CN103278642A

CN103278642A - 一种检测伊氏锥虫vsg抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及制备方法

Info

Publication number: CN103278642A
Application number: CN2013101790012A
Authority: CN
Inventors: 陈汉忠; 李晓栩; 王华俊; 李义平
Original assignee: Guangxi University
Current assignee: Guangxi University
Priority date: 2013-05-15
Filing date: 2013-05-15
Publication date: 2013-09-04

Abstract

一种检测伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）变异表面糖蛋白（VSG）抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定（double antibody sandwich ELISA）试剂盒，由包被有3D7单克隆抗体的多孔板，辣根过氧化物酶（HRP）标记的5B9单克隆抗体，和显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺（TMB）组成。上述试剂盒的制备方法有以下工艺步骤：（1）制备包被有3D7单克隆抗体的多孔板；（2）制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的5B9单克隆抗体检测液：（3）配备显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺。

Description

一种检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及制备方法

技术领域

本发明属于寄生虫病免疫诊断、检测技术领域，具体是一种检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒及制备方法。

背景技术

伊氏锥虫（Trypanosoma evansi）病是一种世界范围广泛分布的、发生于多种动物的锥虫病，我国许多地区都有分布。伊氏锥虫主要寄生于马、驴、骡、水牛、黄牛、奶牛、绵羊等家畜，一些野生动物如虎、鹿和骆驼也常见感染。伊氏锥虫病能直接引起动物的急性死亡或隐性感染，造成贫血，死胎、流产，泌乳减少等，给我国畜牧业造成极大的损失。另外，国外还有感染人的报道，因此伊氏锥虫病也是一种人畜共患寄生虫病。该病的控制有赖于有效的检测诊断方法。

目前伊氏锥虫病的检测和诊断方法主要有：（1）病原学方法，如血液虫体镜查法；（2）分子生物学检测方法，如聚合酶链反应（PCR）法（3）免疫学检测方法，如补体结合试验、间接血凝试验、炭素凝集试验、胶乳凝集试验、琼脂扩散试验、对流免疫电泳试验、酶联免疫吸附测定法、间接荧光抗体试验等等。上述方法各有优缺点，但目前应用的最多的仍然是酶联免疫吸附测定法，酶联免疫吸附测定法仍然被国内外公认为是伊氏锥虫病比较可靠的免疫学诊断和评价手段。本发明建立的检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法，利用了我们制备和筛选鉴定的伊氏锥虫VSG抗原的特异3D7和5B9单克隆抗体，其抗体可大量的制备、单抗质量容易控制，因此可进一步提高检测方法的稳定性、灵敏度和特异性。本法可用于伊氏锥虫病现症检测和诊断、早期诊断和药物治疗效果评价等，尤其适用于以隐性感染为主的动物如水牛等的伊氏锥虫病检测和诊断。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定方法及其试剂盒的制备方法。为临床特异、准确的检测、诊断伊氏锥虫病提供有效方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

1.一种检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，所述试剂盒由包被有3D7单克隆抗体的多孔板、辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体检测液和显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺组成，

其中：

所述多孔板每孔包被3D7单克隆抗体浓度为1.0-5.0μg/mL；

所述的辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体稀释液使用浓度为8.0-24.0μg/mL。

2.一种检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，操作步骤如下：

（1）制备包被有3D7单克隆抗体的多孔板

用Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1000mL，在4℃条件下保存的包被液将3D7单克隆抗体稀释为浓度2.5μg/mL的稀释液；然后将所述3D7单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，加入量为100μL/孔，在37℃条件下反应2小时，置于4℃条件下包被至少12小时，包被时间届满后，将质量浓度1%的牛血清白蛋白溶液加入多孔板的各孔内，并在37℃进行封闭反应，封闭反应时间至少1小时以上，封闭反应结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有7D1单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃，所述磷酸盐缓冲液为NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，KCl0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，Tween-200.5mL，加双蒸水定容至1000mL；

