RU2396087C1 - СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ - Google Patents
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2396087C1 RU2396087C1 RU2009105608/13A RU2009105608A RU2396087C1 RU 2396087 C1 RU2396087 C1 RU 2396087C1 RU 2009105608/13 A RU2009105608/13 A RU 2009105608/13A RU 2009105608 A RU2009105608 A RU 2009105608A RU 2396087 C1 RU2396087 C1 RU 2396087C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- antigen
- test systems
- pneumocystis carinii
- pneumocyst
- animals
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Способ получения антигена пневмоцист Pneumocystis carinii для диагностических тест-систем для прижизненной диагностики пневмоцистоза. Интраназально инфицируют животных пневмоцистами с использованием иммунодепрессанта для подавления иммунитета. В качестве иммунодепрессанта вводят циклофосфан в разовой дозе 20 мг на 1 кг веса. Для интраназального инфицирования используют суспензию пневмоцист в концентрации 104 в 1 мл. Способ позволяет увеличить выход пневмоцист и соответственно антигена, а тест-системы, разработанные на основе антигена пневмоцист, выявляют специфические ранние IgM, диагностические IgG антитела, а также антигены, наличие или отсутствие которых в полной мере отражает течение заболевания.
Description
Изобретение относится к медицине и касается способов получения пневмоцист (Pneumocystis carinii) для диагностических тест-систем.
Известен способ получения Pneumocystis carinii с использованием иммунодепрессанта - ацетат кортизона (В.И.Васильева, Н.В.Каражас и др. - а.с. №1685991; Н.В.Каражас и Т.Н.Рыбалкина - патент №2186390).
Однако для подавления иммунитета животных разовая доза ацетат-кортизона составляет 75-100 мл на 1 кг веса, а для интраназального инфицирования используется большая концентрация пневмоцист (106 в 1 мл), и выход целевого продукта был недостаточно большим (30 цист в поле зрения).
Цель изобретения - усиление подавления иммунитета животного, уменьшение разовой дозы иммунодепрессанта, уменьшение концентрации пневмоцист при интраназальном инфицировании и увеличение выхода целевого продукта.
Сущность изобретения заключается в том, что для подавления иммунитета животных используют циклофосфан в разовой дозе 20 мг на 1 кг веса, а для интраназального инфицирования животных - суспензию пневмоцист в концентрации 104 в 1 мл, что позволяет увеличить выход пневмоцист, используемых для приготовления диагностических тест-систем.
Пример 1.
В качестве испытуемых животных используют мини-свиней в возрасте от 1 до 1,5 месяцев весом 1,5-2 кг. Животных делят на две группы: опыт и контроль. Мини-свиньям в опытной группе за две недели перед инфицированием Pneumocystis carinii подавляют иммунитет введением циклофосфана 20 мг на кг веса дважды в неделю, затем одноразово интраназально заражают животных суспензией пневмоцист в концентрации 104 в 1 мл в количестве 2,0 мл.
Контрольная группа получает по той же схеме вместо циклофосфана 0,85% хлористого натрия. Животных содержат на низкобелковой монотонной диете (овсяная каша на воде). Для предупреждения бактериальной инфекции в пищу добавляют доксициллин гидрохлорид 15,6 мг на 1 кг массы животного.
У погибших животных иссекают легкие и готовят из них мазки-отпечатки. Препараты окрашивают по Романовскому-Гимза, исследуют в световом микроскопе при увеличении ×700 и выявляют все формы развития пневмоцист (трофозоиты, прецисты и цисты).
У животных опытной группы на 5-6 неделе отмечают пассивность поведения, ухудшение аппетита, остановку в прибавке в весе, кожные покровы, хоть и чистые, но животные страдают от кожного зуда. На 7 неделе эксперимента у животных заметна потеря в весе; с трудом встают на ноги, копытца холодные, появляется слабая синюшность пятачков, взъерошенность волосяного покрова. На 8 неделе появляется хриплое дыхание, усиливается насморк, полный отказ от пищи, пятачки выраженного синюшного оттенка.
Контрольная группа животных набирает в весе, активна, волосяной покров в норме, пятачки розовые.
Легкие, выделенные от погибших мини-свиней, увеличены в объеме, тяжелые, характерного мраморного цвета с серым оттенком, узловатые; на разрезе выделяется пенистое содержимое альвеол, в котором и находятся пневмоцисты.
Максимальное содержание пневмоцист в поле зрения при увеличении ×700 достигает 60-100 клеток, что более чем в два раза больше, чем при использовании ацетат кортизона.
Выделенные из легких погибших мини-свиней пневмоцисты концентрируют и очищают в градиенте плотности перколла и используют для приготовления специфического антигена, необходимого для создания диагностических тест-систем.
Пример 2.
