FR2723589A1 - Nouvel antigene de trypanosoma cruzi, et gene codant pour cette derniere; leur application a la detection de la maladie de chagas - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un nouvel antigène de Trypanosoma cruzi, dénommé PTc100, et un gène code codant pour ce dernier, dénommé Tc100. Selon l'invention, on a déterminé et décrit les séquences nucléotidiques de Tc100 et d'acides aminés de PTc100. PTc100 et Tc100, ou leurs fragments, modifiés ou non, peuvent être utilisés directement ou indirectement pour la détection de Trypanosoma cruzi, ou le suivi de l'infection générée par ce dernier, chez l'homme ou l'animal.

Description

La présente invention a pour objet un nouveau matériel génétique codant

pour une protéine nouvelle

reconnue par des antisera anti-Trypanosoma cruzi, et concerne l'utilisation desdits gène et protéine, notamment5 à des fins diagnostique, pharmaceutique et thérapeutique.

Trypanosoma cruzi est un parasite protozoaire flagellé, membre de l'ordre des Kinetoplastida et de la

famille des Trypanosomatidae, responsable de la maladie de Chagas qui affecte naturellement des millions de10 personnes, principalement en Amérique Latine.

Chez l'hôte vertébré, Trypanosoma cruzi se présente sous deux formes: l'une mobile grâce à son

flagelle ou trypomastigote, ne se divisant pas; l'autre aflagellée, ou amastigote intracellulaire, se multipliant15 par division binaire.

La transmission chez l'homme du protozoaire se fait par l'intermédiaire d'insectes hématophages de la famille des réduviidés, lors d'un repas sanguin suivi de déjections à l'endroit de la piqûre. L'insecte vecteur20 libère ainsi les formes trypomastigotes métacycliques infectieuses qui, par la voie de la circulation sanguine, vont coloniser de nombreux types cellulaires. Trypanosoma cruzi infecte les cellules musculaires cardiaques et squelettiques, les cellules gliales et celles du système25 phagocytaire mononucléé. Après pénétration passive dans la cellule hôte, la forme trypomastigote du parasite se

différencie en forme amastigote, se divise activement, puis il s'en suit une libération des formes trypomastigotes provoquant ainsi une nouvelle invasion30 cellulaire.

Les insectes vont compléter le cycle du parasite en ingérant, lors du repas sanguin, les formes

trypomastigotes de l'hôte. Ces dernières se différencient en formes épimastigotes dans l'intestin moyen du vecteur35 et enfin trypomastigotes métacycliques infectieuses dans l'intestin postérieur.

On distingue deux phases dans la maladie de Chagas: la phase aigUe et la phase chronique. La phase aigue survient après une contamination de type transfusionnel, congénital ou vectoriel et dure quelques5 semaines. Elle se caractérise par un nombre important de parasites circulant dans le sang et correspond à une division exponentielle du protozoaire. La phase aig e est le plus souvent asymptomatique. Toutefois, chez les nourrissons contaminés par leur mère, la phase aig e, qui10 est marquée par une cardiopathie aigUe, peut être critique. La phase chronique peut s'étendre sur de nombreuses années. Chez certains individus cette phase est asymptomatique. Par contre d'autres patients présentent des lésions tissulaires au niveau du coeur ou des15 manifestations de type digestif. En tout état de cause, le diagnostic clinique doit toujours être confirmé par des tests de mise en évidence soit d'anticorps dirigés contre les antigènes parasitaires, soit du parasite lui-même. Cette maladie devient un problème mondial en raison de la contamination par transfusion sanguine. Il devenait donc indispensable de disposer de tests de diagnostic qui permettent de déterminer la présence du parasite chez les individus. On dispose de différents tests sérologiques, tels que l'agglutination directe,25 l'immunofluorescence indirecte (IFI), les tests de fixation du complément (RFC), les tests ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Les antigènes de Trypanosoma cruzi utilisés pour les tests sérologiques proviennent d'un lysat total du stade non infectant du parasite ou de30 fractions protéiques partiellement purifiées. Toutefois, ces fractions ne permettent pas l'obtention d'antigènes en

quantité et qualité suffisantes pour l'élaboration d'un test fiable de diagnostic sérologique. De plus, la complexité du parasite et le polymorphisme antigénique35 souche à souche introduisent une difficulté supplémentaire dans la reproductibilité des différentes préparations.

Enfin, il existe de nombreux risques de réactivité croisée

avec d'autres protozoaires, plus particulièrement avec Trypanosoma rangeli, parasite non pathogène, et la famille des Leishmanie. Un autre désavantage de ces techniques est 5 l'absence de détermination de la phase de la maladie qui permettrait un traitement dès la phase aig e.

Pour résoudre ces divers problèmes, il a été envisagé d'élaborer un kit de diagnostic sérologique

composé de protéines recombinantes qui seraient10 spécifiques de Trypanosoma cruzi.

Différents groupes de recherche ont criblé des banques d'expression d'ADN génomique ou d'ADN complémentaire de Trypanosoma cruzi dans le vecteur Xgtll, par des sera de patients atteints de la maladie de Chagas.15 Le phage Xgtll permet l'insertion d'ADN étranger d'une taille maximale de 7Kb dans le site EcoRl localisé dans le

gène lac Z, sous contrôle du promoteur lac. Le produit obtenu est une protéine recombinante en fusion avec la betagalactosidase, inductible par l'IPTG (isopropyl thio20 beta D galactoside).

Divers gènes de Trypanosoma cruzi, codant pour des protéines reconnues par les sera chagasiques ont ainsi été caractérisés. Parmi les antigènes recombinants décrits, on peut citer l'antigène H49 (Paranhos et al., 1994 (1)).25 Toutefois, cet antigène ne permet pas une sensibilité de détection sérologique de 100 % des malades en phase aig e ou chronique. Il a donc été envisagé d'associer l'antigène H49 à l'antigène CRA (Cytoplasmic Repetitive Antigen) (Lafaille et al., (1989)(2)) sans pour autant résoudre ce

problème.

Les présents inventeurs ont identifié et obtenu pour la première fois un matériel génétique nouveau codant pour une protéine nouvelle, reconnue par des anti-sera anti-Trypanosoma cruzi, qui permet d'obvier les35 désavantages précités. Le matériel génétique peut être utilisé pour produire des protéines ou des polypeptides pour la production de tests de diagnostic, ou pour la préparation de compositions vaccinales ou pharmaceutiques, ou être utilisé soit lui même comme sonde, soit pour la détermination de sondes spécifiques utilisables dans des5 essais d'hybridation d'acides nucléiques pour la détection des infections par Trypanosoma cruzi. De même, la protéine

ou tout polypeptide correspondant peuvent être utilisés pour la production d'anticorps spécifiques du parasite, à des fins de diagnostic ou de protection passive.10 Ce gène a été dénommé Tc 100 par la Demanderesse.

Par conséquent, la présente invention a pour objet une molécule d'ADN ou d'ARN, constituée par au moins un brin comprenant une séquence nucléotidique représentée dans l'identificateur SEQ ID N01, ou une séquence15 complémentaire ou anti-sens à cette dernière, ou encore une séquence homologue à celle représentée dans l'identification SEQ ID N01. Par séquence nucléotidique, on entend soit un brin d'ADN ou son brin complémentaire, soit un brin d'ARN ou son brin anti-sens ou leurs ADN complémentaires correspondants. La séquence d'ADN telle que représentée dans l'identificateur SEQ ID N01 correspond à la séquence de l'ARN messager, étant entendu que la thymine (T) dans l'ADN est remplacée par l'uracyle (U) dans l'ARN.25 Bien entendu, la présente invention couvre également toute molécule d'ADN ou d'ARN qui possède une séquence nucléotidique présentant un degré d'homologie d'au moins 50%, de préférence d'au moins 60%, et de manière tout à fait préférée 85% par rapport à la séquence30 nucléotidique représentée dans l'identificateur SEQ ID NOl, à la condition que ladite molécule comprenant une

séquence nucléotidique homologue code pour une protéine présentant une séquence en acides aminés représentée dans l'identificateur SEQ ID N02, ou pour un équivalent35 immunologique de ladite protéine.

L'homologie caractérise le degré de similitude de deux séquences nucléotidiques comparées.

L'invention concerne par ailleurs des fragments d'ADN ou d'ARN dont la séquence nucléotidique est identique, complémentaire ou anti-sens, ou homologue, à l'une quelconque des séquences suivantes: - celle commençant au nucléotide 1232 et se terminant au nucléotide 2207 de SEQ ID N01 celle commençant au nucléotide 1232 et se terminant au nucléotide 1825 de SEQ ID Nl01

- et celle commençant au nucléotide 1266 et se terminant au nucléotide 2207.

