CN103586092B - 用于固定金属离子色谱法（imac）的螯合基团的固定 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于将多羧酸结合到固相上的方法。此外，本发明涉及具有与之固定的多羧酸的固相和使用固相例如用于纯化His-标记的重组多肽的方法。

Description

用于固定金属离子色谱法（IMAC）的螯合基团的固定
本申请是申请号为200880105756.5、申请日为2008年8月6日的中国发明专利申请的分案申请。
本发明涉及用于将多羧酸结合到固相的方法。此外，本发明涉及具有被固定的多羧酸的固相和使用该固相例如用于纯化重组多肽的方法。
用于纯化重组蛋白质的非常有力的策略是“His-标记”的使用，所述“His-标记”一般包括6-10个连续组氨酸。His-标记与Ni2+-离子的游离配位点紧密结合。它们可以通过高浓度的咪唑释放，所述高浓度的咪唑竞争在Ni2+上的配位点。特定吸收和解吸的此种循环可以用于所需蛋白质的一步纯化，导致100或甚至更多的富集因子。
这种技术最广泛使用的变体使用经由ε-氨基基团与琼脂糖珠偶联的NαNα-双（羧甲基）-赖氨酸。活性基团是加载Ni2+的NTA（氮川三乙酸），而间隔物是氨基丁基基团。然而，此种Ni2+-NTA-基质具有几个严重缺点，例如关于NαNα-双（羧甲基）-赖氨酸的高成本。
另外的缺点是被固定的Ni2+-离子的不稳定性。因为NTA仅具有关于Ni2+-的4个配位点，所以Ni2+离子从基质中容易地泄漏并且污染蛋白质样品。由于至少2个原因存在严重问题：Ni2+是偏毒性的重金属，并且它催化不希望有的蛋白质样品氧化。此外，NTA结合的Ni2 +容易地通过蛋白质保护试剂例如DTT（二硫苏糖醇）还原，并且随后从基质中释放。最后，金属螯合蛋白酶抑制剂例如EGTA或EDTA无法与Ni2+-NTA-基质组合，因为它们从这种基质中提取Ni2+-离子。
US6,670,159描述了用于制备基于NTA的金属螯合缀合物的方法，其中在碳化二亚胺的存在下，NTA或其盐在水介质中在至少8的碱性pH下与包含伯胺基团的蛋白质属性的分子反应。
WO2004/036189公开了使用金属螯合物改性的载体用于分离多肽的方法。这种载体包括经由甲酰胺基团与氨基改性的固相结合的NTA。
GB2067203公开了包括与之结合的经由单个甲酰胺基团或经由2个甲酰胺基团结合的EDTA酰胺混合物的载体的聚合螯合剂。既未公开也未暗示这种载体用于纯化多肽的用途。
US2004/204569公开了包括(His-Asn)6-标记的His-标记蛋白质。
US2002/164718公开了用于固定金属离子色谱法（IMAC）的亲和性多肽，其包括具有由His、2个脂族或酰胺氨基酸，His、3个碱性或酸性氨基酸，His和脂族或酰胺氨基酸组成的氨基酸序列的间隔的His-标记。
根据本发明的目的是提供适合于固定金属离子色谱法（IMAC）的新方法和组合物，以避免现有技术相关的问题。
令人惊讶的是，发现与Ni2+络合的基于EDTA的固相，特别是其中EDTA的羧基与固相上的氨基基团结合的固相，在固定金属离子色谱法（IMAC）应用中具有极佳性质，特别用于纯化包含多组氨酸标记的重组多肽。这个发现是完全出乎意料的：根据现有文献，基于EDTA的固相应不适合于镍螯合物色谱法，因为这种六齿（hexadentate）螯合剂应占据Ni2+上的所有6个配位，推测不留下一个用于结合组氨酸残基。与这个预测相反，发现基于EDTA的固相不仅显示与过渡金属离子特别是Ni2+离子的稳定结合，而且所得到的具有Ni2+、Zn2+、Co2+或Cu2+的络合物对于组氨酸标记的蛋白质具有高度选择性。
本发明的第一个方面涉及具有6个或更多配位基团的固定螯合剂用于固定金属离子色谱法（IMAC），特别是用于纯化多组氨酸标记的蛋白质的用途。优选地，固定螯合剂是具有6个或更多配位基团的多羧酸酰胺或酯，所述配位基团特别选自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸盐基团。
更优选地，固定螯合剂是具有式（Ia）或（Ib）结构的具有被固定的多羧酸的固相：
其中SP是固相；
R1是不干扰固相应用的氢或有机残基，例如C1-C3烷基原子团，和
PCA是多羧酸特别是氨基多羧酸残基，或其盐。
更加优选地，固相具有式（II）结构：
其中SP是固相；和
一个或多个羧酸基团可以是去质子化的。
固相结合的多羧酸（Ia）、（Ib）或（II）可以与多价金属离子例如Ni2+离子络合。
本发明的另一个方面指用于使具有6个或更多配位基团的多羧酸与固相结合的方法，其包括步骤：（a）提供多羧酸和包括氨基基团的固相，（b）在缩合剂的存在下使氨基基团与多羧酸反应，其中缩合剂以超过氨基基团的摩尔过量存在，并且多羧酸以超过缩合剂和氨基基团的摩尔过量存在，并且其中多羧酸的单个羧基基团与氨基基团反应。
