JP2006509515A - コンゴトリパノソーマから得られるトランス−シアリダーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、シアル酸をドナー分子(例えばオリゴ糖、ポリシアル酸、グリコシル化タンパク質、グリコシル化ペプチド、グリコシル化脂質(例えばガングリオシド)および他のグリコシル化された低分子のまたは高分子の分子)からアクセプター分子(例えばオリゴ糖および多糖、グリコシル化タンパク質、グリコシル化ペプチド、グリコシル化脂質および他のグリコシル化された低分子のまたは高分子の分子)に転移させる新しい酵素(トランス−シアリダーゼ)に関する。前記酵素は、原生動物のコンゴ トリパノソーマ(Trypanosoma congolense)から単離された。
トランス−シアリダーゼはシアル酸、好ましくはアルファ−2,3−結合シアル酸を、ドナー分子からアクセプター分子に転移させることができ、それによって再びアルファ−2,3−グルコシド結合が、好ましくはβ−末端ガラクトース残基に、形成されうる。
図1は、本発明のトランス−シアリダーゼTS1およびTS2の、アミノ酸部分配列の比較を表す。双方の配列で一致するアミノ酸は太字で示されている。2つの部分配列の一致度はわずか約50%である。
本発明の目的は、シアル酸によって制御される生物学的または病理学的プロセスに影響を与えることができる新しい手段を提供することであった。
TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGR(配列番号2の1〜25番目)
FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI(配列番号4の1〜30番目)。
ヌクレオチド部分配列 配列番号1
アミノ酸部分配列 配列番号2
最適温度 30〜40℃
最適pH pH6.5〜8.5
等電点 pH4〜5
分子量、ネイティブ 400〜600kDa
分子量、還元条件下SDS−PAGEによる 90kDa。
ヌクレオチド配列 配列番号3
アミノ酸部分配列 配列番号4
最適温度 30〜40℃
最適pH pH6.5〜8.5
等電点 pH5〜6
分子量、ネイティブ 120〜180kDa
分子量、還元条件下SDS−PAGEによる 90kDa。
a)前記ドナーが、特にラクトフェリン、グリコリセートホエープロテインおよびカゼインなどの、オリゴ糖、多糖、ポリシアル酸、糖タンパク質、および糖脂質、ならびにそれらのフラグメントに結合したシアル酸から選択される;
b)前記アクセプターが、β−ガラクトオリゴ糖、ラクチトール、ラクトビオン酸、メチル−β−ラクトシド、アセチルラクトサミン、ガラクトピラノシド、トランス−ガラクトオリゴ糖、ポリガラクトース、および末端にβ(1−3)もしくはβ(1−4)結合したガラクトースまたはガラクトースとの他の複合糖質などの、β−ガラクトースを含むポリマーから選択される。
a)上述のトランス−シアリダーゼと相互作用するポリペプチドリガンド;
b)上述の定義のトランス−シアリダーゼの生物活性を調節する低分子エフェクター;
c)上述の定義の核酸配列のアンチセンス核酸配列;
から選択されるトランス−シアリダーゼの、トランス−シアリダーゼ活性のエフェクターに関する。
a)コンゴ トリパノソーマが培養液中で培養される、および
b)所望の生成物が塩勾配によってイオン交換クロマトグラフィーを用いて、必要に応じてその後等電点電気泳動法、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、および/またはタンパク質沈殿を用いて培養上清から単離される、
トランス−シアリダーゼ活性をもつ酵素の単離方法を含む。
i)発明の重要性