L'invention a aussi pour objet une protéine, dénommée PTclOO par la Demanderesse, présentant une masse moléculaire apparente d'au plus lOOkDa, reconnue par des anti-sera anti-Trypanosoma cruzi, ou un équivalent immunologique de cette protéine; et leurs fragments. La séquence en acides aminés de cette protéine est représentée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N02.20 Par équivalent immunologique, on entend tout polypeptide ou peptide susceptible d'être immunologiquement reconnu par les anticorps dirigés contre ladite protéine PTcl0. L'invention concerne aussi tout fragment de la protéine PTclOO. Un fragment protéique particulier présente une séquence commençant à l'acide aminé 323 et se

terminant à l'acide aminé 520 de la séquence définie dans l'identificateur SEQ ID N02, ledit fragment étant spécifiquement reconnu par des antisera anti-Trypanosoma30 cruzi; l'invention concerne aussi tout équivalent immunologique dudit fragment.

La protéine PTclOO et lesdits fragments protéiques peuvent comporter des modifications, notamment chimiques, n'altérant pas leur immunogénicité.35 Par ailleurs, la présente invention a également pour objet une cassette d'expression fonctionnelle, notamment dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, permettant l'expression d'ADN codant pour la totalité ou un fragment de la protéine PTc100, en particulier d'un fragment d'ADN tel que défini5 précédemment, placé sous le contrôle des éléments nécessaires à son expression; ladite protéine et lesdits fragments protéiques étant reconnus par des antisera anti- Trypanosoma cruzi. D'une façon générale, toute cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote peut être utilisée dans le cadre de la présente invention. De telles cellules sont connues de l'homme de l'art. A titre d'exemples, on peut citer les cellules issues d'un organisme eucaryote, telles que les cellules issues d'un mammifère, notamment les15 cellules CHO (Chinese Hamster Ovarian); les cellules d'insectes; les cellules issues d'un champignon, notamment unicellulaire ou d'une levure, notamment de la souche Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces et tout particulièrement sélectionnée dans le groupe constitué de20 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Schizosaccharomyces malidevorans, Schizosaccharomyces sloofiae, Schizosaccharomyces octosporus. De même, parmi les cellules issues d'un organisme procaryote, on peut avoir recours, sans que cela constitue une limitation, aux25 cellules d'une souche de Escherichia coli (E coli) ou à des cellules d'entérobactéries. Un grand nombre de ces cellules sont disponibles commercialement dans les collections, telles que 1'ATCC (Rockville, MA, USA) et l'AFRC (Agriculture & Food Research Council, Norfolk, UK).30 La cellule peut être de type sauvage ou mutante. Les mutations sont décrites dans la littérature accessible à l'homme du métier. Aux fins de la présente invention, on utilise une cellule d'E. coli DH5a (commercialisée par la société

CLONTECH sous la référence: C2007-1).

La cassette d'expression de l'invention est destinée à la production de la protéine PTclOO ou à des fragments de ladite protéine produits par la cellule E. coli précitée, et reconnus par des antisera humains. De5 tels antisera proviennent de patients ayant contracté une infection récente ou ancienne par Trypanosoma cruzi, et contiennent des immunoglobulines reconnaissant spécifiquement la PTc100. Bien entendu, la protéine PTclOO0 peut également être reconnue par d'autres anticorps, comme10 par exemple des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par immunisation d'espèces variées avec la protéine précitée naturelle, la protéine recombinante, leurs fragments ou peptides. Par protéine PTclOO on entend l'antigène cytoplasmique de Trypanosoma cruzi naturel, ou produit notamment par les techniques de recombinaison génétique

décrites dans la présente demande, ou tout fragment ou mutant de cet antigène à la condition qu'il soit immunologiquement réactif avec des anticorps dirigés20 contre la protéine PTclOO de ce parasite.

De manière avantageuse, une telle protéine possède une séquence en acides aminés présentant un degré d'homologie d'au moins 70%, de préférence d'au moins 85 % et, de manière tout à fait préférée, d'au moins 95 % par25 rapport à la séquence identifiée dans l'identificateur SEQ ID N02. En pratique, un tel équivalent peut être obtenu

par délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs acides aminés de la protéine native ou recombinante. Il est à la portée de l'homme de l'art30 d'effectuer par des techniques connues ces modifications sans affecter la reconnaissance immunologique.

Dans le cadre de la présente invention, la protéine PTc100 peut être modifiée in vitro, notamment par délétion ou addition de groupements chimiques, tels que35 des phosphates, sucres ou acides myristiques, de manière à améliorer sa stabilité ou la présentation d'un ou de plusieurs épitopes. La cassette d'expression selon l'invention permet la production d'une protéine PTclOO (ayant une séquence en acides aminés telle que spécifiée précédemment) et de fragments de ladite protéine, fusionnés à un élément

exogène pouvant aider à sa stabilité, sa purification, sa production ou sa reconnaissance. Le choix d'un tel élément exogène est à la portée de l'homme de l'art. Il peut10 notamment s'agir d'un haptène, d'un peptide exogène ou d'une protéine.

La cassette d'expression selon l'invention comprend les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans la cellule considérée. Par "éléments15 nécessaires à l'expression", on entend l'ensemble des éléments qui permettent la transcription du fragment d'ADN en ARN messager (ARNm) et la traduction de ce dernier en protéine. La présente invention s'étend également à un vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'invention. Il peut s'agir d'un vecteur viral et

notamment d'un vecteur dérivé d'un baculovirus, plus particulièrement destiné à l'expression dans les cellules d'insectes, ou d'un vecteur dérivé d'un adénovirus pour25 l'expression dans les cellules de mammifères.

Il peut également s'agir d'un vecteur plasmidique

à réplication autonome et en particulier d'un vecteur multiplicateur.

La présente invention concerne également une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant une cassette d'expression, soit sous forme intégrée dans le génome cellulaire, soit insérée dans un vecteur. Une telle cellule a été définie précédemment. La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'une protéine PTclOO, ou de fragments de ladite protéine, selon lequel: (i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote, comprenant la cassette d'expression selon l'invention; et (ii) on récupère la protéine exprimée issue de l'organisme précité. La présente invention concerne aussi un ou plusieurs peptides, dont la séquence en acides aminés

correspond à une partie de la séquence de la protéine PTclOO, et présentant seuls ou en mélange une réactivité10 avec la totalité des sera d'individus ou d'animaux infectés par Trypanosoma cruzi.

Les peptides peuvent être obtenus par synthèse chimique, lyse de la protéine PTclOO, ou par des techniques de recombinaison génétique.15 L'invention concerne également des anticorps monoclonaux ou polyclonaux obtenus par réaction

immunologique d'un organisme humain ou animal à un agent immunogène constitué par la protéine PTclOO naturelle, recombinante et leurs fragments, ou par un peptide, tel20 que défini précédemment.

La présente invention concerne aussi un réactif pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi, qui comprend à titre de susbtance réactive une protéine PTclOO telle que définie25 précédemment, ou ses fragments, un peptide ou un mélange de peptides tels que définis ci-dessus, ou au moins un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment. Le réactif ci-dessus peut être fixé directement ou indirectement sur un support solide approprié. Le support solide peut être notamment sous la forme d'un cone, d'un tube, d'un puits, de bille, ou analogues. Le terme "support solide" tel qu'utilisé ici inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé un réactif pour une utilisation dans les tests de diagnostic. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés chimiquement ou non peuvent être utilisés comme supports solides, notamment des polysaccharides tels que les matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose5 et la nitrocellulose; des polymères tels que chlorure de vinyle, polyéthylène, polystyrènes, polyacrylate ou

copolymères tels que polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymères de chlorure de vinyle et acétate de vinyle; copolymères à base de styrène, des fibres10 naturelles telles que le coton et les fibres synthétiques telles que le nylon.

De préférence, le support solide est un polymère de polystyrène ou un copolymère de butadiène-styrène.

Avantageusement, le support est un polystyrène ou un15 copolymère a base de styrène comprenant entre environ 10 et 90 % en poids de motifs styrène.

La fixation du réactif sur le support solide peut

être réalisée de manière directe ou indirecte.

