ES2832541T3

ES2832541T3 - Uso de un quelante inmovilizado para la purificación de polipéptidos recombinantes mediante cromatografía de iones metálicos inmovilizados

Info

Publication number: ES2832541T3
Application number: ES14173856T
Authority: ES
Inventors: Steffen Frey; Dirk Görlich
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 2007-08-06
Filing date: 2008-08-06
Publication date: 2021-06-10
Anticipated expiration: 2028-08-06
Also published as: EP2826555B1; CA2695586C; EP2183049B2; JP5629208B2; US20150283536A1; CN101808731A; US9675960B2; CA2934502A1; EP2183049B1; US10538552B2; HK1190978A1; CN103586092B; JP6063907B2; HK1142843A1; US20110071274A1; US9073971B2; WO2009019012A2; CA2934502C; ES2524786T5; CN103586092A

Abstract

Uso de un quelante inmovilizado que tiene 6 o más grupos de coordinación en cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para la purificación de polipéptidos recombinantes que comprenden marcas de polihistidina, en el que el quelante inmovilizado es una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado en la misma que tiene una estructura de fórmula (lb): **(Ver fórmula)** en la que SP es una fase sólida; PCA es el residuo de un ácido policarboxílico, en particular de un ácido aminopolicarboxílico, o una sal del mismo, y en la que el quelante forma un complejo con un ion metálico, por ejemplo un ion de metal de transición, tal como un ion Ni2+.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de un quelante inmovilizado para la purificación de polipéptidos recombinantes mediante cromatografía de iones metálicos inmovilizados

La presente invención se refiere al uso de una fase sólida que presenta un ácido policarboxílico inmovilizado en la misma en la purificación de polipéptidos recombinantes.

Una estrategia muy poderosa para purificar proteínas recombinantes es el uso de una «marca de His», que comprende típicamente de 6 a 10 histidinas consecutivas. Las marcas de His se unen fuertemente a los sitios de coordinación libres de iones Ni2+. Se pueden desprender mediante una alta concentración de imidazol, que compite por los sitios de coordinación del Ni2+. Dicho ciclo de absorción y desorción específicas se puede utilizar para la purificación de una proteína deseada en una sola etapa, lo que da como resultado factores de enriquecimiento de 100 o incluso más.

La variante más ampliamente usada de esta técnica utiliza N^aN^a-bis(carboximetil)-lisina acoplada a microesferas de agarosa a través del grupo £-amino. El grupo activo es NTA (ácido nitrilotriacético) cargado con Ni2+, mientras que el espaciador es un grupo aminobutilo. Sin embargo, dicha matriz de Ni2+-NTA tiene una serie de desventajas importantes, tales como los altos costes de la N^aN^a-bis(carboximetil)-lisina.

Una desventaja adicional es la inestabilidad de los iones Ni2+ inmovilizados. Debido a que el NTA tiene solo 4 sitios de coordinación para Ni2+, los iones Ni2+ se escapan fácilmente de la matriz y contaminan las muestras de proteínas. Es un problema grave por al menos dos razones: el Ni2+ es un metal pesado bastante tóxico y cataliza la oxidación no deseada de la muestra de proteínas. Además, el Ni2+ unido a NTA se reduce fácilmente mediante agentes protectores de proteínas, tales como DTT (ditiotreitol) y, a continuación, se desprende de la matriz. Finalmente, los inhibidores de proteasas quelantes de metales, tales como EGTA o EDTA, no se pueden combinar con una matriz de Ni2+-NTA porque extraen los iones Ni2+ de esta matriz.

El documento US 6.670.159 describe un procedimiento para la preparación de conjugados de quelatos metálicos basados en NTA, en el que el NTA o una sal del mismo se hace reaccionar con una molécula proteínica que contiene un grupo amino primario, en un medio acuoso a un pH alcalino de al menos 8 y en presencia de carbodiimida.

El documento WO 2004/036189 divulga un procedimiento de separación de polipéptidos usando un soporte modificado con quelato metálico. Este soporte comprende NTA unido a una fase sólida modificada con amino a través de un grupo carboxamido.

