Aufgabe der vorliegenden Erfindung
war es, neuartige Mittel bereitzustellen, mit deren Hilfe Sialinsäure-gesteuerte
biologische oder patho-biologische Prozesse beeinflussbar sind.
Obige Aufgabe konnte überraschenderweise
gelöst
werden durch Bereitstellung neuartiger Enzyme mit Trans-Sialidase-Aktivität und der
kodierenden Sequenzen davon aus Trypanosoma congolense.
Ein erster Gegenstand der Erfindung
betrifft Polynukleotide, welche für Proteine mit Trans-Sialidase-Aktivität kodieren
und aus Trypanosoma congolense isolierbar sind, wobei diese Proteine
vorzugsweise den Transfer von Sialinsäure von einem Donor auf ein
Akzeptormolekül
katalysieren.
Bevorzugte Polynukleotide umfassen
wenigstens eine Nukleinsäuresequenz
gemäß SEQ ID
NO: 1 oder 3, oder stellen Fragmente davon dar, welche wenigstens
15 zusammenhängende
Nukleotidreste umfassen. Gegenstand der Erfindung sind auch die
dazu komplementären
Polynukleotide und Fragmente; und die von diesen Polynukleotiden
durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Nukleotidsequenzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung
betrifft Oligonukleotide, welche mit einem erfindungsgemäßen Polynukleotid,
insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisieren.
Gegenstand der Erfindung sind auch
Polynukleotide, welche mit einem Oligonukleotid gemäß obiger Definition,
insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisieren und für ein Genprodukt
aus Mikroorganismen der Gattung Trypanosoma kodieren.
Gegenstand der Endung sind auch Polypeptide,
welche von einem Polynukleotid kodiert werden, das eine Nukleinsäuresequenz
gemäß obiger
Definition umfasst; oder welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die wenigstens
10 zusammenhängende
Aminosäuren
gemäß SEQ ID
NO: 2 oder 4 umfasst; sowie funktionale Äquivalente da von, welche Trans-Sialidase-Aktivität besitzen.
Gegenstand der Erfindung sind insbesondere
Trans-Sialidasen oder funktionale Äquivalente davon mit Trans-Sialidase-Aktivität, gekennzeichnet
durch eine der folgenden Aminosäureteilsequenzen:
TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGR
(Pos. 1 bis 25 gemäß SEQ ID
NO: 2)
FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI (Pos. 1 bis 30 gemäß SEQ ID
NO: 4).
Eine bevorzugte Trans-Sialidase 1
(TS1) ist durch wenigstens eines der folgenden Charakteristika gekennzeichnet:
Eine weitere bevorzugte Trans-Sialidase
2 (TS2), ist durch wenigstens eines der folgenden Charakteristika
gekennzeichnet:
Die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Polynukleotide
und Polypeptide, insbesondere kodierenden Nukleinsäuresequenzen
und Aminosäuresequenzen
sind aus dem Organismus Trypanosoma congolense ableitbar. Sie sind
aber auch unter Anwendung synthetischer, insbesondere chemischer,
biochemischer, enzymatischer, gentechnologischer und transgener
Methoden zugänglich.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin
funktionale Äquivalente
erfindungsgemäßer Trans-Sialidasen.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin
Expressionskassetten, umfassend in operativer Verknüpfung mit
wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz
gemäß obiger
Definition. Weiterhin umfasst die Erfindung auch rekombinante Vektoren,
enthaltend wenigstens eine dieser Expressionskassetten.
Gegenstand der Erfindung sind außerdem prokaryotische
oder eukaryotische Wirte, transformiert mit wenigstens einem Vektor
gemäß obiger
Definition.
Weiterhin betrifft die Erfindung
die Verwendung einer Expressionskassette, eines Vektors oder eines Wirts
gemäß obiger
Definition zur rekombinanten Herstellung eines Proteins mit Trans-Sialidase-Aktivität.
Gegenstand der Erfindung ist auch
ein Verfahren zur enzymatischen Sialisierung eines Akzeptormoleküls, dadurch
gekennzeichnet, dass man das Akzeptormolekül mit einem Sialinsäurereste
enthaltenden Donor in Gegenwart einer Trans-Sialidase gemäß obiger
Definition inkubiert und den sialylierten Akzeptor isoliert.