（2）制备辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体

将纯化的5B9单克隆抗体8～10mg装入透析袋，用0.01M，pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，期间换液4次；取辣根过氧化物酶4mg，溶解于1mL纯水中，缓慢加入0.1M NaIO₄15mL，室温避光搅拌20分钟，装入透析袋，用0.001M pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜，期间换液4次；向辣根过氧化物酶中加入0.2M,pH9.5的Na₂C0₃-NaHCO₃缓冲液，使以上醛化辣根过氧化物酶的pH升高到9.0～9.5,然后与抗体混合，避光搅拌2小时；加入4mg/mL的NaBH₄0.lmL,在4℃条件下静置2小时后，于4℃条件下在0.15M pH7.4PBS中透析过夜，期间换液3次；加入等体积饱和硫酸铵，搅拌30分钟，4℃条件下静置2小时，3000rpm离心20分钟，弃上清。沉淀再用50％的饱和硫酸铵洗一遍；沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中，装入透析袋中，在0.15M pH7.4PBS中透析，去除按离子后，10000rpm离心30min去除沉淀，上清即为辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体，分装后于-80℃保存备用；使用时，用磷酸盐缓冲液作1∶20000倍稀释，然后将辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，加入量为100μL/孔。

（3）配备显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺。

所述辣根过氧化物酶和显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺均为市售商品，可直接从市场购买。

所述多孔板为市售酶标专用多孔板商品，可直接从市场购买。

本发明所述试剂盒及制备方法中，3D7单克隆抗体和5B9单克隆抗体本质上为蛋白质，能特异识别伊氏锥虫VSG抗原，所述3D7单克隆抗体和5B9单克隆抗体的制备和纯化方法见：抗水牛伊氏锥虫VSG抗原单克隆抗体的研制，中国畜牧兽医2009年36卷第10期。

本发明所述检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，检测标本为血清，所需仪器为酶标仪，使用方法如下：

在包被有3D7单克隆抗体的多孔板的孔中加入待检样品，37℃反应1.5小时后，洗涤液洗涤3次除去未反应物，加入辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体稀释液，37℃作用1小时后洗涤除去未反应物，用3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺显色，显色时间为20分钟，用酶标仪测所述多孔板各孔的OD₄₅₀值。

本发明具有以下有益效果：

1.由于本发明所述试剂盒含有两种伊氏锥虫VSG抗原识别抗体（3D7单克隆抗体和5B9单克隆抗体），而且这两种单克隆抗体是我们从制备的多个单克隆抗体中筛选鉴定出来的，因而使用本发明所述试剂盒检测伊氏锥虫VSG抗原特异性更好。

2.使用本发明所述试剂盒进行伊氏锥虫VSG抗原检测，操作方法简单，一个样品的检测只需5个小时左右。与传统血液涂片和动物接种等检测方法相比，使用本发明所述试剂盒可以进行早期诊断，而且具有更高的检测灵敏度。

3.与常用的间接酶联免疫吸附法相比，使用本发明所述试剂盒，能区分现症感染和既往感染，能做出是否感染伊氏锥虫的直接判断，还可用于临床伊氏锥虫病治疗效果的评价。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步说明。

下述实施例中涉及的材料来源和制备方法如下：

3D7单克隆抗体和5B9单克隆抗体的制备方法见：抗水牛伊氏锥虫VSG抗原单克隆抗体的研制，中国畜牧兽医2009年36卷第10期；

辣根过氧化物酶、显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺、牛血清白蛋白均为Sigma公司产品；

其余常规试剂为国产分析纯级产品；

各种试液配制：

包被缓冲液(碳酸钠缓冲液)配制：Na₂CO₃1.59g，NaHCO₃2.93g，加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存；

磷酸盐缓冲液（基础稀释液，PBS）配制：NaCl8.0g，KH₂PO₄0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O2.9g，KCl0.2g，加双蒸水定容至1000mL，高压灭菌，室温保存；