De manière directe, deux approches sont possibles: soit par adsorption du réactif sur le support solide, c'est à dire par des liaisons non covalentes (principalement de type hydrogène, Van der Walls ou ionique), soit par établissement de liaisons covalentes entre le réactif et le support. De manière indirecte, on25 peut fixer préalablement (par adsorption ou covalence) sur le support solide un composé "anti-réactif" capable d'interagir avec le réactif de façon à immobiliser l'ensemble sur le support solide. A titre d'exemple, on peut citer un anticorps anti-PTc100, à la condition qu'il30 soit immunologiquement réactif avec une partie de la protéine différente de celle intervenant dans la réaction

de reconnaissance des anticorps des sera; un système ligand-récepteur, par exemple en greffant sur la protéine PTclOO une molécule telle qu'une vitamine, et en35 immobilisant sur la phase solide le récepteur correspondant (par exemple le système biotine-

il streptavidine). Par manière indirecte, on entend également le greffage au préalable ou fusion par recombinaison génétique d'une protéine, ou un fragment de cette protéine, ou d'un polypeptide, à une extrémité de la5 protéine PTclOO, et l'immobilisation de cette dernière sur le support solide par adsorption passive ou covalence de la protéine ou du polypeptide greffé ou fusionné. L'invention concerne également un procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un individu ou d'un animal susceptible d'avoir été infecté par Trypanosoma cruzi, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon et un réactif tel que défini ci-dessus, dans des15 conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite la présence d'un complexe immun avec ledit réactif. A titre d'exemple non limitatif, on peut citer le procédé de détection de type sandwich en une ou plusieurs étapes, tel que notamment décrit dans les brevets FR 2 481 318 et FR 2 487 983, qui consiste à faire réagir un premier anticorps monoclonal ou polyclonal spécifique d'un antigène recherché, fixé sur un support solide, avec l'échantillon, et à mettre en évidence la présence25 éventuelle d'un complexe immun ainsi formé par un second anticorps marqué par tout marqueur approprié connu de

l'homme du métier, notamment un isotope radioactif, une enzyme par exemple la péroxydase ou la phosphatase alcaline ou analogues; par les techniques dites de30 compétition bien connues de l'homme du métier.

L'invention a aussi pour objet une composition immunothérapeutique active, notamment une préparation vaccinale, qui comprend à titre de principe actif, une protéine PTclOO naturelle, recombinante ou leurs35 fragments, ou les peptides identifiés ci-dessus, le principe actif étant éventuellement conjugué avec un support pharmaceutiquement acceptable, et éventuellement un excipient et/ou un adjuvant approprié. La présente invention couvre également une composition pharmaceutique destinée au traitement ou à la prévention d'une infection par Trypanosoma cruzi chez un homme ou un animal, comprenant une quantité

thérapeutiquement efficace d'une cassette d'expression, d'un vecteur, d'une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote tel que défini précédemment, d'une10 protéine PTclOO selon l'invention, ou de ses fragments, ou d'un anticorps de l'invention.

La présente invention a aussi pour objet des sondes et amorces spécifiques de T. cruzi, et leurs utilisations dans des tests de diagnostic.15 Le terme sonde tel qu'utilisé dans la présente invention fait référence à l'ADN ou l'ARN comportant au moins un brin présentant une séquence nucléotidique permettant l'hybridation aux acides nucléiques présentant une séquence nucléotidique telle que représentée dans20 l'identificateur SEQ ID NOl, ou une séquence complémentaire ou anti-sens, ou homologue à SEQ ID N01, à ses fragments, ou à un oligonucléotide de synthèse permettant une telle hybridation, non modifié ou comprenant une ou plusieurs bases modifiées telles que25 l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée. De même, ces sondes peuvent être modifiées au niveau du sucre, à savoir le remplacement d'au moins un désoxyribose30 par un polyamide (P.E NIELSEN et al.(1991) (13)), ou au niveau du groupement phosphate, par exemple son

remplacement par des esters, notamment choisis parmi les esters de diphosphate, d'alkyle et arylphosphonate et de phosphorothioate.35 Les sondes peuvent être beaucoup plus courtes que la séquence identifiée dans l'identification SEQ ID N01.

En pratique, de telles sondes comprennent au moins 5

monomères, avantageusement de 8 à 50 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec5 l'ADN ou l'ARN ayant une séquence nucléotidique telle que définie précédemment.

Une sonde selon l'invention peut être utilisée à des fins de diagnostic, comme sonde de capture et/ou de détection, ou à des fins de thérapie.10 La sonde de capture peut être immobilisée sur un support solide par tout moyen approprié, c'est à dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption passive. La sonde de détection est marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radioactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la

phosphatase alcaline, et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés chimiques chromophores, des composés chromogènes,20 fluorigènes ou luminescents, des analogues de base nucléotidique, et la biotine.

Les sondes de la présente invention utilisées à des fins de diagnostic peuvent être mises en oeuvre dans toutes les techniques d'hybridation connues, et notamment25 les techniques dites "Dot-Blot" (Maniatis et al. (1982) (14)), Southern Blot (Southern E.M. (1975) (15)), Northern Blot, qui est une technique identique à la technique Southern Blot mais qui utilise de l'ARN comme cible, la technique sandwich (Dunn A.R. et al. (1977)(16)).30 Avantageusement, on utilise la technique sandwich comprenant une sonde de capture spécifique et/ou une sonde de détection spécifique, étant entendu que la sonde de capture et la sonde de détection doivent présenter une séquence nucléotidique au moins partiellement différente.35 Une autre application de l'invention est une sonde de thérapie pour traiter les infections dues à Trypanosoma cruzi, ladite sonde étant susceptible de s'hybrider in vivo sur l'ADN ou l'ARN du parasite pour bloquer les phénomènes de traduction et/ou de transcription et/ou de réplication. 5 Une amorce est une sonde comprenant de 5 à 30 monomères, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions prédéterminées, pour l'initiation d'une polymérisation enzymatique, par exemple dans une technique d'amplification telle que la PCR (Polymerase Chain10 Reaction), dans un procédé d'élongation tel que le séquençage, dans une méthode de transcription inverse ou analogue. Une sonde ou amorce préférentielle comportera une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID

N07, SEQ ID NO8, SEQ ID N09, SEQ ID N010, SEQ ID N012.

L'invention concerne aussi un réactif pour détecter et/ou identifier Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, comprenant au moins une sonde telle que définie précédemment, en particulier une sonde

de capture et une sonde de détection, l'une et/ou l'autre répondant à la définition ci-dessus.

L'invention apporte donc un procédé pour détecter sélectivement et/ou identifier Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, selon lequel on expose i'ARN, extrait du parasite et éventuellement dénaturé, ou l'ADN, extrait dénaturé, ou l'ADN obtenu à partir de la

transcription inverse de i'ARN, à au moins une sonde telle que définie précédemment et on détecte l'hybridation de ladite sonde.30 L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui va suivre faite en référence aux

figures annexées dans lesquelles: La figure 1, représente la carte de restriction du gène TclOO, déduite par Southern blot de différents

fragments obtenus après digestion d'ADN de Trypanosoma cruzi par des endonucléases de restriction.

La figure 2, est une représentation schématique des trois régions chevauchantes de l'ADNc Tc100. Les flèches numérotées représentent les oligonucléotides utilisés comme amorces pour l'amplification PCR. 5 Exemple l:Isolement du clone Tc50 Une banque d'expression a été construite à partir de fragments d'ADN génomique de Trypanosoma cruzi. L'ADN de T. cruzi, souche G (YOSHIDA. N, (1983) (17)), isolé du stade trypomastigote métacyclique a été digéré par l'enzyme DNase I. Après sélection des fragments suivant leur taille, ceux-ci ont été ligués à des adaptateurs15 synthétiques EcoRI et clonés dans le site EcoRI de l'ADN du vecteur lambda gtll (Young et Davis, 1983 (3); Cotrim et al., 1990) (4). Le clone, dénommé Tc50 par la Demanderesse, a été isolé de la banque par criblage immunologique, à l'aide

d'un mélange de sera de patients atteints de la maladie de Chagas en phase chronique.

Le clone phagique Tc50 a été purifié, amplifié et l'insert a été mis en évidence par la technique PCR ("Polymerase Chain Reaction"), à l'aide des amorçes: SEQ ID N03 5'(GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG)3' 24, et SEQ ID N04 5'(TTGACACCAGACCAACTGGTAATG)3' 24 correspondant, respectivement, à la séquence nucléotidique des bras gauche et droit de l'ADN du phage lambda gtll. Le fragment d'ADN Tc50 de 594 paires de bases

(pb), après digestion par EcoRI, a été sous-cloné dans le vecteur d'expression pGEX (Pharmacia) linéarisé par EcoRI.