本発明の重要性は、本発明によって可能になった、シアル酸によって制御される寄生虫、細菌、およびウイルスによる感染のメカニズムの影響、細胞伝達および免疫系の影響、ならびにヒトおよび動物の組織、および腫瘍の調節および発達のメカニズムの変化にある。これは、本明細書に記載されるトランス−シアリダーゼによる、シアル酸の、生物学的に適切な糖鎖構造(グリカン、グリカン誘導体、および複合糖質)への標的転移によって達成される。選択された担体構造へのシアル酸の転移によって、例えば、炎症反応を変化させる、ヒトおよび動物の体内の細胞間相互作用を変化させる、体組織を自己の免疫系の攻撃(自己免疫反応)から保護する、自己の免疫系に戦わせるように患者の体内の癌細胞を「暴露」する(癌治療および癌予防)、病原菌のヒトおよび動物の体内への侵入と戦う、ウイルス感染を予防するおよびウイルス感染と戦う、ヘリコバクターピロリによる胃粘膜の感染と戦う、細菌およびウイルスによって引き起こされる新生児の髄膜炎と戦う、真核細胞のおよび原核細胞の病原菌、細菌、ウイルスならびに毒素のレセプターに、ヒトおよび動物の体内で活性になるのを防ぐために予防および治療のための影響を与える、ヒトおよび動物の消化管の粘膜にコレラ毒素が結合するのを阻害する、トリパノソーマ症のワクチンを開発する、トリパノソーマ感染と戦う(治療する)酵素阻害剤を開発する、ヒトおよび動物の体内の分子および細胞の識別プロセスに影響を与える、糖タンパク質および細胞をプロテアーゼおよび他の酵素の攻撃から保護する、とりわけヒトおよび動物の消化管の酵素による分子の分解から保護する、体組織の発達に影響を与える、および体組織の形態形成に影響を与えるための、生成物が得られる。
(1)酵素TS1の配列の情報:
TS1のDNS部分配列の性質:
長さ:1491塩基対
型:核酸
鎖の形態:二本鎖
由来:コンゴ トリパノソーマ。
5’ACCGACACCGTTGCTAAATACAGCACTGACGGTGGGAGAACGTGGAAGAGGGAGGTTATAATTCCGAATGGTCGTGTGGATGCCCACTACTCCCGCGTCGTTGATCCCACTGTTGTTGCGAAGGGTAATAACATTTATGTTCTCGTTGGGCGGTACAATGTCACGCGGGGCTACTGGCACAATAGGAACAACAAGGCTGGCATAGCCGATTGGGAGCCCTTCGTGTACAAGGGCACGGTGAACGTGGGCACGAAGGGCAATGCCACTGATGTGTCGATCAGCTGGGAGAGGACTGCACTGAAGTCGCTGTACAACTTCCCGGTTTCGGGAAGCCCTGGCACGCAGTTCCTTGGAGGGGCTGGGGGTGGTGTTGTAACATCCAACGGGACGATTGTGCTGCCAGTGCAGGCAAGGAACAAGGCCAACCGTGTTGTGAGCATGATCCTGTACTCGGCTGACGATGGAAAGTCATGGCACTTTGGGAAGGGTGAGGCCGGTGTAGGCACGTCCGAGGCTGCCCTCACTGAGTGGGACGGCAAGCTGCTGATTAGTGCACGATCCGATGGTGGACAGGGCTACCGCATGATATTCGAATCGAGTGACCTTGGTGCGACGTGGAAAGAGATGCTCAACAGCATCTCCCGCGTGATTGGCAACTCTCCGGGTCGCAGTGGTCCTGGCAGCTCGAGTGGCTTCATCACGGTGACAGTGGAGGGTGTGCCTGTGATGCTGATTACCCACCCGAAGAACCTTAAGGGCTCGTATTATCGGGACCGTCTGCAGCTGTGGATGACGGACGGCAATCGTATGTGGCATGTCGGGCAGGTCTCTGAGGGCGACGATAACAGCGCTTACAGCTCCCTGCTGTACACTCCGGACGGGGTCCTGTACTGCTTGCATGAGCAGAACATTGATGAGGTGTACAGCCTCCACCTTGTGCGCCTTGTGGACGAGCTGAAAAGCATTAAATCAACGGCTCTGGTGTGGAAGGCACAGGACGAGCTTCTCCTGGGCAACTGCCTCCCGGGCGATAAATACGATCCCGGGTGTGACGGCATCCCCACCGCTGGGCTTGCCGGGCTGCTGGTAGGACCCCTGACGGAGAAGACGTGGCCCGACGCGTATCGGTGCGTGAACGCTGCAACCAGCGGCGCTGTGAGCACTGCTGAAGGCGTGCGGCTGGACGTGGGTGGCGGTGGCCATGTTGTGTGGCCCGTGAGTGAGCAGGGGCAGGACCAGCGGTATTACTTTACCAACAGCGAGTTCACGCTCGCCGTCACGGTGCGGTTTGACGAGATGCCACGGGGGGAGCTCCCGTTGCTGGGGTTTGTGAACCGCAAAGGGAAGGTGAAGAAGATACTGAAGGTGTCGCTGAGCGGGGTGGAGTGGCTCCTGGCATACGGGAATGAGTACAACAGCACAGCCGCTGAGCCGCTGGACGTGAACGAGAGCCACCAGGTGGTGCTAGCGCTTCACGACGGGATCGTCTCC 3’。
