EP2499157A1 - Applications therapeutiques et diagnostics contre les trypanosomoses - Google Patents

Applications therapeutiques et diagnostics contre les trypanosomoses

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EP2499157A1
EP2499157A1 EP10779306A EP10779306A EP2499157A1 EP 2499157 A1 EP2499157 A1 EP 2499157A1 EP 10779306 A EP10779306 A EP 10779306A EP 10779306 A EP10779306 A EP 10779306A EP 2499157 A1 EP2499157 A1 EP 2499157A1
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EP
European Patent Office
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protein
vaccine
flp80
agent
sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP10779306A
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German (de)
English (en)
Inventor
Virginie Coustou Linares
Theo Baltz
Magali Thonnus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Victor Segalen Bordeaux 2
Universite Bordeaux Segalen
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Victor Segalen Bordeaux 2
Universite Bordeaux Segalen
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Victor Segalen Bordeaux 2, Universite Bordeaux Segalen filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to the identification of the nucleotide and peptide sequences of a new flagellar sac protein specific for African trypanosome parasites and its use for diagnostic and therapeutic applications and in particular as a vaccine for the immunization of human animals and / or non-human or as a therapeutic target for the fight against trypanosomosis or trypanosomiasis.
  • Trypanosomiasis or trypanosomiasis is caused by several species of protozoan parasites of the genus Trypanosoma and African trypanosomes generally refer to trypanosomes belonging to the Salivaria group, which itself comprises three main subgenera: Trypanozoon, Duttonella and Nannomonas.
  • the subgenus Trypanozoon contains, in addition to species that are infective to animals, two species that are infective for humans and cause sleeping sickness. Other subgenera include species that infect wild and domestic animals and are never infective to humans but may have significant indirect health implications.
  • the subgenus Trypanozoon consists of polymorphic trypanosomes (long form and short or squat form), with optional free flagellum and small kinetoplast and subterminal (posterior) position.
  • the species of this subgenus are Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi and T. equiperdum.
  • T. brucei comprises three subspecies: T. b. brucei, T. b. gambiense and T.
  • T. brucei and its subspecies are transmitted by tsetse flies.
  • T. evansi is transmitted to cattle, horses and camels by biting flies other than tsetse flies (Tabanidae) in Africa, South America and South East Asia.
  • T. equiperdum has no invertebrate host (sexual transmission in horses). These last two species largely extend from tsetse flies and are cosmopolitan.
  • Their morphology is similar to that of T. brucei but they are monomorphic (long forms only).
  • Trypanosomes belonging to the subgenus Duttonella have the shape of a club or club, with the rounded and broad posterior end, the body narrowing towards the anterior end.
  • the kinetoplast is bulky, rounded and in a terminal position; the undulating, undeveloped, narrow membrane terminates in free flagellum.
  • T. vivax and T. uniform, parasitic species of wild and domestic ruminants They can be transmitted mechanically or by tsetse flies, of which they exclusively colonize the trunk and the proventriculus.
  • Trypanosomes of the subgenus Nannomonas are small (8 to 24 ⁇ ), they have no free flagellum at any stage of their development.
  • the mid-sized kinetoplast is in a subterminal or marginal position.
  • the posterior end is rounded and the undulating membrane narrow.
  • Pathogenicity is important for livestock, pigs and dogs in Africa. Tsetse development takes place in the stomach and proboscis exclusively.
  • the main species are T. congolense and T. simiae. These trypanosomes are small, with rounded posterior end, kinetoplast in marginal position, narrow undulating membrane. They do not have free flagellum.
  • T. congolense domestic ruminants in Africa are mainly infected by three species of pathogenic trypanosomes, T. congolense, T. vivax, or T. brucei, which are responsible for a pathology called Nagana.
  • Other animals are infected with another pathogenic trypanosome species, T. evansi, which is responsible for a pathology called Surra.
  • Trypanosomes are characterized by a great genetic diversity, which concerns infectivity, virulence, pathogenicity, transmissibility, and susceptibility to trypanocidal products.
  • T. congolense is the main agent of bovine trypanosomosis in Africa, due to its frequency and pathogenicity. It also adapts to various non-human animal species, and can thus parasitize bovines, pigs, sheep, goats, equines and canids.
  • T. brucei and in particular the subspecies Trypanosoma brucei gambiense is probably the most well-known because it is responsible for the chronic form of human sleeping sickness in West and Central Africa.
  • the subspecies Trypanosoma brucei brucei is a parasite of domestic and wild animals throughout Africa, but it is not infectious for humans because of the lytic effect on the blood forms of these trypanosomes, the protein Apolipoprotein L present in human serum.
  • the third subspecies is Trypanosoma brucei rhodesiense which is the agent of sleeping sickness in its acute form in Africa.
  • the subspecies T. evansi is transmitted to cattle, horses and camels, and has significant economic repercussions in Africa especially for the cattle and buffalo farms.
  • T. vivax is a parasite essentially ungulates in tropical Africa and transmission is provided by horseflies or tabanids.
  • Trypanosomes have a complex life cycle that includes different morphological forms. They usually have a fusiform body. They have a flagellum that is connected to the body by an undulating membrane. They reproduce asexually by binary fission.
  • the tsetse fly glossina sp.
  • tsetse fly injects into the dermis of the host at the site of the bite, infectious metacyclic forms present in the mouthparts. Parasites multiply in the dermis at the point of inoculation. A local reaction related to the multiplication of parasites in the dermis occurs, and parasites give birth to blood forms. This stage can last from 1 to 3 weeks for example in the case of T. congolense.
  • the parasites invade the blood, the lymphatic system, including the lymph nodes, as well as the various organs, such as the liver, spleen, heart, kidneys, and testes, which then show significant lesions.
  • Tsetse flies and feeds on infected animals, so once infected, it remains infectious throughout its life.
  • the trypanosome undergoes in the insect a complex cycle involving dedifferentiation in the intestine into non-infectious procyclic forms.
  • the trypanosomes turn into epimastigote, adherent forms, which actively multiply. Their differentiation leads to the infectious stage represented by the metacyclic forms, which no longer divide.
  • the T. vivax cycle does not involve a procyclic stage. It begins with the flagellar attachment of the blood forms ingested by the tsetse fly. They differentiate into epimastigote forms, which proliferate and then differentiate into infectious metacyclic forms.
  • the total cycle time in tsetse flies is approximately 5 to 10 days for T. vivax, 18 days for T. congolense, and 30 days for T. brucei.
  • Sources of infection of domestic animals are other domestic animals or diseased wild animals or healthy carriers.
  • the existence of reservoir comes from the fact that some species are not very receptive to infection, and not very sensitive to the disease.
  • the potential vectors vary depending on the species of trypanosome considered.
  • T. congolense and T. brucei are exclusively transmitted by biological vectors such as tsetse flies, but T. vivax can also be transmitted by mechanical vectors such as biting flies (tabanids or stomoxes).
  • T. evansi is exclusively transmitted by mechanical vectors. The efficiency of transmission depends on the infection rate of tsetse flies and host-vector interactions. In general, infectious trypanosomes for animals give higher infection rates than trypanosomes infecting humans, which contributes to the very wide distribution of animal trypanosomosis.
  • Trypanosome analysis by electron microscopy shows the existence of a mantle of about 15 nm covering the entire cell body of the parasite.
  • This mantle is present only on the surface of blood and metacyclic forms. It is essentially consisting of a glycoprotein called VSG (Variable Surface Antigen) and other membrane proteins in small amounts. VSGs thus form a very dense structure constituting a physical barrier between the plasma membrane and the host. The 3D structure predicts that only a small portion of the protein is exposed to the surface of the parasite.
  • VSG Very Surface Antigen
  • the mantle would be to mask the nonvariable membrane antigens of the parasite by presenting some immunodominant motifs to the immune defenses of the host.
  • the mantle also protects the blood forms against lysis by activation of the alternative complement pathway.
  • control of the disease relies mainly on vector control through the use of insecticides whose environmental impact is far from negligible.
  • control of trypanosomosis relies exclusively on the use of drugs, because these parasites escape the immune defenses of the host by expressing on their surface variable antigens. This phenomenon of antigenic variation has so far ruined all efforts to develop a new parasite vaccine.
  • Only a few limited-effect molecules directed against the pathogen, the trypanosome, and called trypanocides are available.
  • These chemotherapy treatments have many limitations. Indeed, the trypanosomosis treatment uses a few trypanocidal products mostly discovered several decades ago. These products all have significant side effects and many strains of resistant or multiresistant parasites have emerged.
  • the Applicant has identified and characterized in T. congolense a protein called FLP80 located at the level of the flagellar pocket and the compartment of early endocytosis of blood forms of the parasite.
  • FLP80 located at the level of the flagellar pocket and the compartment of early endocytosis of blood forms of the parasite.
  • the main field of application envisaged is the fight against trypanosomosis and the use of this protein for a biotechnological purpose.
  • the new FLP80 protein is useful for the vaccination of trypanosomosis, caused by African trypanosomes.
  • the newly characterized peptide sequences are used for the production of diagnostic tests, for the preparation of vaccine and pharmaceutical compositions.
  • the protein and any antigenic polypeptide fragments of this protein are otherwise useful for the production of parasite-specific antibodies for diagnostic purposes or for passive immunization.
  • the FLP80 protein constitutes a therapeutic target of choice for the development of trypanocidal agents or competitive inhibitors.
  • Figure 1 represents the nucleotide sequence coding for the flagellar FLP80 protein
  • Figure 2 represents the peptide sequence corresponding to the flagellar pocket protein FLP80
  • Figure 3A represents a Western blot analysis of the expression of FLP80 during the parasite cycle in procyclical forms (PCF), epimastigotes (EMF), and blood forms (BSF) versus tubulin expression (TUB ) during the three parasitic stages;
  • Figure 3B Represents a Western blot analysis of the FLP80 protein in blood forms (BSF) without and after treatment with deglycosidase (PNGase).
  • African trypanosomes means the protozoan parasites of the genus Trypanosoma belonging to the Salivaria group, which itself comprises three main subgenera: Trypanozoon, Duttonella and Nannomonas, as defined above. These are known as African trypanosomes, but are found today, however, as well on the African continent as in Asia or South America. The most common African trypanosomes are Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, and Trypanosoma brucei.
  • trypanosomosis and "African animal trypanosomiasis (AAT)” generally refer to non-human animal infections caused by African trypanosomes, while the terms “trypanosomiasis” or “African trypanosomiasis” are used to refer to human infections also caused by African trypanosomes. For the sake of simplification, the terms trypanosomiasis and trypanosomiasis are used interchangeably here.
  • the subject of the present invention is a DNA or RNA molecule encoding a new flagellar pocket protein, called FLP80 specific for African trypanosomes.
  • This novel DNA or RNA molecule comprises at least one nucleotide sequence as represented in the sequence SEQ ID NO: 1, a complementary sequence, an antisense sequence, or a sequence equivalent to the sequence SEQ ID No: 1 , and in particular a sequence comprising an identity of at least 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94% or 95% throughout the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence likely to hydride with the sequence SEQ ID NO: 1 under stringent conditions of hybridization.
  • stringent hybridization conditions hybridization at a temperature of 65 ° C overnight in a solution containing 0.1% SDS, 0.7% skimmed milk powder and 6X SSC, followed by washes at room temperature. room temperature in 2X SSC - 0.1% SDS and at 65 ⁇ C in 0.2X SSC - 0.1% SDS.
  • the invention also relates to DNA or RNA fragments whose nucleotide sequence is identical, complementary, antisense, or equivalent to the sequence SEQ ID NO: 1, and in particular the DNA or RNA fragments, for a sequence of about 30 to 100 contiguous nucleotides, or about 30 to 50, and preferably at least 30 contiguous nucleotides, having at least 50%, at least 60%, at least 70%, or at least 80%, 85%, 90%, 92%, 93%, 94% or 95% of homology with the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence capable of being hydrolyzed with the sequence SEQ ID NO: 1 under conditions stringent hybridization.
  • nucleotide sequence is meant at least one strand of DNA or its complementary strand, either an RNA strand or its antisense strand or the corresponding complementary DNA.
  • the DNA sequence according to SEQ ID NO: 1 corresponds to the sequence of the RNA messenger, it being understood that the thymine (T) in the DNA is replaced by the uracil (U) in the RNA.
  • two nucleotide sequences are said to be equivalent to one another, because of the natural variability, in particular spontaneous mutation of the species from which they have been identified, or induced, as well as homologous sequences, the homology being defined below.
  • variability is meant any modification, spontaneous or induced of a sequence, in particular by substitution, and / or insertion and / or deletion of nucleotides and / or nucleotide fragments, and / or extension and / or shortening of the sequence to at least one of the extremities, or a non-natural variability that may result from the genetic engineering techniques used.
  • This variability can result in modifications of any start sequence, considered as reference, and which can be expressed by a degree of homology with respect to said reference sequence.
  • the subject of the invention is a Trypanosoma congolense protein, designated FLP80, having an apparent molecular weight of about 40 kDa, as well as antigenic peptide fragments or an immunological equivalent of said protein. It was identified in a membrane protein extract of parasite blood forms by mass spectrometry analysis.
  • the FLP80 flagellar protein sequence comprises 41 amino acids, and is represented in the sequence SEQ ID NO: 2.
  • the sequence analysis shows the presence of a signal peptide and a transmembrane domain at positions 354 to 379.