Derartige Verfahren sind durch wenigsten
eine weitere der folgenden Eigenschaften charakterisiert:
- a) der Donor ist ausgewählt unter an Oligosaccharide,
Polysaccharide, Polysialinsäuren,
Glykoproteine und Glykolipide gebundene Sialinsäuren, wie insbesondere Lactoferrine,
glykolisierte Molkenproteine und Caseine und Fragmente davon;
- b) der Akzeptor ist ausgewählt
unter β-Galaktose
enthaltenden Polymeren, wie β-Galaktooligosacchariden, Laktitol,
Laktobionsäure,
Methyl-ß-lactosid,
Acetyllaktosaminen, Galaktopyranosiden, Trans-Galaktooligosacchariden,
Polygalaktose und anderen Glykokonjugaten mit endständig gebundener β(1-3) oder β(1-4)-Galaktose;
oder Galaktose.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden
Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Trans-Sialidase,
einer dafür
kodierenden Nukleinsäuresequenz
oder eines erfindungsgemäß hergestellten
Sialisierungsprodukts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsmittels
oder Nahrungsergänzungsmittels oder
einer Nahrungsmittelzusatzes zur Prävention oder Behandlung Sialinsäure-gesteuerter
parasitärer,
bakterieller oder viraler Infektionen; zur Behandlung von Tumorerkrankungen;
zur Behandlung von Erkrankungen, welche mit einer Entwicklungsstörung des
Gewebes assoziiert sind; zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems;
zur Behandlung von Autoimmunreaktionen; zur Behandlung von Erkrankungen
mit gestörter Zellkommunikation;
und/oder zur Behandlung von Entzündungen.
Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung
die Verwendung einer erfindungsgemäßen Trans-Sialidase gemäß obiger
Definiton, zur Entwicklung eines Trypanosomiasis-Impfstoffs oder zur Entwicklung von
Enzyminhibitoren zur Behandlung oder Prävention von Trypanosoma-Infektionen.
Die Erfindung betrifft weiterhin
die Verwendung einer Trans-Sialidase, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz
oder eines erfindungsgemäß hergestellten
sialylierten Produkts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsergänzungsmittels
oder Nahrungsmittels zum Schutz körpereigener Zellen oder Gewebe oder
Glykoproteine vor enzymatischer Einwirkung.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin
die Verwendung einer Trans-Sialidase, einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz
oder eines erfindungsgemäß hergestellten sialylierten
Produkts zur Herstellung eines Medikaments, Nahrungsergänzungsmittels
oder Nahrungsmittels zu Beeinflussung der Entwicklung und/oder Morphogenese
von Körpergeweben.
Weiterhin betrifft die Erfindung
Effektoren der Trans-Sialidase-Aktivität einer Trans-Sialidase, ausgewählt unter
- a) Polypeptid-Liganden, welche mit einer Trans-Sialidase
gemäß obiger
Definition Wechselwirken;
- b) niedermolekularen Effektoren, welche die biologische Aktivität einer
Trans-Sialidase gemäß obiger
Definition modulieren; und
- c) Antisense-Nukleinsäuresequenzen
zu einer Nukleinsäuresequenz
gemäß obiger
Definition.
Weiterhin betrifft die Erfindung
die Verwendung eines solchen Effektors zur Herstellung eines Medikaments,
Nahrungsergänzungsmittels
oder Nahrungsmittels zur Behandlung oder Prävention von mit Trans-Sialidase-Aktivität assoziierten
Erkrankungen.
Gegenstand der Erfindung ist weiterhin
ein Verfahren zur Isolierung eines Enzyms mit Trans-Sialidase-Ayktivität, wobei
man
- a) Trypanosoma congolense in einem Medium
kultiviert, und
- b) das gewünschte
Produkt aus dem Kulturüberstand
durch Ionenaustauschchromatographie mit Hilfe eines Salzgradienten,
gegebenenfalls gefolgt von Isoelektrischer Fokussierung, Gelfiltration,
Affinitätschromatographie
und/oder Proteinfällung,
isoliert.
Schließlich berifft die Erfindung
pharmazeutisches oder gentherapeutisches Mittel, enthaltend in einem
pharmazeutisch oder gentherapeutisch verträglichen Träger wenigsten einen Effektor
gemäß obiger
Definition
Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
i) Bedeutung der Erfindung
Die Bedeutung der vorliegenden Erfindung
ergibt sich aus der mit dieser Erfindung nun möglichen Beeinflussung der Sialinsäure-gesteuerten
parasitären,
bakteriellen und viralen Infektionsmechanismen, der Beeinflussung
der Zellkommunikation und des Immunsystems und der Veränderung
der Regulations- und Entwicklungsmechnismen menschlicher und tierischer
Gewebe sowie von Tumoren. Dies wird durch die gezielte Übertragung
von Sialinsäuren
auf biologisch relevante Glykostrukturen (Glykane, Glykanderivate
und Glykokonjugate) mittels der hierin beschriebenen Trans-Sialidasen
erreicht.
