WO2002040518A1 - Domaine periplasmique d'une proteine omp d'enterobacterie et son utilisation comme porteur ou adjuvant - Google Patents

Domaine periplasmique d'une proteine omp d'enterobacterie et son utilisation comme porteur ou adjuvant Download PDF

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Jean-François HAEUW
Alain Robert
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    • A61K2039/6068—Other bacterial proteins, e.g. OMP

Definitions

  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising in a pharmaceutically acceptable medium at least one peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein or a nucleic construct coding for said peptide, as is the use of such a peptide or of such a nucleic construct for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial, parasitic or fungal infections or for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers.
  • Vaccination is an effective way to prevent or reduce viral or bacterial infections.
  • the success of vaccination campaigns in these areas has made it possible to extend the concept of vaccine previously used in the field of infectious diseases to the fields of cancer and autoimmune diseases.
  • Carrier proteins are of two types:
  • OMPC Neisseria meningitidis
  • TraT from Escherichia coli
  • PorB of Neisseria meningitidis Feusco et al., J. Infect. Dis., 175, 1997, 364-372
  • antigens generally have low immunogenicity and it is necessary to mix them with adjuvants.
  • a compound which, associated with a molecule, in particular an antigen or hapten, is capable of generating an immune response directed against said molecule.
  • a compound could in particular be used for the preparation of a vaccine composition intended to induce an antiviral, antibacterial, antifungal or antiparasitic, or antitumour immune protection.
  • the OmpA of Klebsiella pneumoniae exhibits carrier protein activity, systemically, for peptide subunit antigens (patents WO 95/27787 and WO 96/14415; Haeuw et al. , Eur. J. Biochem., 255.1998, 446-454; Plotnicky-Gilquin et al, J. Viral., 73, 1999, 5637-5645) and polysaccharides (patent WO 97/41888; Rauly et al, Infect. Immun., 67, 1999, 5547-5551).
  • This activity due to the presence of at least one T epitope on the protein (Haeuw et al.), Is comparable to that of a reference carrier protein such as tetanus toxoid (Rauly et al.), A protein used in vaccines for human use.
  • the present invention thus relates to the use of the periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein, devoid of the membrane part, as a carrier protein and / or adjuvant by the systemic route to increase the immunogenicity of an associated antigen covalently, either chemically conjugated (in particular via coupling reagent), or fused (chimeric protein expressed by genetic recombination when the associated antigen is of a protein nature).
  • This periplasmic fragment lacking the membrane domain of the protein is active in the absence of detergent, unlike the whole protein. Its activity is moreover equivalent to that of the whole protein used in the presence of a detergent.
  • peptide will also be understood to denote the polypeptides and proteins, these three terms being used interchangeably, and by the term “Omp” (for “Outer Membrane Protein”), the proteins of the outer membrane .
  • Omp for “Outer Membrane Protein”
  • peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein is intended to denote in particular any peptide whose acid sequence amino acid is included in the amino acid sequence of a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein and which, when administered in an organism, in particular in an animal or in humans, is capable of generating or increase an immune response, in particular directed against an infectious agent or a tumor cell when said periplasmic peptide is associated with an antigen or hapten specific for said infectious agent or said tumor cell.
  • the subject of the invention is a pharmaceutical composition characterized in that it comprises, in a pharmaceutically acceptable medium, at least one peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein or a nucleic construct coding for said peptide.
  • nucleic construct coding for said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein is intended to denote preferably a nucleic construct, in particular of DNA or RNA type, the nucleic acid coding for a peptide derived from an enterobacterium Omp protein consists exclusively of a nucleic acid encoding its periplasmic domain, one of its homologous peptides or one of its fragments as defined below for the terms of homology or of fragments.
  • said nucleic construct may further comprise other nucleic sequences necessary for example for the expression or cloning of said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein (nucleic construct of expression vector and / or cloning), and / or a nucleic sequence coding for the immunogen, antigen or hapten which it is desired to associate with said peptide derived from the Omp protein.
  • peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein is meant in particular a peptide chosen from:
  • the periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein can be obtained by an extraction process from a culture of said enterobacterium.
  • the periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein can also be obtained recombinantly.
  • the peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein is chosen from a peptide originating from a periplasmic domain of an OmpA protein, and more preferably from a peptide originating from a periplasmic domain of an OmpA protein from Klebsellia pneumoniae.
  • the peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein comprises, preferably consists of a peptide whose sequence is chosen from the following sequences: a) the amino acid sequence of sequence SEQ ID No. 2; b) the amino acid sequence of a sequence having a homology, preferably an identity after optimal alignment, of at least 80%, preferably
  • nucleic acid or amino acid sequence having a homology of at least 80% after optimal alignment with a determined nucleic acid or amino acid sequence is meant a sequence which after optimal alignment with said determined sequence has a percentage identity of at least 80% with said determined sequence.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window" to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be carried out, besides manually, by means of the algorithm of local homology of Smith and Waterman (Ad. App.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences per comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. may include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • BLAST 2 sequences available on the site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf7bl2.html, the parameters used being those given by default (in particular for the parameters “open gap penaltie”: 5, and “extension gap penaltie”: 2; the chosen matrix being for example the “BLOSUM 62” matrix proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences to be compared being calculated directly through the program.