  • the sequence is rich in cysteines but no particular pattern is present.
  • the Applicant has shown that the FLP80 protein is differentially expressed during the trypanosome cycle. Indeed, as shown in the experimental part, in Example 2 below, the FLP80 protein is not detected in the procyclical forms (PCF), but it is detected in the epimastigote forms (EMF) at one time. Molecular weight of about 60kDa and in blood forms (BSF) at a molecular weight of 65kDa.
  • FLP80 is particularly abundant in blood forms. Specifically, FLP80 is present in 2.7.10 5 copies per cell. Its immunolocalization in the blood forms shows that the protein is at the level of the flagellar pocket and the endocytosis compartment (Example 3). This protein is expressed in the blood forms of the parasite, it is therefore present throughout the infection, which is an advantage over vaccine candidates or diagnoses developed so far that have been highlighted only in forms parasites in the insect. Indeed, it is not certain that such candidates are expressed during the infection, whereas the presence of the candidate in the blood of the infected mammalian host is a necessary precondition for its use, in particular for the establishment of a diagnostic test.
  • immunological equivalent any polypeptide or peptide capable of being immunologically recognized by the antibodies directed against the FLP80 protein.
  • the invention also relates to any fragment of the FLP80 protein, and more particularly any antigenic peptide fragment specifically recognized by antisera anti-African trypanosomes.
  • the protein and said protein fragments according to the invention may comprise modifications, in particular chemical modifications, which do not alter their immunogenicity.
  • the peptides can be obtained by chemical synthesis, lysis of the FLP80 protein, or by genetic recombination techniques.
  • the present invention relates to a novel pest control strategy, according to which the FLP80 protein is used as a therapeutic target. More specifically, this new antiparasitic strategy consists of using the new FLP80 flagellar protein as a therapeutic target for internalising a trypanocidal agent or for inhibiting the growth or multiplication of infectious parasites.
  • the FLP80 protein is very abundant in the membrane of the flagellar pocket, it is indeed a therapeutic target of choice for the internalisation of trypanocidal molecule in parasites.
  • the flagellar pocket is the only place of exchange between the parasite and the external environment and is not unlike the rest of the cell body covered with the dense and impenetrable coat of variable surface antigens (VSG).
  • VSG variable surface antigens
  • the FLP80 protein has many advantages in terms of abundance, location, function and specificity, which allow to consider a strategy to block the function of this protein .
  • the FLP80 membrane protein corresponds to an active transporter of HDL lipoproteins.
  • the FLP80 substrate has been identified by affinity chromatography with mouse serum proteins as the HDL fraction (identification of apolipoproteins A1 and E by mass spectrometry).
  • the subject of the present invention is apoliproteins A1 or E, and in particular a therapeutic complex comprising an apoliprotein A1 or E operatively complexed to a toxic molecule and capable of binding to the FLP80 transporter.
  • the coupling of the apoliprotein ligand of FLP80 with a toxic therapeutic molecule makes it possible to internalize, and thus to strongly concentrate such toxic molecules in the parasite, via the privileged interface constituted by the flagellar pocket.
  • the use according to the invention of the FLP80 protein as a carrier of toxic molecules represents an advantage over a long-term conventional vaccine strategy. Since the concentration of toxic molecules at the level of the target infectious agent is still a major problem in a treatment, its presence in large numbers at the level of the preferred exchange zone constituted by the flagellar pocket of the parasite could allow to concentrate very strongly a toxic molecule and thus increase the chances of successful treatment, reduce the risk of toxicity to the host and reduce the costs of treatment.
  • trypanocidal agents such as diamidine (pentamidine or pentamidine mesilate, diminazene or diminazene aceturate), arsenical derivatives such as melarsoprol®, melarsomine, eflornithine or DMFO, arsobal, MelBdm, nitrofuran derivatives such as nifurtimox or 5-nitrofuran, ornithine analogues (eflornithine® or difluoromethylornithine), phenanthridrin (isometamidium or homidium®), a polysulfone naphthylate such as suramin®, an antimalinic such as quinapyramine, buthionine sulfoximine (BSO),
  • trypanocidal agents such as diamidine (pentamidine or pentamidine mesilate, diminazene or diminazene aceturate), arsenical
  • the toxic molecules are operably coupled to the apolipoprotein ligand to allow (1) binding of the complex to the FLP80 protein with an affinity of the same order as the uncoupled apolipoprotein ligand, and (2) internalization and concentration of the trypanocidal complex in the trypanosome parasite.
  • the apolipoprotein-toxic molecule complex As the functional equivalent of the apoliprotein-toxic molecule complex, any molecule having a binding affinity for the membrane protein FLP80 similar to the apolipoprotein substrate is used.
  • an antibody as described below specifically directed against the FLP80 protein, linked to a trypanocidal toxic molecule and capable of causing, after attachment to FLP80, the internalization of the toxic molecule in the trypanosome can be mentioned. Therefore, according to the present invention, the apolipoprotein-toxic molecule complex or a functional equivalent is used as a veterinary composition against trypanosomoses.
  • Such trypanocidal veterinary compositions comprise the apoliprotein substrate operably coupled to a trypanocidal agent as described above in a therapeutically sufficient amount to treat and / or prevent African animal or human trypanosomoses.
  • methods for treating trypanosomoses include obtaining an apolipoprotein or equivalent substrate complex, coupling the substrate to a toxic or trypanocidal agent, and administering the resulting trypanocidal complex to a human and / or an animal. non-human having been or likely to have been infected by African trypanosomes.
  • the methods for determining the attachment of the apolipoprotein or equivalent substrate, and / or a trypanocidal complex according to the invention to membrane proteins such as FLP80 are well known to those skilled in the art, and can be carried out, for example, by competitive inhibition experiments between the apolipoprotein ligand A1 or E, and the trypanocidal complex or by BIAcore technology thus making it possible to study the real-time binding without labeling of the substrate or of the FLP80 protein.
  • This technique is based on the principle of a biosensor based on the use of surface plasmon resonance which detects mass variations on the surface of a sensor chip on which the apolipoprotein ligand or complex is immobilized covalent or non-covalent, and the FLP80 protein is injected by a microfluidic system into a continuous stream of buffer on the surface of the sensor chip.
  • the real-time monitoring allows to determine the kinetic constants of association and dissociation, and to deduce the value of the affinity constant.
  • measurements of the internalization of trypanocidal complexes can be conducted on cell lines expressing the recombinant FLP80 protein, and treated with the trypanocidal complex comprising a radioactive labeled apolipoprotein substrate operably coupled to a toxic agent, and measurement of the radioactivity associated with cells.
  • the present invention relates to competitive inhibitors of the binding of the natural substrate to the FLP80 protein.
  • Such competitive inhibitors are for example an apolipoprotein A1 or truncated E, that is to say comprising between 10 to 80% of the size of natural apoliproteins A1 and E.
  • Specific binding site-specific antibodies on FLP80 can also be competitive inhibitors of natural substrate binding to FLP80, thereby inhibiting growth and destroying infectious trypanosomes.
  • the subject of the present invention is furthermore a method for screening trypanocidal complexes capable of being internalized via the FLP80 protein in trypanosomes infectious and thus likely to destroy infectious trypanosomes.
  • the subject of the present invention is a method for screening FLP80 protein inhibiting agents capable of inhibiting the infectious cycle of trypanosomes, their growth or multiplication in the infected non-human animal host.
  • the methods according to the invention comprise a step of evaluating the capacity of said molecules or agents to be internalized and to concentrate in the parasites in order to induce their destruction, and / or to inhibit the activity or the function of the protein FLP80, and / or to stop the infectious cycles of the parasites, and / or to induce a reduction in their multiplication or growth.
  • the screening method according to the invention therefore comprises a growth inhibition / multiplication test of African trypanosomes.
  • the trypanocidal agents screened by the process as defined above are characterized by their ability to inhibit or modulate the growth or multiplication of infectious African trypanosomes.
  • compositions comprising trypanocidal agents or FLP80 inhibitory molecules as therapeutics for the control of trypanosomoses, or for the preparation of a pharmaceutical composition for treatment and / or prophylaxis, as well as methods of treatment and / or prevention of trypanosomoses comprising the administration of such trypanocidal agents, inhibitory molecules or compositions are also an integral part of the invention.
  • the present invention relates to a functional expression cassette, in particular in a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, allowing the expression of DNA coding for all or a fragment of the FLP80 protein.
  • a DNA fragment as defined above is placed under the control of the elements necessary for its expression. Said protein or protein fragments thus expressed are recognized by antisera anti-African trypanosomes.
  • any cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism may be used in the context of the present invention.
  • Such cells are known to those skilled in the art.
  • a eukaryotic organism such as cells derived from a mammal, in particular CHO (Chinese Hamster Ovarian) cells; insect cells; cells derived from a fungus, especially a unicellular fungus or a yeast, in particular from the Pichia, Saccharomyces and Schizosaccharomyces strains, and very particularly selected from the group consisting of Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, and Schizosaccharomyces octosporus.
  • E coli Escherichia coli strain
  • enterobacterial cells may be used, but not limited to.
  • the cell may be wild type or mutant.
  • the mutations are described in the literature accessible to those skilled in the art.
  • an E. coli cell such as for example BL21 (DE3), is used.
  • the expression cassette of the invention is intended for the production of the FLP80 protein or fragments thereof, for example in E. coli, which are recognized by antisera anti-African trypanosomes. Such antisera come from animals having a recent or old T. congolense infection, and which contain immunoglobulins specifically recognizing the FLP80 protein. Also, FLP80 protein can be recognized by other antibodies, such as for example monoclonal or polyclonal antibodies obtained by immunization of various species with the aforementioned natural protein, the recombinant protein, their fragments or peptides.
  • Flagellar protein FLP80 is the T. congolense membrane antigen, produced in particular by the genetic recombination techniques described herein, or any fragment or mutant of this antigen provided that it is immunologically reactive with antibodies. directed against FLP80 protein of these parasites.
  • said proteins have an amino acid sequence having a degree of homology of at least 70%, at least 80%, preferably at least 85%, or 90%, and preferably at least 92%, 93%, 94%, or at least 95% with respect to the sequence SEQ ID No: 2.
  • an equivalent can be obtained by deletion, substitution and / or addition of one or more amino acids of the native or recombinant protein. It is within the abilities of those skilled in the art to make these modifications by known techniques without affecting the immunological recognition.
  • the FLP80 protein may be modified in vitro, in particular by deletion or addition of chemical groups, such as phosphates, sugars or myristic acids, so as to improve its stability or the presentation of one or more several epitopes.
  • chemical groups such as phosphates, sugars or myristic acids
  • the expression cassette according to the invention allows the production of the FLP80 protein, having the amino acid sequence as specified above, and fragments of said proteins, can be advantageously fused to an exogenous element that can help its stability, its purification. , its production or its recognition.
  • an exogenous element is within the reach of those skilled in the art. It may especially be a hapten or an exogenous peptide.
  • the expression cassette according to the invention comprises the elements necessary for the expression of said DNA fragment in the cell in question.
  • elements necessary for the expression is meant all the elements which allow the transcription of the DNA fragment into messenger RNA (mRNA), such as promoter sequences (for example the CMV promoter) and transcription terminator, as well as elements allowing the translation of the latter into protein.
  • mRNA messenger RNA
  • promoter sequences for example the CMV promoter
  • transcription terminator as well as elements allowing the translation of the latter into protein.
  • the present invention also extends to vectors comprising an expression cassette according to the invention. It may also be a plasmid vector with autonomous replication and in particular a multiplier vector. It may be a viral vector and in particular a vector derived from a baculovirus, more particularly intended for expression in insect cells, or a vector derived from an adenovirus for expression in the cells. mammalian cells.
  • the present invention also relates to a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism, comprising an expression cassette, either in an integrated form in the cellular genome or inserted into a vector.
  • the subject of the present invention is furthermore a process for the preparation of the FLP80 protein, or fragments thereof, according to which: (i) a cell originating from a prokaryotic or eukaryotic organism, comprising the cassette, is cultured under appropriate conditions; expression according to the invention; and (ii) recovering the expressed protein from the above organism.
  • the invention relates to monoclonal or polyclonal antibodies obtained by immunological reaction of a non-human animal organism to an immunogenic agent consisting of natural or recombinant FLP80 protein, and peptide fragments, as defined above.
  • an immunogenic agent consisting of natural or recombinant FLP80 protein, and peptide fragments, as defined above.
  • Antibody production techniques are well known to those skilled in the art.
  • the polyclonal antibodies according to the present invention can be generated by injecting the FLP80 protein or an antigenic peptide fragment into rabbits or mice in order to immunize them. The polyclonal rabbit or mouse sera thus obtained are tested for their reactivity by indirect ELISA.
  • the present invention relates to an active immunotherapeutic composition, in particular a vaccine preparation, which comprises the natural, recombinant FLP80 protein, one or more antigenic peptide fragments of the protein, as defined above, and optionally a excipient and / or a suitable adjuvant.
  • a vaccine preparation which comprises the natural, recombinant FLP80 protein, one or more antigenic peptide fragments of the protein, as defined above, and optionally a excipient and / or a suitable adjuvant.
  • the vaccine or veterinary compositions according to the invention are intended for the treatment and / or prevention of infection by African trypanosomes in a human and / or non-human animal.
  • compositions according to the invention are intended for the treatment and / or prevention of an infection against T. congolense.