Aus der Übertragung der Sialinsäuren auf
ausgewählte
Trägerstrukturen
ergeben sich beispielsweise Produkte zur Veränderung von Entzündungsreaktionen,
Veränderung
zellulärer
Interaktionen im menschlichen und tierischen Körper, Schutz körpereigener
Gewebe vor Angriffen des eigenen Immunsystems (Autoimmunreaktionen), „Enttarnung" von Krebszellen
im Körper
eines Patienten, damit sie vom körpereigenen
Immunsystem wieder bekämpft
werden (Krebstherapie und Krebsprävention), Bekämpfung des
Eindringens pathogener Bakterien in den menschlichen und tierischen
Körper,
Prävention
und Bekämpfung
von viralen Infektionen, Bekämpfung
von Infektionen der Magenschleimhaut durch Helicobacter pylori,
Bekämpfung
der durch Bakterien und Viren hervorgerufenen Neugeborenen-Meningitis,
Präventive
und therapeutische Beeinflussung von Rezeptoren von eukaryontischen
und prokaryontischen pathogenen Organismen, Bakterien, Viren und
Toxinen zur Vermeidung derer Wirkungsenffaltung im menschlichen
und tierischen Körper,
Inhibition der Bindung des Cholera-Toxins an menschliche und tierische
Schleimhäute
des Verdauungstraktes, Entwicklung eines Impfstoffes gegen Trypanosomiasis,
Entwicklung von Enzyminhibitoren zur Bekämpfung (Therapie) von Trypanosoma
Infektionen, Beeinflussung molekularer und zellulärer Erkennungsprozesse
im menschlichen und tierischen Körper,
Schutz von Glykoproteinen und Zellen vor dem Angriff durch Proteasen
und andere Enzyme, unter anderem auch zum Schutz des Abbaus der
Moleküle
durch Enzyme des menschlichen und tierischen Verdauungstraktes,
Beeinflussung der Entwicklung von Körpergeweben und Beeinflussung
der Morphogenese von Körpergeweben.
Die erfindungsgemäßen Trans-Sialidasen sind durch
folgende DNS- und Aminosäure-Teilsequenzen sowie
durch andere DNS-Sequenze-Homologe, z.B. mit einer mehr als 60 prozentigen Übereinstimmung (Identität) zu diesen
Teilsequenzen, charakterisiert.
ii) Sequenzangaben zu
bevorzugten Trans-Sialidasen
(1) Informationen für die Sequenz
des Enzyms TS1:
Merkmale der DNS der Teilsequenz
von TS1:
- Länge:
1491 Basenpaare
- Typ: Nukleinsäure
- Strangform: doppelt
- Ursprung: Trypanosoma congolense
DNS
Teilsequenz des Enzyms TS1 (SEQ ID NO: 1):
Aminosäureteilsequenz
des Enzyms TS1 (SEQ ID NO: 2):
(2) Informationen für die Sequenz
des Enzyms TS2:
Merkmale der DNS der Teilsequenz
von TS2: Länge:
831 Basenpaare
- Typ: Nukleinsäure
- Strangform: doppelt
- Ursprung: Trypanosoma congolense
DNS
Teilsequenz des Enzyms TS2 (SEQ ID NO: 3):
Aminosäureteilsequenz
des Enzyms TS2 (SEQ ID NO: 4):
Die Teilsequenzen der Aminosäuren von
Enzym TS1 und Enzym TS2 haben eine Übereinstimmung (Identiät) von nur
ca. 50%. Die Teilsequenzen charakterisieren daher eindeutig zwei
verschiedene Stoffe (siehe Bild 1).
iii) Beschreibung der
Eigenschaften der neu gefundenen Enzyme TS1 und TS2
a) Physikalisch/chemische
Eigenschaften der Stoffe
Tabelle
1: Basisdaten der beiden Trans-Sialidasen TS1 und TS2
b) Biologische Eigenschaften
der Stoffe
Die beiden hier beanspruchten Stoffe
sind zwei Enzyme, die Sialinsäuren
von einem Donormolekül
auf ein Akzeptormolekül übertragen.
Als Donoren fungieren bei beiden
Enzymen an Glykane, z.B. an Oligosaccharide, Polysaccharide, Polysialinsäuren, Glykoproteine
und Glykolipide, gebundene Sialinsäuren. Unter den Glykoproteinen
sind insbesondere Lactoferrine (aus Mensch, Kuh, Ziege, Schaf, Pferd,
Kamel und anderen Tieren), glykolisierte Molkenproteine (aus Mensch,
Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren) und Caseine
(aus Mensch, Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren)
sowie andere glykolisierte Proteine humanen, tierischen und pflanzlichen
Ursprungs sowie Teilen davon, wie z.B. Teilstücke aus Caseinen (aus Mensch,
Kuh, Ziege, Schaf, Pferd, Kamel und anderen Tieren) wie beispielsweise
das Glykomakropeptid aus den Caseinen dieser Tiere gute Donoren
für Sialinsäuren, die
von den Enzymen übertragen
werden können.
Ganglioside können
ebenfalls als Donoren eingesetzt werden.
Beide Trans-Sialidasen haben eine
gute Akzeptorspezifität
für Galaktooligosaccharide,
insbesondere für
beta-Galakto-Oligosaccharide, wie z.B. Vivinal GOS von der Firma
Borculo Domo Ingredients (BDI) und Oligomate 55 von der Firma Yakult.