  • the sequences of, or coding for, peptides capable of inducing are preferred.
  • an immune response directed specifically against the antigen or hapten associated with it such as the induction of an immune response measured by means of the standard techniques described in the examples below.
  • the present invention also relates to a composition according to the invention, characterized in that the pharmaceutical composition comprises a nucleic construct coding for said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein or a transformed host cell capable of expressing said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein.
  • a subject of the invention is also the composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition further comprises an antigen, immunogen or hapten.
  • immunogen, antigen or hapten specific for an infectious agent or a tumor cell is intended to denote in particular any compound expressed by an infectious agent, such as a virus, a bacterium, a yeast, a fungus or a parasite, by a tumor cell, or one of their structural analogues, which alone or in combination with an adjuvant or carrier is capable of inducing a specific immune response of said infectious agent or of said tumor cell.
  • infectious agent such as a virus, a bacterium, a yeast, a fungus or a parasite
  • a tumor cell or one of their structural analogues, which alone or in combination with an adjuvant or carrier is capable of inducing a specific immune response of said infectious agent or of said tumor cell.
  • immunogen, antigen or hapten is also intended to denote in the present description a compound having a structural analogy with said antigen or hapten capable of inducing an immunological response directed against said antigen or hapten in an organism previously immunized with
  • Said antigen or hapten can in particular be chosen from proteins, glycopeptides, lipopeptides, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids and lipids.
  • said antigen, immunogen or hapten is derived from a virus, a bacterium, a parasite or a fungus.
  • said antigen, immunogen or hapten comprises at least one peptide derived from a microorganism responsible for airway pathologies chosen from NRS (respiratory syncytial virus), para influenza virus (PIN) , infiuenza virus, hantaviruses, streptococci, pneumococci, haemophilus influenza type b, rhinoviruses, coronoviruses and meningococci.
  • said antigen, immunogen or hapten comprises at least one fragment of the protein G of the respiratory syncytial virus of type A or B, in particular human.
  • said antigen, immunogen or hapten is associated or specific for a tumor cell.
  • cancers whose tumors express an associated tumor antigen which can be prevented or treated by the uses according to the present invention, there may be mentioned in particular, but not limited to:
  • the present invention also relates to a composition according to the invention, characterized in that said antigen, immunogen or hapten is coupled or mixed with the peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium protein Omp.
  • the invention also includes the use according to the invention, characterized in that said antigen or hapten is coupled by covalent bond, in particular by chemical coupling, with said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein.
  • said connecting element introduced is an amino acid.
  • binding elements in particular amino acids to facilitate the coupling reactions between the peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein, and said immunogen, antigen or hapten.
  • the covalent coupling between the peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein and said immunogen, antigen or hapten according to the invention can be produced at the N- or C-terminal end of said peptide.
  • the bifunctional reagents allowing this coupling will be determined according to the end of said peptide chosen to perform the coupling and the nature of said immunogen, antigen or hapten to be coupled.
  • the use according to the invention is characterized in that the coupling between said immunogen, antigen or hapten and said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein is achieved by recombination genetic, when said immunogen, antigen or hapten is peptide in nature.
  • the conjugates resulting from a coupling between the immunogen, antigen or hapten and said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium protein Omp can be prepared by genetic recombination.
  • the chimeric or hybrid protein (the conjugate) can be produced by recombinant DNA techniques by insertion or addition to the DNA sequence coding for said peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein, a sequence encoding said immunogen, antigen or hapten of a protein nature.
  • the methods for synthesizing hybrid molecules include the methods used in genetic engineering to construct hybrid polynucleotides encoding the desired polypeptide sequences.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition which comprises a nucleic construct coding for said hybrid protein, or which comprises a vector containing a nucleic construct coding for said hybrid protein or a transformed host cell containing said nucleic construct capable of expressing said protein hybrid.
  • compositions according to the invention may also contain an adjuvant.
  • the latter can in particular be chosen from MPL-A (“MonoPhosphoryl Lipid A”), Quil-A (adjuvant derived from saponin), ISCOM (“ImmunoStimulating COMplex”), Dimethyl Dioctadecyl Ammonium in the form of bromide (DDAB ) or chloride (DDAC), CpG (oligodeoxynucleotides containing a specific motif centered on a CpG dinucleotide), Leif (protein antigen derived from Leishmania capable of stimulating PBMC and antigen presenting cells, and of producing a Th-1 cytokine reaction ), CT (Cholic Toxin), LT (“heat Labil Toxin”) and detoxified versions of CT or LT.
  • MPL-A MonoPhosphoryl Lipid A
  • Quil-A adjuvant derived from saponin
  • ISCOM ImmunoStimulating COMplex
  • the pharmaceutical composition according to the invention does not contain an adjuvant other than the peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein.
  • said pharmaceutical composition according to the invention does not contain any detergent.
  • the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferably a medium injectable into humans. It can consist of water, an aqueous saline solution or an aqueous solution based on dextrose and / or glycerol.
