser la nouvelle protéine flagellaire FLP80 en tant que cible thérapeutique pour l'internalisation d'un agent trypanocide ou pour inhiber la croissance ou la multiplication des parasites infectieux. La protéine FLP80 étant très abondante dans la membrane de la poche flagellaire, elle constitue en effet une cible thérapeutique de choix pour l'internalisation de molécule trypanocide dans les parasites. La poche flagellaire est le seul lieu d'échange entre le parasite et le milieu extérieur et n'est pas contrairement au reste du corps cellulaire recouvert du manteau dense et impénétrable d'antigènes variables de surface (VSG). Très peu de protéines flagellaires ont jusqu'à présent été décrites chez les trypanosomatides et les seules connues sont présentes en un faible nombre d'exemplaires par cellule. Cette protéine membranaire qui vu son abondance recouvre vraisemblablement une grande surface de la poche flagellaire et semble indispensable à la survie du parasite dans l'hôte mammifère infecté. Par conséquent, par rapport aux cibles thérapeutiques jusqu'à présent envisagées, la protéine FLP80 présente de nombreux avantages en termes d'abondance, de localisation, de fonction et spécificité, qui permettent d'envisager une stratégie visant à bloquer la fonction de cette protéine. Selon cet aspect de la présente invention, il a été notamment découvert que la protéine membranaire FLP80 correspondait vraisemblablement à un transporteur actif de lipoprotéines HDL ou LDL. Plus précisément, le substrat de la FLP80 a été identifié par chromatographie d'affinité avec des protéines sériques de souris comme étant très probablement une apolipoprotéine, telle que notamment l'apolipoprotéine Al ou E.
Par conséquent, la présente invention a pour objet une apoliprotéine Al ou E, et notamment un complexe thérapeutique, comprenant une apoliprotéine Al ou E complexée de manière fonctionnelle à une molécule toxique, et susceptible de se lier à la protéine membranaire FLP80. Le couplage du substrat apoliprotéine de la FLP80 avec une molécule thérapeutique toxique permet d'internaliser, et ainsi de concentrer fortement de telles molécules toxiques dans le parasite, via l'interface privilégiée que constitue la poche flagellaire. De plus, l'utilisation selon l'invention de la protéine FLP80 en tant que transporteur de molécules toxiques représente un avantage par rapport à une stratégie vaccinale classique de longue haleine. La concentration des molécules toxiques au niveau de l'agent infectieux visé étant toujours un problème majeur dans un traitement, sa présence en grand nombre au niveau de la zone d'échange privilégiée que constitue la poche flagellaire du parasite pourrait permettre de concentrer très fortement une molécule toxique et ainsi d'augmenter les chances de réussite du traitement, de limiter les risques de toxicité pour l' l'hôte et de réduire les coûts du traitement.
Parmi les composés possédant une activité trypanocide susceptibles d'être couplés au substrat apolipoprotéine et internalisés dans les parasites via la protéine FLP80, on peut citer les agents trypanocides tels que par exemple, la pentamidine ou mésilate de pentamidine, la suramine, des dérivés arsenicaux tels que le mélarsoprol, l'éflornithine ou DMFO, l'arsobal, le MelBdm, et le nifurtimox.
Les molécules toxiques sont couplées de manière fonctionnelle au ligand apolipoprotéine de sorte à permettre (1) la fixation du complexe à la protéine FLP80 avec une affinité du même ordre que le ligand apolipoprotéine non couplé, et (2) l'internalisation et la concentration du complexe trypanocide dans le parasite trypanosome. Comme équivalent fonctionnel du complexe apoliprotéine-molécule toxique, on utilise toute molécule ayant une affinité de liaison pour la protéine membranaire FLP80 similaire au substrat apolipoprotéine. On peut par exemple citer un anticorps tel que décrit ci-dessous dirigé spécifiquement contre la protéine FLP80, lié à une molécule toxique trypanocide et susceptible de provoquer après fixation sur la FLP80, l'internalisation de la molécule toxique dans le trypanosome.