Außerdem
können
Laktitol, Laktobionsäure,
Methyl-β-lactosid,
Acetyllaktosamine, Galaktopyranoside, Trans-Galaktooligosaccharide,
Polygalaktosen und andere Glykokonjugate mit endständig gebundener β(1-3) oder β(1-4)-Galaktose
als Akzeptoren fungieren. Eine Methylierung des Galaktoserestes
führt zu
einer Verminderung der Akzeptorfunktion. Die Methylierung eines
Glukoserestes (z.B. bei der Laktose) hat einen geringen Einfluss
auf die Akzeptorfunktion. Das Monosaccharid Galaktose dient ebenfalls
als Akzeptor, wenn auch mit geringerer Spezifität.
Das Enzym TS1 zeigt eine etwa doppelt
so effiziente Übertragung
der Sialinsäuren
auf die entsprechenden Akzeptoren wie das Enzym TS2. Die Substrate
können
frei, d.h. löslich,
oder auch Zellmembran-gebunden sein.
Die Übertragung von alpha-2,3-gebundenen
endständigen
Sialinsäuren
auf beta-1,4-gebundene
endständige
Galaktosereste ist auch von den Trans-Sialidasen von Typanosoma
cruzi (Schenkman et al.,1991; Vandekerckhove et al., 1992; Scudder
et al., 1993) und Trypanosoma brucei (Engstler et al., 1992, 1993,
1995) bekannt. Aufgrund unterschiedlicher DNS- und Aminosäuresequenzen
unterscheiden sich TS1 und TS2 jedoch von den bereits bekannten
Enzymen. TS1 und TS2 sind damit eindeutig als neue Stoffe (Trans-Sialidasen)
charakterisiert. Zur weiteren Abgrenzung siehe den nächsten Absatz.
iv) Abgrenzung der Erfindung
zu anderen Trans-Sialidasen, Sialidasen und Sialyltransferasen
Das erste Mal beschrieben wurde ein
Enzym „Trans-Sialidase" in der amerikanischen
Trypanosomenart Trypanosoma cruz (Schenkmann et al., 1991). Wenig
später
konnte das Enzym ebenfalls in den afrikanischen Arten Trypanosoma
brucei gambiense, Trypanosoma brucei rhodesiense und Trypanosoma
brucei brucei nachgewiesen werden (Engstler et al,. 1993, Pontes
de Carvalho et al., 1993, Engstler et al., 1995). Weiterhin wurde
Trans-Sialidase in Endotrypanum Arten (Parasiten, die das Faultier
befallen) (Medina-Acosta et al., 1994), in Corynebacterium diphtheriae
(Mattos-Guaraldi et al., 1998) und im menschlichen Plasma (Tertov et
al. 2001) detektiert. Bereits lange vor den Nachweis der Trans-Sialidasen
waren die sogenannten Sialidasen bekannt. Dies sind Glykohydrolasen,
die Sialinsäuren
von einem Donormolekül
ausschließlich
auf Wasser übertragen,
die Sialinsäuren
also von Oligosacchariden und Glykokonjugaten abhydrolysieren.
Weiterhin können bestimmte Enzyme mit Cytidin-Monophosphat
(CMP)-aktivierte Sialinsäuren
auf andere Zuckerreste, meist Galaktose und N-Acetylgalaktosamin, übertragen.
Diese Enzyme nennt man Sialyltransferasen (siehe Bild 2).
Die hier beanspruchten Trans-Sialidasen übertragen
Sialinsäuren
nicht ausschließlich
von einem Donormolekül
auf Wasser, wie dies die reinen Sialidasen tun. Fehlt jedoch ein
geeigneter Akzeptor, hydrolysieren die hier beanspruchten Trans-Sialidasen
die Sialinsäuren
ebenso wie die einfachen Sialidasen. Die hier beanspruchten Trans-Sialidasen benötigen auch
keine aktivierten Sialinsäuren
für ihre Übertragungsreaktion
wie die zuvor erwähnten
Sialyltransferasen. Die Trans-Sialidasen haben auch eine breitere
Donor- und Akzeptorspezifität
als die Sialyltransferasen und sind deshalb besonders vielseitig
einsetzbar. Die hier beanspruchten Trans-Sialidasen sind damit für die industrielle
Verwertung vorteilhafter als die reinen Sialidasen und Sialyltransferasen.