TDTVAKYSTDGGRTWKREVIIPNGRVDAHYSRVVDPTVVAKGNNIYVLVGRYNVTRGYWHNRNNKAGIADWEPFVYKGTVNVGTKGNATDVSISWERTALKSLYNFPVSGSPGTQFLGGAGGGVVTSNGTIVLPVQARNKANRVVSMILYSADDGKSWHFGKGEAGVGTSEAALTEWDGKLLISARSDGGQGYRMIFESSDLGATWKEMLNSISRVIGNSPGRSGPGSSSGFITVTVEGVPVMLITHPKNLKGSYYRDRLQLWMTDGNRMWHVGQVSEGDDNSAYSSLLYTPDGVLYCLHEQNIDEVYSLHLVRLVDELKSIKSTALVWKAQDELLLGNCLPGDKYDPGCDGIPTAGLAGLLVGPLTEKTWPDAYRCVNAATSGAVSTAEGVRLDVGGGGHVVWPVSEQGQDQRYYFTNSEFTLAVTVRFDEMPRGELPLLGFVNRKGKVKKILKVSLSGVEWLLAYGNEYNSTAAEPLDVNESHQVVLALHDGIVS。
TS2のDNS部分配列の性質:
長さ:831塩基対
型:核酸
鎖の形態:二本鎖
由来:コンゴ トリパノソーマ。
5’TTCCGAATTCCCTCACTTGTTGAGATAGACGGCGTGCTTATCGCGACATTCGATACACGTTATCTTCGCGCTTCCGACAGCAGTCTCATAGACACAGCTATGAAATACAGTGCCGATCAGGGGAAGACGTGGAAAACTGAAATCATAATAAAAAATGCTAGACTAACTGATAACTTTTCCCGCGTCGTTGATCCAACGGTTGTTGTTAAGGGTGATAACTTGTTTATTTTTGTTGGGAGGTACAACACCTCATCTGCCCCATGGGTCTGGCAGGAAAACGGTAAAGACTGGGATGTACTGTTGTACAAGGCCAAGGTGAGGAAGGAATCAGCGGGTGGGGTACCATCAGTGAGCTTTACATGGGACGAACCCCTATACCTGAAGCATCTGCTCACCTCTGTCGGTAAAATAGACGGCAGGTCCCTCATACAATACATTGGTGGCGTTGGAAATGGTATTGTAACACCGAAAGGTACTATCGTGTTTCCAGTTCAGGTTTTAAACACCAACAAATCCGTCATGAACATGCTTCTGTATTCAAGTAACGACGGAAAAACCTGGGAGTTCAGCAAAACTTCCACACCCGCGGGCACAACTGAGGCCTCCCTTGTTTGGTGGGATGGACAACTACTTCTCACAAGCAGAACAACTCCGGATGTCGGCAGCCGCAAAGTATATTTAACAAGCGACCTCGGAACTTCATGGAATGAAGCGATCGGAAGTATCTCTCGTGTAATTGGTAACTCGCGGTACCGTAACGATCCTGGGGGGTCAGGTAGCTCAATTGCCATAACTGTGGAGGGAGTACCGGTGATGCTGATTACCCACCCG3’。
FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLIDTAMKYSADQGKTWKTEIIIKNARLTDNFSRVVDPTVVVKGDNLFIFVGRYNTSSAPWVWQENGKDWDVLLYKAKVRKESAGGVPSVSFTWDEPLYLKHLLTSVGKIDGRSLIQYIGGVGNGIVTPKGTIVFPVQVLNTNKSVMNMLLYSSNDGKTWEFSKTSTPAGTTEASLVWWDGQLLLTSRTTPDVGSRKVYLTSDLGTSWNEAIGSISRVIGNSRYRNDPGGSGSSIAITVEGVPVMLITHP