Le séquençage de l'ADN du clone Tc50 a été réalisé dans ce même vecteur, àl'aide d'amorces spécifiques situées en 3' et 5' du site de clonage du pGEX, selon la technique de35 terminaison des chaines (Sanger et al., 1977(5)) et suivant le protocole du fournisseur (USB-Amersham).

La séquence nucléotidique du fragment Tc50 de 594 pb, ainsi que sa séquence déduite en acides aminés (198 aa) sont représentées dans les identificateurs SEQ ID NOI et SEQ ID N02,respectivement. La séquence nucléotidique du5fragment Tc50 de 594 pb commence au nucléotide (nt) 1232 et se termine au nucléotide 1825. La séquence en acides aminés correspondante commence à l'acide aminé 323 et se termine à l'acide aminé 520 de la SEQ ID N02 Exemple 2: Expression du clone Tc50 chez Escherichia coli La construction pGEX-Tc50 (198 aa) synthétise, dans la bactérie DH5alpha, une protéine en fusion avec la GST ("Glutathion S Transférase"), de masse moléculaire apparente de 50 kDa, mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (SDS: Dodecyl Sulfate de Sodium)(Laemmli, 1970(6)). La réactivité de la protéine20 vis à vis des sera humains chagasiques a été confirmée par la technique de Western blot (Towbin et al., 1979(7)), à l'aide du même mélange de sera chagasiques de phase chronique utilisé pour le criblage de la banque en lambda gtll.25 La fraction soluble de la protéine recombinante GST-Tc50 obtenue après lyse des extraits bactériens par ultrasons a été purifiée par chromatographie d'affinité sur colonne de glutathion agarose (Sigma),selon la méthode de Smith et Johnson, (1988) (8).30 Les propriétés antigéniques de l'antigène recombinant GST-Tc50 ont été testées par ELISA (Voller et al, 1975 (9)). Pour cela, des plaques de microtitrage (Maxisorp (nom commercial), Nunc) ont été sensibilisées avec 100 ng/ml de l'antigène GST-Tc50 en lOOmM NaHCO3 (pH 9,6). Après incubation avec les sera de patients, les immuncomplexes ont été détectés à l'aide d'un sérum de chèvre anti IgG humaines, couplé à la péroxydase. Les résultats sont présentés dans le tableau annexé et montrent que la totalité des séra humains chagasiques testés réagissent spécifiquement avec la protéine recombinante. Aucune réactivité croisée n'a été

observée sur 7 sera de malades atteints de leishmaniose cutanée ou viscérale.

Exemple 3: Identification de la protéine native de T. cruzi, présentant les déterminants antigèniques du clone Tc50 La mise en évidence de la protéine native de T. cruzi a été effectuée après immunopurification d'un mélange de sera humains chagasiques sur la protéine recombinante corespondante dénommée par la Demanderesse PTc50.20 L'éluat d'anticorps polyclonaux monospécifiques obtenu a été utilisé comme sonde, en Western blot, sur des

extraits protéiques totaux des différents stades du parasite. Les anticorps sélectionnés ont spécifiquement réagi avec une protéine de masse moléculaire apparente de25 lOOkDa, dénommée PTclOO par la Demanderesse, exprimée dans toutes les souches testées du parasite.

Exemple 4: Analyse moléculaire du qène TclOO0 -Southern blots Afin d'établir la carte de restriction du gène TclOO (figure 1), l'ADN nucléaire de T. cruzi, souche G, a été digéré par différentes endonucléases de restriction (BamHI, EcoRI, HindIII, PstI, PvuII, SacI, BamHI/EcoRI, BamHI/PvuII, EcoRI/HindIII, EcoRI/PstI, EcoRI/PvuII, EcoRI/SacI, PstI/SacI, PstI/PvuII, PvuII/SacI, PvuII/HindIII), séparé sur gel d'agarose puis transféré sur filtre de nylon d'après la technique de Southern. L'hybridation des Southern blots a été réalisée avec l'ADN5 de Tc 50 de 594 pb, qui est un fragment de l'ADN de Tcl00 décrit précédemment, radiomarqué au 32p par incorporation

aléatoire (Amersham).

- Clonaqe d'un fraqment génomique TclOO de 3500 pb D'après les résultats obtenus en Southern blot, l'ADN génomique de T. cruzi, souche G, a été digéré par l'enzyme EcoRI puis séparé sur gel d'agarose. Les fragments de restriction EcoRI d'environ 3500 pb (figure 1) ont été clonés dans le vecteur lambda gtlO (Huynh et al., 1984(10)) linéarisé par EcoRI. Le clone phagique contenant l'insert génomique TclOO de 3500 pb a été isolé à l'aide de la sonde radiomarquée de 594 pb décrite ci- dessus. Un fragment de 1041 pb situé dans la région 3' de l'insert génomique TclOO de 3500 pb a été séquencé. Ce20 séquençage a été effectué progressivement à l'aide des amorçes suivantes:

SEQ ID N05 5' (TCGGGCACTGACGCGGCG) 3' 18

SEQ ID N06 5' (CTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA) 3' 24

L'amorce SEQ ID N05 est située dans la partie séquencée préalablement du fragment de 594 pb de Tc50.

L'amorce SEQ ID N06 correspond à l'amorce du phage lambda gtlO.

Ce fragment de 1041 pb, qui commence au nucléotide 1403 et se termine au nucléotide 2443 de la SEQ ID N01, présente un cadre ouvert de lecture, en phase avec la

séquence du fragment de 594 pb de Tc50.

Exemple 5: Clonage de l'ADNc TclOO0 L'ADNc a été synthétisé à partir d'ARN totaux d'épimastigotes de T. cruzi, souche G. L'ADNc TclOO a été amplifié par la technique PCR, en trois différents fragments: un fragment A correspondant à la région 5' de 1459 pb, un fragment B correspondant à la région centrale de 942 pb, un fragment C correspondant à la région 3' de 1406 pb de l'ADNc de TclOO, comme représenté

schématiquement sur la figure 2.

- Clonage du fraqment A de l'ADNc TclOO0 L'ADNc total synthétisé par la transcriptase inverse de l'AMV ("avian myeloblastosis virus"), à l'aide d'hexanucléotides aléatoires (Boehringer Mannheim), a été amplifié, par PCR, grâce au couple d'amorces suivant: SEQ ID N07 5'(AACGCTATTATTAGAACAGTT)3' 21, et

SEQ ID N08 5'(TGCAGCAGCGGCAGAAGT)3' 18

La SEQ ID N07 correspond à une partie de la séquence consensus de 35 nucléotides présente en 5' des

ARNm chez les trypanosomatides et appelée "Spliced leader" (Parsons et al. 1984(11)).

La SEQ ID N08 correspond à la séquence complémentaire d'une partie de la séquence prédéterminée du fragment de 594 pb, et commence au nucléotide 1442 pour se terminer au nucléotide 1459 de la SEQ ID Nl01, selon la numérotation du brin codant. Apres vérification en Southern blot à l'aide de la sonde de 594 pb radiomarquée préalablement décrite, le fragment d'ADNc de 1459 pb correspondant à la région 5' de

TclOo0 a été cloné dans le plasmide nommé pCRII (nom commercial) (Invitrogen), et séquencé. La séquence représentée dans l'identificateur SEQ ID N01 commence au35 nucleotide 1 et se termine au nucléotide 1459.

- Clonage du fragment B de l'ADNc TclOO L'ADNc total de T. cruzi a été amplifié par PCR à l'aide des amorces: SEQ ID N09: 5'(CAGCCGACGGTAGCTGCGTCCT)3' 22, et

SEQ ID N010: 5'(ACATAATGGCCTCGTTCACAC)3' 21

La séquence ID N09 qui correspond à une partie de la séquence prédéterminée de 594 pb du gène TclOO,

commence au nucléotide 1266 et se termine au nucléotide10 1287 de la SEQ ID N01.

La séquence ID N010 correspond à la séquence complémentaire d'une partie de la séquence préalablement

décrite de 1041 pb du gène TclOO. Cette séquence ID N010 commence au nucléotide 2187 et se termine au nucléotide15 2207 de la SEQ ID N01, selon la numérotation du brin codant.

Le fragment obtenu, d'une longueur de 942 pb a été cloné dans le plasmide pCRII et séquencé. La séquence

représentée dans l'identificateur SEQ ID NOI commence au20 nucléotide 1266 et se termine au nucléotide 2207.