Par conséquent, selon la présente invention, le complexe apolipoprotéine-molécule toxique ou un équivalent fonctionnel est utilisé en tant que composition vétérinaire contre les trypanosomoses africaines. De telles compositions vétérinaires trypanocides comprennent le substrat apoliprotéine couplé de manière fonctionnelle à un agent trypanocide tel que décrit ci-dessus en quantité thérapeutique suffisante pour traiter et/ou prévenir les trypanosomoses animales africaines. Egalement, les méthodes de traitement des trypanosomoses comprennent l'obtention d'un complexe substrat apolipoprotéine ou équivalent, le couplage du substrat à un agent toxique ou trypanocide, et l'administration du complexe trypanocide ainsi obtenu à un animal non humain ayant été ou susceptible d'avoir été infecté par des trypanosomes africains. Les méthodes de détermination de la fixation du substrat apolipoprotéine ou équivalent, et/ou d'un complexe trypanocide selon l'invention sur les protéines membranaires telles que la FLP80 sont bien connues de l'homme du métier, et peuvent se faire par exemple par des expériences d'inhibition compétitive entre le ligand apolipoprotéine Al ou E, et le complexe trypanocide ou par la technologie BlAcore permettant ainsi d'étudier la fixation en temps réel sans marquage du substrat ou de la protéine FLP80. Cette technique est basée sur le principe d'un biocapteur basé sur l'utilisation de la résonance plasmonique de surface qui détecte des variations de masse à la surface d'une « sensor chip » sur laquelle le ligand apolipoprotéine ou le complexe est immobilisé de façon covalente ou non, et la protéine FLP80 est injectée par un système microfluidique dans un flux continu de tampon à la surface de la sensor chip. Le suivi en temps réel permet de déterminer les constantes cinétiques d'association et de dissociation, et d'en déduire la valeur de la constante d'affinité. Egalement, les mesures de l'internalisation des complexes trypanocides peuvent être conduites sur des lignées cellulaires exprimant la protéine FLP80 recombinante, et traitées avec le complexe trypanocide comprenant un substrat apolipoprotéine marquée radioactive couplée de manière fonctionnelle à un agent toxique, et la mesure de la radioactivité associée aux cellules. Alternativement, la présente invention a pour objet des inhibiteurs compétitifs de la liaison du substrat naturel à la protéine FLP80. De tels inhibiteurs compétitifs sont par exemple une apolipoprotéine Al ou E tronquée, c'est-à-dire comprenant entre 10 à 80% de la taille des apoliprotéines Al et E naturelles. Des anticorps spécifiques du site de liaison sur la FLP80 peuvent également constituer des inhibiteurs compétitifs de la liaison du substrat naturel sur la FLP80, et ainsi inhiber la croissance et détruire les trypanosomes infectieux. La présente invention a en outre pour objet un procédé de criblage des complexes trypanocides susceptibles d'être internalisés via la protéine FLP80 dans les trypanosomes infectieux et ainsi susceptibles de détruire les trypanosomes infectieux. Alternativement, la présente invention a pour objet un procédé de criblage d'agents inhibiteurs de la protéine 2952649 n FLP80, susceptibles d'inhiber le cycle infectieux des trypanosomes, leur croissance ou leur multiplication dans l'hôte animal non humain infecté. Les procédés selon l'invention comportent une étape d'évaluation de la capacité desdites molécules ou agents à être internalisés et à se concentrer dans les parasites afin d'induire leur destruction, et/ou à 5 inhiber l'activité ou la fonction de la protéine FLP80, et/ou à arrêter les cycles infectieux des parasites, et/ou induire une réduction de leur multiplication ou de leur croissance. Le procédé de criblage selon l'invention comporte donc un test d'inhibition de la croissance/multiplication des trypanosomes africains. Les agents trypanocides criblés par le procédé tel que défini ci-dessus sont caractérisés par leur capacité à inhiber ou à moduler la 10 croissance ou la multiplication des trypanosomes africains infectieux. Par conséquent, les compositions vétérinaires comprenant des agents trypanocides ou des molécules inhibitrices de la protéine FLP80 en tant que thérapies pour la lutte contre les trypanosomoses africaines, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prophylaxie, ainsi que les méthodes de traitement et/ou de 15 prévention des trypanosomes africaines comprenant l'administration de tels agents trypanocides, molécules inhibitrices ou compositions vétérinaires font également partie intégrante de l'invention. Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une cassette d'expression fonctionnelle, notamment dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou 20 eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour la totalité ou un fragment de la protéine FLP80. En particulier, un fragment d'ADN tel que défini précédemment est placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Ladite protéine ou fragments protéiques ainsi exprimés sont reconnus par des antisera anti-trypanosoma africains. D'une façon générale, toute cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote 25 peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. De telles cellules sont connues de l'homme de l'art. A titre d'exemples, on peut citer les cellules issues d'un organisme eucaryote, telles que les cellules issues d'un mammifère, notamment les cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian); les cellules d'insectes; les cellules issues d'un champignon, notamment unicellulaire ou d'une levure, notamment de la souche Pichia, Saccharomyces, 30 Schizosaccharomyces et tout particulièrement sélectionnée dans le groupe constitué