酵素TS1および酵素TS2のアミノ酸の前記部分配列は、わずか約50%の一致度である。したがって前記部分配列は、明らかに別の物質と考えられる(図1を参照)。
a)物質の物理的/化学的性質
本明細書中で扱う2つの物質は、シアル酸をドナー分子からアクセプター分子に転移させる2つの酵素である。
酵素「トランス−シアリダーゼ」は、最初に、アメリカトリパノソーマ型のクルーズ トリパノソーマについて報告された(Schenkmann et al.,1991)。すぐ後に、前記酵素は、アフリカ型のガンビア トリパノソーマ(Trypanosoma brucei gambiense)、ローデシア トリパノソーマ(Trypanosoma brucei rhodesiense)およびブルース トリパノソーマ(Engstler et al.,1993,Pontes de Carvalho et al.,1993,Engstler et al.,1995)でも示された。さらに、トランス−シアリダーゼは、エンドトリパヌム(Endotrypanum)類中(ナマケモノを冒す寄生虫)(Medina−Acosta et al.,1994)、ジフテリア菌(Corynebacterium diphtheriae)中(Mattos−Guaraldi et al.,1998)、およびヒトの血漿中(Tertov et al.,2001)、で検出された。いわゆるシアリダーゼは、トランス−シアリダーゼが明らかにされる前に、すでによく知られていた。これらは、シアル酸をドナー分子から水のみに転移させ、オリゴ糖および複合糖質からのシアル酸を脱水素分解する、グリコヒドロラーゼである。さらに、シチジンモノリン酸(CMP)−活性化シアル酸を有するある種の酵素は、他の糖残基、おもにガラクトースおよびN−アセチルガラクトサミンに、転移させることができる。これらの酵素は、シアリルトランスフェラーゼと呼ばれる(図2を参照)。
a)ポリペプチドおよび機能的等価物
「ポリペプチド」は、本発明においては、本発明の酵素およびその機能的等価物のアミノ酸配列のみならず、本発明のアミノ酸配列の特有の部分フラグメントをも含む。
本発明の意味における「ポリヌクレオチド」は、本発明の酵素のアミノ酸部分配列をコードする、本発明の核酸配列の特有の部分フラグメント、ならびに、酵素およびその機能的等価物をコードする核酸配列も含む。ポリヌクレオチドは、好ましくは約20以上、特に約30以上、例えば約45以上または約60以上の核酸残基を含む。
本発明の主題はまた、調節核酸配列の遺伝子制御の中で、本発明のポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現コンストラクト;および前記発現コンストラクトのうち少なくとも1つを含むベクターを含む。好ましくは、本発明の前記コンストラクトは、それぞれのコード配列の5’上流域のプロモーターおよび3’下流域のターミネーター配列を含み、必要に応じて、さらに従来の調節要素を含み、それぞれコード配列を作動可能なように連結する。
(すなわち構造遺伝子の前にさらなる調節信号が挿入されない)、調節配列をもつ天然のプロモーターは除去されない。そのかわり、天然の調節配列はそれ以上の調節が起こらないように突然変異し、遺伝子の発現は増加または減少する。核酸配列は1以上の複製で、遺伝子コンストラクトの中に含まれる。
pGEX(ファルマシア バイオテク インコーポレイテッド,Pharmacia Biotech Inc;Smith,D.B.and Johnson,K.S.(1998)Gene 67:31−40)、pMAL(ニュー イングランド バイオラブズ、ビバリー、マサチューセッツ、New England Biolabs,Beverly,MA)およびpRIT 5(ファルマシア、ピスカタウェイ、ニュージャージーPharmacia,Piscataway,NJ)などの、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)、マルトースE−結合タンパク質またはタンパク質Aと組み換え標的タンパク質に融合する、一般的な融合発現ベクター。