  • the invention also comprises a composition according to the invention, characterized in that said pharmaceutical composition is conveyed in a form making it possible to improve its stability and / or its immunogenicity; thus, it can be conveyed in the form of liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
  • the present invention also relates to a protein from the periplasmic domain of an enterobacterium Omp chosen from the proteins of the following sequence: a) the protein of sequence SEQ ID No. 2; b) a protein of sequence having a homology, preferably an identity after optimal alignment, of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99% with the sequence SEQ ID No. 2; c) a protein of at least 5 amino acids, preferably at least 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 75 and 100 consecutive amino acids of the periplasmic domain of sequence SEQ ID N ° 2 and having an immunogenic activity, in particular as a carrier protein and / or as an adjuvant.
  • the present invention also relates to a nucleic construct, in particular of the DNA type, coding for the periplasmic domain of an Omp protein. Enterobacteriaceae with sequence SEQ ID No. 2, its homologous sequences or its fragments as defined above in b) and c).
  • the present invention relates in particular to a nucleic acid construction, characterized in that the nucleic acid coding for the peptide originating from the periplasmic domain is chosen from nucleic acids of the following sequence: a) the nucleic acid of sequence SEQ ID No. 1; b) a nucleic acid of sequence having a homology, preferably an identity after optimal alignment, of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99% with the sequence SEQ ID No. 1; and c) a nucleic acid whose sequence consists of the sequence of a fragment of at least 15 nucleotides, preferably 24, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 225 and
  • sequence SEQ ID No. 1 corresponds to amino acids 199 to 335 of the OmpA of Klebsiella pneumoniae (OmpA whose protein of 335 amino acids is also called protein P40).
  • This fragment lacks the first 17 amino acids of the periplasmic domain (amino acids 182 to 198 of the said OmpA sequence of
  • Klebsiella pneumoniae in order to eliminate the so-called "hinge" zone, which has a strong homology with the light chain 1 of human myosin.
  • the invention also relates to the use of a peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein as defined above for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of viral, bacterial infections , parasitic or fungal or for the preparation of a vaccine intended for the prophylactic or therapeutic treatment of cancers.
  • the subject of the invention is also the use of a peptide originating from a periplasmic domain of an enterobacterium Omp protein as defined above for the preparation of a pharmaceutical composition for generating or enhancing an immune response against an infectious agent or a tumor cell.
  • Figures 1A and 1B Study of the anti-G5 serum response after immunization of ALB / c B mice with the P40-G5 and P40 Southern-G5 conjugates ("P40 Canal” for fragment of the perplasmic domain of the P40 protein).
  • the gene coding for the periplasmic part was obtained by PCR amplification from the plasmid DNA coding for rP40 using as primer couple: - the sense sequence oligonucleotide:
  • the expression of the recombinant protein is induced by adding IAA (indole-3 acrylic acid) at 25 ⁇ g / ml in the medium. About 5 hours at 37 ° C after induction, the cells are harvested by centrifugation.
  • IAA indole-3 acrylic acid
  • the cells After centrifugation, the cells are resuspended in a buffer
  • the purification is carried out by affinity chromatography on immobilized metal.
  • the preceding dialysate is deposited on a column of the Chelating Sepharose type.
  • the protein can be concentrated, after purification, by tangential ultrafiltration.
  • the G5 peptide (SEQ ID No. 6) is a synthetic peptide of 16 amino acids, the sequence of which is as follows:
  • This peptide corresponds to part 144-159 of protein G of the respiratory syncytial virus. It is coupled to the proteins P40 and P40peri, thanks to a cysteine residue introduced in the C-terminal position, using the bromo-N-hydroxysuccinimide acetate reagent according to the method described by Haeuw et al ..
  • the conjugates obtained are analyzed by SDS-PAGE electrophoresis (PolyAcrylamide Gel Electrophoresis).
  • the rate of coupling of the peptide to the proteins is estimated by assaying the carboxymethylcysteine residue released after hydrolysis (HCl 6N) of the conjugates.
  • the coupling rate determined by this method is approximately 3 to 5 moles of coupled peptides per mole of P40peri.
  • the perplasmic part of the P40 protein was compared to the whole P40 for its ability to induce an antibody response against a pure B epitope: the G5 peptide described above.
  • rP40 for recombinant P40 protein
  • FIGS. 1A and 1B show that the periplasmic part of P40 is capable, like the whole P40, of inducing an antibody response directed against a pure B epitope in the presence or in the absence of adjuvant.

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Abstract

L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ou une construction nucléique codant pour ledit peptide, tout comme l'utilisation d'un tel peptide ou d'une telle construction pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.

Description

DOMAINE PERIPLASMIQUE D ' UNE PROTEINE OMP D ' ENTEROBACTERIE ET SON UTILISATION COMME PORTEUR OU ADJUVANT
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ou une construction nucléique codant pour ledit peptide, tout comme l'utilisation d'un tel peptide ou d'une telle construction nucléique pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.
La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes.