本发明的另一个方面指具有式（Ia）或（Ib）结构的具有被固定的多羧酸的固相：
其中SP是固相；
R1是不干扰固相应用的氢或有机残基，例如C1-C3烷基原子团，和
PCA是多羧酸特别是氨基多羧酸残基，或其盐，
其中被固定的多羧酸酰胺或酯具有至少6个或更多配位基团，所述配位基团特别选自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸盐基团，
并且其中固相的表面优选基本上不含可触及的氨基基团，其中在固相表面上例如≥90％、优选≥95％和更优选≥99％的可触及的氨基基团被阻断。
在本发明的某些实施方案中，甲酰胺基团-NR1-CO-与固相直接结合。在其他实施方案中，甲酰胺基团经由接头与固相结合，其可以具有1个原子直至20个原子，优选2-12个原子，例如2-6个原子的长度，所述原子可以选自碳原子和任选杂原子例如O和/或N。
本发明的另一个方面是纯化重组多肽的方法，其包括步骤：（a）提供包括具有多个组氨酸残基例如多个连续组氨酸残基的多肽的样品，（b）使样品与包含预先结合的络合金属离子例如Ni2+离子的如上所述的固相接触，条件是其中所述重组多肽与所述固相选择性结合，（c）使结合的重组多肽与其他样品组分分离，和（d）从固相中洗脱重组多肽。
本发明的另一个方面是包括在序列[HnSm]k中具有至少4个组氨酸残基的“间隔的组氨酸标记”的重组多肽，其中H是组氨酸，S是不同于组氨酸的选自甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的氨基酸残基，n在每种情况下独立地是1-4，m在每种情况下独立地是1-6，并且k是2-6、优选2-5。间隔组氨酸标记可以具有常规序列，即n和m在每次事件中可以具有相同值或不规则序列，即n和m可以具有不同值。在多组氨酸-标记内的大量组氨酸可能增加对于Ni2+螯合物基质的结合强度和特异性。然而，太多连续组氨酸可能降低重组蛋白质的表达水平和溶解性，例如在大肠杆菌（E.coli）中重组表达的蛋白质。这些问题可以通过用短间隔物，即用间隔的组氨酸标记中断组氨酸的连续运行来克服，所述短间隔物包括甘氨酸、丝氨酸和/或苏氨酸。与常规寡聚组氨酸标记对比，当根据本发明用间隔的组氨酸标记进行标记时，重组蛋白质例如核转运受体或二氢叶酸还原酶（DHFR）在大肠埃希杆菌（Escherichiacoli）中的表达过程中显示更高的表达和更佳的溶解性。
根据本发明，提供了用于使多羧酸与固相结合的方法。多羧酸具有6个或更多，例如6、7或8个配位基团。优选地，多羧酸具有4、5个或更多羧酸基团。多羧酸可以是氨基、氮川或醚多羧酸，其中氨基多羧酸特别地具有叔胺基团的氨基多羧酸是优选的。多羧酸的特定例子是乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA）和三乙烯四胺-N,N,N',N',N'',N''-六乙酸（TTHA）。特别优选的是EDTA。
多羧酸优选与包括伯胺或仲胺基团的固相结合。结合在允许多羧酸的仅一个羧基基团与固相选择性结合的条件下实施，无需分离活化或衍生形式的多羧酸例如酐、活性酯、或其中多羧酸的伯胺或仲胺基团保持用于后续偶联步骤的可触及的形式。借助于羧基基团和氨基基团之间的反应，形成甲酰胺键。固相可以是氨基官能化的色谱法载体。例如固相可以选自氨基官能化碳水化合物，例如琼脂糖、琼脂糖凝胶或纤维素，金属或半金属例如硅或其氧化物例如硅胶、玻璃，塑料例如聚苯乙烯，或脂质例如含磷脂酰乙醇胺或磷脂酰丝氨酸的磷脂。此外，固相可能包括颗粒，例如囊泡、磁珠、量子点、囊泡或蛋白质。固相上的氨基基团优选是伯胺或仲胺基团，例如脂族伯胺基团。
固相的氨基官能化可以通过已知方法来实施，例如通过使含氨基基团的硅烷例如氨丙基三乙氧基硅烷与固相例如硅胶或玻璃反应，或通过使氨水与环氧活化的固相反应。优选地，硅胶或玻璃的氨基官能化用氨丙基三甲氧基硅烷或氨丙基三乙氧基硅烷来实施。碳水化合物例如琼脂糖、琼脂糖凝胶或纤维素优选首先用环氧氯丙烷或环氧溴丙烷进行环氧活化，以产生环氧活化的基质，并且随后用过量氨水、伯胺或羟胺处理，以产生氨基改性的基质。
在固相上的氨基基团密度可以通过氨基官能化的反应条件例如反应物的温度、持续时间和/或浓度而改变。例如，氨基官能化试剂可以用钝化剂稀释，例如包含非氨基基团的硅烷，以便在需要时减少表面上的氨基基团密度。含氨基基团的反应物可以用钝化剂稀释至例如1-50％的浓度，优选用缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷和3-巯基1,2-丙二醇之间的反应产物。可替代地，氨基密度可以通过使用双或多功能试剂增加，所述双或多功能试剂包含2个或更多伯胺或仲胺基团例如1,13-二氨基-4,7,10-trioxatridexane。因此，可以增加基质对于His-标记的蛋白质的亲和力。因此，可以选择反应条件以获得具有所需特征的终产物，例如致使His-标记的蛋白质特异性地结合终产物，而其他蛋白质的本底结合最小。最佳氨基密度可以根据实施例中所描述的操作对于每种固体载体进行经验性确定。