- Clonage du fragment C de l'ADNc TclOO Afin d'isoler la partie 3' de l'ADNc TclOO, l'ADNc total de T. cruzi a été synthétisé à l'aide de l'amorce hybride oligo(dT)16 adaptateur:

SEQ ID N011: 5' (GACTCGCTGCAGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT)3' 34,

suivant le protocole RACE ("Rapid Amplification of cDNA Ends") (Frohman et., 1988(12)). La région 3' de 1'ADNc TclOO a été amplifiée grâce à l'amorce adaptateur et au couple d'amorces suivant: SEQ ID N012: 5'(CGAAGAGACCATGAACAACTT)3' 21, et

SEQ ID N013: 5'(GACTCGCTGCAGATCGAT)3' 18

La séquence ID N012 correspond à une partie de la séquence 1041 pb précédemment décrite du gène TclOO, commençant au nucléotide 1997 et se terminant au nucléotide 2017. La séquence ID N011 correspond à la séquence arbitraire de l'adaptateur représentée dans la SEQ ID

N011.

Apres contrôle en Southern blot à l'aide du fragment radiomarqué de 1041 pb, décrit précédemment, le

fragment 3' de l'ADNc Tc100, long de 1423 pb, a été cloné en pCRII et séquence. La séquence représentée dans10 l'identificateur SEQ ID N01 commence au nucléotide 1997 et se termine au nucléotide 3402.

L'ADNc complet TclOO, d'une taille de 3402 pb, a été entièrement séquencé. Il présente un cadre ouvert de lecture de 2745 pb, et la séquence déduite en amino-acides

est de 915. Le codon methionine est en position 266 et le codon stop en position 3011.

Le gène TclOO de Trypanosoma cruzi code pour la nouvelle protéine PTclOO, de masse moléculaire théorique de 100 kDa.20 Bien entendu, puisque la séquence d'ADN du gène a été entièrement identifiée, il est possible de produire l'ADN correspondant entièrement par synthèse chimique,

puis d'insérer l'ADN dans des vecteurs d'ADN disponibles commercialement, en utilisant des techniques connues de la25 technologie relative à la recombinaison génétique.

TABLEAU

Maladie sera DO (492nm) seuil de détection = 0,320

MALADIE DE CHAGAS 1 1,358 (+)

2 1,278 (+)

3 0,328 (+)

4 0,404 (+)

1,378 (+)

LI VC L K - r 6 1,059 (+)

7 0,895 (+)

8 1,791 (+)

9 1,635 (+)

1,427 (+)

I 1 1,009(+)

12 1,743 (+)

13 0,530 (+)

14 1,035 (+)

0,461 (+)

LEISHMANIOSE CUTANÉE16 0,291 (-)

LEISHMANIOSE VISCERALE (Kala-azar) 17 0,071 (-)

18 0,081 (-)

19 0,279 (-)

0,098 (-)

21 0,067 (-)

0,125 (-)

NOMBRE DE SEQUENCES:13

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR:3402 liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: double liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE:ADN complémentaire lvi ORIGINE:T. cruzi lviA ORGANISME:T. cruzi lviB SOUCHE: G lviD STADE DE DEVELOPPEMENT: épimastigote lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE:Tc100