本発明のベクターの助けによって、例えば、少なくとも1つの本発明のベクターを形質転換した、および本発明のポリペプチドの製造に用いられうる、組み換え微生物を製造することができる。上述の本発明の組み換えコンストラクトは適切な宿主系に有効に導入され、発現する。このとき、例えば共沈、原形質融合、エレクトロポレーション、レトロウイルスのトランスフェクションなどの当業者に知られた一般的に用いられるクローニングおよびトランスフェクションの方法が、それぞれの発現系で特定の核酸を発現させるために好ましく用いられる。適当な系は、例えば、Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel et al.,Hrsg.,Wiley Interscience,New York 1997、または、Sambrook et al.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nd Edition,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989に記載されている。
さらに、本発明の主題は、ポリペプチド生産微生物を培養し、必要に応じてポリペプチドの発現を誘導し、およびこれを培養から単離することによる、本発明のポリペプチド、機能的で、生物学的に活性なそのフラグメントの組み換え生産の方法を含む。さらに、必要に応じて前記ポリペプチドをこの方法で大きな工業的スケールで生産することができる。
所望の生成物は、微生物または培養上清から、当業者によって知られたさまざまな方法で得られる。所望の生産物が細胞から分離されない場合、細胞を低速遠心分離によって培養液から回収し、機械的な力または超音波処理などの標準的な技術で細胞を溶解することができる。細胞の破片は遠心分離によって培養液から除かれ、溶解性タンパク質を含む上清部分が、所望の化合物のさらなる精製に供される。前記生産物が細胞から分離される場合、細胞は低速遠心分離によって除かれ、上清部分はさらなる精製に供される。
概要:
本発明の枠内で行われる、例えば制限分裂、アガロースゲル電気泳動、DNAフラグメントの精製、核酸のニトロセルロースおよびナイロン膜への移動、DNAフラグメントの結合、細胞の形質転換、細菌の培養、ファージの増殖および組み換えDNAの解析などのクローニングのステップは、Sambrookらの前掲箇所に記載されるように行った。
コンゴ トリパノソーマの共変的な形態(スイス トロピカル インスティテュート バーゼル、Swiss Tropical Institute Basel(STIB)でstem No.249として提出される)を、10%の子ウシ胎児の血清およびヘミンを含むSM/SDM 79培養液中で27℃でCO2を除いて培養する。3〜4日後、細胞数は約1x106から約7x106/mlに増加した。培養上清を遠心分離によって分離し、ろ過して、限外ろ過によって濃縮する。この方法で得られる培養上清中に、84%の酵素の活性が観察され、一方で他の16%の酵素の活性は細胞ペレットに結合して検出される。濃縮された培養上清は直接トランス−シアリダーゼ反応のための濃縮酵素として用いられる。所望のシアル化された分子は反応後培養上清から単離される。
高純度の酵素を単離するために、濃縮した培養上清をイオン交換カラム(Qセファロース)に導入する。カラムは洗浄の後、塩勾配によって溶出させる。TS2は、塩濃度が最大0.2Mで、およびTS1は塩勾配が最小0.2Mで溶出する。溶出後、両方の酵素を等電点電気泳動法、ゲルろ過(Sephades G150 SF)、アフィニティークロマトグラフィーまたはタンパク質沈殿によって外見上均質に精製されるまで分離する。