例如，具有长组氨酸标记（具有例如≥10个组氨酸残基）的蛋白质的纯化，优选用这样的表面来实施，即所述表面具有比具有6个组氨酸残基标记的蛋白质的纯化更低密度的Ni2+-络合的多羧酸酰胺基团。相反，在变性条件下的纯化，例如在胍氯化物的存在下，优选用比在天然条件下的纯化更高密度的螯合基团来实施。
在下一个步骤中，实施多羧酸的一个羧基基团和在表面上的氨基基团之间的缩合反应。图1显示用EDTA作为多羧酸例示的这个反应的示意性描述。
在缩合剂的存在下实施反应，所述缩合剂可以选自碳化二亚胺、碳酸盐例如二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸盐、O-(N-琥珀酰亚胺基)-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸盐或类似化合物。碳化二亚胺例如1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳化二亚胺（EDC）或N,N'-二环己基碳化二亚胺（DCC）是优选的。当多羧酸以超过氨基和/或缩合剂足够摩尔过量存在时，发现在其中多羧酸的单个羧基与固相上的氨基反应的反应条件。在一个优选实施方案中，为了获得关于IMAC的高度特异性基质，选择在其中氨基基本上量化地与多羧酸反应的反应条件。因此，应使用缩合剂超过氨基基团的至少2倍摩尔过量、优选至少4倍摩尔过量，以及多羧酸超过氨基基团的至少5倍过量、优选至少10倍摩尔过量和更优选至少25倍摩尔过量（参见实施例）。
优选在水相中实施反应。反应条件优选是pH5-9、更优选pH7-8.5。优选使用与饱和限度（例如0.5M用于EDTA和0.1M用于EGTA）接近的多羧酸和以多羧酸浓度1/10-1/50的缩合剂。
反应产物是具有经稳定的羧酸酰胺键将多羧酸固定于其上的固相。优选地，固相具有如上所述的被固定的式（Ia）结构。优选地，被固定的多羧酸残基仍具有至少3、4个或更多羧基和任选进一步的螯合基团例如氨基或醚基团。
如果所述多羧酸是EDTA，那么固相优选具有式（II）结构：
其中SP是固相。
本发明的固相例如EDTA-酰胺固相对于多价金属离子具有高亲和力，例如过渡金属离子如Ni2+、Zn2+、Co2+或Cu2+-离子。这些金属离子与根据本发明固定的螯合剂的几种组合提供高度选择性基质用于结合组氨酸标记的蛋白质而相比传统的被固定的NTA-基团具有较少的非特异性结合（参见图2和3）。
在一个优选实施方案中，本发明的固相基本上量化地不含可触及的氨基基团，例如伯胺基团和/或羟基基团，因为未反应的氨基基团可以是不携带His-标记的多肽的低亲和力Ni2+结合和高非特异性本底结合的原因。因此，可能希望在固相表面上≥90％、优选≥95％和更优选≥99％的可触及的氨基基团，特别是伯胺基团是被阻断的，例如通过由缩合剂介导的与多羧酸的反应。可触及的未反应基团例如伯胺基团的量可以根据已知方法进行测定，例如通过茚三酮测试或OPA（邻苯二甲醛/硫醇）反应。
此外，优选固相例如EDTA-酰胺固相基本上不含松散结合的多价金属离子，例如Ni2+离子。本发明发现当最初用Ni2+离子饱和EDTA-酰胺基质时，其显著量可能保持仅与之松散结合，特别地，当固体载体仍包含未反应的氨基基团时。该松散结合的Ni2+级份可以用合适试剂例如二甲基乙二肟检测出。例如，在将溶解于乙醇中的0.2-1体积1％w/v的二甲基乙二肟加入在Tris-缓冲液pH7.5中的Ni2+装载基质并且使混合物在60℃下振荡15分钟后，任何松散结合的Ni2+离子都可以作为粉红色沉淀物被检测出。松散结合的金属离子可能引发问题，即含蛋白质样品被毒性和氧化性Ni2+离子污染和增加的非His-标记蛋白质的非特异性结合。
因此，本发明的固相优选基本上不含松散结合的金属离子，特别是松散结合的Ni2+离子。松散结合的金属离子可以这样从固相中去除，例如通过使固相与游离多羧酸螯合剂例如NTA或EGTA或EDTA接触，优选在约pH7.5下，例如与40mMNTA或10mMEGTA或10mMEDTA接触，直至松散结合的金属离子已变得无法检测时，例如通过使基质与对于相关金属离子合适的检测试剂接触，例如用于检测Ni2+离子的二甲基乙二肟。在去除松散结合的金属离子后，其余离子保持如此紧密的结合，使得即使在室温下与等体积0.5MEDTA（pH7.5）过夜温育也不足以从EDTA-酰胺基质中完全释放。相比之下，应当指出用40mMNTA或10mMEGTA或10mMEDTA预洗涤商购可得的Ni-NTA-琼脂糖（Qiagen）或Ni-NTA-酰胺基质不仅去除了松散结合的Ni2+离子，还明显去除是所有结合的Ni2+离子（图4）。