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 1

Description de la séquence: SEQ ID N 1

20 30 40 50 60

AACGCTATTA TTAGAACAGT TTC-GTACTA TATTGTCATT TGGGGAGGGG GGAAAGGGGG

80 90 100 110 120

GAAGTACTTG CCGTTTTGTG TGGGTGACGA GACAACACAC ATCGAGCGGG AAGAAAAAAA

140 150 160 170 180

AAAAGGAAAT AAATTAAATT AAATTATTTG TTCTTiGAAT AGGCAAAGAA GAAGAAGAAG

200 210 220 230 240

AAAAGGTGCT GGGGAGGGAG GAGAAAGCGA CACACACACA AAAAAAAAAA AAGGAATTGC

250 260 270 280 290 300

GGAAATAACA ACGCAAGGCG CGGACATGAC CGTGACGGTG GATTTGTTCA ATCATGCGAA

310 320 330 340 350 360

GCCGAGCAAC AATGAGGGCC GCGTGTGGTC TGTGGACGCC GCGACATTA ACGAGGTGCC

370 380 390 400 410 420

TGAGGCGCAG CGTGTGCTGG CGGATTCGCA GTTTTATCTT GCCTACACCA TGAAGCGGCG

430 440 450 460 470 480

TCACGTGCTG CGTGTGGTGA AGCGCTCGAA CCTTTTGAAG GGCACCGTGC GGGCACACTC

490 500 510 520 530 540

AAAGCCCATT CATGCGGTGA AG=TTGTGAA TTACCGCAGT AACGTCGCAG CATCGGCTGG

550 560 570 580 590 600

GAAGGGGGAG TTCTTCGTGT GGGTTGTGAC GGATGAAACG GAGGCGAGCA ACGGCAAGCC

610 620 630 640 650 660

GGATCTCGCA GCCCGCCTCA CAGTGAAGGT GTACTTAAG CTTCAGGATC CTGTCACAAT

670 680 690 700 710 720

TCCATGCITT TCTTTCTTTA TCAACGCCGA GAGTCAGCGG CCTGATCTGC TTGTCCTTTA

730 740 750 760 770 780

CGAAACGCAG GCGGCAATTC TTGACAGCTC CTCCCTCATT GAGCGCTTG ACGTGGAATC

790 800 810 820 830 840

ACTGGAGGCA ACACTACAGC GGAATTGCAC AACCCTGCGA ACCCTGACTC AACCGGTTAG

850 860 870 880 890 900

TGAGAACAGT TTATGCTCCG TTGGCTCTGG CGGATGGTTC ACCTrTACCA CGGAACCAAC

910 920 930 940 950 960

AATGGTAGCG GCATGCACAT TACGAAACCG CAGCACTCCA TCATGGGCGT GTTGCGAGGG

970 980 990 1000 1010 1020

TGAGCCAGTG AAGGCATTGC ATCTCCTTGA CGCAACCGTT GAGGAAAATG TCAGTGTTCT

1030 1040 1050 1060 1070 1080

CGTGGCCGCA TCTACAAAAG GGGTGTACCA ATGGCTCCTT ACGGGTGTAG CAGAACCAAA

1090 1100 1110 1120 1130 1140

CTTGTTGCGC AAGTTTGTCA TTGATGGATC TATTGTCGCG ATGGAAAGCT CACGAGAAAC

1150 1160 1170 1180 1190 1200

GTTTGCCGTG TTTGACGACA GGAAGCAGCT GGCGCTGGTG AACATGCATT CCCCTCATAA

1210 1220 1230 1240 1250 1260

CTTTACCTGC ACACACTACA TGATCGCCTTG TCAGGTACAG CGTAACGGCT TTGCTTCAA

1270 1280 1290 1300 1310 1320

TCGTACAGCC GACGGTAGCT GCGTCCTGGC TGACATGTCG AATCGATTGA CGATCTTCCA

1330 1340 1350 1360 1370 1380

TCTCCGGTCC TCCCGCAGGG AAGAACAGCA GCCAGGCCAA AAAACATCGG TAGTGGCGAC

1390 1400 1410 1420 1430 1440

GGCGAAACCG GGGTGTGTGT CCTCGGGCAC TGACGCGGCG AGTAGCAGTC ATACCAATAC

1450 1460 1470 1480 1490 1500

GACTTCTGCC GCTGCTGCAT CCCCTGCATC ACCCCCTGTT TCAGCGCCAG CGAAGGCAGC

1510 1520 1530 1540 1550 1560

CGCGCCTCCT GCCGCGGCGC GATCGGCTGA GCCGCACGTG GGGAGCAAGA TCATTGCTAA

1570 1580 1590 1600 1610 1620

TCTAGTGAAT CAGCTGGGGA TTAATGTCAC CCAAAGGAGC GTCGTCAGCA CTGGAGCGCC

1630 1640 1650 1660 1670 1680

GGCCACGACG AGGTCTACGG CGGTGACGTC CACGACTACC GCCCCGCAGC GAACAAGTCC

1690 1700 1710 1720 1730 1740

ATACGGGCAC AATGGCCGAC CTGTGACGGC TGGATTGGTG GCAGCTAATA GTGGTGCCAG

1750 1760 1770 1780 1790 1800

CGCGGCCTCG TCTCCCACAG CCGCGGCGAA ACCAACAGGA GAAGAAAAGG CCTCCGCGGC

1810 1820 1830 1840 1850 1860

ATGTGAAACG AGCTCCGTGG CGATAAATGC GACACGCCCG GCGCTTCACA ACGCCTCTCT

1870 1880 1890 1900 1910 1920

CCCGCAGGCG CCAACGGATG GCGTTTTGGC GGCAGCAGTA TACCAGTCGG AGGGCGAGGT

1930 1940 1950 1960 1970 1980

TCATCAGTCG CTGGAGCGGC TGGAGTCCGT CATAACCAAC ACGTCTCGGG TTCTGAAGTT

1990 2000 2010 2020 2030 2040

GCTCCCTGAC ACCATTCGAA GAGACCATGA ACAACTTCTG AATCTGGGTT TAGAGGCACA

2050 2060 2070 2080 2090 2100

GATGACAGAG CTGCAGCAGA GCCGTCCAAC ACCGCAAACA CAGCCGAGAG ACACAAGCTC

2110 2120 2130 2140 2150 2160

CGCGAAATCA TCCGTGTrrG AGACGTACAC CCTTGTTCTC ATTGCGGATT CCCTCTCTCG

2170 2180 2190 2200 2210 2220

CAACATCACG AAGGGGGTGA AGCGTGGTGT GAACGAGGCC ATTATGTTGC ATCTCGACCA

2230 2240 2250 2260 2270 2280

TGAGGTGCGG CACGCCATAG GGAACCGGCT TCGGCAAACA CAAAAGAACA TCATCAAGAG

2290 2300 2310 2320 2330 2340

CCGCCTCGAT GAAGCGTTGA AGGAAAGCAC TACACAGTTT ACGGCTCAAT TGACGCAAAC

2350 2360 2370 2380 2390 2400

GGTGGAGAAT CTGGTGAAGC GCGAGCTTGC CGAGGTGCTT GGTAGCATCA ACGGCTCCCT

2410 2420 2430 2440 2450 2460

CACTTCTCTC GTGAAGGAAA ATGCCTCATT ACAGAAAGAG TTGAATTCCA TAATGTCTAG

2470 2480 2490 2500 2510 2520

TGGGGTGTTG GATGAAATGC GTCGTATGCG GGAAGAGCTG TGCACATTGC GAGAGTCCGT

2530 2540 2550 2560 2570 2580

* TGCGAAGCGG AAGGCAACAA TGCCAGATTC TTCTCTTCAC GCCACGAGCT CCITTCAAGG

2590 2600 2610 2620 2630 2640

AAGAAGGTCT GCGCCCGAGA CAATTCTTGC AACCGCGTTA TCGATGGTGC GAGAGCAGCA

2650 2660 2670 2680 2690 2700

ATACCGTCAG GGACTGGAAT ACATGTTGAT GGCTCAGCAG CCCTCTCTCC TCCTGCGGTT

2710 2720 2730 2740 2750 2760

CCTCAGCATA CTTACAAGGG AAAACGAAAA CGCCTACTCG GAACTTATTG AAAATGTAGA

2770 2780 2790 2800 2810 2820

GACGCCGAAT GACGTGTGGT GTTCGGTTCT GTTGCAACTC ATAGAGGCCG CGGCGACGGA

2830 2840 2850 2860 2870 2880

GGCTGAGAAG GAGGTGGTTG TTGGCGTCGC CATTGATATT CTCTCCGAGC GCGATCAAAT

2890 2900 2910 2920 2930 2940

TGCTCAGAAC GGCGCACTCG GCTCGAAACT CACCACCGCC ATGCGAGCCT TTGAGCGACA

2950 2960 2970 2980 2990 3000

GGCAAGGTCG GAGACAACGA GCAGGTCATT CTTGCAATGC CTGAAGAACC TGGAAAAGCT

3010 3020 3030 3040 3050 3060

TCTGCAATCA TGATAATAAA AAGAACTCAA CGAATACAGT TGTTGATTAT TAAGGAAGGG

3070 3080 3090 3100 3110 3120

AAAAGAGCAGA AAGAGAGAGA AGAGAGAGAGA AATGTAATGG GCGiTTAGTT ACGGTAGAAA

3130 3140 3150 3160 3170 3180

GAAAACGTGT GGATAAGAAG GAGGGGTTTT GTGTGCGACC AGGAATTACT GGGGAACGCT

3190 3200 3210 3220 3230 3240

GCTACACGGC GGAATCGACC A-rTTTTATTAT TATTATTATT GTCTTAGTA TTATGiTTi1T

3250 3260 3270 3280 3290 3300

TCTTGTGTGT GTGTGTGTGT GTTTGTGTGT GTGCGGTTAT TTTGTATCCG TTTGCTCCCG

3310 3320 3330 3340 3350 3360

CCCCTGCCCC CCATCACCCG AGGAGAAAGT AGAATAAGAC ACATACGATT GTTGTTTTTG

3370 3380 3390 3400

TTATCCTTAA AAGGAAGAGA GACCAAAAAA AAAAAAAAAA AA

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 2

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR:915 liB TYPE: protéique liC NOMBRE DE BRINS: simple lvi ORIGINE:T. cruzi lviA ORGANISME:T. cruzi lviB SOUCHE:G lvii SOURCE IMMEDIATE: lviiA BIBLIOTHEQUE: lviiB CLONE:Tc100