洗涤液配制：基础稀释液1000mL，Tween200.5ml，用前配制,4℃保存；

血清稀释液：牛血清白蛋白1.0g，加基础稀释液定容至100mL。

酶标二抗稀释液配制:基础稀释液1000mL，Tween200.5mL，用前配制,4℃保存；

封闭液配制牛血清白蛋白1.0g，加洗涤液定容至100mL。

底物缓冲液配制:底物缓冲液配制Na₂HPO₄·12H₂O3.68g，柠檬酸0.93g，加双蒸水定容至100mL，4℃保存。

显色液配制：3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺使用液配制TMB10mg，加入 5mL无水乙醇溶解，加0.75％H₂O₂32μL，加底物缓冲液容至10mL，用前配制。

终止液配制：浓硫酸22.2mL，蒸馏水177.8mL。

多孔板为市售96孔的酶标检测用多孔板。

实施例1

本实施例中，采用以下工艺步骤制备检测伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒。

（1）制备包被有3D7单克隆抗体的多孔板

用碳酸盐缓冲液即包被液将3D7单克隆抗体稀释为浓度2.5μg/mL的稀释液，然后将所述3D7单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，加入量为100μL/孔，湿盒37℃反应2小时，再置于4℃条件下包被至少12小时，包被时间届满后，将质量浓度1%的牛血清白蛋白溶液加入多孔板的各孔内，加入量为100μL/孔，并在37℃条件下进行封闭反应，封闭反应时间至少1小时以上，封闭反应结束后，用磷酸盐缓冲液洗涤多孔板，当多孔板上的未反应物被去除后即获得包被有3D7单克隆抗体的多孔板，其保存温度为4℃（一般在4℃冰箱保存备用）。

（2）制备辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体

将纯化的5B9单克隆抗体8～10mg装入透析袋，用0.01M，pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，期间换液4次；取HRP4mg，溶解于1mL纯水中，缓慢加入0.1M NaIO₄0.15mL，室温避光搅拌20分钟，装入透析袋，用0.001M pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜。期间换液4次；向HRP中加入0.2M,pH9.5的Na₂C0₃-NaHCO₃缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5,然后与抗体混合，避光搅拌2小时；加入4mg/mL的NaBH₄0.lmL,4℃静置2小时后，于4℃在0.15M pH7.4PBS中透析过夜，期间换液3次；加入等体积饱和硫酸铵，搅拌30分钟，4℃静置2小时，3000rpm离心20分钟，弃上清。沉淀再用50％的饱和硫酸铵洗一遍；沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中，装入透析袋中，在0.15M pH7.4PBS中透析，去除按离子后，10000rpm离心30min去除沉淀，上清即为酶结合物，分装后于-80℃保存备用。使用时，用磷酸盐缓冲液作1：2000倍稀释。

（3）用底物缓冲液配制3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺底物显色液20000μL。

用本实施例制备的检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒对伊氏锥虫VSG抗原和阴性血清进行对比检测，操作如下：

将伊氏锥虫VSG抗原用磷酸盐缓冲液稀释成表1中的稀释倍数；用碳酸缓冲液将3D7单克隆抗体稀释为浓度2.5μg/mL的稀释液；将辣根过氧化物酶（HRP）标记的5B9单克隆抗体作1:2000稀释。对照包括阴性血清和空白对照（磷酸盐缓冲液,PBS）。

向包被有3D7单克隆抗体的多孔板的各列孔中分别加入不同稀释倍数的伊氏锥虫VSG抗原、血清和磷酸盐缓冲液。加入量为每孔100μL。在37℃反应1.5小时后，用洗涤液洗涤3次除去未反应物，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的5B9单克隆抗体稀释液，37℃作用1小时后洗涤除去未反应物，再洗涤3次，加入新鲜配制的3'.3'.5，5'-四甲基联苯胺显色底物，37℃显色时间为35分钟，加入终止液50μL/孔终止反应，用酶标仪测所述多孔板各孔的OD₄₅₀值。结果见表1。