de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, et Schizosaccharomyces octosporus. De même, parmi les cellules issues d'un organisme procaryote, on peut avoir recours, sans que cela constitue une limitation, aux cellules d'une souche Escherichia coli (E coli) ou à des 35 cellules d'entérobactéries. La cellule peut être de type sauvage ou mutant. Les mutations sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier. De préférence, on utilise une cellule E. coli, telle que par exemple BL21 (DE3). La cassette d'expression de l'invention est destinée à la production de la protéine FLP80 ou des fragments de cette protéine par exemple dans E. coli, qui sont reconnus par des antisera anti-trypanosomes africains. De tels antisera proviennent d'animaux ayant contracté une infection récente ou ancienne par les espèces de trypanosomes, tels que T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax, contiennent des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement la protéine FLP80. Egalement, de la protéine FLP80 peut être reconnue par d'autres anticorps, comme par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par immunisation d'espèces variées avec la protéine précitée naturelle, la protéine recombinante, leurs fragments ou peptides. Par protéine flagellaire FLP80, on entend l'antigène membranaire des Trypanosomes africains naturels, appartenant aux espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax, produit notamment par les techniques de recombinaison génétique décrites dans la présente demande, ou tout fragment ou mutant de cet antigène à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec des anticorps dirigés contre de la protéine FLP80 de ces parasites. De manière avantageuse, lesdites protéines possèdent une séquence en acides aminés présentant un degré d'homologie d'au moins 70 %, d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85 %, ou 90% et, de manière tout à fait préférée, d'au moins 95 % par rapport à la séquence SEQ ID No :2. En pratique, un tel équivalent peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou recombinante. Il est à la portée de l'homme de l'art d'effectuer par des techniques connues ces modifications sans affecter la reconnaissance immunologique.
Dans le cadre de la présente invention, la protéine FLP80 peut être modifiée in vitro, notamment par délétion ou addition de groupements chimiques, tels que des phosphates, sucres ou acides myristiques, de manière à améliorer sa stabilité ou la présentation d'un ou de plusieurs épitopes. La cassette d'expression selon l'invention permet la production de la protéine FLP80, ayant la séquence en acides aminés telle que spécifiée précédemment, et de fragments desdites protéines, peuvent être avantageusement fusionnées à un élément exogène pouvant aider à sa stabilité, sa purification, sa production ou sa reconnaissance. Le choix d'un tel élément exogène est à la portée de l'homme de l'art. Il peut notamment s'agir d'un haptène, ou d'un peptide exogène.
La cassette d'expression selon l'invention comprend les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule considérée. Par "éléments nécessaires à l'expression", on entend l'ensemble des éléments qui permettent la transcription du fragment d'ADN en ARN messager (ARNm), tels que des séquences promotrice (par exemple le promoteur CMV) et terminatrice de la transcription, ainsi que des éléments permettant la traduction de ce dernier en protéine.
La présente invention s'étend par ailleurs aux vecteurs comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Il peut également s'agir d'un vecteur plasmidique à réplication autonome et en particulier d'un vecteur multiplicateur. Il peut s'agir d'un vecteur viral et notamment d'un vecteur dérivé d'un baculovirus, plus particulièrement destiné à l'expression dans les cellules d'insectes, ou un vecteur dérivé d'un adénovirus pour l'expression dans les cellules de mammifères. La présente invention concerne également une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant une cassette d'expression, soit sous forme intégrée dans le génome cellulaire, soit insérée dans un vecteur. La présente invention a en outre pour objet un procédé de préparation de la protéine FLP80, ou de fragments de ladite protéine, selon lequel: (i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant la cassette d'expression selon l'invention; et (ii) on récupère la protéine exprimée issue de l'organisme précité. Selon un quatrième aspect, l'invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain à un agent immunogène constitué par de la protéine FLP80 naturelle ou recombinante, et de fragments peptidiques, tels que définis précédemment. Les techniques de production des anticorps sont bien connus de l'homme du métier. A titre d'exemples, les anticorps polyclonaux selon la présente invention peuvent être générés en injectant la protéine FLP80 ou un fragment peptidique antigénique à des lapins ou des souris afin de les immuniser. Les sérums polyclonaux de lapin ou de souris ainsi obtenus sont testés quant à leur réactivité par ELISA indirect. Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet une composition immunothérapeutique active, notamment une préparation vaccinale, qui comprend la protéine FLP80 naturelle, recombinante, un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de la protéine, tels que définis ci-dessus, et éventuellement un excipient et/ou un adjuvant approprié. Les compositions vaccinales ou vétérinaires selon l'invention sont destinées au traitement et/ou la prévention d'une infection par les trypanosomes africains chez un animal non humain, particulièrement contre les infections par les espèces T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax.