Bisher sind nur die DNS- und Aminosäuresequenzen
der Trans-Sialidasen von Trypanosoma cruzi und Trypanosoma brucei
brucei bekannt, sowie die DNS- und Aminosäuresequenz einer reinen Sialidase
aus Trypanosoma rangeli. Das hier beanspruchte Enzym TS1 hat zu
der entsprechenden Aminosäureteilsequenz der
Trans-Sialidase aus Trypanosoma brucei brucei eine Übereinstimmung
(Identität)
von unter 60% und zu der entsprechenden Teilsequenz von Trypanosoma
cruzi eine Übereinstimmung
von unter 50%. Das hier beanspruchte Enzym TS2 hat zu der entsprechenden
Aminosäureteilsequenz
der Trans-Sialidase aus Trypanosoma brucei brucei eine Übereinstimmung
(Identität)
von unter 50% und zu der entsprechenden Teilsequenz von Trypanosoma
cruzi eine Übereinstimmung
von ebenfalls unter 50% (siehe Bild 3). Des Weiteren ist bekannt,
dass die Übereinstimmung
der Aminosäuren
zwischen den Trans-Sialidasen von Trypanosomen und den bekannten
Sialidasen und Trans-Sialidasen von Bakterien und Viren nur 20%
bis 30% beträgt
(Chuenkova et al., 1999, Montagna et al., 2002).
Bei den hier beschriebenen Enzymen
handelt es sich somit um neu charakterisierte Stoffe (Enzyme), deren Übereinstimmung
(Identität)
zu den entsprechenden DNS- und Aminosäuresequenzen anderer bekannter
Enzyme ähnlicher
Funktion unter 60% beträgt.
v) Weitere Erläuterungen
zur vorliegenden Erfindung
a) Polypeptide und funktionale Äquivalente
„Polypeptide" im Sinne der Erfindung
umfassen charakteristische Teilfragmente der erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen,
ebenso wie Aminosäuresequenzen
der erfindungsgemäßen Enzyme
und der funktionalen Äquivalente
davon.
Erfindungsgemäß mit umfasst sind somit ebenfalls „funktionale Äquivalente" oder „Homologe" der konkret offenbarten
neuen Polypeptide bzw. Enzyme.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der
konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden
Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische
Aktivität gemäß obiger
Definition (wie z.B. Substratspezifität) besitzen.
Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere
Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen
eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem
eine der hierin genannten biologische Aktivität besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die
durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen,
-Substituenten, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen
Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition
auftreten können,
solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil
führen.
Funktionale Äquivalenz
ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster
zwischen Mutante und unverändertem
Polypeptid qualitativ übereinstimmen,
d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit
umgesetzt werden.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne
sind auch Präkursoren
der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze
der Polypeptide. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen
als auch Säureadditionssalze
von Aminogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze
von Carboxylgrup pen können
in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische
Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und
Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen,
wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze,
wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder
Schwefelsäure
und Salze mit organischen Säuren,
wie Essigsäure
und Oxalsäure
sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide
können
an funktionellen Aminosäure-Seitengruppen
oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken
ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise
aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen,
Amide von Carbonsäuregruppen,
erhältlich
durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate
freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen;
oder O-Acylderivate freier Hydroxygruppen, hergestellt durch Umsetzung
mit Acylgruppen.
"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch
Polypeptide welche aus anderen Organismen zugänglich sind sowie natürlich vorkommende
Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche
homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten
Vorgaben der Erfindung äquivalente
Enzyme ermitteln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls
Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen oder Sequenzmotive, der
erfindungsgemäßen Polypeptide,
welche z.B. die gewünschte
biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine,
welche ein der oben genannten Polypeptidsequenzen oder davon abgeleitete
funktionale Äquivalente
und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe
Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h.
ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung
der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitiernde Beispiele für derartige
heterologe Sequenzen sind z.B. Signalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline,
Oberflächenantigene, Rezeptoren
oder Rezeptorliganden.
„Funktionale Äquivalente" erfindungsgemäßer Trans-Sialidasen
sind insbesondere Enzyme, deren Aminosäuresequenzen oder -teilsequenzen
zur korrespondierenden Aminosäuresequenz
oder -teilsequenz gemäß SEQ ID
NO: 2 oder 4 eine Sequenzidentität
(Sequenzhomologie) von wenigsten 60% insbesondere wenigstens 65%
oder wenigstens 70%, wie z.B. 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% oder
99%, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc.
Natl. Acad, Sci. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448, aufweisen.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung
umfassen erfindungsgemäße Äquivalente
Proteine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter
Form sowie durch Veränderung
des Glykosylierungsmusters erhältliche
abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine
oder Polypeptide können
durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation, Verlängerung
oder Verkürzung
des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet
wird, betrifft auch eine variante Form des Proteins, die als Agonist
oder Antagonist der Protein-Aktivität wirkt.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine
können
durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten,
identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank
von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene
erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches
synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die
zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten
Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese
einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten
durchgeführt
werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor
ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die
Bereitstellung sämtlicher Sequenzen
in einem Gemisch, die den gewünschten
Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese
degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang,
S.A. (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev.
Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et
al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
b) Polynukleotide
„Polynukleotide" im Sinne der vorliegender
Erfindung umfassen charakteristische Teilfragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen
die für
Aminosäureteilsequenzen
erfindungsgemäßer Enzyme kodieren,
ebenso wie Nukleisäuresequenzen
die für
Enzyme und deren funktionale Äquivalente
kodieren. Polynukleotide umfassen vorzugsweise mehr als etwa 20
insbesondere mehr als etwa 30, wie z.B. mehr als etwa 45 oder mehr
als etwa 60 Nukleinsäurereste.
„Oligonukleotide" umfassen insbesondere
eine Sequenz von weniger als etwa 60, vorzugsweise weniger als etwa
45, insbesondere weniger als etwa 30 oder weniger als etwa 20 Nukleinsäuresten.
Alle hierin erwähnten „Nukleinsäuresequenzen" sind in an sich
bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen,
wie beispielsweise durch Fragmentkondensation einzelner überlappender,
komplementärer
Nukleinsäurebausteine
der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden
kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode
(Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seiten 896–897) erfolgen.
Die Anlagerung synthetischer Oligonukleotide und Auffüllen von
Lücken
mit Hilfe des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase und Ligationsreaktionen sowie
allgemeine Klonierungsverfahren werden in Sambrook et al. (1989),
Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, beschrieben.
Gegenstand der Erfindung sind auch
Nukleinsäuresequenzen
(einzel- und doppelsträngige
DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines
der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. auch
unter Verwendung künstlicher
Nukleotidanaloga zugänglich
sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte
Nukleinsäuremoleküle, welche
für erfindungsgemäße Polypeptide
bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren,
sowie Nukleinsäurefragmente,
die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur
Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßer kodierenden
Nukleinsäuren
verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem
untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder
5'-Ende des kodierenden
Genbereichs enthalten
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt,
die in der natürlichen
Quelle der Nukleinsäure
zugegen sind und kann überdies
im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium
sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder
frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn
es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels
molekularbiologischer Standardtechniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten
Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer
geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten
vollständigen
Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und
Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook,
J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies
läßt sich
ein Nukleinsäuremolekül, umfassend
eine der offenbarten Sequenzen oder ein Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion
isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser
Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte
Nukleinsäure
kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse
charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide, können ferner
durch Standard-Syntheseverfahren,
z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin die
zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen „komplementären" Nukleinsäuremoleküle oder
einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen
die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder
Klonierung von homologen Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar
sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich,
der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise
mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende
Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder
eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen
sind abgeleitet von SEQ ID NO: 1 und 3 und unterscheiden sich davon
durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner
oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide
mit dem gewünschten
Eigenschaftsprofil.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche
Nukleinsäuresequenzen,
die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der
Codon-Nutzung eins speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich
zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende
Varianten, wie z.B. Spleißvarianten
oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative
Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird
durch eine Aminosäure
gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder
Löslichkeit
ersetzt) erhältliche
Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch
die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten
Moleküle.
Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb
einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren.
Diese natürlichen
Variationen bewirken üblicherweise
eine Varianz von 1 bis 5% in der Nukleotidsequenz eines Gens.
Weiterhin umfasst die Erfindung auch
Nukleinsäuresequenzen,
welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder
dazu komplementär
sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen
oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten
Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten
Sonden isolieren. Eine weitere Mög lichkeit
bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder
Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide
und deren anschließende Isolierung.
Darüber
hinaus können
erfindungsgemäße Polynukleotide
auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht
man die Fähigkeit
eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an
eine nahezu komplementäre
Sequenz zu binden, während
unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern
unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70–100%, vorzugsweise zu 90–100%, komplementär sein.
Die Eigenschaft komplementärer
Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in
der Northern- oder Southern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung
in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise
werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt.
Unter "stringenten" Bedingungen versteht man, wenn beispielsweise
nach dem Southern bzw. Northern Blot die DNA bzw. RNA Fragmente
auf den Membranen mit einer Sonde unter spezifischen Bedingungen, das
heißt,
bei einer Temperatur von 60–70°C, (38–42°C bei 50%
Hybridisierungslösungen
die 50% Formamid enthalten) hybridisiert. Weiterhin sind die Bedingungen
dann spezifisch bzw. stringent, wenn die im Anschluss an die Hybridisierung
durchgeführten
Waschschritte zur Elution unspezifisch hybridisierter DNA bzw. RNA-Sonden
ebenfalls spezifisch durchgeführt
werden. Bei spezifischen Waschschritten handelt es sich üblichenrweise
um das zweimalige Waschen bei 20–25 °C für 5–10min. mit 2 × SSC-Puffer,
der 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat) enthält und anschließendem zweimaligen
Waschen mit Puffer niedrigerer Ionenstärke (z.B. 0,1 × SSC mit
0,1% SDS) bei höherer
Temperatur (z.B. 64°C).