令人惊讶的是，未发现EDTA中的一个羧基向甲酰胺基团的转化将弱化在中性pH下对Ni2+的亲和力的指示。相反，甲酰胺的羰基氧或氨基基团可以明显衔接与Ni2+的配位键，暗示着EDTA-酰胺真实地是六齿螯合物。甲酰胺基团能配位Ni2+是证明，例如，来自甲基辅酶M-还原酶，其中提供给Ni2+的4个配位点由辅酶F430提供的，而第五个是由谷氨酰胺侧链的甲酰胺提供的（Ermler等人，Science278（1997），1457）。
本发明的固相可以用于固定金属离子色谱法（IMAC）。在这种色谱法中，包含多个组氨酸残基，例如连续组氨酸残基，例如至少6个连续组氨酸残基的多肽与本发明的金属络合物固相选择性结合，并且与其他组分分离。所述多肽可以通过加入合适的洗脱剂如咪唑从固相中洗脱。咪唑浓度优选在1至1000mM的范围中，依赖于被固定的活性基团的密度、多组氨酸标记的长度和被标记的蛋白质的多聚状态。
对于His-标记的蛋白质的IMAC纯化起作用，迄今为止假定被固定的螯合剂应仅占据Ni2+的6个配位点中的3-5个。因此，本发明的一个出乎意料的方面是被固定的六齿螯合剂如EDTA-酰胺或EDTA-羟酰胺和甚至具有超过6个配位基团的螯合剂对于本申请工作极其良好。显而易见的是，组氨酸侧链可以暂时取代在给定螯合剂内的弱配位基团。因此，根据本发明的一个实施方案，被固定的螯合剂，即被固定的多羧酸酰胺具有6个或更多配位基团，特别是选自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸盐基团。
可以在本发明的固相上形成例如EDTA-酰胺例如与Ni2+在动态上非常稳定的络合物。所得到的基质对Ni2+-提取非常有抗性，例如通过EGTA或NTA。即使0.5M的EDTA也仅非常缓慢地提取Ni2+，即在数小时至数天的时间尺度上。通过在缓冲液中包含咪唑例如1mM咪唑进一步增加针对Ni2+提取的抗性。因此，可以在螯合金属蛋白酶抑制剂例如以1-10mM例如5mM浓度的EDTA的存在下，实施用本发明的固相例如EDTA-酰胺基质的IMAC。
传统的Ni-螯合物基质，例如Ni-NTA琼脂糖，通过蛋白质保护试剂例如二硫苏糖醇（DTT）容易被减少。即使低的毫摩尔浓度的DTT也以呈褐色还原产物的形式提取镍。相比之下，其中已去除松散结合的Ni2+的Ni2+EDTA-酰胺基质未显示这些问题。相反，在Ni2+EDTA-酰胺硅胶上，在极高浓度的DTT例如0.5M或1MDTT的存在下，可以成功地纯化his-标记的蛋白质（图5），这是比在典型的蛋白质纯化方案中使用的DTT浓度高100-1000倍。因此，在一个优选实施方案中，包含本发明的固相的金属离子例如Ni2+离子在含硫醇或含二硫醇的还原剂例如DTT的存在下优选对于在室温下至少1小时是稳定的，所述DTT以至少10mM、优选至少20mM、更优选至少50mM、和更加优选至少100mM或甚至至少500mM、和直至1000mM或甚至更高的浓度。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，用在“间隔的组氨酸标记”中优选在序列[HnSm]k中包含多个组氨酸残基的重组多肽实施色谱法，其中H是组氨酸，S是选自甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的间隔物残基，n是1-4，m是1-6、优选1-4，并且k是2-8、优选2-6。标记的长度优选是8至50个氨基酸、更优选12至40个氨基酸。本发明还包括不规则间隔的组氨酸标记，其中寡聚组氨酸簇的长度和间隔物区域的长度在给定标记序列内变化。间隔的组氨酸标记优选位于重组多肽的N和/或C末端处和/或插入重组多肽的序列内。
此外，本发明通过下图和实施例更详细地说明。
图例
图1：关于EDTA与含胺载体偶联的图示。
在其中在EDTA的单个羧基与载体上的氨基之间发生选择性反应的条件下实施反应。
图2：各种含Ni2+-色谱法基质在IMAC中的蛋白质结合特异性的对比。
显示了各种His-标记的蛋白质，即对比基质（NTA-Qiagen）和3种本发明的基质（EDTA-酰胺硅胶I、EDTA-酰胺硅胶II和EDTA-酰胺琼脂糖凝胶）的蛋白质结合特征（关于细节参考实施例5）。
图3：用于IMAC的各种螯合剂与过渡金属离子的组合。
显示了在各种过渡金属离子的存在下各种基质（本发明的EDTA，EGTA和TTHA基质以及NTA基质）与不同螯合剂的蛋白质结合性质（关于细节参考实施例6）。
图4：Ni-螯合物基质针对通过游离螯合剂提取Ni2+的抗性。
显示了Ni2+结合至本发明的EDTA-酰胺基质和至对比NTA基质的强度（关于细节参考实施例7）。