Les trypanosomoses africaines se traduisent chez l'animal par des syndromes de gravité variable, allant de l'infection aigüe mortelle en 3 à 4 semaines, jusqu'à l'infection chronique durant des mois voire des années. L'évolution chronique, caractérisée par des parasitémies intermittentes, est la plus fréquente chez les bovins africains. La maladie débute par une phase d'hyperthermie, puis deux à trois semaines après la piqûre infectante, le nombre de globules rouges, le taux d'hémoglobine et l'hématocrite chutent, reflétant l'anémie, qui est le symptôme majeur des trypanosomoses animales. Les animaux chroniquement infectés ont une consommation alimentaire réduite, ils deviennent cachectique, leur croissance est freinée, et des effets négatifs sur la reproduction sont observés. L'anémie des trypanosomoses animales s'établit selon deux phases. Au cours de la phase initiale, l'anémie s'accompagne de la parasitémie et résulte essentiellement d'une hémolyse extra-vasculaire : les globules rouges sont détruits par le système phagocytaire dans la rate, le foie, dans la circulation et la moelle osseuse. A terme, l'anémie se traduit par un dysfonctionnement de la moelle osseuse. Lesdites compositions vaccinales vétérinaires peuvent se présenter sous la forme de vaccin antigénique et comprennent alors une quantité thérapeutiquement efficace de la protéine FLP80 naturelle, recombinante ou des fragments peptidiques de celle-ci, tels que précédemment décrits.
Alternativement, les compositions vaccinales peuvent comprendre une quantité thérapeutique efficace d'un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit ci-dessus. Enfin, les compositions vaccinales peuvent se présenter sous la forme de vaccins ADN et peuvent alors comprendre une cassette d'expression, un vecteur, une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote tels que définis précédemment, susceptible d'exprimer la protéine FLP80, ou les fragments peptidiques antigéniques, ou encore une combinaison de ceux-ci. Les compositions vaccinales selon la présente invention sont particulièrement utiles pour traiter et/ou prévenir les pathogénies induites par les trypanosomoses africaines, telles que notamment les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression des animaux non humains. Selon un sixième aspect, la présente invention a pour objet des sondes ou des amorces spécifiques des Trypanosomes africains, et leurs utilisations dans des tests de diagnostic. Le terme sonde tel qu'utilisé dans la présente invention fait référence à l'ADN ou l'ARN comportant au moins une séquence nucléotidique permettant l'hybridation aux acides nucléiques ayant au moins une séquence nucléotidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID No: 1, une séquence complémentaire, une séquence anti-sens, ou une séquence équivalente à ladite séquence, et notamment une séquence présentant, 5 à 100 nucléotides contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, au moins 70% ou au moins 85 % d'homologie avec la séquence SEQ ID No :1, ou à un oligonucléotide de synthèse permettant une telle hybridation, non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée. De même, ces sondes peuvent être modifiées au niveau du sucre, à savoir le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide ou au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, dialkyle et arylphosphonate et de phosphorothioate. Les sondes peuvent être beaucoup plus courtes que la séquence identifiée dans la séquence SEQ ID No: 1. En pratique, de telles sondes comprennent au moins 5 nucléotides, avantageusement entre 5 et 50 nucléotides, de préférence aux alentours de 20 nucléotides, et possèdent une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec l'ADN ou l'ARN ayant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment. Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées à des fins de diagnostic, comme sonde de capture et/ou de détection. Les amorces selon l'invention comprennent une séquence de 5 à 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID No : 1, et possèdent une spécificité d'hybridation dans des conditions prédéterminées, pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé d'élongation tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue.