Для определения IgM (ранних) и IgG антител против Pneumocystis carinii в динамике используют иммуноферментную тест-систему (ИФА), что позволяет оценивать течение инфекционного процесса.
Антиген получают разрушением пневмоцист ультразвуком и объединением внутренних и поверхностных белков в один пул, который адсорбируют в определенной концентрации на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов. Выявление антител к антигенам пневмоцист основано на иммуноферментном анализе на твердой фазе с использованием пероксидазы хрена в качестве маркерного фермента.
Исследуемую сыворотку крови добавляют в лунку планшета с адсорбированным на ее поверхности антигеном пневмоцист. Если в сыворотке содержатся антитела, они образуют комплекс антиген-антитело.
Сыворотку удаляют отмыванием и в лунку добавляют конъюгат моноклональных антител против IgM или IgG человека, меченных пероксидазой, которые взаимодействуют с антителами, присоединившимися на первом этапе к антигену пневмоцист.
Лунки промывают и добавляют хромоген (ТМБ). В результате взаимодействия ТМБ с пероксидазой, соединенной с антителами, раствор приобретает желтую окраску. Интенсивность окрашивания прямо пропорциональна содержанию антител к антигенам пневмоцист в сыворотке.
Контрольные положительные сыворотки разводят в 160 мкл ФСБ, а отрицательную - в 320 мкл. Анализируемые сыворотки разводят в соотношении 1:200, 1:2000 и 1:20000 (при выявлении антител класса IgM) и 1:100, 1:1000 и 1:10000 (при выявлении антител класса IgG).
При проведении исследований в этих разведениях не наблюдалось ложноположительных реакций ни с одной из 200 сывороток доноров.
Реакция останавливается добавлением в лунки планшета стоп-реагента (2М серной кислоты).
Результаты ИФА регистрируют с помощью мультискана.
Для диагностики заболевания (особенно острой формы) одного исследования недостаточно. Диагноз может быть установлен на основании изучения двух образцов сыворотки одного и того же пациента, полученных в динамике с интервалом 2-3 недели на IgM и IgG антитела.
Пример 3.
Для выявления антител IgM и IgG к антигену Pneumocystis carinii при непрямом иммунофлюоресцентном методе (НРИФ) в качестве антигена берут целые, инактивированные формалином клетки Pneumocystis carinii, высоко специфические положительные и отрицательные контроли сывороток (К+ и К-) и анти-человеческие сыворотки, меченные ФИТЦ.
Исследуемые пробы сывороток, помещают во все лунки предметного стекла, кроме контрольных. В контрольные лунки с антигеном вносят контрольные сыворотки (К+) и (К-). Антиген, находящийся в (К+) и в исследуемом материале, соединяется со специфическими антителами к Pneumocystis carinii.
Сыворотку удаляют отмывкой и в лунки вносят смесь иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих против иммуноглобулинов человека и альбумина, меченного родамином, которые взаимодействуют с антителами. Лунки отмывают, подсушивают и исследуют под люминисцентным микроскопом ЛЮМАМ РПО-11 ув. ×400, водная иммерсия.
В исследуемых сыворотках, содержащих антитела к Pneumocystis carinii и в (К+), наблюдается желто-зеленое свечение на 3-4 креста, в (К-) - свечение отсутствует или не более чем на один крест. Сыворотки должны исследоваться в динамике с интервалом 2-3 недели.
Пример 4.
Для выявления антигена Pneumocystis carinii в биологических материалах больных с подозрением на пневмоцистоз и у лиц с иммунодефицитными состояниями в непрямом иммунофлюоресцентном методе (НРИФ) используют целые и инактивированные формалином клетки Pneumocystis carinii, высокоспецифические иммунные сыворотки и иммуноглобулины диагностические, флюоресцирующие против иммуноглобулинов человека.
Исследуемый биологический материал человека помещают в пустые лунки (по 1 или 2 на пробу) 18-ти луночного предметного стекла. Препарат фиксируют холодным ацетоном после высыхания образца. Во все лунки с исследуемым материалом, а также в 2 лунки с антигеном вносят положительную сыворотку по 5 мкл, кроме 5 и 6 лунок третьего ряда - в них вносят отрицательную сыворотку (К-).
Сыворотку удаляют отмывкой и в лунку вносят смесь иммуноглобулинов диагностических, флюоресцирующих против иммуноглобулинов человека и альбумина бычьего, меченного родамином, которые взаимодействуют с антителами. Лунки отмывают, подсушивают и исследуют под люминисцентным микроскопом.
В исследуемых материалах, содержащих антиген Pneumocystis carinii, наблюдается желто-зеленое свечение на +++ или ++++.
При этом не наблюдается ложноположительных реакций ни в одном из материалов, полученных от больных с клинически выраженной пневмонией. Из 150 обследованных у 30% была диагностирована пневмоцистная пневмония, что было подтверждено комплексом лабораторных методов и клинической картиной.