[20 × SSC:
3M NaCl, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0]. Dabei bleiben nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander
gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann
bekannt und ist z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons,
N.Y. (1989), 6.3.1–6.3.6.
beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung
betrifft "Antisense-"Nukleinsäuren. Diese
umfassen eine Nukleotidsequenz, die zu einer kodierenden "Sense-"Nukleinsäure, komplementär ist. Die
Antisense-Nukleinsäure
kann zum gesamten kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt
davon komplementär
sein. Bei einer weiteren Ausführungsform
ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense
zu einem nicht-kodierenden Bereich des kodierenden Stranges einer
Nukleotidsequenz. Der Begriff "nicht-kodierender
Bereich" betrifft
die als 5'- und 3'-untranslatierte
Bereiche bezeichneten Sequenzabschnitte.
Ein Antisense-Oligonukleotid kann
z.B. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein.
Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann
durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mittels
im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure kann
chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide
oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so
gestaltet sind, daß sie
die biologische Stabilität
der Moleküle
erhöhen, oder
die physikalische Stabilität
des Duplexes erhöhen,
der zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure entstanden ist. Beispielsweise
können
Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden.
Beispiele modifizierter Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet
werden können,
sind z.B. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-loduracil,
Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, und dergleichen.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise
an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so daß sie mit
der zellulären
mRNA und/oder einer kodierenden DNA hybridisieren oder daran binden,
so daß die
Expression des Proteins, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation,
gehemmt wird.
Die Begriffe "exprimieren" bzw. 'Verstärkung" oder „Überexpression" beschreiben im Kontext
der Erfindung die Produktion bzw. Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines
oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende
DNA kodiert werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einen
Organismus einbringen, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen
ersetzen, die Kopienzahl des Gens bzw. der Gene erhöhen, einen
starken Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes
Enzym mit einer hohen Aktivität
kodiert und man kann gegebenenfalls diese Maßnahmen kombinieren.
Die Begriffe „abschwächen" und „verringern" beschreiben im Kontext
der Erfindung die Abschwächung
oder Verringerung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA kodiert
werden. Dazu kann man beispielsweise ein Gen in einem Organismus
deletieren, ein vorhandenes Gen durch ein anderes Gen ersetzen,
die Kopienzahl eines Transkriptes des Gens bzw. der Gene erniedrigen,
einen schwachen Promotor verwenden oder ein Gen verwenden, das für ein entsprechendes
Enzym mit einer niedrigeren Aktivität kodiert und man kann gegebenenfalls
diese Maßnahmen
kombinieren.
c) Expressionskonstrukte
und Vektoren:
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte,
enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen
eine für
ein erfindungsgemäßes Polypeptid
kodierende Nukleinsäuresequenz;
sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-stromaufwärts von
der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine
Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente,
und zwar jeweils operativ verknüpft
mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die
sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator
und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes
der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden
Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
Beispiele für
operativ verknüpfbare
Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylierungssignale
und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare
Marken, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete
regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,
San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu den artifiziellen
Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor
dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische
Veränderung
kann diese natürliche
Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene
erhöht
oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher
aufgebaut sein, das heißt
es werden keine zusätzlichen
Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor
mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die
natürliche
Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt
und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen
können
in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind:
cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, lpp-, lac-, lpp-lac-, laclq-,
T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, lambda-PR- oder im lambda-PL-Promotor, die vorteilhafterweise
in gram-negativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven
Promotoren amy und SPO2, die Hefepromotoren ADC1, MFalpha , AC,
P-60, CYC1, GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS,
lib4, usp, STLS1, B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren,
wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduztierbarer Promotoren,
wie der PrPl-Promotor.
Prinzipiell können
alle natürlichen
Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus
können
auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorischen Sequenzen
sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen und der Proteinexpression
ermöglichen.
Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das
Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass
es sofort exprimiert und/oder überexprimiert
wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw.
Faktoren können
dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch
erhöhen
oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise
auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale
wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden.
Daneben ist aber auch eine Verstärkung
der Translation möglich,
indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Die Herstellung einer Expressionskassette
erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten
kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal.
Dazu verwendet man gängige
Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise
in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments
with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular
Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987)
beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt
bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus
vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert,
der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht.
"Vektoren" sind dem Fachmann
wohl bekannt und können
beispielsweise aus "Cloning
Vectors" (Pouwels
P.H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen
werden. Unter Vektoren sind außer
Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie
beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus,
Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu
verstehen. Diese Vektoren können
autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert
werden.
Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren
können
genannt werden: Übliche
Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith,
D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs,
Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase
(GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante
Zielprotein fusioniert wird.
Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren
wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) und pET 11 d (Studier et al. Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press,
San Diego, Kalifornien (1990)60–89).
Hefe-Expressionsvektor zur Expression
in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSec1 (Baldari et al., (1987) Embo
J. 6: 229–234),
pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al.