Selon un septième aspect, l'invention comprend un réactif pour la détection et/ou la surveillance ainsi qu'un procédé et des kits pour le diagnostic d'infections par les trypanosames africains, notamment par T. congolense, T. brucei, T. evansi et/ou T. vivax. Les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment. Alternativement, les réactifs pour la détection ou kit de diagnostic des trypanosomes comprennent une sonde et/ou une amorce pour détecter et/ou identifier les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, en particulier une sonde de capture et/ou une sonde de détection, l'une et/ou l'autre répondant à la définition donnée ci-dessus. Selon un mode de réalisation préférentiel, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé d'immunodétection et d'immunolocalisation de la protéine FLP80 au cours du cycle parasitaire.
Le réactif utilisé pour l'immunodétection ou l'immunolocalisation peuvent être fixés directement ou indirectement sur un support solide approprié. Le support solide peut être notamment sous la forme d'un cône, d'un tube, d'un puits, de bille, ou analogues. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un réactif pour une utilisation dans les tests de diagnostic. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés chimiquement ou non peuvent être utilisés comme supports solides, notamment des polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose; des polymères tels que chlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou copolymères tels que polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymères de chlorure de vinyle et acétate de vinyle, des copolymères à base de styrène, des fibres naturelles telles que le coton et les fibres synthétiques telles que le nylon. La fixation du réactif sur le support solide peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, deux approches sont possibles: soit par adsorption du réactif sur le support solide, c'est à dire par des liaisons non covalentes (principalement de type hydrogène, Van der Walls ou ionique), soit par établissement de liaisons covalentes entre le réactif et le support. De manière indirecte, on peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur le support solide un composé "anti-réactif" capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support solide. A titre d'exemple, on peut citer un anticorps anti-FLP80, à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec une partie de la protéine différente de celle intervenant dans la réaction de reconnaissance des anticorps des sera; un système ligand-récepteur, par exemple en greffant sur la protéine FLP80 une molécule telle qu'une vitamine, et en immobilisant sur la phase solide le récepteur correspondant (par exemple le système biotine-streptavidine). Par manière indirecte, on entend également le greffage au préalable ou fusion par recombinaison génétique d'une protéine, ou un fragment de cette protéine, ou d'un polypeptide, à une extrémité de la protéine FLP80, et l'immobilisation de ces dernières sur le support solide par adsorption passive ou covalence de la protéine ou du polypeptide greffé ou fusionné. Les sondes de capture peuvent être immobilisées sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive. Les sondes de détection sont marquées au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la phosphatase alcaline, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotidique, et la biotine.
Les sondes de la présente invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment les techniques dites "Dot-Blot" (Maniatis et al. (1982) (14)), Southern Blot (Southern E.M. (1975) (15)), Northern Blot, qui est une technique identique à la technique Southern Blot mais qui utilise de l'ARN comme cible, la technique sandwich (Dunn A.R. et al. (1977)(16)). Le procédé d'immunodétection et/ou de d'une infection par les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un animal non humain, consiste à mettre en contact ledit échantillon avec un réactif tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, puis la détection de la présence d'un complexe immun avec ledit réactif. De préférence, ledit procédé met en oeuvre un sérum immun comprenant des anticorps polyclonaux obtenus par exemple à partir de souris immunisées par la protéine recombinante exprimée chez E.coli. Selon un mode de réalisation préférentiel, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic des trypanosomoses comprenant la détection de la protéine FLP80 en tant qu'antigène circulant au cours de l'infection, et la mise en évidence de la présence des parasites trypanosomes dans le bétail se trouvant en zone endémique afin d'appliquer le traitement approprié. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection par la technique ELISA en une ou plusieurs étapes, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de compétition bien connues de l'homme du métier. Alternativement, le procédé pour la détection sélective des trypanosomes africains dans un échantillon biologique, et le diagnostic des trypanosomoses africaines consiste à prélever un échantillon de sang, exposer l'ADN extrait de l'échantillon préalablement dénaturé, à au moins une sonde telle que définie précédemment et on détecte l'hybridation de ladite sonde. Enfin selon cet aspect, la présente invention a pour objet un kit à usage vétérinaire pour le diagnostic de trypanosomoses africaines dans un échantillon biologique comprenant une sonde ou une amorce, ou bien un anticorps tel que précédemment décrit ainsi qu'un réactif pour la détection d'une réaction immunologique. Les kits selon la présente invention comportent au moins un compartiment pour un conditionnement éventuellement stérile comprenant une quantité thérapeutique efficace d'un réactif tel que précédemment décrit, ainsi qu'une fiche d'instructions concernant le protocole de mise en oeuvre du diagnostic vétérinaire selon l'invention.