表1检测结果

从表1的检测结果可以看出随着检测标本中伊氏锥虫VSG抗原浓度的降低，OD₄₅₀值也随之降低。

实施例2

判断检测样本中伊氏锥虫VSG抗原阴阳临界值（OD₄₅₀平均值）的确定。按照实施例1所述的检测伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测操作方法，向包被有3D7单克隆抗体的多孔板的各列孔中分别加入阴性血清、阳性对照血清和空白对照（PBS，同上）检测样品，检测20份阴性血清样本，以及阳性对照血清和空白对照，每份重复3孔，结果见表2，按照公式：阴阳性临界值=阴性样本OD₄₅₀平均值+3×标准方差，经计算把判断检测样本中伊氏锥虫VSG抗原阴阳临界值确定为0.135。用所述的检测伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测样本时，在阴阳对照成立的情况下，OD₄₅₀大于0.135就可以判定为伊氏锥虫VSG抗原阳性，否则，判为阴性。

表2阴性血清、阳性对照血清OD₄₅₀值测定结果

实施例3

对伊氏锥虫VSG抗原的特异性检测验证测定。按照实施例1所述的检测伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测方法，检测伊氏锥虫VSG抗原、泰勒虫抗原、弓形虫抗原、衣原体抗原、大片吸虫抗原，并用SP2/0细胞（骨髓瘤细胞）作阴性对照，进行特异性验证测定，结果见表3。

从表3的检测结果可以看出，伊氏锥虫VSG抗原的OD₄₅₀值在0.135（阴阳临界值）以上，而泰勒虫抗原、弓形虫抗原、衣原体抗原、大片吸虫抗原检测到的OD₄₅₀值都低于阴阳临界值，证明用所述的检测大片形吸虫双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测泰勒虫抗原、弓形虫抗原、衣原体抗原、大片吸虫抗原时，不与这些抗原发生交叉反应，说明所述的检测伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒具有良好的检测特异性。

表3双抗体夹心ELISA特异性检测结果

实施例4

采集82份广西南宁地区水牛的血清，按照实施例1所述的检测伊氏锥虫VSG抗原双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测方法检测这些临床血清样本，结果见表4。

从表4检测结果可知，按照实验确定的阴阳临界OD₄₅₀值（见实施例2）为0.135，实验的阴阳对照和空白对照成立，在所检测的血清82份中，有18份的OD₄₅₀值大于0.135，因此判断为阳性。结果：临床样本血清抗原阳性检出率为21.95%，检测数据结果见表4。

表4检测大片形吸虫双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒检测临床血清样本结果

。

Claims

1.一种检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由包被有3D7单克隆抗体的多孔板、辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体检测液和显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺组成，

其中：

所述多孔板每孔包被3D7单克隆抗体浓度为1.0-5.0μg/mL；

所述的辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体检测液使用浓度为8.0-24.0μg/mL。

2.一种检测伊氏锥虫VSG抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其特征在于，操作步骤如下：

（1）制备包被有3D7单克隆抗体的多孔板

（2）制备辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体

将纯化的5B9单克隆抗体8～10mg装入透析袋，用0.01M，pH9.6的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜，期间换液4次；取辣根过氧化物酶4mg，溶解于1mL纯水中，缓慢加入0.1M NaIO₄15mL，室温避光搅拌20分钟，装入透析袋，用0.001M pH4.4的醋酸盐缓冲液4℃透析过夜，期间换液4次；向辣根过氧化物酶中加入0.2M,pH9.5的Na₂C0₃-NaHCO₃缓冲液，使以上醛化辣根过氧化物酶的pH升高到9.0～9.5,然后与抗体混合，避光搅拌2小时；加入4mg/mL的NaBH₄0.lmL,在4℃条件下静置2小时后，于4℃条件下在0.15M pH7.4PBS中透析过夜，期间换液3次；加入等体积饱和硫酸铵，搅拌30分钟，4℃条件下静置2小时，3000rpm离心20分钟，弃上清，沉淀再用50％的饱和硫酸铵洗一遍；沉淀物溶于少量0.15M pH7.4的PBS中，装入透析袋中，在0.15M pH7.4PBS中透析，去除按离子后，10000rpm离心30min去除沉淀，上清即为辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体，分装后于-80℃保存备用；使用时，用磷酸盐缓冲液作1∶20000倍稀释,然后将辣根过氧化物酶标记的5B9单克隆抗体稀释液加入多孔板的各孔内，加入量为100μL/孔；

（3）配备显色底物3'，3'，5，5'-四甲基联苯胺。