图5：各种Ni-螯合物基质针对含硫醇的还原剂的抗性。
显示了各种含Ni2+螯合剂基质（本发明的EDTA-酰胺基质和对比NTA基质）针对Ni2+提取和在DTT的存在下的还原的抗性（关于细节参考实施例8）。
图6：间隔多组氨酸标记的表征。
A）显示了本发明间隔的聚-His标记（间隔H14、间隔H21和间隔H28）和对比His标记（MRGS6和H10）的结合表征。
B）显示了包含本发明间隔的His-标记和对比His-标记（H10）的蛋白质的表达（关于细节参考实施例9）。
实施例
实施例1：Ni-EDTA-酰胺琼脂糖凝胶4B的制备。
在玻璃漏斗上用1升0.1MNaOH（在水中）、随后1升纯净水5次预洗涤1升琼脂糖凝胶4B，转移至5升烧瓶，并且用水填充至2升的体积。加入0.8molNaOH，并且使温度调整至25℃，随后加入1.0mol环氧溴丙烷。随后使混合物在25℃下振荡2小时，并且随后在冰上冷激。随后通过玻璃漏斗经过滤回收所得到的环氧活化的琼脂糖凝胶，用水洗涤，并且重悬浮于2MNH4Cl（在水中的终浓度，终体积2升）中。加入来自25％水溶液的4molNH3，并且使混合物在室温下振荡o/n。
用水洗涤经过滤回收所得到的NH2-琼脂糖凝胶4B直至无法检测到游离NH3，并且重悬浮于0.5MEDTA/Na+pH8.0（终浓度，终体积2升）。随后，加入50mmolEDC，并且使混合物在室温下振荡1小时。其后，加入另一个50mmolEDC等份试样，并且允许反应进行o/n。
经过滤回收所得到的EDTA-酰胺琼脂糖凝胶，并且洗涤直至游离EDTA-浓缩物降到1mM下。随后用Tris缓冲液pH7.5中的20mMNiCl2加载琼脂糖凝胶，直至游离Ni2+在非结合级份中出现。随后通过用水、10mMNTApH7.5、水洗涤来去除游离和松散结合的Ni2+离子，并且最终重悬浮于30％乙醇+10mM咪唑/HCl+1mMNTApH7.5中用于长期贮存。
通过改变环氧活化步骤可以调整Ni2+EDTA-酰胺琼脂糖凝胶的性质。在较高温度下（高达40℃）偶联且使用较高浓度的环氧氯丙烷和NaOH（分别高达1.2M环氧氯丙烷和1.0MNaOH）将导致较高的偶联密度，但也是更高的本底结合。使用较低浓度的环氧氯丙烷和NaOH（分别降至0.2M环氧氯丙烷和0.1MNaOH）的较低温度（低至18℃）将导致较低的偶联密度，和甚至更低的本底结合，但也是较低的特异性结合能力，特别对于具有短His-标记的蛋白质而言。
实施例2：EDTA-酰胺磁珠的制备。
在水中洗涤5ml胺-末端的磁珠（Sigma#17643-5ml），并且以5ml终体积重悬浮于0.5MEDTA/Na+pH8.0中。加入125μmolEDC等分试样，并且使反应在室温下振荡1小时。其后，加入另一个125μmolEDC等分试样，并且使反应继续o/n。
通过磁分离回收所得到的EDTA-酰胺磁珠，在水中洗涤，并且与实施例1类似地加载Ni2+或另一种金属离子。
实施例3：高密度EDTA-酰胺硅胶的制备
使100gDavisil90-130（Grace）重悬浮于500ml3％（v/v）氨丙基三乙氧基硅烷、4％水、93％乙醇中，并且在40℃下轻轻振荡2小时，并且随后在室温下o/n。通过过滤回收氨基改性的硅胶，并且通过用纯净水洗涤回收去除游离硅烷。如对于琼脂糖凝胶4B所述地实施与EDTA的共价偶联和加载Ni2+。对于长期贮存，产物可以进行脱水或脱异丙醇。
实施例4：具有钝化表面的EDTA-酰胺硅胶的制备
当在IMAC中使用时，来自实施例3的Ni2+EDTA-酰胺硅胶仍具有高本底结合。该本底可能起因于残留硅醇基团和氨基基团（出于立体原因无法与活化EDTA反应）和/或高表面浓度的EDTA-酰胺。通过在用氨丙基-硅烷改性硅胶的过程中包括钝化硅烷可以解决本底问题。迄今为止最佳钝化的硅烷是缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷和3-巯基1,2-丙二醇之间的反应产物。
使3ml缩水甘油基氧基丙基三甲氧基硅烷与3ml2-巯基1,3-丙二醇、90ml甲醇、4ml水和10μl4-甲基吗啉混合，并且允许该反应在25℃下进行30分钟。加入150μl氨丙基三甲氧基硅烷，并且如上所述使用所得到的混合物改性30gDavisil90-130。氨基硅烷和钝化硅烷之间的比例在该实施例中定义为5％。然而，它可以在1％和50％之间改变。所得到的钝化氨基-硅胶随后与EDTA或另一种螯合基团反应，加载金属离子，并且如上所述进行处理以去除松散结合的金属离子。
实施例5：含Ni2+-色谱法载体在IMAC中的对比
测试了下述色谱法载体：