  • African trypanosomias due to 3 ⁇ 4 by T. congolense, are expressed in animals by gravity syndromes variable, ranging from acute lethal infection in 3-4 weeks, to chronic infection for months or even years.
  • Chronic evolution characterized by intermittent parasitaemia, is most common in African cattle. The disease begins with a hyperthermia phase, then two to three weeks after the infective bite, the number of red blood cells, hemoglobin and hematocrit fall, reflecting anemia, which is the major symptom of trypanosomosis.
  • Chronically infected animals have reduced food consumption, become cachectic, slow growth, and negative reproductive effects.
  • Anemia of trypanosomoses is established in two phases. During the initial phase, anemia is accompanied by parasitaemia and results mainly from extra-vascular hemolysis: red blood cells are destroyed by the phagocytic system in the spleen, liver, circulation and bone marrow. . In the long run, anemia results in a dysfunction of the bone marrow.
  • the said veterinary vaccine compositions may be in the form of antigenic vaccine and then comprise a therapeutically effective amount of the native, recombinant FLP80 protein or peptide fragments thereof as previously described.
  • the vaccine compositions may be in the form of DNA vaccines and may then comprise an expression cassette, a vector, a cell derived from a prokaryotic or eukaryotic organism as defined above, capable of expressing the FLP80 protein, or the antigenic peptide fragments, or a combination thereof.
  • Vaccines according to the present invention may be monovalent vaccines comprising an effective amount of a natural, recombinant FLP80 protein, and / or antigenic peptide fragments and / or nucleotide sequences encoding such peptides or peptide fragments.
  • This monovalent vaccine prevents infestation and thus the expression of the disease.
  • anti-disease vaccine does not prevent the infestation but only the expression of the disease, it could be called “anti-disease” vaccine.
  • the use of multivalent vaccines combining the so-called “anti-disease” vaccine with antigens of other trypanosomes and / or Other therapeutic active agents and / or other vaccines commonly used for prophylaxis are particularly advantageous according to the present invention.
  • the vaccines according to the present invention may be monovalent vaccines associating one or more natural, recombinant proteins and / or peptide fragments and / or nucleotide sequence coding for said peptides and fragments.
  • peptides of one or more species of trypanosomes and preferably derived from one or more species similar or different from trypanosomes.
  • peptides, antigenic fragments or antigenic peptide cocktail cocktails derived from trypanosomes are, for example, sialidases, trans-sialidases, tubulines, proteases, lipases, but also other flagellar proteins.
  • trans-sialidases examples include trans-sialidases of T. cruzi, T. congolense, T. vivax, T. evansi, T. brucei, T. rhodesiense. , and / or T. gambiense.
  • Some trans-sialidases of T. congolense are, inter alia, described in international application WO 2004/55176 or by Tiralongo E. et al. (JBC Vol 278, No. 26, pp 23301-10, 2003). More specifically, mention may be made of T.
  • cruzi trans-sialidase chains A and B as deposited in GenBank under the numbers Gl: 29726491, Gl: 29726490, Gl: 29726489 and Gl: 29726488. It is also advantageous to use inactive mutated forms of transialidases. In this respect, mention may be made of the T. cruzi mutant trans-sialidases described, for example, in International Application WO2007 / 107488, which have conserved less than 20% of their sialidase and transferase enzymatic activity.
  • tubulin alpha T. brucei (deposited in GenBank accession number AAA30262.1), or tubulin beta (deposited in GenBank accession number AAA30261). .1), T. brucei epsilon tubulin (deposited in GenBank under accession number EAN77544.1), T. brucei epsilon tubulin TREU927 (referenced in NCBI under the numbers XP_822372.1 and XP_829157.1), T. brucei delta tubulin (deposited in GenBank under accession number EAN80045.1), T. brucei zeta tubulin (referenced in NCBI under the number XP 001218818.1), or T. brucei tubulins which are described in the international application WO 2008/134643.
  • flagellar proteins derived from trypanosomes mention may be made of the T. brucei flagellar protein as described in International Application WO2002 / 19960, or the T. congolense flagellar protein described in the applicant's French application November 13, 2009 under the number FR09 / 58035. Mention may also be made of the flagellar protein of T. brucei TREU927 or the flagella-like proteins (referenced in NCBI under the numbers XP_847376.1; XP_847374.1; XP_847295.1; XP_843961 .1; XP_847377.1), the flagellar protein TB -44A from T.
  • T. brucei (deposited in GenBank accession number AAZ13310.1), T. brucei flagellar protein TB-24 (deposited in GenBank accession number AAZ13308.1), the flagellar protein of T. brucei filed in GenBank under accession number AAZ1331 1 .1.
  • proteases include trypanosome cysteine proteases, such as T. congolense congopaine or trypanopaine-Tc, rhodesiense rhodesaine, chagasine or T. cruzi cruzipaine.
  • Vaccines according to the present invention may also include adjuvants to increase the antigenic response.
  • adjuvants are well known in the state of the art.
  • adjuvants mention may be made of vitamin E, gels or aluminum salts, such as aluminum hydroxide, aluminum phosphates, metal salts, saponins, polymers of aluminum, polyacrylic acid, such as carbopols®, non-ionic block polymers, fatty acid amines, such as avridine and DDA, dextran-based polymers, such as dextran sulfate, and DEAE dextran liposomes, bacterial immunogens, such as LPS, peptidoglycans, or CDMs.
  • vitamin E gels or aluminum salts, such as aluminum hydroxide, aluminum phosphates, metal salts, saponins, polymers of aluminum, polyacrylic acid, such as carbopols®, non-ionic block polymers, fatty acid amines, such as avridine and
  • Non-human animals that can be treated include, for example, cattle, ovids, felids, suids, camelids, and / or canines.
  • the vaccines may comprise a therapeutically effective amount of a monoclonal or polyclonal antibody as described below.
  • the multivalent vaccines according to the present invention may further contain antigens from other blood parasitoses derived for example from protozoa such as Theirera parva, Babesia bigemina, and B. divergens, T. annulata, for the treatment and / or prevention of trypanosomes. and theileriosis, anaplasmosis, and / or babesiosis.
  • the vaccines according to the present invention are particularly useful for treating and / or preventing trypanosomosis-induced pathogenesis, such as, in particular, anemia, deterioration of the general state, weight loss, and / or immunosuppression of men or women. non-human animals.
  • Monovalent or multivalent vaccines may also be administered in combination with anti-parasitic agents, anti-infective agents, and / or anti-symptomatic agents.
  • the antiparasitic agents are, for example, trypanocides, such as diamidine (pentamidine or pentamidine mesilate, diminazene or diminazene aceturate), arsenic derivatives such as melarsoprol®, melarsomine, ef-lornithine or DMFO, arsobal, MelBdm, nitrofuran derivatives such as nifurtimox or 5-nitrofuran, ornithine analogues (eflornithine® or difluoromethylornithine), phenanthridrin (isometamidium or homidium®), a polysulfonated naphthaea such as suramin®, antimalinic such as quinapyramine, buthionine sulfoximine (BSO), azaserine, 6-diazo-5-oxo-norleucine (DON), and / or acivicin.
  • antiparasitic agents When vaccines are administered in combination with antiparasitic agents, the latter will be administered before and / or simultaneously and / or after the mono or multivalent vaccines previously described.
  • Other non-specific trypanosome antiparasitics are well known in the art, and will be administered before and / or simultaneously and / or after the vaccines according to the invention. These include avermectins (ivermectin, abamectin, doramectin, eprinomectin and selamectin), pyrethrins (deltamethrin, etc.), and / or anthelmintic antiparasitics (oxybendazole, piperazine, flubendazole).
  • antibiotics such as ⁇ -lactams, fosfomycin, glycopeptides or polypeptides with antibiotic activity, bacitracin, aminoglycosides, macrolides, lincosamides, streptogramins , tetracyclines, phenicolis, fusidanides, or quinolones
  • Anti-symptomatic agents are for example anti-anemic agents, such as iron, vitamin B12, folic acid, levofolinate calcium; hepatoprotective agents, such as flavonoids complexes (sylymarin silybin, etc.), turmeric, desmodium ascendens, and / or chrysanthellum Americanum (charcoal).
  • anti-anemic agents such as iron, vitamin B12, folic acid, levofolinate calcium
  • hepatoprotective agents such as flavonoids complexes (sylymarin silybin, etc.), turmeric, desmodium ascendens, and / or chrysanthellum Americanum (charcoal).
  • Non-steroidal anti-inflammatory drugs can be, among others, oxicams (meloxicam, piroxicam, and / or tenoxicam), salicylated derivatives (methyl salicylate and lysine acetylate), 2-arylpropionic acids (profenes), derivatives thereof. indolic sulfonamides, selective cox-2 NSAIDs (celecoxib, etoricoxib, etc.), phenylbutazone, niflumic acid, and / or phenamic acids.
  • oxicams meloxicam, piroxicam, and / or tenoxicam
  • salicylated derivatives methyl salicylate and lysine acetylate
  • 2-arylpropionic acids profenes
  • indolic sulfonamides selective cox-2 NSAIDs (celecoxib, etoricoxib, etc.)
  • phenylbutazone niflumic acid,
  • the subject of the present invention is probes or primers specific for African Trypanosomes, and their uses in diagnostic tests.
  • probe refers to DNA or RNA comprising at least one nucleotide sequence allowing hybridization to nucleic acids having at least one nucleotide sequence as represented in the sequence SEQ ID No: 1, a complementary sequence, an antisense sequence, or a sequence equivalent to said sequence, and in particular a sequence having, from 5 to 100 contiguous nucleotides, at least 50%, preferably at least 60%, at least 70% or at least at least 85% homology with the sequence SEQ ID No: 1, or a synthetic oligonucleotide allowing such hybridization, unmodified or comprising one or more modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine , dimethylamino-5-deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified basis.
  • modified bases such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, deoxyuridine , dimethylamino-5-deoxyuridine, dia
  • these probes can be modified at the level of the sugar, namely the replacement of at least one deoxyribose with a polyamide or at the level of the phosphate group, for example its replacement with esters, especially chosen from diphosphate and dialkyl esters. and arylphosphonate and phosphorothioate.
  • the probes can be much shorter than the sequence identified in the sequence SEQ ID No: 1.
  • such probes comprise at least 5 nucleotides, advantageously between 5 and 50 nucleotides, preferably around 20 nucleotides, and have hybridization specificity under determined conditions to form a hybridization complex with DNA or RNA having a nucleotide sequence as defined above.
  • the probes according to the invention can be used for diagnostic purposes, as a capture and / or detection probe.
  • the primers according to the invention comprise a sequence of 5 to 30 consecutive nucleotides of the sequence SEQ ID NO: 1, and have a hybridization specificity under predetermined conditions, for the initiation of an enzymatic polymerization, for example in a amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction), in an elongation method such as sequencing, in a reverse transcription method or the like.
  • amplification technique such as PCR (Polymerase Chain Reaction)
  • elongation method such as sequencing
  • reverse transcription method or the like.
  • the invention comprises a reagent for detection and / or monitoring as well as a method and kits for diagnosing T. congolense infections.
  • the reagents for the detection or trypanosome diagnostic kits comprise as reactive substance at least one monoclonal or polyclonal antibody as described above.
  • reagents for the detection or diagnostic kit of trypanosomes include a probe and / or a primer for detecting and / or identifying African trypanosomes in a biological sample, particularly a capture probe and / or a detection probe. one and / or the other as defined above.
  • the present invention relates more particularly to a method of immunodetection and immunolocalization of the FLP80 protein during the parasitic cycle.
  • the reagent used for immunodetection or immunolocalization can be fixed directly or indirectly on a suitable solid support.
  • the solid support may be in particular in the form of a cone, a tube, a well, a ball, or the like.
  • solid support includes all materials on which a reagent may be immobilized for use in diagnostic tests.
  • Natural, synthetic, chemically modified or non-chemically modified materials can be used as solid supports, in particular polysaccharides such as cellulose-based materials, for example paper, cellulose derivatives such as cellulose acetate and cellulose. nitrocellulose; polymers such as vinyl chloride, polyethylene, polystyrenes, polyacrylates or copolymers such as polymers of vinyl chloride and propylene, polymers of vinyl chloride and vinyl acetate, copolymers based on styrene, natural fibers such as cotton and synthetic fibers such as nylon.
  • the attachment of the reagent to the solid support can be carried out directly or indirectly.
  • two approaches are possible: either by adsorption of the reagent on the solid support, that is to say by non-covalent bonds (mainly of hydrogen, Van der Walls or ionic type), or by establishment of covalent bonds between the reagent and the support.
  • an anti-FLP80 antibody provided that it is immunologically reactive with a part of the protein different from that involved in the antibody recognition reaction of sera; a ligand-receptor system, for example by grafting on the FLP80 protein a molecule such as a vitamin, and immobilizing on the solid phase the corresponding receptor (for example the biotin-streptavidin system).
  • indirect means is also meant the prior grafting or fusion by genetic recombination of a protein, or a fragment of this protein, or of a polypeptide, at one end of the FLP80 protein, and the immobilization of the latter on the solid support by passive adsorption or covalence of the grafted or fused protein or polypeptide.
  • the capture probes can be immobilized on a solid support by any appropriate means, that is to say directly or indirectly, for example by covalence or passive adsorption.