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 2

Description de la séquence: SEQ ID N02

10 15 20

MET THR VAL THR VAL ASP LEU PHE ASN HIS ALA LYS PRO SER ASN ASN GLU GLY ARG VAL

30 35 40

TRP SER VAL ASP ALA ALA THR PHE ASN GLU VAL PRO GLU ALA GLN ARG VAL LEU ALA ASP

50 55 60

SER GLN PHE TYR LEU ALA TYR THR MET LYS ARG ARG HIS VAL LEU ARG VAL VAL LYS ARG

70 75 80

SER ASN LEU LEU LYS GLY THR VAL ARG ALA HIS SER LYS PRO ILE HIS ALA VAL LYS PHE

90 95 100

VAL ASN TYR ARG SER ASN VAL ALA ALA SER ALA GLY LYS GLY GLU PHE PHE VAL TRP VAL

110 115 120

VAL THR ASP GLU THR GLU ALA SER ASN GLY LYS PRO ASP LEU ALA ALA ARG LEU THR VAL

130 135 140

LYS VAL TYR PHE LYS LEU GLN ASP PRO VAL THR ILE PRO CYS PHE SER PHE PHE ILE ASN

150 155 160

ALA GLU SER GLN ARG PRO ASP LEU LEU VAL LEU TYR GLU THR GLN ALA ALA ILE LEU ASP

170 175 180

SER SER SER LEU ILE GLU ARG PHE ASP VAL GLU SER LEU GLU ALA THR LEU GLN ARG ASN

190 195 200

CYS THR THR LEU ARG THR LEU THR GLN PRO VAL SER GLU ASN SER LEU CYS SER VAL GLY

205 210 215 220

SER GLY GLY TRP PHE THR PHE THR THR GLU PRO THR MET VAL ALA ALA CYS THR LEU ARG

225 230 235 240

ASN ARG SER THR PRO SER TRP ALA CYS CYS GLU GLY GLU PRO VAL LYS ALA LEU HIS LEU

245 250 255 260

LEU ASP ALA THR VAL GLU GLU ASN VAL SER VAL LEU VAL ALA ALA SER THR LYS GLY VAL

265 270 275 280

TYR GLN TRP LEU LEU THR GLY VAL ALA GLU PRO ASN LEU LEU ARG LYS PHE VAL ILE ASP

285 290 295 300

GLY SER ILE VAL ALA MET GLU SER SER ARG GLU THR PHE ALA VAL PHE ASP ASP ARG LYS

305 310 315 320

GLN LEU ALA LEU VAL ASN MET HIS SER PRO HIS ASN PHE THR CYS THR HIS TYR MET MET

325 330 335 340

345 350 355 360

LEU ALA ASP MET SER ASN ARG LEU THR ILE PHE HIS LEU ARG SER SER ARGARG GLU GLU

365 370 375 380

GLN GLN PRO GLY GLN LYS THR SER VAL VAL ALA THR ALA LYS PRO GLY CYS VAL SER SER

385 390 395 400

GLY THR ASP ALA ALA SER SER SER HIS THR ASN THR THR SER ALA ALA ALA ALA SER PRO

405 410 415 420

ALA SER PRO PRO VAL SER ALA PRO ALA LYS ALA ALA ALA PRO PRO ALA ALA ALA ARG SER

425 430 435 440

ALA GLU PRO HIS VAL GLY SER LYS ILE ILE ALA ASN LEU VAL ASN GLN LEU GLY ILE ASN

445 450 455 460

VAL THR GLN ARG SER VAL VAL SER THR GLY ALA PRO ALA THR THR ARG SER THR ALA VAL

465 470 475 480

THR SER THR THR THR ALA PRO GLN ARG THR SER PRO TYR GLY HIS ASN GLY ARG PRO VAL

485 490 495 500

THR ALA GLY LEU VAL ALA ALA ASN SER GLY ALA SER ALA ALA SER SER PRO THR ALA ALA

505 510 515 520

ALA LYS PRO THR GLY GLU GLU LYS ALA SER ALA ALA CYS GLU THR SER SER VAL ALA ILE

525 530 535 540

ASN ALA THR ARG PRO ALA LEU HIS ASN ALA SER LEU PRO GLN ALA PRO THR ASP GLY VAL

545 550 555 560

LEU ALA ALA ALA VAL TYR GLN SER GLU GLY GLU VAL HIS GLN SER LEU GLU ARG LEU GLU

565 570 575 580

SER VAL ILE THR ASN THR SER ARG VAL LEU LYS LEU LEU PRO ASP THR ILE ARG ARG ASP

585 590 595 600

HIS GLU GLN LEU LEU ASN LEU GLY LEU GLU ALA GLN MET THR GLU LEU GLN GLN SER ARG

605 610 615 620

PRO THR PRO GLN THR GLN PRO ARG ASP THR SER SER ALA LYS SER SER VAL PHE GLU THR

625 630 635 640

TYR THR LEU VAL LEU ILE ALA ASP SER LEU SER ARG ASN ILE THR LYS GLY VAL LYS ARG

645 650 655 660

GLY VAL ASN GLU ALA ILE MET LEU HIS LEU ASP HIS GLU VAL ARG HIS ALA ILE GLY ASN

665 670 675 680

ARG LEU ARG GLN THR GLN LYS ASN ILE ILE LYS SER ARG LEU ASP GLU ALA LEU LYS GLU

685 690 695 700

SER THR THR GLN PHE THR ALA GLN LEU THR GLN THR VAL GLU ASN LEU VAL LYS ARG GLU

705 710 715 720

LEU ALA GLU VAL LEU GLY SER ILE ASN GLY SER LEU THR SER LEU VAL LYS GLU ASN ALA

725 730 735 740

SER LEU GLN LYS GLU LEU ASN SER ILE MET SER SER GLY VAL LEU ASP GLU MET ARG ARG

745 750 755 760

MET ARG GLU GLU LEU CYS THR LEU ARG GLU SER VAL ALA LYS ARG LYS ALA THR MET PRO

765 770 775 780

ASP SER SER LEU HIS ALA THR SER SER PHE GLN GLY ARG ARG SER ALA PRO GLU THR ILE

785 790 795 800

LEU ALA THR ALA LEU SER MET VAL ARG GLU GLN GLN TYR ARG GLN GLY LEU GLU TYR MET

805 810 815 820

LEU MET ALA GLN GLN PRO SER LEU LEU LEU ARG PHE LEU SER ILE LEU THR ARG GLU ASN

825 830 835 840

GLU ASN ALA TYR SER GLU LEU ILE GLU ASN VAL GLU THR PRO ASN ASP VAL TRP CYS SER

845 850 855 860

VAL LEU LEU GLN LEU ILE GLU ALA ALA ALA THR GLU ALA GLU LYS GLU VAL VAL VAL GLY

865 870 875 880

VAL ALA ILE ASP ILE LEU SER GLU ARG ASP GLN ILE ALA GLN ASN GLY ALA LEU GLY SER

885 890 895 900

LYS LEU THR THR ALA MET ARG ALA PHE GLU ARG GLN ALA ARG SER GLU THR THR SER ARG

905 910 915

SER PHE LEU GLN CYS LEU LYS ASN LEU GLU LYS LEU LEU GLN SER

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 24 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 3

GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG 24

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 4

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 24 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: oui lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 4

TTGACACCAGACCAACTGGTAATG 24

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 5

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 18 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 5

TCGGGCACTGACGCGGCG 18

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 6

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 24 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (phagique lambda gtlO) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: oui lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 6

CTTATGAGTATTTCTTCCAGGGTA 24

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 7

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 21 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADNc liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 7

AACGCTATTATTAGAACAGTT 21

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 8

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 18 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: oui lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

vii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 8

TGCAGCAGCGGCAGAAGT 18

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 9

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 22 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 9

CAGCCGACGGTAGCTGCGTCCT 22

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 10

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 21 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: oui lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 10

ACATAATGGCCTCGTTCACAC 21

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 11

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 34 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADNc liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: oui lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 11

GACTCGCTGCAGATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT 34

)

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 12

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 21 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN (génomique) liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: non lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 12

CGAAGAGACCATGAACAACTT 21

1 INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 13

li CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: liA LONGUEUR: 18 bases liB TYPE: acide nucléique liC NOMBRE DE BRINS: simple liD CONFIGURATION: linéaire lii TYPE DE MOLECULE: ADN liii HYPOTHETIQUE: non liv ANTI-SENS: oui lv TYPE DE FRAGMENT: lvi ORIGINE: oligonucléotide de synthèse

lvii SOURCE IMMEDIATE: bioMérieux S.A.

lxi DESCRIPTION DE LA SEQUENCE:

SEQ ID NO: 13

GACTCGCTGCAGATCGAT 18

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Les techniques classiques de biologie moléculaire ont été effectuées d'aprés les protocoles cités dans: "Molecular cloning, a laboratory manual". Maniatis T., Fritsch E.F. & Sambrook J. Second edition. Cold Spring

Harbor Laboratory Press (New York) (1989).

1. Paranhos-Baccala G., Santos M., Cotrim P., l0 Rassi A., Jolivet M., Camargo M.E. & Da Silveira J F. Detection of antibodies in sera from Chagas disease

patients using a Trypanosoma cruzi immunodominant recombinant antigen. Parasite Immunology (1994): 16: 165-169.

2. Lafaille J.J., Linss J., Krieger M.A., Padron T.S., De Souza W & Goldenberg S. Structure and expression

of two Trypanosoma.cruzi genes encoding antigenic proteins bearing repetitive epitopes. Molecular and Biochemical20 Parasitology. (1989). 35: 127-136.

3. Young R.A. & Davis R.W. Efficient isolation of genes by using antibody probes. Proc. Natl. Acad. Sci.

USA. (1983). 80: 1194-1198.25

4. Cotrim P.C., Paranhos G., Mortara R.A., Wanderley J., Rassi A., Camargo ME. & Da Silveira J.F.

Expression in Escherichia coli of a dominant immunogen of Trypanosoma cruzi recognized by human chagasic sera.30 Journal of Clinical Microbiology. (1990). 28(3): 519-524.

5. Sanger F., Nicklen S. & Coulson A.R. DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1977). 74: 54635467.35

6. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.

Nature. (1970). 227: 680-685.

7. Towbin H., Staehelin T. & Gordon J. Electrophoretic transfer ofproteins from polyacrylamide

gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1979). 76: 4350-4354.

8. Smith D.B. & Johnson K.S. Single step purification of polypeptides expressed in Escherichia coli

as fusions with glutathione S transferase. Gene. (1988). 67: 31-40.

9. Voller A., Draper C., Bidwell D.E. & Bartlett A. Microplate enzymelinked immunosorbent assay for Chagas

disease. Lancet (1975). 1.: 1426.

10. Huynh T.V., Young R.A. & Davis R.W. DNA Cloning: A practical approach. (1984)(Ed. D. Glover) 49-

78. IRL. Oxford.

11. Parsons M., Nelson R.G., Watkins K.P. &

Agabian N. Trypanosome mRNAs share a common 5' Spliced Leader sequence. Cell. (1984). 38: 309-316.

12. Frohman M.A., Dush M.K. & Martin G.R. Rapid production of full lengh cDNA from rare transcripts:

amplification using a single gene specific oligonucleotide primer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.(1984) 85: 8998-9002.

13. Nielsen P.E et al., Science, 254, 1497-1500

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14. Maniatis et ai., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor (1982).

15. Southern E.M, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975).

16. Dunn A.R, Hassel J.A, Cell, 12, 23 (1977).

17. Yoshida N, Surface antigens of metacyclic trypomastigotes of Trypanosoma cruzi, Infection and

Immunity, 40, 386-389, (1983).

Claims (19)

REVENDICATIONS

1- Molécule d'ADN ou d'ARN, caractérisée en ce qu'elle est constituée par au moins un brin comprenant une

séquence nucléotidique identique, complémentaire ou anti-5 sens, ou homologue à la séquence identifiée dans l'identificateur SEQ ID N01.

2- Fragment d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique identique,

complémentaire ou anti-sens, ou homologue à la séquence10 commençant au nucléotide 1232 et se terminant au nucleotide 2207 de la SEQ ID N01.