使大肠杆菌细胞重悬浮于缓冲液（50mMTris/HClpH7.5、2mM乙酸镁、50mMNaCl、5mM巯基乙醇）中。制备溶解产物，并且通过超速离心法澄清。随后，加入包含核输出信号（NES）、黄色荧光蛋白（YFP）和C末端十His-标记的1μM融合蛋白（"NES-YFP-H10"），或麦芽糖结合蛋白（MBP）与C末端六His-标记之间的1μM融合物（"MBP-H6"），或包含十His-标记、zz-标记和小鼠输出蛋白CRM1的0.5μM融合蛋白（"H10-zz-CRM1"），并且用作起始材料用于结合实验。用1mM咪唑补充起始材料用于十-His-标记的蛋白质的纯化。
400μl起始材料各自与10μl色谱法载体在4℃下旋转o/n。在用5ml缓冲液洗涤后，用0.4M咪唑pH7.5洗脱结合的蛋白。分析是通过在12％丙烯酰胺凝胶上的SDS-PAGE，随后通过考马斯-染色进行的。载量对应于0.5μl基质。
图2显示关于NES-YFP-H10（小图A）、MBP-H6（小图B）和H10-ZZ-CRM1（小图C）的结果。所有测试的基质显示His-标记的蛋白质的有效结合。然而，与NTA-Qiagen基质对比，本发明的基质显示显著更低的本底。
实施例6：各种螯合剂和过渡金属离子用于IMAC的测试
具有5％偶联密度的氨基-硅胶（如实施例4中描述的）与EDTA、EGTA、NTA或TTHA缀合。所得到的基质各自随后加载Ni2+、Co2+、Zn2+或Cu2+。如实施例5中所述实施关于NES-YFP-H10的结合测定法，然而，在洗涤缓冲液中包括100mMNaCl。
图3显示基质和金属离子的测试组合显示NES-YFP-H10的有效结合。
实施例7：Ni-螯合物基质针对通过游离螯合剂提取Ni2+的抗性。
用30mlTris-缓冲液、或10mMEDTApH7.6、或10mMEGTApH7.6、或40mMNTApH7.6经45分钟的时间洗涤各1mlNi2+-EDTA-酰胺硅胶（50％偶联密度；根据实施例4制备）、Ni2+-NTA-酰胺硅胶（50％偶联密度）或Ni2+-NTA-琼脂糖（Qiagen），随后在结合缓冲液（50mMTris/HClpH7.5、500mMNaCl、5mMMgCl2）中平衡。10μl各自预处理的基质随后用于结合出自600μl大肠杆菌溶解产物中的His10-MBP-GFP融合物（10μM浓度）。用75μl的1M咪唑/HClpH7.5洗脱结合的级份。随后通过SDS-PAGE分析1μl每种洗脱物，随后为考马斯-染色。结果显示于图4A中。本发明的Ni2+-EDTA-酰胺硅胶基质针对所有测试的螯合剂溶液完全有抗性。对比基质是显著较小抗性的。Ni2+-NTA-琼脂糖被任何螯合剂处理卸载。Ni2+-NTA-酰胺硅胶基质被10mMEDTA和40mMNTA完全卸载，但在用EGTA处理后保留少量活性。
在100mMTris/HClpH7.5中平衡来自图4A中显示的小图的经螯合剂洗涤的基质，与等体积的1％二甲基乙二肟（在乙醇中溶解）混合，并且在获取照片前，在60℃温育15分钟，并且随后o/n在室温下。结果显示于图4B中。未处理的Ni2+-NTA-酰胺硅胶和未处理的Ni2 +-NTA琼脂糖出现代表松散结合的Ni2+的粉红色二甲基乙二肟-Ni2+沉淀物，但本发明的Ni2 +-EDTA-酰胺硅胶未出现。用上述螯合剂预洗涤Ni2+-NTA-酰胺硅胶或Ni2+-NTA琼脂糖去除松散结合的Ni2+的程度相同于结合组氨酸标记的蛋白质的能力的减少。
因此，与对比NTA基质对比，Ni2+离子与本发明的EDTA-酰胺基质的结合显著更强。
实施例8：Ni-螯合剂基质针对含硫醇还原剂的抗性。
测试了各种含Ni2+螯合剂基质针对二硫苏糖醇（DTT），含硫醇还原剂的抗性。
NTA-琼脂糖（Qiagen）、NTA-酰胺硅胶和EDTA-酰胺硅胶未处理或在室温下用1MDTT温育o/n，用1MTris/HClpH7.5缓冲。结果显示于图5A中。DTT处理使来自NTA-琼脂糖（Qiagen）和NTA-酰胺硅胶的Ni2+转化成呈褐色的反应产物。相比之下，Ni2+EDTA-酰胺硅胶保持完全不受影响。
使上述基质（≈50μl）重悬浮于1ml1MTris/HClpH7.5或1MTris/HClpH7.5+1MDTT中。5分钟后，加入His10-标记的红色荧光蛋白，并且使该结合反应在室温下旋转o/n。通过重力允许基质沉降，并且获取照片。结果显示于图5B（上图）中。在珠上的红色指示his-标记的蛋白质的结合。在不存在DTT的情况下，所有基质非常良好地结合his-标记的蛋白质。DTT-处理完全取消与Ni2+NTA琼脂糖（Qiagen）和Ni2+NTA-酰胺硅胶的结合。未结合的级份包含从珠中释放的Ni2+的呈褐色的反应产物。相比之下，His-标记的红色荧光蛋白与本发明的Ni2+EDTA酰胺硅胶的结合通过DTT处理保持不受影响。
用1M咪唑pH7.3洗脱结合的级份，并且通过SDS-PAGE随后考马斯染色进行分析。结果显示于图5B（下图）中。分析证实1MDTT完全取消his标记的蛋白质与Ni2+NTA-琼脂糖或Ni2+NTA-酰胺硅胶的结合，同时与本发明的Ni2+EDTA-酰胺硅胶的结合完全不受影响。