  • the detection probes are labeled with a marker chosen from radioactive isotopes, enzymes chosen in particular from peroxidase and alkaline phosphatase, and those capable of hydrolyzing a chromogenic, fluorogenic or luminescent substrate, chromophoric chemical compounds, chromogenic, fluorogenic or luminescent compounds, nucleotide base analogs, and biotin.
  • the probes of the present invention used for diagnostic purposes can be implemented in all known hybridization techniques, and in particular the so-called “Dot-Blot”, Southern blot, and Northern Blot techniques, which is a technique identical to the Southern blot technique but uses RNA as a target, the sandwich technique.
  • the method of immunodetection and / or infection with African trypanosomes in a biological sample comprises contacting said sample with a reagent as defined herein. above, under conditions allowing a possible immunological reaction, and then the detection of the presence of an immune complex with said reagent.
  • said method implements an immune serum comprising polyclonal antibodies obtained for example from mice immunized with the recombinant protein expressed in E. coli.
  • the subject of the present invention is a method for diagnosing trypanosomoses comprising the detection of the FLP80 protein as an antigen circulating during the infection, and the detection of the presence of trypanosome parasites. in livestock in endemic areas in order to apply the appropriate treatment.
  • the method of detection by the ELISA technique in one or more steps, which consists in reacting a first monoclonal or polyclonal antibody specific for a desired antigen, fixed on a solid support, with the sample, and to highlight the possible presence of an immune complex thus formed by a second antibody labeled with any suitable marker known to those skilled in the art, including a radioactive isotope, an enzyme, for example peroxidase or phosphatase alkaline or the like; by the so-called competition techniques well known to those skilled in the art.
  • kits for veterinary use for the diagnosis of trypanosomoses in a biological sample comprising a probe or a primer, or an antibody as previously described, as well as a reagent for the detection of an immunological reaction.
  • the kits according to the present invention comprise at least one compartment for a possibly sterile packaging comprising a therapeutically effective amount of a reagent as described above, as well as an instruction sheet concerning the protocol for implementing the veterinary diagnosis according to the invention. 'invention.
  • T. congolense The blood forms of T. congolense have been labeled with DAPI, which stains the nucleus and mitochondria (kinetoplast) DNA, an immunoserum directed against FLP80, or tomato lectin which stains the flagellar pocket and the early endosome.
  • DAPI stains the nucleus and mitochondria (kinetoplast) DNA
  • FLP80 an immunoserum directed against FLP80
  • tomato lectin which stains the flagellar pocket and the early endosome.
  • the overlay image shows that the signal corresponding to FLP80 colocalizes only at the level of the flagellar pocket near the kinetoplast with that of the tomato lectin, the early endocytosis compartment was labeled only by the lectin .
  • Example 4 Example of diagnostic tests on blood of infected animals
  • This test is carried out by detecting the FLP80 circulating antigen by the sandwich ELISA method.
  • the anti-FLP80 said capture antibody is adsorbed to the wells of a 96 well plate by incubation overnight at 4 ° C of 1 to 10 .mu.g / ml capture antibody diluted in 100 ⁇ ⁇ - NaHC0 3 buffer 50 mM pH9.6.
  • the plate is then emptied and then washed 3 times with 200 ⁇ l per well of a solution of PBS-Tween (3.2 mM Na 2 HPO 4, 0.5 mM KH 2 PO 4, 1.3 mM KCl, 135 mM NaCl, pH 7, 4, 0.05% Tween 20).
  • a blocking solution PBS-Tween 0.2% gelatin
  • 100 ⁇ l of a blocking solution PBS-Tween 0.2% gelatin
  • the plates are emptied then 100 ⁇ of sera of test animals are deposited in the wells and incubated for 2 hours at 37 ⁇ ⁇ .
  • the plate is then emptied and then washed 3 times with 200 ⁇ l per well of a solution of PBS-Tween.
  • 100 ⁇ ⁇ - of a solution containing the second antibody coupled to biotin PBS-Tween containing 1 to 10 ug / ml biotinylated antibody
  • the plate is then emptied and then washed 4 times with 200 ⁇ l per well of a PBS-Tween solution.
  • 100 ⁇ l of PBS-Tween containing streptavidin coupled with peroxidase (Sigma) are added according to the supplier's recommendations.
  • the plate is then emptied and then washed 4 times with 200 ⁇ l per well of a PBS-Tween solution.
  • Finally the reaction is revealed by addition of peroxidase substrate according to the supplier's recommendations (example of developer that can be used: ABTS (Sigma)).
  • the result is read using a plate reader or fluorimeter according to the supplier's recommendations.
  • the capture antibody used may be either an immunopurified polyclonal serum against T. congolense FLP80 protein, or a monoclonal antibody recognizing an epitope present on said protein.
  • the second antibody is a monoclonal antibody different from the capture antibody that recognizes an epitope different from the FLP80 protein.

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Abstract

La présente invention se rapporte à l'identification des séquences nucléotidique et peptidique d'un nouveau transporteur d'HDL localisé au niveau de la poche flagellaire des parasites trypanosomes africains, et son utilisation pour des applications diagnostiques, thérapeutiques et vaccinales anti-trypanosomose chez l'homme et les animaux.

Description

APPLICATIONS THERAPEUTIQUES ET DIAGNOSTICS CONTRE
LES TRYPANOSOMOSES
La présente invention se rapporte à l'identification des séquences nucléotidique et peptidique d'une nouvelle protéine de la poche flagellaire spécifique des parasites trypanosomes africains et son utilisation pour des applications diagnostiques et thérapeutiques et notamment en tant que vaccin pour l'immunisation des animaux humains et/ou non humains ou encore en tant que cible thérapeutique pour la lutte contre la contre les trypanosomoses ou les trypanosomiases.
La trypanosomose ou trypanosomiase est causée par plusieurs espèces de protozoaires parasites du genre Trypanosoma et les trypanosomes africains désignent généralement les trypanosomes appartenant au groupe Salivaria, qui lui-même comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas.
Seul le sous-genre Trypanozoon comporte, outre des espèces infectantes pour les animaux, deux espèces infectantes pour l'homme chez qui elles provoquent la maladie du sommeil. Les autres sous-genres comprennent des espèces qui infectent les animaux sauvages et domestiques et ne sont jamais infectantes pour l'homme mais peuvent avoir des répercussions indirectes importantes pour sa santé. Le sous genre Trypanozoon est constitué de trypanosomes polymorphes (forme longue et forme courte ou trapue), avec flagelle libre facultatif et kinétoplaste petit et en position subterminale (postérieur). Les espèces de ce sous-genre sont Trypanosoma (T.) brucei, T. evansi et T. equiperdum. T. brucei comprend trois sous-espèces : T. b. brucei, T. b. gambiense et T. b. rhodesiense, qui sont très proches sur les plans morphologique, antigénique et biochimique, qui se distinguent par leurs caractères infectieux, leur pathogénicité et leur distribution géographique. T. brucei et ses sous-espèces sont transmis par les glossines. T. evansi est transmis au bétail, aux chevaux et aux chameaux par des mouches piqueuses autres que les glossines (Tabanidae) en Afrique, en Amérique du Sud et dans le Sud Est Asiatique. T. equiperdum n'a pas d'hôte invertébré (transmission sexuelle chez les chevaux). Ces deux dernières espèces débordent largement des régions à glossines et sont cosmopolites. Leur morphologie est semblable à celle de T. brucei mais elles sont monomorphes (formes longues uniquement).
Les trypanosomes appartenant au sous-genre Duttonella ont une forme de massue ou de gourdin, avec l'extrémité postérieure arrondie et large, le corps se rétrécissant vers l'extrémité antérieure. Le kinétoplaste est volumineux, arrondi et en position terminale; la membrane ondulante peu développée, étroite, se termine en flagelle libre. T. vivax et T. uniforme, espèces parasites des ruminants sauvages et domestiques. Ils peuvent être transmis par voie mécanique ou par les glossines, dont ils colonisent exclusivement la trompe et le proventricule.
Les trypanosomes du sous-genre Nannomonas sont de petite taille (8 à 24 μηι), ils n'ont de flagelle libre à aucun stade de leur développement. Le kinétoplaste de taille moyenne se trouve en position subterminale ou marginale. L'extrémité postérieure est arrondie et la membrane ondulante étroite. La pathogénicité est importante pour le bétail, le porc et le chien en Afrique. Le développement chez la glossine prend place dans l'estomac et le proboscis exclusivement. Les principales espèces sont T. congolense et T. simiae. Ces trypanosomes sont de petite taille, avec extrémité postérieure arrondie, kinétoplaste en position marginale, membrane ondulante étroite. Ils n'ont pas de flagelle libre.
Les ruminants domestiques en Afrique sont essentiellement infectés par trois espèces de trypanosomes pathogènes, T. congolense, T. vivax, ou T. brucei qui sont responsables d'une pathologie dénommée Nagana. D'autres animaux sont infectés par une autre espèce de trypanosome pathogène, T. evansi, qui est responsable d'une pathologie dénommée Surra. Les trypanosomes sont caractérisés par une grande diversité génétique, qui concerne l'infectivité, la virulence, la pathogénicité, la transmissibilité, et la sensibilité aux produits trypanocides.
T. congolense est l'agent principal de la trypanosomose bovine en Afrique, par sa fréquence et sa pathogénicité. Il s'adapte également à diverses espèces animales non humaines, et peut ainsi parasiter indifféremment les bovidés, les porcins, les ovins, les caprins, les équidés et les canidés.
T. brucei et notamment la sous-espèce Trypanosoma brucei gambiense est probablement la plus connue puisqu'elle est responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil chez l'homme en Afrique occidentale et centrale. La sous-espèce Trypanosoma brucei brucei est un parasite des animaux domestiques et sauvages dans toute l'Afrique, mais elle n'est pas infectieuse pour l'homme en raison de l'effet lytique sur les formes sanguines de ces trypanosomes, de la protéine Apolipoprotéine L présente dans le sérum humain. La troisième sous-espèce est Trypanosoma brucei rhodesiense qui est l'agent de la maladie du sommeil dans sa forme aiguë en Afrique.
Egalement, la sous-espèce T. evansi est transmise aux bovidés, chevaux et dromadaires, et a des répercussions économiques importantes en Afrique notamment pour les élevages des bovins et des buffles.
Enfin, T. vivax est un parasite essentiellement des ongulés en Afrique tropicale et la transmission est assurée par les taons ou les tabanidés.
Les trypanosomes présentent un cycle de vie complexe qui inclut différentes formes morphologiques. Ils présentent en général un corps fusiforme. Ils possèdent un flagelle qui est relié au corps par une membrane ondulante. Ils se reproduisent de manière asexuée par fission binaire. Lors de l'infection, la glossine (glossina sp.) ou mouche tsé-tsé injecte dans le derme de l'hôte à l'endroit de la piqûre, les formes métacycliques infectieuses présentes dans les pièces buccales. Les parasites se multiplient dans le derme au point de l'inoculation. Une réaction locale liée à la multiplication des parasites dans le derme se produit, et les parasites donnent naissance aux formes sanguines. Ce stade peut durer de 1 à 3 semaines par exemple dans le cas de T. congolense. Ensuite, les parasites envahissent le sang, le système lymphatique, notamment les ganglions lymphatiques, ainsi que les différents organes, tels le foie, la rate, le cœur, les reins, et les testicules, qui montrent alors d'importantes lésions. La glossine s'infecte et se nourrit sur les animaux parasités, et donc une fois infectée, elle reste infectieuse durant toute sa vie. Dans le cas de T. brucei et T. congolense, le trypanosome subit chez l'insecte un cycle complexe impliquant une dédifférenciation dans l'intestin en formes procycliques non-infectieuses. Dans les glandes salivaires, ou les pièces buccales, les trypanosomes se transforment en formes epimastigotes, adhérentes, qui se multiplient activement. Leur différenciation conduit au stade infectieux représenté par les formes métacycliques, qui ne se divisent plus.
Le cycle de T. vivax ne comporte pas de stade procyclique. Il débute par l'attachement flagellaire des formes sanguines ingérées par la glossine. Elles se différencient en formes epimastigotes, qui prolifèrent puis se différencient en formes métacycliques infectieuses. La durée totale du cycle chez la glossine est d'environ 5 à 10 jours pour T. vivax, 18 jours pour T. congolense, et 30 jours pour T. brucei.
Les sources d'infection des animaux domestiques sont les autres animaux domestiques ou les animaux sauvages malades ou porteurs sains. L'existence de réservoir provient du fait que certaines espèces sont peu réceptives à l'infection, et peu sensibles à la maladie. Les vecteurs potentiels varient en fonction de l'espèce de trypanosome considérée. T. congolense et T. brucei sont exclusivement transmis par des vecteurs biologiques comme les mouches tsé-tsé, mais T. vivax peut être également transmis par des vecteurs mécaniques tels que les mouches piqueuses (tabanidés ou stomoxes). T. evansi est exclusivement transmis par des vecteurs mécaniques. L'efficacité de la transmission dépend du taux d'infection des glossines et des interactions hôte-vecteurs. De façon générale, les trypanosomes infectieux pour l'animal donnent des taux d'infection plus élevés que les trypanosomes infectant l'homme, ce qui contribue à la très large distribution de la trypanosomose animale.