EXEMPLES Exemple 1 : Démonstration de l'expression de la protéine FLP80 au cours du cycle parasitaire 5.106 cellules de la souche IL3000 de T. congolense pour les formes procycliques (PCF), épimastigotes (EMF) et les formes sanguines (BSF) ont été soumises à une analyse en western blot avec un immunserum dirigé contre FLP80 ou contre la tubuline (contrôle de charge). Comme cela est montré sur le Western blot à la Figure 3, aucun signal n'a été détecté dans les formes procycliques, un signal correspondant à un poids moléculaire de 65 kDa a été détecté dans les formes épimastigotes et un signal encore supérieur a été détecté correspondant à un poids moléculaire de 75 kDa. Un signal constant a été détecté dans les 3 stades parasitaires pour la tubuline.
Exemple 2 : Immunolocalisation de FLP80 dans les formes sanguines de T. 15 congolense Les formes sanguines de T. congolense ont été marquées avec du DAPI qui colore l'ADN du noyau et de la mitochondrie (kinétoplaste), un immunserum dirigé contre FLP80, ou de la lectine de tomate qui colore la poche flagellaire et l'endosome précoce. L'image en superposition (overlay) montre que le signal correspondant à FLP80 colocalise uniquement 20 au niveau de la poche flagellaire à proximité du kinétoplaste avec celui de la lectine de tomate, le compartiment d'endocytose précoce n'a été marqué que par la lectine.
Exemple 3 : Essais de vaccination avec la protéine flagellaire FLP80 2 lots de bovins sont injectés en sous-cutané avec la protéine antigénique FLP80 mélangée 25 avec deux types d'ajuvants Quil A (saponine) lmg/ml et Adjuphos (Phosphate d'aluminium colloidal) volume à volume selon un volume final de 1 mL ou juste avec le mélange d'adjuvants (contrôle). 3 injections à 3 semaines d'intervalle sont réalisées avec respectivement 100 µg, 50 µg et 25 µg d'antigène(s). Les animaux sont infectés par la souche IL3000 de T. congolense 3 semaines après la dernière injection à raison de 1000 30 parasites par animal en intradermique. Des prélèvements de sang journaliers sont réalisés jusqu'à ce que tous les animaux soient reconnus infectés, la détermination de la parasitémie se faisant sur buffy-coat. Puis des prélèvements de sang hebdomadaires sont réalisés pour suivre la parasitémie et l'anémie, le poids des animaux est suivi mensuellement. La cinétique de réponde à l'immunisation et à l'infection est suivie par ELISA sur les différents antigènes 35 immunisants.
Exemple 4 : Exemple de tests de diagnostic sur sang d'animaux infectés Ce test est réalisé par détection de l'antigène circulant FLP80 par la méthode ELISA sandwich. L'anticorps anti-FLP80 dit de capture est adsorbé dans les puits d'une plaque 96 puits par incubation sur la nuit à 4°C de 1 à 10 µg/mL d'anticorps de capture dilué dans 100 µL tampon NaHCO3 50 mM pH9,6. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween (3,2 mM Na2HPO4 ; 0,5 mM KH2PO4 ; 1,3 mM KCI ; 135 mM NaCl, pH 7,4 ; 0,05% Tween 20). Puis 100 µL d'une solution de blocage (PBSTween 0,2% de gélatine) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 30 minutes à température ambiante. Les plaques sont vidées puis 100 µl des sérums d'animaux à tester sont déposés dans les puits et incubés 2 heures à 37°C. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 µL d'une solution contenant le deuxième anticorps couplé à de la biotine (PBS-Tween contenant 1 à 10 µg/mL d'anticorps biotinylé) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 1 heure à 37°C. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 µL de PBS-Tween contenant de la streptavidine couplée à la peroxydase (Sigma) sont ajoutés selon recommandations du fournisseur. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 µL par puits d'une solution de PBS-Tween. Enfin la réaction est révélée par ajout de substrat de la peroxydase selon les recommandations du fournisseur (exemple de révélateur pouvant être utilisé : ABTS (Sigma)). Le résultat est lu à l'aide d'un lecteur de plaque ou fluorimètre selon recommandations du fournisseur. L'anticorps de capture utilisé peut être soit un sérum polyclonal immunopurifié contre la protéine FLP80 de T. congolense, ou bien un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope présent sur ladite protéine. Le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal différent de l'anticorps de capture qui reconnaît un épitope différent de la protéine FLP80.25

Claims (21)

  1. REVENDICATIONS. 1. Molécule d'ADN ou d'ARN caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique isolée codant pour une protéine de la poche flagellaire des trypanosomes africains, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID NO: 1, une séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1, une séquence comprenant une identité d'au moins 70% avec la séquence SEQ ID NO: 1, un fragment de celles-ci, ou une séquence nucléotidique susceptible de s'hydrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes d'hybridation.