El documento GB 2067203 divulga agentes quelantes poliméricos que comprenden un soporte al que está unida una mezcla de amidas de EDTA unidas por medio de un solo grupo carboxamido o por medio de dos grupos carboxamido. El uso de este soporte para la purificación de polipéptidos no se divulga ni se sugiere.

El documento US 2004/204569 divulga una proteína marcada con His que comprende una marca (His-Asn)6.

El documento US 2002/164718 divulga péptidos de afinidad para cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) que comprenden una marca de His espaciada con una secuencia de aminoácidos que consiste en His, dos aminoácidos alifáticos o amido, His, tres aminoácidos básicos o ácidos, His y un aminoácido alifático o amido.

GOVENDER S ET AL: "A Pluronic-coupled metal-chelating ligand for membrane affinity chromatography", JOURNAL OF MEMBRANE SCIENCE, ELSEVIER, vol. 279, n.° 1-2, 6 enero de 2006 (2006-01-06), páginas 120-128, XP024931496 divulga un quelante de EDTA inmovilizado en un grupo hidroxi terminal de un copolímero tribloque Pluronic de poli(óxido de etileno)-poli(óxido de propileno)-poli(óxido de etileno) a través de uno de los grupos ácido carboxílico del EDTA por medio de un enlace éster sencillo, esterificándose un segundo grupo carboxílico del EDTA con metanol. Una membrana de fluoruro de polivinilideno se recubre con el polímero Pluronic modificado. Dicha membrana modificada se utiliza en la cromatografía de iones metálicos inmovilizados para la purificación de proteínas recombinantes marcadas con polihistidina.

El documento US 2005/0272116 divulga un procedimiento para purificar proteínas recombinantes marcadas con histidina usando un sustrato polimérico fibroso tratado con un precursor de agente quelante que incluye dianhídrido de EDTA. Este precursor de agente quelante se une al sustrato por medio de dos enlaces éster. El ligando quelante obtenido tiene cuatro grupos quelantes y está complejado con un ion de metal de transición tal como Ni2+. El objetivo de acuerdo con la presente invención se refiere al uso de composiciones adecuadas para cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para evitar los problemas asociados con la técnica anterior.

Sorprendentemente, se ha encontrado que una fase sólida basada en EDTA y complejada con Ni2+, en particular una fase sólida en la que un grupo carboxilo del EDTA está unido a grupos hidroxilo de la fase sólida, tiene excelentes propiedades en aplicaciones de cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC), en particular para la purificación de polipéptidos recombinantes que comprenden marcas de polihistidina. Este hallazgo fue completamente inesperado: de acuerdo con la bibliografía existente, una fase sólida basada en EDTA no debería ser adecuada para la cromatografía con quelato de níquel, porque este quelante hexadentado debería ocupar los seis sitios de coordinación del Ni2+ y, supuestamente, no dejar ninguno para la unión de un residuo de histidina. Al contrario de lo esperado, se ha encontrado que una fase sólida basada en EDTA no solo presenta una unión estable de iones de metales de transición, en particular de iones Ni2+, sino también que los complejos resultantes con Ni2+, Zn2+, Co2+ o Cu2+ tienen una alta selectividad por proteínas marcadas con histidina. La presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas.

La presente invención se refiere al uso de un quelante inmovilizado que tiene seis o más grupos de coordinación en cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para la purificación de polipéptidos recombinantes marcados con polihistidina.

En el uso de la presente invención, el quelante inmovilizado es una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado en la misma que tiene una estructura de fórmula (Ib):

O SP —-O JipC A (Ib)

en la que SP es una fase sólida;

PCA es el residuo de un ácido policarboxílico, en particular de un ácido aminopolicarboxílico, o una sal del mismo.

El ácido policarboxílico unido a la fase sólida (lb) forma un complejo con un ion metálico, por ejemplo un ion de metal de transición, tal como un ion Ni2+.

Preferentemente, el quelante inmovilizado para el uso de la presente invención es un éster de ácido policarboxílico que tiene seis o más grupos de coordinación, que se seleccionan en particular de grupos amino, carboxilo, carboxamido e hidroxamato. Para el uso de la presente invención, el ácido policarboxílico se selecciona preferentemente de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N-tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA) y ácido trietilentetramino-N,N,N',N',N",N"-hexaacético (TTHA), en particular de EDTA o sales del mismo.