L'analyse des trypanosomes par microscopie électronique montre l'existence d'un manteau d'environ 15 nm recouvrant la totalité du corps cellulaire du parasite. Ce manteau est présent uniquement à la surface des formes sanguines et métacycliques. Il est essentiellement constitué d'une glycoprotéine appelée VSG (Antigène Variable de Surface) et d'autres protéines membranaires en faibles quantités. Les VSGs forment ainsi une structure très dense constituant une barrière physique entre la membrane plasmique et l'hôte. La structure 3D prédit que seule une faible partie de la protéine est exposée à la surface du parasite. Ainsi le principal rôle du manteau serait de masquer les antigènes membranaires non variables du parasite en présentant quelques motifs immunodominants aux défenses immunitaires de l'hôte. Le manteau protège par ailleurs les formes sanguines contre la lyse par activation de la voie alterne du complément.
A l'heure actuelle, le contrôle de la maladie repose essentiellement sur le contrôle des vecteurs par l'utilisation d'insecticides dont l'impact environnemental est loin d'être négligeable. Au niveau de l'infection, le contrôle de la trypanosomose repose exclusivement sur l'utilisation de médicaments, car ces parasites échappent aux défenses immunitaires de l'hôte en exprimant à leur surface des antigènes variables. Ce phénomène de variation antigénique a donc pour l'instant ruiné tous les efforts de développement d'un nouveau vaccin anti-parasite. Seules quelques molécules à effet limité dirigées contre l'agent pathogène, le trypanosome, et appelées trypanocides sont disponibles. Ces traitements par chimiothérapie présentent de nombreuses limites. En effet, le traitement de la trypanosomose fait appel à quelques produits trypanocides découverts pour la plupart il y a plusieurs décennies. Ces produits ont tous des effets secondaires importants et de nombreuses souches de parasites résistants ou multirésistants sont apparues.
Concernant le diagnostic, des techniques rapides, fiables, peu coûteuses et utilisables sur le terrain manquent également. Différentes techniques sont actuellement utilisées mais présentent également de nombreuses limitations. Le diagnostic clinique qui se limite généralement à une suspicion repose sur l'observation de symptômes qui sont généralement peu spécifiques. En effet des infections avec d'autres parasites pouvant provoquer certains symptômes comparables sont fréquentes dans ces régions. La mise en évidence, directe ou après enrichissement, des trypanosomes dans le sang, suc ganglionnaire et autres est réalisée par examen microscopique de préparation (état frais ou coloration au Giemsa), elle permet de confirmer une trypanosomose mais est peu sensible. Les techniques moléculaires telles que la PCR sont onéreuses et demandent trop d'investissement notamment dans le cadre d'études épidémiologiques. Les techniques sérologiques sont basées sur des lysats totaux, sont difficilement standardisables sont sensibles mais peu spécifiques. La recherche d'antigènes spécifiques par des méthodes de type ELISA n'a pas pour l'instant abouti. Dans ce contexte, la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques permettant le développement d'un vaccin « anti-pathologie » destiné à réduire les effets néfastes que la parasitémie a sur l'animal ou de nouvelles molécules trypanocides est une priorité. Résumé de l'invention
Le Demandeur a identifié et caractérisé chez T. congolense une protéine dénommée FLP80 localisée au niveau de la poche flagellaire et du compartiment d'endocytose précoce des formes sanguines du parasite. Le principal domaine d'application envisagé est la lutte contre la trypanosomose et l'utilisation de cette protéine dans un but biotechnologique. En effet, la nouvelle protéine FLP80 est utile pour la vaccination de la trypanosomose, causée par des trypanosomes africains.
Selon l'invention, les séquences peptidiques nouvellement caractérisées sont utilisées pour la production de tests de diagnostic, pour la préparation de compositions vaccinales et pharmaceutiques. La protéine et tout fragment polypeptide antigénique de cette protéine sont par ailleurs utiles pour la production d'anticorps spécifiques des parasites, à des fins de diagnostic ou d'immunisation passive. Enfin, la protéine FLP80 constitue une cible thérapeutique de choix pour le développement d'agents trypanocides ou d'inhibiteurs compétitifs. Brève description des Figures
Figure 1 : représente la séquence nucléotidique codant pour la protéine de la poche flagellaire FLP80 ;
Figure 2: représente la séquence peptidique correspondant à la protéine de la poche flagellaire FLP80 ;
Figure 3A : représente une analyse par Western blot de l'expression de FLP80 au cours du cycle parasitaire dans les formes procycliques (PCF), épimastigotes (EMF), et les formes sanguines (BSF) par rapport l'expression de la tubuline (TUB) au cours des trois stades parasitaires ;
Figure 3B : représente une analyse par Western blot de la protéine FLP80 dans les formes sanguines (BSF) sans et après traitement avec une déglycosidase (PNGase).
Définitions
On entend par « trypanosomes africains », les protozoaires parasites du genre Trypanosoma appartenant au groupe Salivaria, qui lui-même comprend trois principaux sous-genres: Trypanozoon, Duttonella et Nannomonas, tels que définis précédemment. Ceux-ci sont ont été qualifiés de trypanosomes africains, mais se retrouvent, aujourd'hui, toutefois aussi bien sur le continent africains qu'en Asie ou en Amérique du Sud. Les trypanosomes africains les plus courants sont Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, et Trypanosoma brucei.
Les termes « trypanosomose » et « trypanosomose africaine animale (TAA) » désignent généralement les infections des animaux non humains causées par des trypanosomes africains, alors que les termes « trypanosomiase » ou « trypanosomiase africaine » sert à désigner les infections humaines également causées par les trypanosomes africains. Dans un but de simplification, on utilise ici indifféremment les termes trypanosomose et trypanosomiase.
Description détaillée de l'invention
La présente invention a pour objet une molécule d'ADN ou d'ARN, codant pour de nouvelle protéine de la poche flagellaire, dénommée FLP80 spécifique des trypanosomes africains. Cette nouvelle molécule d'ADN ou d'ARN comprend au moins une séquence nucléotidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID NO :1 , une séquence complémentaire, une séquence anti-sens, ou une séquence équivalente à la séquence SEQ ID No: 1 , et notamment une séquence comprenant une identité d'au moins 80%, 85%, 90%, 92%, 93 %, 94% ou 95% sur toute la séquence SEQ ID NO: 1 , ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hydrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes d'hybridation.
On entend par conditions stringentes d'hybridation, une hybridation à une température de 65 'C pendant une nuit dans une solution contenant 0,1 % de SDS, 0,7% de lait en poudre écrémé et 6X de SSC, suivie de lavages à température ambiante dans du 2X SSC - 0,1 % SDS et à 65 <C dans du 0,2X SSC - 0,1 % SDS.
L'invention concerne également des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire, anti-sens, ou équivalente à la séquence SEQ ID NO : 1 , et notamment les fragments d'ADN ou d'ARN, pour une séquence d'environ 30 à 100 nucléotides contigus, ou environ 30 à 50, et de préférence au moins 30 nucléotides contigus, ayant au moins 50%, au moins 60%, au moins 70%, ou encore au moins 80%, 85%, 90%, 92%, 93 %, 94% ou 95% d'homologie avec la séquence SEQ ID NO :1 , ou encore une séquence nucléotidique susceptible de s'hydrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes d'hybridation.
Par séquence nucléotidique, on entend au moins un brin d'ADN ou son brin complémentaire, soit un brin d'ARN ou son brin anti-sens ou l'ADN complémentaire correspondant. La séquence d'ADN selon SEQ ID NO: 1 correspond à la séquence de l'ARN messager, étant entendu que la thymine (T) dans l'ADN est remplacé par l'uracile (U) dans l'ARN.
Selon l'invention, deux séquences nucléotidiques sont dites équivalentes l'une par rapport à l'autre, du fait de la variabilité naturelle, notamment mutation spontanée de l'espèce à partir de laquelle elles ont été identifiées, ou induite, ainsi que des séquences homologues, l'homologie étant définie ci-après. Par variabilité, on entend toute modification, spontanée ou induite d'une séquence, notamment par substitution, et/ou insertion, et/ou délétion de nucléotides et/ou de fragments nucléotidiques, et/ou extension et/ou raccourcissement de la séquence à l'une au moins des extrémités, ou bien une variabilité non naturelle pouvant résulter des techniques de génie génétique utilisées. Cette variabilité peut se traduire par des modifications de toute séquence dis départ, considérée comme référence, et pouvant être exprimées par un degré d'homologie par rapport à ladite séquence de référence.
L'homologie caractérise le degré d'identité de deux fragments nucléotidiques (ou peptidiques) comparés; elle se mesure par le pourcentage d'identité qui est notamment déterminé comparaison directe de séquences nucléotidiques (ou peptidiques), par rapport à des séquences nucléotidiques (ou peptidiques) de référence. L'invention a pour objet une protéine de Trypanosoma congolense, dénommée FLP80, présentant une masse moléculaire apparente d'environ 40 kDa, ainsi que les fragments peptidiques antigéniques ou un équivalent immunologique de ladite protéine. Elle a été identifiée dans un extrait de protéines membranaires des formes sanguines du parasite par une analyse de spectrométrie de masse. La séquence de la protéine flagellaire FLP80 comprend 41 1 acides aminés, et est représentée dans la séquences SEQ ID No: 2. L'analyse de la séquence montre la présence d'un peptide signal et d'un domaine transmembranaire en positions 354 à 379. La séquence est riche en cystéines mais aucun motif particulier n'est présent. Par ailleurs, le Demandeur a montré que la protéine FLP80 est exprimée de façon différentielle au cours du cycle du trypanosome. En effet, comme cela est montré dans la partie expérimentale, à l'Exemple 2 ci-dessous, la protéine FLP80 n'est pas détectée dans les formes procycliques (PCF), mais elle est détectée dans les formes épimastigotes (EMF) à un poids moléculaire d'environ 60kDa et dans les formes sanguines (BSF) à un poids moléculaire de 65kDa. Un traitement à l'aide de déglycosidases a permis de montrer que la différence de taille entre le poids moléculaire observé en western-blot et le poids moléculaire théorique est due à une forte glycosylation de la protéine. De plus, FLP80 est particulièrement abondante dans les formes sanguines. Plus précisément, FLP80 est présente en 2,7.105 exemplaires par cellule. Son immunolocalisation dans les formes sanguines montre que la protéine se trouve au niveau de la poche flagellaire et du compartiment d'endocytose (Exemple 3). Cette protéine est exprimée dans les formes sanguines du parasite, elle est donc présente tout au long de l'infection, ce qui représente un avantage par rapport aux candidats vaccinaux ou diagnostics développés jusqu'à présent qui ont été mis en évidence uniquement dans les formes parasitaires se trouvant dans l'insecte. En effet, il n'est pas sûr que de tels candidats soient exprimés au cours de l'infection, alors que la présence du candidat dans le sang de l'hôte mammifère infecté est un préalable nécessaire à son utilisation notamment pour l'établissement d'un test diagnostic.
Par équivalent immunologique, on entend tout polypeptide ou peptide susceptible d'être immunologiquement reconnus par les anticorps dirigés contre la protéine FLP80.
L'invention concerne par ailleurs tout fragment de la protéine FLP80, et plus particulièrement tout fragment peptidique antigénique spécifiquement reconnu par des antisera anti-trypanosomes africains.
La protéine et lesdits fragments protéiques selon l'invention peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité. Les peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique, lyse de la protéine FLP80, ou par des techniques de recombinaison génétique.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet une nouvelle stratégie antiparasitaire, selon laquelle la protéine FLP80 est utilisée en tant que cible thérapeutique. Plus précisément, cette nouvelle stratégie antiparasitaire consiste à utiliser la nouvelle protéine flagellaire FLP80 en tant que cible thérapeutique pour l'internalisation d'un agent trypanocide ou pour inhiber la croissance ou la multiplication des parasites infectieux. La protéine FLP80 étant très abondante dans la membrane de la poche flagellaire, elle constitue en effet une cible thérapeutique de choix pour l'internalisation de molécule trypanocide dans les parasites. La poche flagellaire est le seul lieu d'échange entre le parasite et le milieu extérieur et n'est pas contrairement au reste du corps cellulaire recouvert du manteau dense et impénétrable d'antigènes variables de surface (VSG). Très peu de protéines flagellaires ont jusqu'à présent été décrites chez les trypanosomatides et les seules connues sont présentes en un faible nombre d'exemplaires par cellule. Cette protéine membranaire qui vu son abondance recouvre vraisemblablement une grande surface de la poche flagellaire et semble indispensable à la survie du parasite dans l'hôte mammifère infecté. Par conséquent, par rapport aux cibles thérapeutiques jusqu'à présent envisagées, la protéine FLP80 présente de nombreux avantages en termes d'abondance, de localisation, de fonction et spécificité, qui permettent d'envisager une stratégie visant à bloquer la fonction de cette protéine. Selon cet aspect de la présente invention, il a été notamment découvert que la protéine membranaire FLP80 correspond à un transporteur actif de lipoprotéines HDL. Plus précisément, le substrat de la FLP80 a été identifié par chromatographie d'affinité avec des protéines sériques de souris comme étant la fraction HDL (identification des apolipoprotéines A1 et E par spectrométrie de masse).
Par conséquent, la présente invention a pour objet les apoliprotéines A1 ou E, et notamment un complexe thérapeutique, comprenant une apoliprotéine A1 ou E complexée de manière fonctionnelle à une molécule toxique, et susceptible de se lier au transporteur FLP80. Le couplage du ligand apoliprotéine de la FLP80 avec une molécule thérapeutique toxique permet d'internaliser, et ainsi de concentrer fortement de telles molécules toxiques dans le parasite, via l'interface privilégiée que constitue la poche flagellaire.