La mise au point de vaccins parfaitement définis et dépourvus d'effets secondaires marqués, nécessite l'emploi d'antigènes vaccinants de faible masse moléculaire, tels que des peptides ou des oligosaccharides. Ces antigènes de faible masse, mais aussi certains antigènes de masse moléculaire supérieure tels que les polysaccharides de la paroi bactérienne, ne peuvent induire seuls une réponse immunitaire durable et intense. Il est indispensable de lier ces antigènes, par voie chimique ou par génie génétique, à des protéines porteuses.
Les protéines porteuses, actuellement utilisées, sont de deux types :
- les anatoxines tétanique et diphtérique : l'emploi trop fréquent de ces protéines porteuses risque d'aller à l'encontre d'une réponse intense contre l'haptène et risque de poser des problèmes d'immunotoxicologie,
- les extraits de protéines membranaires bactériennes telles que les OMPC de Neisseria meningitidis (Vella et al., Infect. Immun., 60, 1992, 4977-4983), TraT d'Escherichia coli (Croft et al., J. Immunol., 146, 1991, 793-798) ou PorB de Neisseria meningitidis (Fusco et al., J. Infect. Dis., 175, 1997, 364-372). De plus, les antigènes possèdent généralement une faible immunogénicité et il est nécessaire de les mélanger à des adjuvants.
Ainsi, il existe aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un composé qui, associé à une molécule, notamment un antigène ou haptène, soit capable de générer une réponse immunitaire dirigée contre ladite molécule. Un tel composé pourrait en particulier être utilisé pour la préparation d'une composition vaccinale destinée à induire une protection immunitaire antivirale, antibactérienne, antifongique ou antiparasitaire, ou antitumorale.
L'OmpA de Klebsiella pneumoniae, protéine majeure de la membrane externe baptisée P40, présente une activité de protéine porteuse, par voie systémique, pour des antigènes sous-unitaires peptidiques (brevets WO 95/27787 et WO 96/14415 ; Haeuw et al., Eur. J. Biochem., 255,1998, 446-454 ; Plotnicky-Gilquin et al, J. Viral., 73, 1999, 5637-5645) et polysaccharidiques (brevet WO 97/41888 ; Rauly et al, Infect. Immun., 67, 1999, 5547-5551). Cette activité, due à la présence d'au moins un épitope T sur la protéine (Haeuw et al.), est comparable à celle d'une protéine porteuse de référence comme Panatoxine tétanique (Rauly et al.), protéine utilisée dans les vaccins à usage humain.
Un modèle structural de l'OmpA d'Escherichia coli a été établi sur la base d'études biochimiques et physico-chimiques (Ried et al., Mol. Gen. Genêt., 243, 1994, 127-135 ; Koebnik et Krâmer, J. Mol. Biol., 250, 1995, 617-626 ; Pautsch et Schulz, Nature Struct. Biol., 5, 1998, 1013-1017). Selon ce modèle, les OmpA présenteraient deux domaines distincts : un domaine membranaire présentant une structure en feuillets β, et un domaine périplasmique sans structure définie.
On peut citer tout particulièrement le document brevet WO 96/14415 qui décrit la protéine complète P40 de K. pneumoniae, ses trois fragments transmembranaires AA 1-179, AA 108-179 et AA 127-179 et leur utilisation pour la préparation d'une composition adjuvante, vaccinale ou d'un complexe immunogène. On peut également citer le document Puohiniemi et al. (Infection and Immunity, 58(6), 1691-1696, 1990) qui décrit en particulier la réponse anticorps produite chez la souris après immunisation avec une protéine complète d'OmpA d'entérobactéries ou avec des entérobactéries entières (telles que E. coli et Salmonella typhimurium) ainsi que le document Nguyen et al. (Gène, 210, 93-101, 1998) qui décrit une méthode PCR particulière utilisée pour l'isolement et le séquençage complet du gène codant pour l'OmpA de K. pneumoniae.
Le principal inconvénient lié à l'utilisation de protéines membranaires est dû à la nécessité d'utiliser des détergents pour les solubiliser et les maintenir en solution, ces détergents devant ensuite faire partie de la formulation vaccinale finale.
Ainsi, lorsque de telles protéines sont destinées en particulier à être injectées in vivo, la présence de ces détergents est potentiellement toxique (risques de nécrose, etc.). Il existe donc aujourd'hui un besoin de disposer de protéine porteuse et/ou adjuvante capable de générer une réponse immunitaire en l'absence ou en quantité non significative de détergent.
Ceci est justement l'objet de la présente invention.
De manière surprenante, il a été mis en évidence qu'un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, notamment une protéine OmpA d'entérobactérie telle que la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae, répond à ces besoins.
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation du domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, dépourvue de la partie membranaire, en tant que protéine porteuse et/ou adjuvante par voie systémique pour augmenter l'immunogénicité d'un antigène associé de manière covalente, soit conjuguée de manière chimique (notamment par l'intermédiaire de réactif de couplage), soit fusionnée (protéine chimérique exprimée par recombinaison génétique lorsque l'antigène associé est de nature protéique). Ce fragment périplasmique dépourvu du domaine membranaire de la protéine est actif en l'absence de détergent, contrairement à la protéine entière. Son activité est de plus équivalente à celle de la protéine entière utilisée en présence d'un détergent.
Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme «peptide » également les polypeptides et les protéines, ces trois termes étant utilisés indifféremment, et par le terme « Omp » (pour « Outer Membrane Protein »), les protéines de la membrane externe. Par peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, on entend désigner en particulier tout peptide dont la séquence d'acides aminés est comprise dans la séquence d'acides aminés d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie et qui, lorsqu'il est administré chez un organisme, notamment chez un animal ou chez l'homme, est capable de générer ou accroître une réponse immunitaire, notamment dirigée contre un agent infectieux ou une cellule tumorale lorsque ledit peptide périplasmique est associé à un antigène ou haptène spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale.
L'invention a pour objet une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ou une construction nucléique codant pour ledit peptide.
Par construction nucléique codant pour ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, on entend désigner de préférence une construction nucléique, notamment de type ADN ou ARN, dont l'acide nucléique codant pour un peptide dérivé d'une protéine Omp d'entérobactérie est constitué exclusivement d'un acide nucléique codant pour son domaine périplasmique, l'un de ses peptides homologues ou l'un de ses fragments comme ci-après définis pour les termes d'homologie ou de fragments.
Bien entendu, ladite construction nucléique pourra en outre comprendre d'autres séquences nucléiques nécessaires par exemple à l'expression ou au clonage dudit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie (construction nucléique de vecteur d'expression et/ou de clonage), et/ou une séquence nucléique codant pour l'immunogène, antigène ou haptène que l'on désire associer audit peptide dérivé de la protéine Omp.
Par peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, on entend notamment un peptide choisi parmi :
- un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ;
- un peptide présentant une homologie, de préférence une identité après alignement optimal, d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 % avec un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ; - un peptide d'au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45 et 50 acides aminés consécutifs d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie et présentant une activité immunogénique ; et
- un épitope T helper d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie.
Le domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie peut être obtenu par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
Les procédés d'extraction de protéines de membrane bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.F. et al..
Le domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie peut également être obtenu par voie recombinante.
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee S.C., 1993, Curr. Op. Biotechnology, 4:520-525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G., Curr. Op. Biotechnology, 4:538-542, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C.P. et Aruffo A., Curr. Op. Biotechnology, 4:558-563, 1993) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow N.A., Curr. Op. Biotechnology, 4:564-572, 1993).
De manière tout à fait préférée, le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie est choisi parmi un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine OmpA, et plus préférentiéllement parmi un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine OmpA de Klebsellia pneumoniae.
Dans un autre mode de réalisation préféré de l'invention, le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie comprend, de préférence est constitué par, un peptide dont la séquence est choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie, de préférence une identité après alignement optimal, d'au moins 80 %, de préférence
85 %, 90 %, 95 % et 99 % avec la séquence SEQ ID N° 2 ; et c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés, de préférence d'au moins 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45 et 50 acides aminés consécutifs d'une séquence telle que définie en a). Par séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ladite séquence déterminée. Par «pourcentage d'identité» entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par «fenêtre de comparaison» pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (Ad. App. Math., 2:482-489, 1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (J. Mol. Biol., 48:443-453, 1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444, 1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, «BLAST 2 séquences», disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf7bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres «open gap penaltie» : 5, et «extension gap penaltie» : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice «BLOSUM 62» proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.
Parmi lesdites séquences présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence OmpA de référence ou parmi les séquences de fragment du domaine périplasmique de l'OmpA de référence, on préfère les séquences de, ou codant pour des, peptides capables d'induire une réponse immunitaire dirigée spécifiquement contre l'antigène ou haptène qui lui est associée, telle que l'induction d'une réponse immunitaire mesurée au moyen des techniques standards décrites dans les exemples ci-après. La présente invention concerne aussi une composition selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ou une cellule hôte transformée capable d'exprimer ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie. L'invention a également pour objet la composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre, un antigène, immunogène ou haptène.
Par « immunogène, antigène ou haptène spécifique d'un agent infectieux ou d'une cellule tumorale », on entend désigner en particulier tout composé exprimé par un agent infectieux, tel qu'un virus, une bactérie, une levure, un champignon ou un parasite, par une cellule tumorale, ou un de leurs analogues structuraux, qui seul ou en association avec un adjuvant ou porteur est capable d'induire une réponse immunitaire spécifique dudit agent infectieux ou de ladite cellule tumorale. On entend également désigner par "immunogène, antigène ou haptène" dans la présente description un composé présentant une analogie structurale avec ledit antigène ou haptène capable d'induire une réponse immunologique dirigée contre ledit antigène ou haptène dans un organisme préalablement immunisé avec ledit composé analogue.
Ledit antigène ou haptène peut notamment être choisi parmi les protéines, les glycopeptides, les lipopeptides, les polysaccharides, les oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides.
Dans une forme de réalisation de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de micro-organisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le NRS (virus syncytial respiratoire), le para influenza virus (PIN), l'infiuenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus respiratoire syncytial de type A ou B, notamment humain.