3- Fragment d' ADN ou d' ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique identique,

complémentaire ou anti-sens, ou homologue à la séquence15 commençant au nucléotide 1232 et se terminant au nucleotide 1825 de la séquence SEQ ID N01.

4- Fragment d'ADN ou d'ARN, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique identique,

complémentaire ou anti-sens, ou homologue à la séquence20 commençant au nucléotide 1266 et se terminant au nucleotide 2207 de la SEQ ID N01.

- Substance protéique reconnue par des anti-sera anti Trypanosoma cruzi, caractérisée en ce qu'elle est

choisie dans le groupe comprenant:25 - une protéine de masse moléculaire apparente d'au plus environ 100 kDa, reconnue par des antisera anti-

Trypanosoma cruzi - tout équivalent immunologique de ladite protéine

- et tout fragment de ladite protéine.

6- Substance protéique, selon la revendication 5, caractérisée en ce qu'elle est choisie dans le groupe comprenant: - une protéine ayant une séquence en acides aminés, identifiée dans l'identification SEQ ID N02

- tout fragment de ladite protéine.

7- Fragment protéique selon la revendication 6, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence en acides

aminés commençant à l'acide aminé 323 et se terminant à l'acide aminé 520 de la SEQ ID N02, ou tout équivalent5 immunologique dudit fragment.

8- Cassette d'expression fonctionnelle dans une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote,

permettant l'expression d'ADN codant pour un fragment protéique selon la revendication 7 ou d'une protéine selon10 l'une quelconque des revendications 5 ou 6.

9- Cassette d'expression selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans les

cellules issues d'un organisme eucaryote, notamment les cellules issues d'un mammifère, les cellules d'insectes,15 les cellules issues d'un champignon, les cellules issues d'une levure.

- Cassette d'expression selon la revendication 8, caractérisée en ce qu'elle est fonctionnelle dans les cellules issues d'un organisme procaryote, notamment les

cellules issues d'une souche d'E. coli ou les cellules issues d'entérobactéries.

11- Cassette selon la revendication 10, caractérisée en ce que la cellule issue d'un organisme

procaryote est une cellule de la souche d'E. coli DH5a.25 12- Cassette d'expression selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que l'ADN code

pour une protéine reconnue par des anti-sera anti- Trypanosoma cruzi, ayant la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N02, débutant à30 l'acide aminé +1 et se terminant à l'acide aminé +915, ou tout équivalent immunologique de ladite protéine.

13- Cassette d'expression selon l'une des revendications 8 à 11, caractérisée en ce que l'ADN code

pour une protéine spécifique de Trypanosoma cruzi, ayant35 la séquence identifiée dans l'identificateur de séquence SEQ ID N02, débutant à l'acide aminé 323 et se terminant à

l'acide aminé 520. 14- Vecteur comprenant une cassette d'expression selon l'une des revendications 8 à 13.

15- Cellule issue d'un organisme eucaryote ou procaryote comprenant une cassette d'expression selon

l'une des revendications 8 à 13 ou un vecteur selon la revendication 14. 16- Procédé de préparation d'une protéine selon la

revendication 5 ou 6, ou d'un fragment protéique selon la revendication 7 selon lequel: (i) on cultive dans des conditions appropriées une cellule issue d'un organisme procaryote ou eucaryote selon

la revendication 15, et15 (ii) on récupère ladite protéine produite par ladite cellule issue dudit organisme.

17- Peptide caractérisé en ce qu'il comprend une séquence peptidique appartenant à la protéine selon la revendication 5 ou 6, ou à un fragment protéique selon la20 revendication 7, et en ce qu'il présente une réactivité avec des sera d'individus ou d'animaux infectés par T. cruzi. 18- Composition peptidique, caractérisée en ce qu'elle comprend un mélange de peptides, selon la

revendication 17.

19- Anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par réaction

immunologique d'un organisme humain ou animal à un agent immunogène constitué par une protéine selon la30 revendication 5 ou 6, ou à un fragment protéique selon la revendication 7, ou un peptide selon la revendication 17.

- Réactif pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi,

caractérisé en ce qu'il comprend, à titre de substance35 réactive, au moins un anticorps selon la revendication 19.

21- Réactif pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi, caractérisé en ce qu'il comprend, à titre de substance réactive, une protéine selon la revendication 5 ou 6, ou5 un fragment protéique selon la revendication 7, ou un peptide selon la revendication 17, ou une composition peptidique selon la revendication 18. 22- Moyen de détection et/ou de surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi, caractérisé en ce qu'un

réactif selon l'une des revendications 20 ou 21, est fixé sur un support solide compatible avec ledit réactif.

23- Procédé pour la détection et/ou la surveillance d'une infection par Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, tel qu'un échantillon de sang d'un individu ou d'un animal susceptible d'avoir été infecté par Trypanosoma cruzi, caractérisé en ce qu'on met en contact ledit échantillon et un réactif selon la revendication 20 ou 21, dans des conditions permettant une éventuelle réaction immunologique, et on détecte ensuite

la présence d'un complexe immun avec ledit réactif.

24- Sonde pour l'identification de Trypanosoma cruzi, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique dont la séquence nucléotidique correspond à tout25 ou partie de la séquence représentée dans l'identification SEQ ID Nl01, ou à la séquence complémentaire ou homologue à cette dernière. 25- Sonde selon la revendication 24, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence de 5 à 100, en

particulier de huit à 50 nucleotides.

26- Sonde de thérapie pour le traitement des infections dues à Trypanosoma cruzi, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique dont la séquence35 nucléotidique correspond à tout ou partie de la séquence représentée dans l'identification SEQ ID NOl, ou à la séquence complémentaire ou homologue à cette dernière.

27- Amorce pour l'amplification d'une séquence nucléotidique, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique permettant l'hybridation à un acide nucléique dont la séquence nucléotidique correspond à tout ou partie de la séquence représentée dans l'identification SEQ ID Nl01, ou à la séquence complémentaire ou homologue à cette dernière.10 28- Amorce selon la revendication 27, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence nucléotidique d'au moins cinq nucléotides. 29- Amorce selon la revendication 28, caractérisée en ce qu'elle présente une séquence nucléotidique choisie

parmi SEQ ID N07, SEQ ID N08, SEQ ID N09, SEQ ID N010 et SEQ ID N012.

- Composition pharmaceutique pour prévenir ou traiter les infections dues à Trypanosoma cruzi, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe20 actif une quantité thérapeutiquement active d'une substance protéique selon la revendication 5 ou 6, d'un

fragment protéique selon la revendication 7, d'une cassette selon l'une des revendications 8 à 13, d'un vecteur selon la revendication 14, d'une cellule selon la25 revendication 15, ou un d'anticorps selon la revendication

19. 31- Réactif pour détecter et/ou identifier Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une sonde dite de capture30 et/ou une sonde de détection selon la revendication 24 ou , ladite sonde de capture et ladite sonde de détection, si présentes toutes les deux, ayant respectivement des

séquences nucléotidiques au moins partiellement différentes.

32- Réactif selon la revendication 31, caractérisé en ce que la sonde de capture est fixée sur un support solide directement ou indirectement. 33Réactif selon la revendication 31, caractérisé en ce que la sonde de détection est marquée au moyen d'un marqueur choisi parmi les isotopes radiactifs, des enzymes notamment choisies parmi la peroxydase et la phosphatase alcaline et celles susceptibles d'hydrolyser un substrat chromogène, fluorigène ou luminescent, des composés10 chimiques chromophores, des composés fluorigènes, luminescents, des analogues de bases nucléotidiques, et la biotine. 34- Réactif selon la revendication 31, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une amorce selon l'une des

revendications 27 à 29.

- Procédé de détection et/ou d'identification de Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on expose l'ADN extrait et dénaturé de Trypanosoma cruzi, ou l'ADN obtenu par transcription20 inverse de l'ARN, à au moins une sonde selon la revendication 24 ou 25, puis on détecte l'hybridation de ladite sonde. 36- Procédé de détection et/ou d'identification de Trypanosoma cruzi dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'on expose l'ARN extrait et éventuellement dénaturé de Trypanosoma cruzi à au moins une sonde selon la revendication 24 ou 25, puis on détecte l'hybridation de ladite sonde. 37- Procédé selon la revendication 35 ou 36, caractérisé en ce que, avant d'exposer l'ADN ou l'ARN à ladite sonde, on réalise une amplification dudit ADN ou

ARN, en présence d'un système enzymatique approprié, et avec au moins une amorce selon l'une des revendications 27 à 29.