De plus, l'utilisation selon l'invention de la protéine FLP80 en tant que transporteur de molécules toxiques représente un avantage par rapport à une stratégie vaccinale classique de longue haleine. La concentration des molécules toxiques au niveau de l'agent infectieux visé étant toujours un problème majeur dans un traitement, sa présence en grand nombre au niveau de la zone d'échange privilégiée que constitue la poche flagellaire du parasite pourrait permettre de concentrer très fortement une molécule toxique et ainsi d'augmenter les chances de réussite du traitement, de limiter les risques de toxicité pour l'hôte et de réduire les coûts du traitement.
Parmi les composés possédant une activité trypanocide susceptibles d'être couplés au ligand apolipoprotéine et internalisés dans les parasites via la protéine FLP80, on peut citer les agents trypanocides tels que la diamidine (pentamidine ou mésilate de pentamidine, diminazène ou acéturate de diminazène), des dérivés arsenicaux tels que le mélarsoprol®, melarsomine, l'éflornithine ou DMFO, l'arsobal, le MelBdm, des dérivés du nitrofurane tel que le nifurtimox ou le 5-nitrofurane, des analogues de l'ornithine (éflornithine® ou difluorométhylornithine), la phénanthridrine (isométamidium ou homidium® ), un naphturée polysulfoné tel que la suramin®, un antimalinique tel que la quinapyramine, le buthionine sulfoximine (BSO), l'azaserine, 6-diazo-5-oxo-norleucine (DON), et/ou l'acivicine.
Les molécules toxiques sont couplées de manière fonctionnelle au ligand apolipoprotéine de sorte à permettre (1 ) la fixation du complexe à la protéine FLP80 avec une affinité du même ordre que le ligand apolipoprotéine non couplé, et (2) l'internalisation et la concentration du complexe trypanocide dans le parasite trypanosome.
Comme équivalent fonctionnel du complexe apoliprotéine-molécule toxique, on utilise toute molécule ayant une affinité de liaison pour la protéine membranaire FLP80 similaire au substrat apolipoprotéine. On peut par exemple citer un anticorps tel que décrit ci-dessous dirigé spécifiquement contre la protéine FLP80, lié à une molécule toxique trypanocide et susceptible de provoquer après fixation sur la FLP80, l'internalisation de la molécule toxique dans le trypanosome. Par conséquent, selon la présente invention, le complexe apolipoprotéine-molécule toxique ou un équivalent fonctionnel est utilisé en tant que composition vétérinaire contre les trypanosomoses. De telles compositions vétérinaires trypanocides comprennent le substrat apoliprotéine couplé de manière fonctionnelle à un agent trypanocide tel que décrit ci-dessus en quantité thérapeutiquement suffisante pour traiter et/ou prévenir les trypanosomoses animales ou humaines africaines. Egalement, les méthodes de traitement des trypanosomoses comprennent l'obtention d'un complexe substrat apolipoprotéine ou équivalent, le couplage du substrat à un agent toxique ou trypanocide, et l'administration du complexe trypanocide ainsi obtenu à un humain et/ou à un animal non humain ayant été ou susceptible d'avoir été infecté par des trypanosomes africains.
Les méthodes de détermination de la fixation du substrat apolipoprotéine ou équivalent, et/ou d'un complexe trypanocide selon l'invention sur les protéines membranaires telles que la FLP80 sont bien connues de l'homme du métier, et peuvent se faire par exemple par des expériences d'inhibition compétitive entre le ligand apolipoprotéine A1 ou E, et le complexe trypanocide ou par la technologie BIAcore permettant ainsi d'étudier la fixation en temps réel sans marquage du substrat ou de la protéine FLP80. Cette technique est basée sur le principe d'un biocapteur basé sur l'utilisation de la résonance plasmonique de surface qui détecte des variations de masse à la surface d'une « sensor chip » sur laquelle le ligand apolipoprotéine ou le complexe est immobilisé de façon covalente ou non, et la protéine FLP80 est injectée par un système microfluidique dans un flux continu de tampon à la surface de la sensor chip. Le suivi en temps réel permet de déterminer les constantes cinétiques d'association et de dissociation, et d'en déduire la valeur de la constante d'affinité.
Egalement, les mesures de l'internalisation des complexes trypanocides peuvent être conduites sur des lignées cellulaires exprimant la protéine FLP80 recombinante, et traitées avec le complexe trypanocide comprenant un substrat apolipoprotéine marquée radioactive couplée de manière fonctionnelle à un agent toxique, et la mesure de la radioactivité associée aux cellules.
Alternativement, la présente invention a pour objet des inhibiteurs compétitifs de la liaison du substrat naturel à la protéine FLP80. De tels inhibiteurs compétitifs sont par exemple une apolipoprotéine A1 ou E tronquée, c'est-à-dire comprenant entre 10 à 80% de la taille des apoliprotéines A1 et E naturelles. Des anticorps spécifiques du site de liaison sur la FLP80 peuvent également constituer des inhibiteurs compétitifs de la liaison du substrat naturel sur la FLP80, et ainsi inhiber la croissance et détruire les trypanosomes infectieux.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de criblage des complexes trypanocides susceptibles d'être internalisés via la protéine FLP80 dans les trypanosomes infectieux et ainsi susceptibles de détruire les trypanosomes infectieux. Alternativement, la présente invention a pour objet un procédé de criblage d'agents inhibiteurs de la protéine FLP80, susceptibles d'inhiber le cycle infectieux des trypanosomes, leur croissance ou leur multiplication dans l'hôte animal non humain infecté. Les procédés selon l'invention comportent une étape d'évaluation de la capacité desdites molécules ou agents à être internalisés et à se concentrer dans les parasites afin d'induire leur destruction, et/ou à inhiber l'activité ou la fonction de la protéine FLP80, et/ou à arrêter les cycles infectieux des parasites, et/ou induire une réduction de leur multiplication ou de leur croissance.
Le procédé de criblage selon l'invention comporte donc un test d'inhibition de la croissance/multiplication des trypanosomes africains. Les agents trypanocides criblés par le procédé tel que défini ci-dessus sont caractérisés par leur capacité à inhiber ou à moduler la croissance ou la multiplication des trypanosomes africains infectieux.
Par conséquent, les compositions comprenant des agents trypanocides ou des molécules inhibitrices de la protéine FLP80 en tant que thérapies pour la lutte contre les trypanosomoses, ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prophylaxie, ainsi que les méthodes de traitement et/ou de prévention des trypanosomoses comprenant l'administration de tels agents trypanocides, molécules inhibitrices ou compositions font également partie intégrante de l'invention.
Selon un troisième aspect, la présente invention a pour objet une cassette d'expression fonctionnelle, notamment dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour la totalité ou un fragment de la protéine FLP80. En particulier, un fragment d'ADN tel que défini précédemment est placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression. Ladite protéine ou fragments protéiques ainsi exprimés sont reconnus par des antisera anti-trypanosomes africains.
D'une façon générale, toute cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. De telles cellules sont connues de l'homme de l'art. A titre d'exemples, on peut citer les cellules issues d'un organisme eucaryote, telles que les cellules issues d'un mammifère, notamment les cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian); les cellules d'insectes; les cellules issues d'un champignon, notamment unicellulaire ou d'une levure, notamment de la souche Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces et tout particulièrement sélectionnée dans le groupe constitué de Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, et Schizosaccharomyces octosporus. De même, parmi les cellules issues d'un organisme procaryote, on peut avoir recours, sans que cela constitue une limitation, aux cellules d'une souche Escherichia coli (E coli) ou à des cellules d'entérobactéries. La cellule peut être de type sauvage ou mutant. Les mutations sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier. De préférence, on utilise une cellule E. coli, telle que par exemple BL21 (DE3).
La cassette d'expression de l'invention est destinée à la production de la protéine FLP80 ou des fragments de cette protéine par exemple dans E. coli, qui sont reconnus par des antisera anti-trypanosomes africains. De tels antisera proviennent d'animaux ayant contracté une infection récente ou ancienne par T. congolense, et qui contiennent des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement la protéine FLP80. Egalement, de la protéine FLP80 peut être reconnue par d'autres anticorps, comme par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par immunisation d'espèces variées avec la protéine précitée naturelle, la protéine recombinante, leurs fragments ou peptides.
Par protéine flagellaire FLP80, on entend l'antigène membranaire de T. congolense, produit notamment par les techniques de recombinaison génétique décrites dans la présente demande, ou tout fragment ou mutant de cet antigène à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec des anticorps dirigés contre de la protéine FLP80 de ces parasites.
De manière avantageuse, lesdites protéines possèdent une séquence en acides aminés présentant un degré d'homologie d'au moins 70 %, d'au moins 80%, de préférence d'au moins 85 %, ou 90% et, de manière tout à fait préférée, d'au moins 92%, 93%, 94%, ou au moins 95 % par rapport à la séquence SEQ ID No :2. En pratique, un tel équivalent peut être obtenu par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou recombinante. Il est à la portée de l'homme de l'art d'effectuer par des techniques connues ces modifications sans affecter la reconnaissance immunologique.
Dans le cadre de la présente invention, la protéine FLP80 peut être modifiée in vitro, notamment par délétion ou addition de groupements chimiques, tels que des phosphates, sucres ou acides myristiques, de manière à améliorer sa stabilité ou la présentation d'un ou de plusieurs épitopes.
La cassette d'expression selon l'invention permet la production de la protéine FLP80, ayant la séquence en acides aminés telle que spécifiée précédemment, et de fragments desdites protéines, peuvent être avantageusement fusionnées à un élément exogène pouvant aider à sa stabilité, sa purification, sa production ou sa reconnaissance. Le choix d'un tel élément exogène est à la portée de l'homme de l'art. Il peut notamment s'agir d'un haptène ou d'un peptide exogène.
La cassette d'expression selon l'invention comprend les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule considérée. Par "éléments nécessaires à l'expression", on entend l'ensemble des éléments qui permettent la transcription du fragment d'ADN en ARN messager (ARNm), tels que des séquences promotrice (par exemple le promoteur CMV) et terminatrice de la transcription, ainsi que des éléments permettant la traduction de ce dernier en protéine.
La présente invention s'étend par ailleurs aux vecteurs comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Il peut également s'agir d'un vecteur plasmidique à réplication autonome et en particulier d'un vecteur multiplicateur. Il peut s'agir d'un vecteur viral et notamment d'un vecteur dérivé d'un baculovirus, plus particulièrement destiné à l'expression dans les cellules d'insectes, ou un vecteur dérivé d'un adénovirus pour l'expression dans les cellules de mammifères.
La présente invention concerne également une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant une cassette d'expression, soit sous forme intégrée dans le génome cellulaire, soit insérée dans un vecteur.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de préparation de la protéine FLP80, ou de fragments de ladite protéine, selon lequel: (i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant la cassette d'expression selon l'invention; et (ii) on récupère la protéine exprimée issue de l'organisme précité.
Selon un quatrième aspect, l'invention concerne des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction immunologique d'un organisme animal non humain à un agent immunogène constitué par de la protéine FLP80 naturelle ou recombinante, et de fragments peptidiques, tels que définis précédemment. Les techniques de production des anticorps sont bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemples, les anticorps polyclonaux selon la présente invention peuvent être générés en injectant la protéine FLP80 ou un fragment peptidique antigénique à des lapins ou des souris afin de les immuniser. Les sérums polyclonaux de lapin ou de souris ainsi obtenus sont testés quant à leur réactivité par ELISA indirect.
Selon un cinquième aspect, la présente invention a pour objet une composition immunothérapeutique active, notamment une préparation vaccinale, qui comprend la protéine FLP80 naturelle, recombinante, un ou plusieurs fragments peptidiques antigéniques de la protéine, tels que définis ci-dessus, et éventuellement un excipient et/ou un adjuvant approprié.
Les compositions vaccinales ou vétérinaires selon l'invention sont destinées au traitement et/ou la prévention d'une infection par les trypanosomes africains chez un humain et/ou un animal non humain.
Plus particulièrement, des compositions selon l'invention sont destinées au traitement et/ou la prévention d'une infection contre T. congolense. Les trypanosomoses africaines, dues au ¾ par T. congolense, se traduisent chez l'animal par des syndromes de gravité variable, allant de l'infection aiguë mortelle en 3 à 4 semaines, jusqu'à l'infection chronique durant des mois voire des années. L'évolution chronique, caractérisée par des parasitémies intermittentes, est la plus fréquente chez les bovins africains. La maladie débute par une phase d'hyperthermie, puis deux à trois semaines après la piqûre infectante, le nombre de globules rouges, le taux d'hémoglobine et l'hématocrite chutent, reflétant l'anémie, qui est le symptôme majeur des trypanosomoses. Les animaux chroniquement infectés ont une consommation alimentaire réduite, ils deviennent cachectique, leur croissance est freinée, et des effets négatifs sur la reproduction sont observés. L'anémie des trypanosomoses s'établit selon deux phases. Au cours de la phase initiale, l'anémie s'accompagne de la parasitémie et résulte essentiellement d'une hémolyse extra-vasculaire : les globules rouges sont détruits par le système phagocytaire dans la rate, le foie, dans la circulation et la moelle osseuse. A terme, l'anémie se traduit par un dysfonctionnement de la moelle osseuse.