トランス−シアリダーゼの転移活性を決定するために、pH7.0の50mMのBisTrisバッファーに溶解した酵素溶液25μlに、ドナーとして1mMのNeufAc−α(2−3)ラクトース、およびアクセプターとして0.5mMの4−メチルウンベリフェリルガラクトシドを最終体積が50μlになるように加えて、37℃で2時間インキュベートする。1mlの氷水を加えてインキュベーションを停止させる。あらかじめ0.3mlのQセファロースFF(アセテート型)で充填し、あらかじめ水で平衡にしたカラムに反応バッチを導入する。アクセプターを水で洗い流し、デッドボリュームを捨てた後(200μl 1N HCl)、シアル化生成物を1NのHClで溶出させる(700μl)。生成物を95℃で45分間、酸加水分解し氷で冷却した後、プローブを250〜290μlの2NNaOHおよび300μlのpH10の1Mグリシン/NaOHバッファーで中和する。放出されたメチルウンベリフェロンの蛍光を黒色96穴プレート(マイクロフルオール、ダイネックス、米国、Microfluor,Dynex,U.S.A)で、励起波長365nm、発光波長450nmで測定する。酵素活性は測定された蛍光強度に対応し、あらかじめ作成した検量線(Engstler et al.,1992の方法による)から読み取ることができる。
本明細書中に記載されるTS1およびTS2のDNS部分配列は、初めて、通常用いられる標準的な技術から前記酵素の全配列を確立することを可能にする(特に、本明細書に示されるDNS配列は非コードイントロンを含まないため)。対応する標準的な技術は、例えば「ポリメラーゼ連鎖反応」技術(PCR技術)、例えばインビトロジェン社またはクロンテック(Clontech)社製の市販のキットを用いて行うことができる、ゲノムDNSまたはcDNAおよびmRNAを用いる「サザンブロット」である。前記技術は当業者に知られ、とくに、Ausubel et al:Current Protocols in Molecular Biology,Edition 1989 and 2001に記載されている。それぞれの酵素の全DNSまたはその機能的部分配列は、標準的な形質転換技術(Ausubel et al.)によって所望の生産物生物に導入される。遺伝子組み換え生物はTS1およびTS2を製造し、遺伝子組み換え生物および/またはその培養上清から単離されうる。TS1またはTS2をコードするDNSのレシーバー生物としては、原核細菌、真核微生物、酵母および他の菌類、真核細胞培養、藻、植物、種子、動物、動物の部分、組織、ハイブリドーマ、それらから誘導される遺伝子組み換え生物;遺伝子生物の、遺伝子治療の、および遺伝子組み換えの組み換え体および生物、器官、組織ならびに細胞;が用いられる。ここで問題にする酵素は、対応する遺伝子組み換え生物の全体または部分からも、その培養上清からも、器官、組織、細胞、生物液、浸出液、眼、血液、リンパ液、牛乳、植物、藻および種子からもおよびそれらの部分からも単離されうる。
グリコマクロペプチド(GMP)6kgと、鎖長が6〜10糖であるガラクトオリゴ糖1kgを従来用いられるpH7.0の50mMのBisTrisバッファー(例えばダルムシュタット、メルク(Merk,Darmstadt)社製)に溶解する。溶液をトランス−シアリダーゼを含むコンゴ トリパノソーマの培養上清1lとあわせて37℃で3時間インキュベートする。このときトランス−シアリダーゼはシアル酸をGMPからガラクトオリゴ糖に転移させる。シアル化生成物は、従来のクロマトグラフ法(Ausubel at el.)またはろ過技術を用いて分離および精製することができ、製品処方のための純粋状態に用いることができる。
単離された両方の酵素は、例えば、ベータ−ガラクトースを含むポリマー(アラビアゴムなど)、特にポリラクトサミンおよびガラクタンおよびガラクトオリゴ糖(GOS)、特にBorculo Domo Ingredients(BDI)社製のVivinal GOS、およびヤクルト(Yakult)社のオリゴメート55(Oligomate 55)などのベータ−ガラクトオリゴ糖をシアル化するために用いることができる。
Claims (26)
- トランス−シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードし、コンゴ トリパノソーマ(Trypanosoma congolense)から単離されうるポリヌクレオチド。
- トランス−シアリダーゼ活性を有するタンパク質をコードし、ドナーからアクセプター分子へのシアル酸の転移を触媒する請求項1に記載のポリヌクレオチド。