(1987) Gene 54: 113–123)
sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und
Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung
in anderen Pilzen, wie filamentösen
Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind
in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt,
P.J. (1991) "Gene
transfer systems and vector development for filamentous fungi, in:
Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg.,
S. 1–28,
Cambridge University Press: Cambridge.
Baculovirus-Vektoren, die zur Expression
von Proteinen in gezüchteten
Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe
(Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3: 2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow
und Summers (1989) Virology 170: 31–39).
Pflanzen-Expressionsvektoren, wie
solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E.,
Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable
markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und
Bevan, M.W. (1984) "Binary
Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711–8721.
Säugetier-Expressionsvektoren,
wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman
et al. (1987) EMBO J. 6: 187–195).
Weitere geeignete Expressionssysteme
für prokaryontische
und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook,
J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory
Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
d) Rekombinante Mikroorganismen:
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren
sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise
mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor trans formiert sind
und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt
werden können.
Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten
Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert.
Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs-
und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation,
Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und
dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im
jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete
Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular
Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York
1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierte
Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der
zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden
Sequenz enthält,
worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, -Addition oder
-Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz
zu verändern,
z.B. funktionell zu disrumpieren ("Knockout"-Vektor).
Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem
verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle
abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor
kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer
Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das
funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene
regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch
die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt
des erfindungsgemäßen Gens
ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter
Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas,
K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503.
Als Wirtsorganismen sind prinzipiell
alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer
Allelvarianten, ihrer funktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen.
Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen,
pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen
sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z.B. Escherichia
coli, Streptomy ces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen,
wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus
Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen.
Die Selektion erfolgreich transformierter
Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor
oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche
Markergene sind Gene für
Antibiotikaresistenz und für
Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der
transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer
Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte
Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen
(z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende
Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine,
die an der Zelloberfläche
präsentiert
werden, können
zur Selektion mittels Affinitätschromatographie
genutzt werden.
Die Kombination aus den Wirtsorganismen
und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren
oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA-Polymerase/Promoter-System,
die Phagen 8 oder 7 oder andere temperente Phagen oder Transposons
und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet
ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expressionssystem" die Kombination
aus Säugetierzellen,
wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind,
zu verstehen.
Gewünschtenfalls kann das Genprodukt
auch in transgenen Organismen, wie transgenen Tieren, insbesondere
Mäusen,
Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression, gebracht werden.
e) Rekombinante Herstellung
der Polypeptide:
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin
Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Polypeptide
oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man
einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls
die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur
isoliert.
Die Polypeptide können so auch in großtechnischem
Maßstab
produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus
kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien
können
beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von
20 bis 40°C
und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden
geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis,
E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die
Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen
und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem
Lysat gewonnen. Die Zellen können
wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie
z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung
von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch
Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren
aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide
kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden,
wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie,
Ionenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie
mit anderen üblichen
Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse
und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise
in Cooper, F.G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de
Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification,
Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben. Analoges
gilt für
nicht-rekominant hergestellte Polypeptide.
Besonders vorteilhaft ist es, zur
Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide
zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und
damit für
veränderte Polypeptide
oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung
dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als
Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als
Hexa-Histidin- Anker
bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt
werden können
(beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies:
A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker
können
zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix,
dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein
kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet
werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung
der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker,
wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmarker, die nach Reaktion mit einem
Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive
Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung
der Proteine verwendet werden.
f) Reinigung des gewünschten
Sialisierungsproduktes aus der Kultur
Die Gewinnung des gewünschten
Produktes aus dem Mikrooganismus oder aus dem Kulturüberstand kann
durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird
das gewünschte
Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur
durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch
Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung,
lysiert werden. Die Zelltrümmer
werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die
löslichen
Proteine enthält,
wird zurweiteren Reinigung dergewünschten Verbindung erhalten.
Wird das Produkt von den Zellen sezerniert, werden die Zellen durch
langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion
wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden
Reinigungsverfahren kann einer Chromatographie mit einem geeigneten
Harz unterworfen werden, wobei das gewünschte Molekül mit höherer Selektivität als die
Verunreinigungen entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten
wird oder dieses passiert. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls
wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet
werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze
und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes
Molekül bewandert.
Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration
konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der
die Stabilität
des Produktes maximal ist.
Im Stand der Technik sind viele Reinigungsverfahren
bekannt. Diese Reinigungstechniken sind z.B. beschrieben in Bailey,
J.E. & Ollis,
D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986).
Die Identität und Reinheit der isolierten
Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt
werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie,
NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren
sind z.B. zusammengefaßt
in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140; Malakhova
et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27–32; und Schmidt et al. (1998)
Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ullmann's Encyclopedia of
Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S.
521–540,
S. 540–547,
S. 559–566,
575–581
und S. 581–587;
Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry
and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987)
Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in
Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Folgende nichtlimitierende Beispiele
beschreiben spezielle Ausführungsformen
der Erfindung.