Таким образом, использование циклофосфана как иммунодепрессанта позволяет получить усиление подавления иммунитета животного, уменьшение разовой дозы иммунодепрессанта, уменьшение концентрации пневмоцист при интраназальном инфицировании и увеличение выхода целевого продукта, который используется для приготовления тест-систем ИФА и НРИФ (для определения антител IgM и IgG) и НРИФ (для выявления антигенов Pneumocystis carinii).
Claims (1)
- Способ получения антигена Pneumocystis carinii для диагностических тест-систем, включающий использование иммунодепрессанта для подавления иммунитета, интраназальное инфицирование животных пневмоцистами, отличающийся тем, что в качестве иммунодепрессанта используют циклофосфан в разовой дозе 20 мг на 1 кг веса, а для интраназального инфицирования животных используют суспензию пневмоцист в концентрации 104 в 1 мл.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009105608/13A RU2396087C1 (ru) | 2009-02-19 | 2009-02-19 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2009105608/13A RU2396087C1 (ru) | 2009-02-19 | 2009-02-19 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2396087C1 true RU2396087C1 (ru) | 2010-08-10 |
Family
ID=42698913
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2009105608/13A RU2396087C1 (ru) | 2009-02-19 | 2009-02-19 | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2396087C1 (ru) |
-
2009
- 2009-02-19 RU RU2009105608/13A patent/RU2396087C1/ru active
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kantele et al. | Immune response to acute diarrhea seen as circulating antibody-secreting cells | |
CN104928258B (zh) | 犬细小病毒杂交瘤细胞、及单克隆抗体和应用 | |
FR2872579A1 (fr) | Detection de la tuberculose et de l'infection par mycobacterium tuberculosis a l'aide de hbha | |
KR101961999B1 (ko) | 항분비 인자 복합체 분석 | |
Hornsleth et al. | Detection of respiratory syncytial virus in nasopharyngeal secretions by ELISA: comparison with fluorescent antibody technique | |
CN110488025A (zh) | 一种化学发光定量检测粪便钙卫蛋白及其检测方法和其在肠道健康检测的用途 | |
Chand et al. | Comparison of milk-ELISA and serum-ELISA for the diagnosis of Brucella melitensis infection in sheep | |
CA3181751A1 (en) | Detection of antibodies to sars-cov-2 | |
Girma et al. | Phenotypic characterization of Peripheral B cells in Mycobacterium tuberculosis infection and disease in Addis Ababa, Ethiopia | |
Lei et al. | Detection of circulating antigen in serum of mice infected with Schistosoma japonicum by immunomagnetic bead ELISA based on IgY | |
RU2396087C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА Pneumocystis carinii ДЛЯ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ТЕСТ-СИСТЕМ | |
Sandoval et al. | Detection of antibodies against avian antigens in bronchoalveolar lavage from patients with pigeon breeder's disease: Usefulness of enzyme‐linked immunosorbent assay and enzyme immunotransfer blotting | |
ES2637200T3 (es) | Procedimiento para el diagnóstico in vitro y/o monitorización de terapia in vitro de infecciones | |
JPH01503487A (ja) | ヒト免疫不全ウイルスに対する抗体の検出方法 | |
EP3583424B1 (fr) | Methode de dosage immunologique d'anticorps specifiques d'antigenes de virus de la famille despoxviridae | |
Sommerfelt et al. | Immunological and hematological response in experimental Toxocara canis-infected pigs | |
JP2009536327A (ja) | 薬剤誘導肝臓損傷及び中毒性物質誘導肝臓損傷の同定及び早期同定並びに治療の同時観察のためのinvitro方法 | |
Saha et al. | Enhanced inflammasome-mediated inflammation and impaired autophagy in peripheral blood mononuclear cells is associated with non-alcoholic fatty liver disease severity | |
Pinelli et al. | Specific IgG4 response directed against the 45-kDa glycoprotein in trichinellosis: a re-evaluation of patients 15 years after infection | |
Zimmermann et al. | Membranous nephropathy and primary biliary cholangitis: a case report and review of the literature | |
Cruz-Rivera et al. | Distribution of Taenia solium diagnostic glycoproteins in the different developmental stages of the parasite | |
Gould et al. | Evaluation of surface antigen TF1. 17 in feline Tritrichomonas foetus isolates | |
ES2257095T3 (es) | Especificidad mejorada en la deteccion de anticuerpos igm de anti-rubeola. | |
ES2674672T3 (es) | Péptidos de interferencia y procedimiento de detección de microorganismos | |
CN103163302B (zh) | 一种采用定向交叉偶联技术制备的短肽抗体试剂盒 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PD4A | Correction of name of patent owner | ||
PD4A | Correction of name of patent owner |