- 配列番号1もしくは3に記載される核酸配列を含む請求項1または2に記載のポリヌクレオチド、または少なくとも15の結合したヌクレオチド残基を含むそのフラグメント;前記ポリヌクレオチドもしくはフラグメントと相補的なポリヌクレオチドおよびフラグメント;および、遺伝子コードの変性によって前記ポリヌクレオチドから誘導されるヌクレオチド配列。
- 前記請求項のうちいずれか1項に記載のポリヌクレオチドと、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズするオリゴヌクレオチド。
- 請求項4に記載のオリゴヌクレオチドと、特にストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、トリパノソーマ属の微生物の遺伝子産物をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜3または5のいずれか1項に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドでコードされる;または配列番号2もしくは4に記載される少なくとも10の結合したアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する;ポリペプチド、およびトランス−シアリダーゼ活性を有するその機能的等価物。
- TDTVKYSTDGGRTWKREVIIPNGR(配列番号2の1〜25番目)、
FRIPSLVEIDGVLIATFDTRYLRASDSSLI(配列番号4の1〜30番目)
のアミノ酸部分配列のうち1つを特徴とする、トランス−シアリダーゼまたはトランス−シアリダーゼ活性を有するその機能的等価物。 - 以下の性質:
ヌクレオチド配列 配列番号1
アミノ酸配列 配列番号2
最適温度 30〜40℃
最適pH pH6.5〜8.5
等電点 pH4〜5
分子量、ネイティブ 400〜600kDa
分子量、還元条件下SDS−PAGEによる 90kDa;
のうち少なくとも1つを特徴とする、トランス−シアリダーゼ1(TS1)。 - 以下の性質:
ヌクレオチド配列 配列番号3
アミノ酸配列 配列番号4
最適温度 30〜40℃
最適pH pH6.5〜8.5
等電点 pH5〜6
分子量、ネイティブ 120〜180kDa
分子量、還元条件下SDS−PAGEによる 90kDa;
のうち少なくとも1つを特徴とする、トランス−シアリダーゼ2(TS2)。 - コンゴ トリパノソーマ微生物由来である、請求項1〜9のいずれか1項に記載の物質。
- 合成による方法、特に化学的、生化学的、酵素反応的、遺伝子工学的、および遺伝子組み換えによる方法を用いて製造された、請求項1〜9のいずれか1項に記載の物質。
- 請求項8または9に記載のトランス−シアリダーゼの機能的等価物、配列番号2または4の対応するアミノ酸配列または部分配列との配列一致度が、Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8),1998,2444−2448のアルゴリズムで計算して、少なくとも50%または少なくとも60%、特に少なくとも65%または少なくとも70%、例えば75%、80%、85%、90%、95%、98%または99%である;あるいは個々のもしくはいくつかのアミノ酸残基の1以上の欠失、付加、置換または反転を含む、または糖鎖付加パターンの変化を示す;それによってシアル酸のドナーからアクセプターへの転移の触媒作用の能力が維持される、アミノ酸配列または部分配列。
- 少なくとも1つの調節核酸配列を作動可能なように連結した請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸配列を含む、発現カセット。
- 請求項13に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む、組み換えベクター。
- 請求項14に記載の少なくとも1つのベクターを形質転換した、原核細胞または真核細胞の宿主。
- トランス−シアリダーゼ活性をもつタンパク質の組み換え生産のための請求項13に記載の発現カセット、請求項14に記載のベクター、または請求項15に記載の宿主の使用。