En el presente documento también se divulga un procedimiento para unir un ácido policarboxílico que tiene 6 o más grupos de coordinación a una fase sólida, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un ácido policarboxílico y una fase sólida que comprende grupos amino, (b) hacer reaccionar los grupos amino con el ácido policarboxílico en presencia de un agente de condensación, en el que el agente de condensación está presente en un exceso molar con respecto a los grupos amino y el ácido policarboxílico está presente en un exceso molar con respecto al agente de condensación y los grupos amino, y en el que un solo grupo carboxilo del ácido policarboxílico reacciona con los grupos amino.

También se divulga una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado en la misma que tiene una estructura de fórmula (Ia) o (Ib):

0

SP —N-KfCA (la)

1

R1

O SP — Q-U-PCA (Ib)

en la que SP es una fase sólida;

R1 es hidrógeno o un residuo orgánico que no interfiere con la aplicación de la fase sólida, por ejemplo un radical alquilo C¹-C³,

PCA es el residuo de un ácido policarboxílico, en particular de un ácido aminopolicarboxílico, o una sal del mismo,

en la que la amida o el éster del ácido policarboxílico inmovilizado tiene al menos 6 o más grupos de coordinación que se seleccionan en particular de grupos amino, carboxilo, carboxamido e hidroxamato,

y en la que la superficie de la fase sólida preferentemente carece sustancialmente de grupos amino accesibles, en la que, por ejemplo, >90 %, preferentemente >95 % y más preferentemente >99 % de los grupos amino accesibles en la superficie de la fase sólida están bloqueados.

El grupo carboxamido -NR1-CO- se une directamente a la fase sólida. El grupo carboxamido se puede unir a la fase sólida por medio de un conector, que puede tener una longitud de 1 átomo hasta 20 átomos, preferentemente 2-12 átomos, por ejemplo 2-6 átomos, que se pueden seleccionar de átomos de carbono y opcionalmente heteroátomos tales como O y/o N.

Además, en el presente documento se divulga un procedimiento para purificar un polipéptido recombinante, que comprende las etapas de: (a) proporcionar una muestra que comprende un polipéptido con una pluralidad de residuos de histidina, por ejemplo una pluralidad de residuos de histidina consecutivos, (b) poner en contacto la muestra con una fase sólida como se describe anteriormente que contiene un ion metálico complejante unido previamente, por ejemplo un ion Ni2+, en condiciones en las que el polipéptido recombinante se une selectivamente a la fase sólida, (c) separar el polipéptido recombinante unido de otros componentes de la muestra y (d) eluir el polipéptido recombinante de la fase sólida.

También se divulga en el presente documento un polipéptido recombinante que comprende una «marca de histidina espaciada» con al menos 4 residuos de histidina en una secuencia [HnSm]k, en la que H es histidina, S es un residuo de aminoácido diferente de histidina seleccionado de glicina y/o serina y/o treonina, n es en cada caso independientemente 1-4, m es en cada caso independientemente 1-6 y k es 2-6, preferentemente 2-5. La marca de histidina espaciada puede tener una secuencia regular, es decir, n y m tienen en cada caso el mismo valor, o una secuencia irregular, es decir, n y m pueden tener valores diferentes. Un mayor número de histidinas dentro de una marca de polihistidina puede incrementar la fuerza de unión y la especificidad por una matriz con quelato de Ni2+. Sin embargo, demasiadas histidinas consecutivas pueden reducir los niveles de expresión y la solubilidad de las proteínas recombinantes, por ejemplo de proteínas expresadas de forma recombinante en E. coli. Estos problemas se pueden superar interrumpiendo los ciclos continuos de histidinas con espaciadores cortos que comprenden glicina, serina y/o treonina, es decir, con una marca de histidina espaciada. Las proteínas recombinantes, tales como los receptores de transporte nuclear o la dihidrofolato reductasa (DHFR), muestran una mayor expresión y una mejor solubilidad durante la expresión en Escherichia coli cuando se marcan con una marca de histidina espaciada en comparación con una marca de oligohistidina convencional.