Lesdites compositions vaccinales vétérinaires peuvent se présenter sous la forme de vaccin antigénique et comprennent alors une quantité thérapeutiquement efficace de la protéine FLP80 naturelle, recombinante ou des fragments peptidiques de celle-ci, tels que précédemment décrits.
Les compositions vaccinales peuvent se présenter sous la forme de vaccins ADN et peuvent alors comprendre une cassette d'expression, un vecteur, une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote tels que définis précédemment, susceptible d'exprimer la protéine FLP80, ou les fragments peptidiques antigéniques, ou encore une combinaison de ceux-ci.
Les vaccins selon la présente invention peuvent être des vaccins monovalents comprenant une quantité efficace d'une protéine FLP80 naturelle, recombinante, et/ou des fragments peptidiques antigéniques et/ou des séquences nucléotidiques codant pour ces peptides ou fragments peptidiques.
Ce vaccin monovalent prévient l'infestation et donc l'expression de la maladie.
Si ce vaccin ne prévient pas l'infestation mais uniquement l'expression de la maladie, il pourrait être appelé vaccin « anti maladie ». Dans ce cas et étant donné que le diagnostic différentiel avec d'autres parasitoses du sang n'est actuellement pas systématique, l'utilisation de vaccins multivalents associant le vaccin dit « anti-maladie » à des antigènes d'autres trypanosomes et/ou d'autres actifs thérapeutiques et/ou d'autres vaccins couramment utilisés en prophylaxie est particulièrement avantageux selon la présente invention.
Ainsi les vaccins selon la présente invention peuvent être des vaccins monovalents associant une ou plusieurs protéines naturelles, recombinantes et/ou des fragments peptidiques et/ou séquence nucléotidique codant pour les dits peptides et fragments peptidiques d'une ou plusieurs espèces de trypanosomes, et de préférence dérivés d'une ou plusieurs espèces similaires ou différentes de trypanosomes.
Ces peptides, fragments antigéniques ou cocktails de peptides antigéniques dérivés de trypanosomes, sont par exemple des sialidases, des trans-sialidases, des tubulines, des protéases, des lipases, mais également d'autres protéines flagellaires.
A titre d'exemples de trans-sialidases susceptibles d'être incorporées dans les vaccins multivalents, on peut citer les trans-sialidases de T. cruzi, T. congolense, T. vivax, T. evansi, T. brucei, T. rhodesiense, et/ou T. gambiense. Certaines trans-sialidases de T. congolense sont entre autres décrites dans la demande internationale WO2004/55176 ou par Tiralongo E. et al. (JBC vol. 278, No. 26, pp 23301 -10, 2003). Plus précisément, on peut citer les chaînes A et B des trans-sialidase de T.cruzi telles que déposées dans GenBank sous les numéros Gl:29726491 , Gl:29726490, Gl:29726489 et Gl:29726488. Il est également avantageux d'utiliser des formes mutées inactives des transialidases. A cet égard, on peut citer les trans-sialidases mutantes de T. cruzi décrites par exemple dans la demande internationale WO2007/107488, qui ont conservées moins de 20% de leur activité enzymatique de sialidase et transferase.
A titre d'exemples de tubulines dérivées de trypanosomes, on peut citer la tubuline alpha T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAA30262.1 ), ou la tubuline beta (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAA30261 .1 ), la tubuline epsilon de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession EAN77544.1 ), les tubuline epsilon de T. brucei TREU927 (référencée dans NCBI sous les numéros XP_822372.1 et XP_829157.1 ), la tubuline delta de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession EAN80045.1 ), la tubuline zeta de T. brucei (référencée dans NCBI sous le numéro XP 001218818.1 ), ou encore les tubulines de T. brucei qui sont décrites dans la demande internationale WO 2008/134643.
A titre d'exemples de protéines flagellaires dérivées de trypanosomes, on peut citer la protéine flagellaire de T. brucei telle que décrite dans la demande internationale WO2002/19960, ou encore la protéine flagellaire de T. congolense décrite dans la demande française du Demandeur déposée le 13 novembre 2009 sous le numéro FR09/58035. On peut encore citer la protéine flagellaire de T. brucei TREU927 ou les protéines flagelles-like (référencées dans NCBI sous les numéros XP_847376.1 ; XP_847374.1 ; XP_847295.1 ; XP_843961 .1 ; XP_847377.1 ), la protéine flagellaire TB-44A de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAZ13310.1 ), la protéine flagellaire TB-24 de T. brucei (déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAZ13308.1 ), la protéine flagellaire de T. brucei déposée dans GenBank sous le numéro d'accession AAZ1331 1 .1 . A titre d'exemples de protéases on peut citer les cystéines protéases des trypanosomes, telles que la congopaine ou la trypanopaine-Tc de T. congolense, la rhodesaine de T. rhodesiense, la chagasine ou la cruzipaine de T. cruzi.
Les vaccins selon la présente invention qu'ils soient monovalents ou multivalents peuvent également comprendre des adjuvants afin d'augmenter la réponse antigénique. Les adjuvants son bien connus dans l'état de la technique. A titres d'exemples d'adjuvants, on peut citer la vitamine E, les gels ou les sels d'aluminium, tells que l'hydroxyde d'aluminium les phosphates d'aluminium, les sels de métaux, les saponines, polymères de l'acide polyacrylique, tels que les carbopols®, les polymères à bloc non ioniques, les aminés d'acides gras, telles que l'avridine et le DDA, les polymères à base de dextran, tels que le sulfate dextran, et le DEAE dextran, les liposomes, des immunogènes bactériens, tels que le LPS, les peptidoglycanes, ou les MDP.
Les animaux non humains susceptibles d'être traités incluent par exemple les bovidés, les ovidés, les félidés, les suidés, les camélidés, et/ou les canidés.
Alternativement, les vaccins peuvent comprendre une quantité thérapeutique efficace d'un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit ci-dessous.
Les vaccins multivalents selon la présente invention peuvent en outre contenir des antigènes des autres parasitoses du sang dérivés par exemple de protozoaires tels que Theirlera parva, Babesia bigemina, et B. divergens, T. annulata, pour le traitement et/ou la prévention des trypanosomes et de la theilériose, l'anaplasmose, et/ou la babésiose.
Ceux-ci peuvent être en outre associés à d'autres vaccins standards utilisés pour la prophylaxie et/ou le traitement de parasitoses dans les zones cibles, à savoir contre la fièvre aphteuse, les clostridioses, la peste, la fièvre catarrhale, la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB), le charbon symptomatique, les pasteurelloses, et/ou la clavelée.
Les vaccins selon la présente invention sont particulièrement utiles pour traiter et/ou prévenir les pathogénies induites par les trypanosomoses, telles que notamment les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression des hommes ou des animaux non humains.
Les vaccins monovalents ou multivalents peuvent être également administrés en association avec des agents anti-parasitaires, des agents anti-infectieux, et/ou des agents anti-symptomatiques.
Les agents antiparasitaires sont par exemple des trypanocides, tels que la diamidine (pentamidine ou mésilate de pentamidine, diminazène ou acéturate de diminazène), des dérivés arsenicaux tels que le mélarsoprol®, melarsomine, l'éf lornithine ou DMFO, l'arsobal, le MelBdm, des dérivés du nitrofurane tel que le nifurtimox ou le 5-nitrofurane, des analogues de l'ornithine (éflornithine® ou difluorométhylornithine), , la phénanthridrine (isométamidium ou homidium® ), un naphturée polysulfoné tel que la suramin®, un antimalinique tel que la quinapyramine, le buthionine sulfoximine (BSO), l'azaserine, 6-diazo- 5-oxo-norleucine (DON), et/ou l'acivicine. Lorsque les vaccins sont administrés en association avec des antiparasitaires, ces derniers seront administrés avant et/ou simultanément et/ou après les vaccins mono ou multivalents précédemment décrits. D'autres antiparasitaires non spécifiques des trypanosomes sont bien connus dans le domaine, et seront administrés avant et/ou simultanément et/ou après les vaccins selon l'invention. Parmi ceux-ci on peut citer les avermectines (ivermectine, abamectine, doramectine, eprinomectine et selamectine), des pyréthrines (deltaméthrine, etc.), et/ou les antiparasitaires anthelminthiques (oxybendazole, piperazine, flubendazole).
A titre d'exemples d'agents anti-infectieux, on peut citer les antibiotiques tels que les β-lactamines, la fosfomycine, les glycopeptides ou les polypeptides à activité antibiotique, la bacitracine, les aminoglycosides, les macrolides, les lincosamides, les streptogramines, les tétracyclines, les phénicolés, les fusidanides, ou les quinolones
Les agents anti-symptomatiques sont par exemple des agents anti-anémiques, tels que le fer, la vitamine B12, l'acide folique, le calcium lévofolinate ; des agents hépatoprotecteurs, tels que les complexes de flavonoides (sylymarin silybin, etc.), le curcuma, le desmodium ascendens, et/ou le chrysanthellum Americanum (charbon).
Les anti-inflammatoires non stéroidiens (AINS) peuvent être entre autres des oxicams (meloxicam, piroxicam, et/ou ténoxicam), des dérivés salicylés (salicylate de méthyle et acétylate de lysine), des acides 2-arylproprioniques (profènes), des dérivés indoliques des sulfonamides, des AINS cox-2 sélectifs (célécoxib, étoricoxib, etc .), la phénylbutazone, l'acide niflumique, et/ou les acides phénamiques.
Selon un sixième aspect, la présente invention a pour objet des sondes ou des amorces spécifiques des Trypanosomes africains, et leurs utilisations dans des tests de diagnostic.
Le terme sonde tel qu'utilisé dans la présente invention fait référence à l'ADN ou l'ARN comportant au moins une séquence nucléotidique permettant l'hybridation aux acides nucléiques ayant au moins une séquence nucléotidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID No: 1 , une séquence complémentaire, une séquence anti-sens, ou une séquence équivalente à ladite séquence, et notamment une séquence présentant, 5 à 100 nucléotides contigus, au moins 50 %, de préférence au moins 60 %, au moins 70% ou au moins 85 % d'homologie avec la séquence SEQ ID No :1 , ou à un oligonucléotide de synthèse permettant une telle hybridation, non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5- désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée. De même, ces sondes peuvent être modifiées au niveau du sucre, à savoir le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide ou au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, dialkyle et arylphosphonate et de phosphorothioate.
Les sondes peuvent être beaucoup plus courtes que la séquence identifiée dans la séquence SEQ ID No: 1 . En pratique, de telles sondes comprennent au moins 5 nucléotides, avantageusement entre 5 et 50 nucléotides, de préférence aux alentours de 20 nucléotides, et possèdent une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec l'ADN ou l'ARN ayant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment. Les sondes selon l'invention peuvent être utilisées à des fins de diagnostic, comme sonde de capture et/ou de détection.
Les amorces selon l'invention comprennent une séquence de 5 à 30 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID No : 1 , et possèdent une spécificité d'hybridation dans des conditions prédéterminées, pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain Reaction), dans un procédé d'élongation tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue.
Selon un septième aspect, l'invention comprend un réactif pour la détection et/ou la surveillance ainsi qu'un procédé et des kits pour le diagnostic d'infections par T. congolense. Les réactifs pour la détection ou kits de diagnostic des trypanosomes comprennent à titre de substance réactive au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment. Alternativement, les réactifs pour la détection ou kit de diagnostic des trypanosomes comprennent une sonde et/ou une amorce pour détecter et/ou identifier les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, en particulier une sonde de capture et/ou une sonde de détection, l'une et/ou l'autre répondant à la définition donnée ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préférentiel, la présente invention concerne plus particulièrement un procédé d'immunodétection et d'immunolocalisation de la protéine FLP80 au cours du cycle parasitaire.
Le réactif utilisé pour l'immunodétection ou l'immunolocalisation peuvent être fixés directement ou indirectement sur un support solide approprié. Le support solide peut être notamment sous la forme d'un cône, d'un tube, d'un puits, de bille, ou analogues.
Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un réactif pour une utilisation dans les tests de diagnostic. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés chimiquement ou non peuvent être utilisés comme supports solides, notamment des polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose; des polymères tels que chlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou copolymères tels que polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymères de chlorure de vinyle et acétate de vinyle, des copolymères à base de styrène, des fibres naturelles telles que le coton et les fibres synthétiques telles que le nylon.
La fixation du réactif sur le support solide peut être réalisée de manière directe ou indirecte. De manière directe, deux approches sont possibles: soit par adsorption du réactif sur le support solide, c'est à dire par des liaisons non covalentes (principalement de type hydrogène, Van der Walls ou ionique), soit par établissement de liaisons covalentes entre le réactif et le support. De manière indirecte, on peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur le support solide un composé "anti-réactif" capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support solide. A titre d'exemple, on peut citer un anticorps anti-FLP80, à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec une partie de la protéine différente de celle intervenant dans la réaction de reconnaissance des anticorps des sera; un système ligand-récepteur, par exemple en greffant sur la protéine FLP80 une molécule telle qu'une vitamine, et en immobilisant sur la phase solide le récepteur correspondant (par exemple le système biotine-streptavidine). Par manière indirecte, on entend également le greffage au préalable ou fusion par recombinaison génétique d'une protéine, ou un fragment de cette protéine, ou d'un polypeptide, à une extrémité de la protéine FLP80, et l'immobilisation de ces dernières sur le support solide par adsorption passive ou covalence de la protéine ou du polypeptide greffé ou fusionné.