实施例9：间隔的多组氨酸标记的表征
用各种组氨酸标记进行标记的DHFR衍生物的混合物与Ni2+EDTA酰胺硅胶结合，并且用增加咪唑浓度的梯度缓慢洗脱。结果显示于图6A中。（实际浓度在泳道上给出）。小图显示通过SDS-PAGE/考马斯染色的洗脱级份分析。具有较大数目的组氨酸的标记赋予与基质的更紧密的结合，在较高咪唑浓度下的洗脱，并且因此与并非多组氨酸标记的污染物的更好地分离。使用了下述标记（氨基酸以单字母编码）：
尽管具有较多组氨酸的His-标记赋予与Ni-螯合物基质的更特异性结合，但它们具有太多组氨酸的连续串妥协了在大肠杆菌中的表达水平和溶解性的问题。用含Gly、Ser和/或Thre间隔物中断连续多组氨酸串纠正了这些问题。在显示的代表性实施例中，与常规、连续His10标记对比，用间隔His14标记来标记DHFR使在大肠杆菌中的重组表达过程中的可溶性蛋白质产率加倍（图6B）。
本发明涉及以下内容：
1.具有6个或更多配位基团的固定螯合剂用于固定金属离子色谱法（IMAC）的用途。
2.项目1的用途，其中所述固定螯合剂是具有6个或更多配位基团的多羧酸酰胺或酯，所述配位基团特别选自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸盐基团。
3.项目1或2的用途，其中所述固定螯合剂是具有式（Ia）或（Ib）结构的具有被固定的多羧酸的固相：
其中SP是固相；
R1是不干扰所述固相应用的氢或有机残基和
PCA是多羧酸特别是氨基多羧酸残基，或其盐。
4.项目2或3的用途，其中所述多羧酸选自乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）、二乙烯三胺五乙酸（DPTA）和三乙烯四胺-N,N,N',N',N'',N''-六乙酸（TTHA），特别选自EDTA或其盐。
5.项目3或4的用途，其中所述固相具有式（II）结构：
其中SP是固相，和
其中一个或多个所述羧酸基团可以是去质子化的。
6.项目1-5中任一项的用途，其中所述螯合剂与金属离子例如过渡金属离子如Ni2+离子络合。
7.用于使具有6个或更多配位基团的多羧酸与固相结合的方法，其包括步骤：
（a）提供多羧酸和包括氨基基团的固相，
（b）在缩合剂的存在下使所述氨基基团与所述多羧酸反应，其中所述缩合剂以超过所述氨基基团的摩尔过量存在，并且所述多羧酸以超过所述缩合剂和氨基基团的摩尔过量存在，并且其中所述多羧酸的单个羧基与所述氨基基团反应。
8.项目7的方法，其中所述多羧酸是氨基多羧酸，特别选自乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇-双（2-氨基乙醚）-N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）、二乙烯三胺五乙酸（DPTA）和三乙烯四胺-N,N,N',N',N'',N''-六乙酸（TTHA）。
9.项目7-8中任一项的方法，其中所述固相是氨基官能化的色谱法载体，特别选自氨基官能化碳水化合物，例如琼脂糖、琼脂糖凝胶或纤维素，金属或半金属例如硅，或金属氧化物或半金属氧化物例如硅胶、玻璃、塑料例如聚苯乙烯，或脂质例如磷脂。
10.项目7-9中任一项的方法，其中所述固相包括颗粒，例如囊泡、磁珠、量子点、蛋白质或具有多个伯胺或仲胺基团的分子。
11.项目7-10中任一项的方法，其中在所述固相上的所述氨基是伯胺或仲胺基团，例如脂族伯胺基团。
12.项目7-11中任一项的方法，其中所述缩合剂选自碳化二亚胺，例如1-乙基-3-（3-二甲氨丙基）碳化二亚胺（EDC）或N,N'-二环己基碳化二亚胺（DCC）。
13.项目7-12中任一项的方法，其中所述缩合剂超过所述氨基基团的摩尔过量是至少2倍、优选至少4倍，和/或所述多羧酸超过所述氨基基团的摩尔过量是至少5倍、优选至少25倍。
14.具有式（Ia）或（Ib）结构的固相，其具有被固定的多羧酸：
其中SP是固相；
R1是不干扰固相应用的氢或有机残基，和
PCA是多羧酸特别是氨基多羧酸残基，或其盐，
其中所述固定的多羧酸酰胺或酯具有至少6个或更多配位基团，所述配位基团特别选自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸盐基团，
并且其中所述固相的表面优选基本上不含可触及的氨基和/或羟基基团，其中所述固相表面上例如≥90％、优选≥95％和更优选≥99％的可触及的氨基和/或羟基基团被阻断。
15.项目14的固相，其中PCA是EDTA的残基或其盐。
16.项目14或15的固相，其具有式（II）结构：
其中SP是固相，并且一个或多个所述羧酸基团可以是去质子化的。