Dans une autre forme de réalisation de l'invention, ledit antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale. Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter :
• le cancer du sein, du poumon, du colon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al., Cancer Res., 59:431-435, 1999) ;
• le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., J. Natl. Cancer. Inst, 91:169-175, 1999) ;
• le mélanome (Zheuten et al., Bratilsl. Lek. Listy, 99:426-34, 1998) ;
• l'adénome cystique du pancréas (Hammel et al., Eur. J. gastroenterol. Hepatol., 10:345-348, 1998) ;
• le cancer colorectal (Ogura et al., Anticancer Res., 18:3669-3675, 1998) ;
• le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., Cancer Res., 58:3078-3086, 1998) ; et
• le cancer de l'ovaire et du cervix (Sonoda et al., Cancer., 77:1501-1509, 1996). La présente invention a aussi pour objet une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est couplé ou mélangé au peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie.
L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit antigène ou haptène est couplé par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit antigène ou haptène pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.
Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, et ledit immunogène, antigène ou haptène. Le couplage covalent entre le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie et ledit immunogène, antigène ou haptène selon l'invention peut être réalisé à l'extrémité N- ou C- terminale dudit peptide. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité dudit peptide choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit immunogène, antigène ou haptène à coupler. Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le couplage entre ledit immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie est réalisé par recombinaison génétique, lorsque ledit immunogène, antigène ou haptène est de nature peptidique. Les conjugués issus d'un couplage entre l'immunogène, antigène ou haptène et ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, peuvent être préparés par recombinaison génétique. La protéine chimérique ou hybride (le conjugué) peut être produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie, d'une séquence codant pour ledit immunogène, antigène ou haptène de nature protéique.
Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D.V. Goeddel (Gène expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990).
Ainsi, la présente invention concerne aussi une composition pharmaceutique qui comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, ou qui comprend un vecteur contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride ou une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine hybride.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un adjuvant. Ce dernier peut notamment être choisi parmi le MPL-A (« MonoPhosphoryl Lipid A »), le Quil-A (adjuvant dérivé de saponine), l'ISCOM (« ImmunoStimulating COMplex »), le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure (DDAC), les CpG (oligodésoxynucléotides contenant un motif spécifique centré sur un dinucléotide CpG), la Leif (antigène protéique dérivée de Leishmania capable de stimuler les cellules PBMC et présentatrices d'antigène, et de produire une réaction cytokine de type Th-1), la CT (Toxine Cholérique), la LT («heat Labil Toxin ») et les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas d'adjuvant autre que le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie.
Dans un mode de réalisation encore plus préféré de l'invention ladite composition pharmaceutique selon l'invention ne contient pas de détergent.
Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préférentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol. L'invention comprend également une composition selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité ; ainsi, elle peut être véhiculée sous forme de liposomes, virosomes, nanosphères, microsphères ou microcapsules.
La présente invention concerne encore une protéine du domaine périplasmique d'une Omp d'entérobactérie choisie parmi les protéines de séquence suivantes : a) la protéine de séquence SEQ ID N° 2 ; b) une protéine de séquence présentant une homologie, de préférence une identité après alignement optimal, d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 % avec la séquence SEQ ID N° 2 ; c) une protéine d'au moins 5 acides aminés, de préférence d'au moins 8, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 45, 50, 75 et 100 acides aminés consécutifs du domaine périplasmique de séquence SEQ ID N° 2 et présentant une activité immunogénique, notamment comme protéine porteuse et/ou comme adjuvant.
La présente invention concerne encore une construction nucléique, notamment de type ADN, codant pour le domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie de séquence SEQ ID N° 2, ses séquences homologues ou ses fragments tels que ci-avant définis en b) et c).
La présente invention concerne notamment une construction nucléique, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le peptide provenant du domaine périplasmique est choisi parmi les acides nucléiques de séquence suivante : a) l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 1 ; b) un acide nucléique de séquence présentant une homologie, de préférence une identité après alignement optimal, d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 % avec la séquence SEQ ID N° 1 ; et c) un acide nucléique dont la séquence est constituée de la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides, de préférence 24, 30, 45, 60, 75, 90, 105, 120, 135, 150, 225 et
300 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 1 et dont le peptide codé par ledit fragment présente une activité immunogénique, notamment comme protéine porteuse et/ou comme adjuvant. La séquence SEQ ID N° 2 correspond aux acides aminés 199 à 335 de l'OmpA de Klebsiella pneumoniae (OmpA dont la protéine de 335 acides aminés est dénommée également protéine P40). Ce fragment est dépourvu des 17 premiers acides aminés du domaine périplasmique (acides aminés 182 à 198 de ladite séquence de l'OmpA de
Klebsiella pneumoniae, afin d'éliminer la zone dite « charnière », qui présente une forte homologie avec la chaîne légère 1 de la myosine humaine.
L'utilisation d'un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie tel que défini ci-dessus comme porteur et/ou adjuvant dans un vaccin (ou pour la préparation d'un vaccin) constitue un autre objet de l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie tel que défini ci-dessus pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.
L'invention a encore pour objet l'utilisation d'un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie tel que défini ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.
Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée. Légendes des figures :
Figures 1A et 1B : Etude de la réponse anti-G5 sérique après immunisation de souris B ALB/c avec les conjugués P40-G5 et P40péri-G5 (« P40péri » pour fragment du domaine périplasmique de la protéine P40).
Exemple 1 : Clonage du domaine périplasmique de la P40
Le gène codant pour la partie périplasmique a été obtenu par amplification par PCR à partir de l'ADN plasmidique codant pour rP40 en utilisant comme couple d'amorces : - l'oligonucléotide sens de séquence :
5'-GCGAATTCGTGGCTACCAAGCACTTCACC-3' (SEQ ID No. 3) ; et - l'oligonucléotide antisens de séquence :
5'-CGAAGCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTCCGGAGCCGGAGCCG-3' (SEQ ID No. 4). Le fragment ainsi amplifié correspondant à P40péri (« P40péri » ou « P40p » pour fragment du domaine périplasmique de la protéine P40) et identifié par séquençage a été clone dans un vecteur sous le contrôle du promoteur de l'opéron tryptophane, en amont de 9 acides aminés du peptide leader (MKAIFNLNA (SEQ ID No. 5)). La séquence protéique de la partie périplasmique correspond aux acides aminés 182 à 335 de l' OmpA de Klebsiella pneumoniae.
Exemple 2 : Expression du domaine périplasmique de la P40 chez Escherichia coli
La souche à'Escherichia coli ICONE 100 (Souche ICONE 100 telle que décrite dans la demande WO 99/53080 publiée le 15 Octobre 1999) transformée par le vecteur pvaLP40p est mise à cultiver une nuit à 37°C sous agitation dans 100 ml de TSB complémenté en extrait de levure, en tétracycline (8 μg/ml). Le lendemain une culture diluée à une concentration en biomasse équivalente à une densité optique D.O. = 1 pour une longueur d'onde de 580 nm est préparée dans du milieu TSB additionnée d'extrait de levure, de tétracycline et de tryptophane (100 μg/ml). Après 10 minutes de culture, l'expression de la protéine recombinante est induite par addition d'IAA (acide indole-3 acrylique) à 25 μg/ml dans le milieu. Environ 5 heures à 37°C après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation.
Exemple 3 : Extraction et purification du domaine périplasmique de la P40
Après centrifugation, les cellules sont remises en suspension dans un tampon
Tris-HCl 25 mM pH 8,5, puis traitées par le lysozyme (0,5 g/litre pendant 1 heure à température ambiante sous agitation douce). Après centrifugation (25 min à 10 000g et à + 4°C), le surnageant est dialyse pendant une nuit à + 4°C sous agitation contre un tampon 20 mM phosphate de sodium, pH 7, contenant 0,5 M NaCl.
La purification est réalisée par chromatographie d'affinité sur métal immobilisé.
Le dialysat précédent est déposé sur une colonne de type Chelating Sepharose
(Amersham Pharmacia Biotech) préalablement chargée d'ions Ni à l'aide d'une solution 1 M NiSO4. La protéine est éluée à l'aide d'un gradient d'imidazole de 0 à
0,5 M.
La protéine peut être concentrée, après purification, par ultrafiltration tangentielle.
1 litre de culture permet d'obtenir 50 à 100 mg de protéine purifiée. La concentration en protéine est déterminée par dosage à l'aide de la méthode
BCA (microdosage de protéine à l'Acide BicinChoninique), et la pureté de la protéine purifiée est déterminée par analyse par électrophorèse SDS-Page. Le domaine périplasmique purifié présente une masse moléculaire apparente de 18 kDa. Exemple 4 : Couplage du peptide G5 Le peptide G5 (SEQ ID No. 6) est un peptide synthétique de 16 acides aminés, dont la séquence est la suivante :
Ser Lys Pro Thr Thr Lys Gin Arg Gin Asn Lys Pro Pro Asn Lys Pro
1 5 10 15
Ce peptide correspond à la partie 144-159 de la protéine G du virus respiratoire syncytial. Il est couplé aux protéines P40 et P40péri, grâce à un résidu cystéine introduit en position C-terminale, à l'aide du réactif bromo-N-hydroxysuccinimide acétate selon la méthode décrite par Haeuw et al..
Les conjugués obtenus sont analysés par électrophorèse SDS-PAGE (PolyAcrylamide Gel Electrophorèse). Le taux de couplage du peptide sur les protéines est estimé par dosage du résidu carboxyméthylcystéine libéré après hydrolyse (HC1 6N) des conjugués.
Le taux de couplage déterminé par cette méthode est d'environ 3 à 5 moles de peptides couplés par mole de P40péri. Exemple 5 : Immunogénicité du conjugué P40péri-G5
La partie périplasmique de la protéine P40 a été comparée à la P40 entière pour sa capacité à induire une réponse anticorps contre un épitope B pur : le peptide G5 décrit précédemment.
L'extraction et la purification de la rP40 (rP40 pour protéine P40 recombinante) ont été décrites par Haeuw et al., ainsi que dans les demandes WO 95/27787 et FR 00 02 104.