Les sondes de capture peuvent être immobilisées sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive. Les sondes de détection sont marquées au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la phosphatase alcaline, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes, fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotidique, et la biotine.
Les sondes de la présente invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en œuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment les techniques dites "Dot-Blot", Southern Blot, Northern Blot, qui est une technique identique à la technique Southern Blot mais qui utilise de l'ARN comme cible, la technique sandwich.
Le procédé d'immunodétection et/ou de d'une infection par les trypanosomes africains dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un animal non humain, consiste à mettre en contact ledit échantillon avec un réactif tel que défini ci- dessus, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, puis la détection de la présence d'un complexe immun avec ledit réactif. De préférence, ledit procédé met en œuvre un sérum immun comprenant des anticorps polyclonaux obtenus par exemple à partir de souris immunisées par la protéine recombinante exprimée chez E.coli.
Selon un mode de réalisation préférentiel, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic des trypanosomoses comprenant la détection de la protéine FLP80 en tant qu'antigène circulant au cours de l'infection, et la mise en évidence de la présence des parasites trypanosomes dans le bétail se trouvant en zone endémique afin d'appliquer le traitement approprié.
A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection par la technique ELISA en une ou plusieurs étapes, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de compétition bien connues de l'homme du métier.
Enfin selon cet aspect, la présente invention a pour objet un kit à usage vétérinaire pour le diagnostic de trypanosomoses dans un échantillon biologique comprenant une sonde ou une amorce, ou bien un anticorps tel que précédemment décrit ainsi qu'un réactif pour la détection d'une réaction immunologique. Les kits selon la présente invention comportent au moins un compartiment pour un conditionnement éventuellement stérile comprenant une quantité thérapeutique efficace d'un réactif tel que précédemment décrit, ainsi qu'une fiche d'instructions concernant le protocole de mise en œuvre du diagnostic vétérinaire selon l'invention.
EXEMPLES
Exemple 1 : Démonstration de l'expression de la protéine FLP80 au cours du cycle parasitaire
5.106 cellules de la souche IL3000 de T. congolense pour les formes procycliques (PCF), épimastigotes (EMF) et les formes sanguines (BSF) ont été soumises à une analyse en western blot avec un immunserum dirigé contre FLP80 ou contre la tubuline (contrôle de charge).
Comme cela est montré sur le Western blot à la Figure 3, aucun signal n'a été détecté dans les formes procycliques, un signal correspondant à un poids moléculaire de 60 kDa a été détecté dans les formes épimastigotes et un signal encore supérieur a été détecté correspondant à un poids moléculaire de 65 kDa. Un signal constant a été détecté dans les 3 stades parasitaires pour la tubuline.
Exemple 2 : Immunolocalisation de FLP80 dans les formes sanguines de T. congolense
Les formes sanguines de T. congolense ont été marquées avec du DAPI qui colore l'ADN du noyau et de la mitochondrie (kinétoplaste), un immunserum dirigé contre FLP80, ou de la lectine de tomate qui colore la poche flagellaire et l'endosome précoce. L'image en superposition (overlay) montre que le signal correspondant à FLP80 colocalise uniquement au niveau de la poche flagellaire à proximité du kinétoplaste avec celui de la lectine de tomate, le compartiment d'endocytose précoce n'a été marqué que par la lectine.
Exemple 3 : Essais de vaccination avec la protéine flagellaire FLP80
2 lots de bovins sont injectés en sous-cutané avec la protéine antigénique FLP80 mélangée avec deux types d'ajuvants Quil A (saponine) 1 mg/ml et Adjuphos (Phosphate d'aluminium colloïdal) volume à volume selon un volume final de 1 mL ou juste avec le mélange d'adjuvants (contrôle). 3 injections à 3 semaines d'intervalle sont réalisées avec respectivement 100 μg, 50 μg et 25 μg d'antigène(s). Les animaux sont infectés par la souche IL3000 de T. congolense 3 semaines après la dernière injection à raison de 1000 parasites par animal en intradermique. Des prélèvements de sang journaliers sont réalisés jusqu'à ce que tous les animaux soient reconnus infectés, la détermination de la parasitémie se faisant sur buffy-coat. Puis des prélèvements de sang hebdomadaires sont réalisés pour suivre la parasitémie et l'anémie, le poids des animaux est suivi mensuellement. La cinétique de réponde à l'immunisation et à l'infection est suivie par ELISA sur les différents antigènes immunisants. Exemple 4 : Exemple de tests de diagnostic sur sang d'animaux infectés
Ce test est réalisé par détection de l'antigène circulant FLP80 par la méthode ELISA sandwich. L'anticorps anti-FLP80 dit de capture est adsorbé dans les puits d'une plaque 96 puits par incubation sur la nuit à 4°C de 1 à 10 μg/mL d'anticorps de capture dilué dans 100 μ\- tampon NaHC03 50 mM pH9,6. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS-Tween (3,2 mM Na2HP04 ; 0,5 mM KH2P04 ; 1 ,3 mM KCI ; 135 mM NaCI, pH 7,4 ; 0,05% Tween 20). Puis 100 μΐ d'une solution de blocage (PBS- Tween 0,2% de gélatine) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 30 minutes à température ambiante. Les plaques sont vidées puis 100 μΙ des sérums d'animaux à tester sont déposés dans les puits et incubés 2 heures à 37<Ό. La plaque est ensuite vidée puis lavée 3 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 μ\- d'une solution contenant le deuxième anticorps couplé à de la biotine (PBS-Tween contenant 1 à 10 μg/mL d'anticorps biotinylé) sont ajoutés dans chaque puits et incubés 1 heure à 37 <Ό. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS-Tween. 100 μ\- de PBS-Tween contenant de la streptavidine couplée à la peroxydase (Sigma) sont ajoutés selon recommandations du fournisseur. La plaque est ensuite vidée puis lavée 4 fois avec 200 μ\- par puits d'une solution de PBS-Tween. Enfin la réaction est révélée par ajout de substrat de la peroxydase selon les recommandations du fournisseur (exemple de révélateur pouvant être utilisé : ABTS (Sigma)). Le résultat est lu à l'aide d'un lecteur de plaque ou fluorimètre selon recommandations du fournisseur.
L'anticorps de capture utilisé peut être soit un sérum polyclonal immunopurifié contre la protéine FLP80 de T. congolense, ou bien un anticorps monoclonal reconnaissant un épitope présent sur ladite protéine. Le deuxième anticorps est un anticorps monoclonal différent de l'anticorps de capture qui reconnaît un épitope différent de la protéine FLP80.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Molécule d'ADN ou d'ARN caractérisée en ce qu'elle comprend au moins une séquence nucléotidique isolée codant pour un protéine de la poche flagellaire des trypanosomes africains, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence nucléotidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID NO: 1 , une séquence complémentaire de la séquence SEQ ID NO: 1 , une séquence comprenant une identité d'au moins 85% sur toute la longueur de la séquence SEQ ID NO: 1 , un fragment desdites séquences comprenant entre 30 et 100 nucléotides, ou une séquence nucléotidique susceptible de s'hydrider avec la séquence SEQ ID NO: 1 dans des conditions stringentes d'hybridation.
2. Protéine appartenant aux trypanosomes africains codée par la séquence nucléotidique selon la revendication 1 .
3. Protéine en ce qu'elle comprend la séquence peptidique telle que représentée dans la séquence SEQ ID No : 2, et qui est désignée FLP80, ou un fragment peptidique antigénique de ladite protéine.
4. Protéine selon la revendication 2 ou 3 en tant que cible thérapeutique pour le traitement et/ou la prévention des trypanosomoses.
5. Une cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule d'origine procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'une molécule d'ADN selon la revendication 1 .
6. Cassette d'expression selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle code pour une protéine de la poche flagellaire de trypanosome africain ayant une séquence telle que représentée dans la séquence SEQ ID NO : 2, ou un fragment peptidique antigénique desdites séquences.
7. Un vecteur recombinant comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 ou une cassette d'expression selon la revendication 5 ou 6.
8. Vecteur recombinant selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit vecteur est d'origine eucaryote ou procaryote.
9. Une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon la revendication 1 , une cassette d'expression selon la revendication 5 ou 6, ou encore un vecteur recombinant selon la revendication 7 ou 8.
10. Protéine selon l'une quelconque des revendications 2 et 3, ou un fragment peptidique antigénique de ladite protéine, caractérisé en ce que ladite protéine ou ledit fragment présente une réactivité avec les sera des animaux non humains ou humains infectés par un trypanosome africain.
1 1 . Vaccin pour la prévention et/ou le traitement des trypanosomoses et pathogénies induites par lesdites trypanosomoses chez les animaux non humains, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité efficace d'une ou plusieurs protéines selon l'une quelconque des revendications 2, 3, et 10.
12. Vaccin pour la prévention et/ou le traitement des trypanosomiases et pathogénies induites par lesdites trypanosomiases chez l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une quantité thérapeutique efficace d'une ou plusieurs protéines selon l'une quelconque des revendications 2, 3, et 10.
13. Vaccin selon la revendication 1 1 ou 12 pour la protection contre les infections à trypanosomes africains choisis parmi Trypanosoma congolense, Trypanosoma vivax, Trypanosoma evansi, et/ou Trypanosoma brucei, et de préférence contre les infections à Trypanosoma congolense.
14. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 13 caractérisé en ce que lesdites pathogénies induites comprennent les anémies, les dégradations de l'état général, l'amaigrissement, et/ou l'immunosuppression chez l'homme ou les animaux non humains.
15. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 , et 13 à 14, caractérisé en ce que lesdits animaux non humains sont choisis parmi les bovidés, les ovidés, les félidés, les suidés, les camélidés, et/ou les canidés.
16. Vaccin multivalent selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 15, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un ou plusieurs peptides antigéniques et/ou des fragments antigéniques et/ou des séquences nucléotidiques codant pour lesdits peptides dérivés d'une ou plusieurs espèces de trypanosomes africains.
17. Vaccin multivalent selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 16, caractérisé en ce que le ou lesdits peptides et/ou fragments et/ou séquence nucléotidique sont dérivés des protéines flagellaires, des sialidases, des trans-sialidases, les protéases, des lipases, et/ou des tubulines.
18. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un agent antiparasitaire, au moins un agent infectieux, et/ou au moins un agent anti-symptomatique.
19. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent antiparasitaire est un trypanocide et/ou un agent antiparasitaire non spécifique des trypanosomes.
20. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent anti-infectieux est choisi parmi les β-lactamines, la fosfomycine, les glycopeptides ou les polypeptides à activité antibiotique, la bacitracine, les aminoglycosides, les macrolides, les lincosamides, les streptogramines, les tétracyclines, les phénicolés, les fusidanides, ou les quinolones.
21 . Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent anti-symptomatique est un agent anti-anémique, un agent hépatoprotecteur, et/ou un anti-inflammatoire non stéroïdien.
22. Vaccin selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'agent antiparasitaire, et/ou l'agent infectieux, et/ou l'agent anti-symptomatique est administré avant et/ou simultanément et/ou après ledit vaccin.
23. Vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 22, caractérisé en ce qu'il comprend en outre un adjuvant.
24. Vaccin comprenant le vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 23 et un vaccin et/ou ou un antigène dirigé contre la theilériose, l'anaplasmose, et/ou la babésiose.
25. Vaccin comprenant le vaccin selon l'une quelconque des revendications 1 1 à 23 et un vaccin et/ou ou un antigène dirigé contre la fièvre aphteuse, les clostridioses, la peste, la fièvre catarrhale, la péripneumonie contagieuse bovine (PPCB), le charbon symptomatique, les pasteurelloses, et/ou la clavelée.
26. Anticorps monoclonal ou polyclonal caractérisé en ce qu'il est obtenu par réaction immunologique d'un organisme animal non humain avec au moins une protéine ou un fragment peptidique antigénique selon l'une quelconque des revendications 2, 3 et 10.
27. Réactif pour la détection de trypanosomose dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps selon la revendication 26.
28. Méthode de diagnostic in vitro de trypanosomose dans un échantillon biologique d'un animal non humain susceptible d'avoir été infecté par un trypanosome africain, caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon et un réactif selon la revendication 27, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et en ce que l'on détecte ensuite la présence d'un complexe immun.
29. Kit de diagnostic de trypanosomose dans un échantillon biologique pour la mise en œuvre de la méthode selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un anticorps selon la revendication 26, un milieu approprié pour la formation d'un complexe immun avec ledit anticorps, au moins un réactif pour la détection d'une réaction immunologique.
30. Procédé de criblage d'agents trypanocides ou d'agents inhibiteurs comprenant la mise en contact de l'agent à tester préalablement marqué radioactivement avec des lignées cellulaires exprimant la protéine FLP80 selon l'une quelconque des revendications 2, 3 et 10 et la mesure de la radioactivité associée aux cellules.
31 . Inhibiteur compétitif pour la fixation sur la protéine FLP80, susceptible d'être obtenu par le procédé selon la revendication 30, pour le traitement et/ou la prévention des trypanosomoses, caractérisé en ce que le dit inhibiteur est constitué par une apolipoprotéine A ou E1 tronquée.
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