17.项目14-16中任一项的固相，其中所述多羧酸残基与金属离子例如过渡金属离子如Ni2+离子络合，并且其中优选已去除基本上所有松散结合的金属离子。
18.项目17的固相，其在含硫醇或二硫醇的还原剂的存在下是稳定的。
19.纯化重组多肽的方法，其包括步骤：
（a）提供包括具有多个组氨酸残基的多肽的样品，
（b）使所述样品与项目14-17中任一项的固相接触，所述固相包含预先结合的络合金属离子例如Ni2+离子，条件是其中所述重组多肽与所述固相选择性结合，
（c）使所述结合的重组多肽与其他样品组分分离，和
（d）从所述固相中洗脱所述重组多肽。
20.项目18的方法，其中所述多肽包括至少6个连续组氨酸残基。
21.项目18的方法，其中所述多肽包括在序列[HnSm]k中的至少4个组氨酸残基，其中H是组氨酸残基，并且S是选自甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的间隔物氨基酸残基，n在每种情况下独立地是1-4，m在每种情况下独立地是1-6，并且k是2-6。
22.重组多肽，其包括在序列[HnSm]k中的至少4个组氨酸残基，其中H是组氨酸残基，并且S是选自甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的间隔物氨基酸残基，n在每种情况下独立地是1-4，m在每种情况下独立地是1-6，并且k是2-8。
23.项目21的多肽，其中所述多组氨酸序列在所述标记蛋白质的N和/或C末端处，或插入所述标记蛋白质的序列内。

Claims (17)

1.具有6个或更多配位基团的固定螯合剂用于固定金属离子色谱法(IMAC)的用途，其中所述固定螯合剂是具有式(Ib)结构的具有被固定的多羧酸的固相：
其中SP是固相；和
PCA是选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)和三乙烯四胺-N,N,N',N',N”,N”-六乙酸(TTHA)的多羧酸残基，或其盐。
2.权利要求1的用途，其中所述固定螯合剂是具有6个或更多配位基团的多羧酸酯，所述配位基团选自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸盐基团。
3.权利要求1或2的用途，其中所述多羧酸是EDTA或其盐。
4.权利要求1或2的用途，其中所述螯合剂与金属离子络合。
5.权利要求1或2的用途，其中所述螯合剂与过渡金属离子络合。
6.权利要求1或2的用途，其中所述螯合剂与Ni2+离子络合。
7.具有式(Ib)结构的固相，其具有被固定的多羧酸：
其中SP是固相；和
PCA是选自乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇-双(2-氨基乙醚)-N,N,N',N'-四乙酸(EGTA)、二乙烯三胺五乙酸(DPTA)和三乙烯四胺-N,N,N',N',N”,N”-六乙酸(TTHA)的多羧酸残基，或其盐，
其中固定的多羧酸酯具有至少6个或更多配位基团，所述配位基团选自氨基、羧基、甲酰胺和氧肟酸盐基团，
并且其中所述固相的表面基本上不含可触及的氨基和/或羟基基团，其中所述固相表面上≥90％的可触及的氨基和/或羟基基团被阻断。
8.权利要求7所述的固相，其中所述固相表面上≥95％的可触及的氨基和/或羟基基团被阻断。
9.权利要求7所述的固相，其中所述固相表面上≥99％的可触及的氨基和/或羟基基团被阻断。
10.权利要求7的固相，其中PCA是EDTA的残基或其盐。
11.权利要求7-10任一项的固相，其中所述多羧酸残基与金属离子络合，并且其中已去除基本上所有松散结合的金属离子。
12.权利要求11的固相，其中所述多羧酸残基与过渡金属离子络合。
13.权利要求11的固相，其中所述多羧酸残基与Ni2+离子络合。
14.纯化重组多肽的方法，其包括步骤：
(a)提供包括具有多个组氨酸残基的多肽的样品，
(b)使所述样品与权利要求7-13中任一项的固相接触，所述固相包含预先结合的络合金属离子，条件是其中所述重组多肽与所述固相选择性结合，
(c)使所述结合的重组多肽与其他样品组分分离，和
(d)从所述固相中洗脱所述重组多肽。
15.权利要求14的方法，其中所述金属离子是Ni2+离子。
16.权利要求14的方法，其中所述多肽包括至少6个连续组氨酸残基。
17.权利要求14的方法，其中所述多肽包括在序列[HnSm]k中的至少4个组氨酸残基，其中H是组氨酸残基，并且S是选自甘氨酸和/或丝氨酸和/或苏氨酸的间隔物氨基酸残基，n在每种情况下独立地是1-4，m在每种情况下独立地是1-6，并且k是2-6。
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