Pour cette étude, le peptide G5 a été couplé selon la méthode indiquée ci-dessus aux protéines P40 et P40péri. 10 μg d'équivalents G5 ont été administrés, par voie sous cutanée, A en présence ou B en absence d'hydroxyde d'aluminium à des souris BALB/c (n=5), à J0, J10 et J20. Une ponction individuelle des souris a été réalisée avant chaque immunisation et 11 jours après la dernière immunisation, et le titre en IgG sériques anti- G5 a été déterminé par ELISA.
Les résultats présentés dans les figures 1A et 1B montrent que la partie périplasmique de P40 est capable, comme la P40 entière, d'induire une réponse anticorps dirigée contre un épitope B pur en présence ou en absence d'adjuvant.
En présence d'adjuvant (figure 1A), l'intensité de la réponse anti-G5 et la cinétique de réponse sont identiques dans les deux cas.
En absence d'adjuvant (figure 1B), on note une réponse anti-G5 lorsque G5 est conjugué à P40péri. Ces résultats mettent en évidence le rôle porteur de la partie périplasmique de la protéine P40.

Claims

REVENDICATIONS
1/ Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ou une construction nucléique codant pour ledit peptide.
2/ Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie est choisi parmi les peptides suivants : - un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ;
- un peptide présentant au moins 80 % d'homologie avec un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie ;
- un peptide d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie et présentant une activité immunogénique ; et
- un épitope T helper d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie.
3/ Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie est choisi parmi un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp A et plus préférentiellement parmi un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp A de Klebsellia pneumoniae.
4/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie comprend, de préférence est constitué par, un peptide dont la séquence est choisie parmi les séquences suivantes : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N° 2 ; et c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés consécutifs d'une séquence telle que définie en a). 5/ Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle contient en outre un antigène, immunogène ou haptène.
61 Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est choisi parmi les peptides, les glycopeptides, les lipopeptides, les poly- ou oligosaccharides, les acides nucléiques et les lipides.
Il Composition selon la revendication 5 ou 6, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène dérive d'un virus, d'une bactérie, d'un parasite ou d'un champignon.
8/ Composition selon la revendication 7, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un peptide dérivé de microorganisme responsable de pathologies des voies aériennes choisi parmi le NRS, le para influenza virus (PIN), l'influenza virus, les hantavirus, les streptocoques, les pneumocoques, haemophilus influenza type b, les rhinovirus, les coronovirus et les méningocoques. 9/ Composition selon la revendication 7 ou 8, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène comprend au moins un fragment de la protéine G du virus respiratoire syncytial.
10/ Composition selon la revendication 5, caractérisée en ce que l'antigène, immunogène ou haptène est associé ou spécifique d'une cellule tumorale. 11/ Composition selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisée en ce que ledit antigène, immunogène ou haptène est associé, par mélange ou par couplage, au peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie.
12/ Composition selon la revendication 11, caractérisée en ce que le couplage entre ledit antigène, immunogène ou haptène et ledit peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie est réalisé par recombinaison génétique.
13/ Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique contient en outre un adjuvant, préférentiellement choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le MPL-A, le Quil-A, l'ISCOM, le Diméthyl Dioctadécyl Ammonium sous forme de bromure (DDAB) ou de chlorure
(DDAC), les CpG, la Leif, la CT, la LT et les versions détoxifiées de la CT ou la LT. 14/ Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique ne contient pas d'adjuvant autre que le peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie.
15/ Composition selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que ladite composition ne contient pas de détergent.
16/ Composition selon l'une des revendications 1 à 15, caractérisée en ce que ledit milieu pharmaceutiquement acceptable est constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
17/ Composition selon l'une des revendications 1 à 16, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son im unogénicité.
18/ Peptide provenant du domaine périplasmique d'une Omp d'entérobactérie choisie parmi les peptides de séquence suivante : a) le peptide de séquence SEQ ID N° 2 ; b) un peptide de séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N° 2 ; c) un peptide d'au moins 5 acides aminés consécutifs du domaine périplasmique de séquence SEQ ID N° 2 et présentant une activité immunogénique, notamment comme protéine porteuse et/ou comme adjuvant. 19/ Construction nucléique codant pour un peptide selon la revendication 18.
20/ Construction nucléique selon la revendication 19, caractérisée en ce que l'acide nucléique codant pour le peptide provenant du domaine périplasmique est choisi parmi les acides nucléiques de séquence suivante : a) l'acide nucléique de séquence SEQ ID N° 1 ; b) un acide nucléique de séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N° 1 ; c) un acide nucléique dont la séquence est constituée de la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de la séquence SEQ ID N° 1 et dont le peptide codé par ledit fragment présente une activité immunogénique, notamment comme protéine porteuse et/ou comme adjuvant. 21/ Utilisation d'un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4 comme porteur et/ou adjuvant pour la préparation d'un vaccin.
22/ Utilisation d'un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4 pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des infections virales, bactériennes, parasitaires ou fongiques ou pour la préparation d'un vaccin destiné au traitement prophylactique ou thérapeutique des cancers.
23/ Utilisation d'un peptide provenant d'un domaine périplasmique d'une protéine Omp d'entérobactérie tel que défini dans l'une des revendications 1 à 4 pour la préparation d'une composition phaπnaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre un agent infectieux ou une cellule tumorale.
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