- アクセプター分子がシアル酸残基をもつドナーとともに、請求項6〜12のいずれか1項に記載の酵素の存在下でインキュベートされ、シアル化されたアクセプターが単離されることを特徴とする、アクセプター分子の酵素によるシアル化の方法。
- 以下の性質:
a)前記ドナーが、特にラクトフェリン、グリコリセートホエープロテインおよびカゼインなどの、オリゴ糖、多糖、ポリシアル酸、糖タンパク質、および糖脂質、ならびにそれらのフラグメントに結合したシアル酸から選択される;
b)前記アクセプターが、β−ガラクトオリゴ糖、ラクチトール、ラクトビオン酸、メチル−β−ラクトシド、アセチルラクトサミン、ガラクトピラノシド、トランス−ガラクトオリゴ糖、ポリガラクトース、および末端にβ(1−3)もしくはβ(1−4)結合したガラクトースまたはガラクトースとの他の複合糖質などの、β−ガラクトースを含むポリマーから選択される;
のうち、少なくとも1以上を特徴とする請求項17に記載の方法。 - シアル酸によって制御される寄生虫、細菌、もしくはウイルスによる感染の予防または治療のための;腫瘍疾患の治療のための;組織の発育の障害に関連する疾患の治療のための;免疫系の疾患の治療のための;自己免疫反応の治療のための;細胞伝達の分断を伴う疾患の治療のための;または炎症の治療のための、薬剤、食品、あるいは食品添加剤を製造するための請求項6〜12のいずれか1項に記載のトランス−シアリダーゼ、それをコードする請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸配列、または請求項18もしくは19に記載の方法で製造されるシアル化生成物の使用。
- トリパノソーマ感染の治療もしくは予防のためのトリパノソーマ症ワクチンの開発のための、または酵素阻害剤の開発のための、請求項6〜12のいずれか1項に記載のトランス−シアリダーゼの使用。
- 酵素の作用から体細胞もしくは組織もしくは糖タンパク質を保護するための薬剤、食品添加剤、または食品を製造するための、請求項6〜12のいずれか1項に記載のトランス−シアリダーゼ、それをコードする請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸配列、あるいは請求項18もしくは19に記載の方法で製造されるシアル化生成物の使用。
- 体組織の発達および/または形態形成に影響を与えるための薬剤、食品添加剤、または食品を製造するための、請求項6〜12のいずれか1項に記載のトランス−シアリダーゼ、それをコードする請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸配列、あるいは請求項17もしくは18に記載の方法で製造されるシアル化生成物の使用。
- a)請求項6〜12のいずれか1項に記載のトランス−シアリダーゼと相互作用するポリペプチドリガンド;
b)請求項6〜12のいずれか1項に記載のトランス−シアリダーゼの生物活性を調節する低分子エフェクター;および
c)請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸配列のアンチセンス核酸配列;
から選択される、請求項6〜12のいずれか1項に記載のトランス−シアリダーゼの、トランス−シアリダーゼ活性のエフェクター。 - トランス−シアリダーゼ活性に伴う疾患の治療または予防のための、製薬または遺伝子治療の手段、食品添加剤、または食品を製造するための、請求項23に記載のエフェクターの使用。
- a)コンゴ トリパノソーマが培養液中で培養される;
b)および所望の生成物が塩勾配によってイオン交換クロマトグラフィーを用いて、必要に応じてその後等電点電気泳動法、ゲルろ過、アフィニティークロマトグラフィー、および/またはタンパク質沈殿を用いて培養上清から単離される、
トランス−シアリダーゼ活性をもつ酵素の単離方法。 - 少なくとも1つの、請求項23に記載のエフェクターを製薬上もしくは遺伝子治療上適切な担体中に含む、製薬または遺伝子治療の手段。
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