  2. 2. Protéine flagellaire appartenant aux trypanosomes africains codée par la séquence nucléotidique selon la revendication 1.
  3. 3. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence peptidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID No : 2, et qui est désignée FLP80, ou un fragment peptidique antigénique de ladite protéine.
  4. 4. Protéine selon la revendication 2 ou 3 en tant que cible thérapeutique pour le traitement et/ou la prévention des trypanosomoses africaines.
  5. 5. Une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule d'origine procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'une molécule d'ADN selon la revendication 1.
  6. 6. Cassette d'expression selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de la poche flagellaire du parasite Trypanosoma ayant une séquence telle que représentée dans la séquence SEQ ID NO: 2, ou un fragment peptidique antigénique desdites séquences.
  7. 7. Un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 ou une cassette d'expression selon la revendication 5 ou 6.
  8. 8. Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit vecteur est d'origine eucaryote ou procaryote. 21 ._ e 2952649 2.2
  9. 9. Une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon la revendication 1, une cassette d'expression selon la revendication 5 ou 6, ou encore un vecteur recombinant selon la revendication 7 ou 8.
  10. 10. Protéine selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, ou un fragment peptidique antigénique de ladite protéine, caractérisé en ce que ladite protéine ou ledit fragment présente une réactivité avec les sera des animaux infectés par un trypanosome africain.
  11. 11. Protéine selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle présente une réactivité avec les sera des animaux infectés par les trypanosomes africains, choisis parmi Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, ou Trypanosome brucei.
  12. 12. Un vaccin pour la prévention etlou le traitement des trypanosomoses africaines et pathogénies induites, chez les animaux non humains, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité thérapeutique efficace d'une ou plusieurs protéines selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 10 et 11.
  13. 13. Vaccin selon la revendication 12 pour la protection contre les infections à Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, ou Trypanosoma bruceL
  14. 14. Vaccin selon la revendication 12 ou 13 caractérisé en ce que lesdites pathogénies induites comprennent les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression desdits animaux non humains.
  15. 15. Anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain avec au moins une protéine ou un fragment peptidique antigénique selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 10 et 11.
  16. 16. Sonde pour l'identification des parasites trypanosomes africains, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique selon la revendication 1.
  17. 17. Réactif pour la détection de trypanosomose africaine dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon la revendication 15 ou une sonde selon la revendication 16.
  18. 18. Méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose africaine dans un échantillon biologique d'un animal non humain susceptible d'avoir été infecté par un trypanosome africain, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon et un réactif selon la revendication 17, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et en ce que l'on détecte ensuite la présence d'un complexe immun.
  19. 19. Kit de diagnostic de trypanosomose africaine dans un échantillon biologique pour la mise en oeuvre de la méthode selon la revendication 18, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 15, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun avec ledit anticorps, au moins un réactif pour la détection d'une réaction immunologique.
  20. 20. Procédé de criblage d'agents trypanocides ou d'agents inhibiteurs comprenant la mise en contact de l'agent à tester préalablement marqué radioactivement avec des lignées cellulaires exprimant la protéine FLP80 selon l'une quelconque des revendications 2, 3, 10 et 11, et la mesure de la radioactivité associée aux cellules.
  21. 21. Inhibiteur compétitif pour la fixation sur la protéine FLP80, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 20, pour le traitement et/ou la prévention des trypanosomoses africaines, caractérisé en ce que le dit inhibiteur est constitué par une apolipoprotéine A ou El tronquée.
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