En el presente documento se divulga un procedimiento para unir un ácido policarboxílico a una fase sólida. El ácido policarboxílico tiene 6 o más, por ejemplo, 6, 7 u 8 grupos de coordinación. Preferentemente, el ácido policarboxílico tiene 4, 5 o más grupos ácido carboxílico. El ácido policarboxílico puede ser un ácido amino-, nitrilo- o éterpolicarboxílico, en el que son preferentes los ácidos aminopolicarboxílicos, en particular los ácidos aminopolicarboxílicos con grupos amino terciarios. Ejemplos específicos de ácidos policarboxílicos son ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA) y ácido trietilentetramino-N,N,N',N',N",N"-hexaacético (TTHA). Es especialmente preferente el EDTA.

No de acuerdo con la invención, el ácido policarboxílico se une a una fase sólida que comprende grupos amino primarios o secundarios. La unión se lleva a cabo en condiciones que permitan la unión selectiva de un solo grupo carboxilo del ácido policarboxílico a la fase sólida sin necesidad de aislar una forma activada o derivatizada del ácido policarboxílico, tal como un anhídrido, un éster activo o una forma en la que un grupo amino primario o secundario del ácido policarboxílico se ha mantenido accesible para una etapa de acoplamiento posterior. Por medio de la reacción entre el grupo carboxilo y los grupos amino, se forma un enlace carboxamida. La fase sólida puede ser, por ejemplo, un soporte cromatográfico aminofuncionalizado. Por ejemplo, la fase sólida se puede seleccionar de carbohidratos aminofuncionalizados tales como agarosa, sefarosa o celulosa, metales o semimetales tales como silicio u óxidos del mismo tal como sílice, vidrio, plásticos tales como poliestireno, o lípidos tales como fosfolípidos que contienen fosfatidiletanolamina o fosfatidilserina. Además, la fase sólida puede comprender partículas, por ejemplo vesículas, microesferas magnéticas, puntos cuánticos, vesículas o proteínas. Los grupos amino de la fase sólida son preferentemente grupos amino primarios o secundarios, por ejemplo grupos amino primarios alifáticos.

La aminofuncionalización de la fase sólida se puede llevar a cabo mediante procedimientos conocidos, por ejemplo haciendo reaccionar un silano que contiene un grupo amino, tal como aminopropiltrietoxisilano, con una fase sólida tal como sílice o vidrio, o haciendo reaccionar amoniaco con una fase sólida activada con epoxi. Preferentemente, la aminofuncionalización de sílice o vidrio se lleva a cabo con aminopropiltrimetoxisilano o aminopropiltrietoxisilano. Los carbohidratos, tales como agarosa, sefarosa o celulosa, preferentemente se activan primero con epoxi, por ejemplo con epiclorhidrina o epibromhidrina, para proporcionar matrices activadas con epoxi y, a continuación, se tratan con un exceso de amoniaco, una amina primaria o una hidroxilamina para proporcionar matrices modificadas con amino.

La densidad de grupos amino en la fase sólida se puede variar mediante las condiciones de reacción de la aminofuncionalización, por ejemplo temperatura, duración y/o concentración de los reactantes. Por ejemplo, el agente de aminofuncionalización se puede diluir con un agente de pasivación, por ejemplo un silano que contenga un grupo no amino, para reducir, si fuese necesario, la densidad de grupos amino en la superficie. El reactante que contiene grupos amino se puede diluir a una concentración de, por ejemplo, 1-50 % con un agente de pasivación, preferentemente con el producto de reacción entre glicidiloxipropiltrimetoxisilano y 3-mercapto-1,2-propanodiol. De forma alternativa, la densidad de grupos amino se puede incrementar usando agentes di- o polifuncionales que contengan 2 o más grupos amino primarios o secundarios, tales como 1,13-diamino-4,7,10-trioxatridexano. De este modo, se puede incrementar la afinidad de la matriz por las proteínas marcadas con His. Por tanto, se pueden elegir las condiciones de reacción para obtener un producto final con las características deseadas, por ejemplo de modo que las proteínas marcadas con His se unan específicamente al producto final, mientras que la unión de fondo de otras proteínas sea mínima. La densidad óptima de grupos amino se puede determinar empíricamente para cada soporte sólido de acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos.

Por ejemplo, la purificación de proteínas con una marca de histidina larga, por ejemplo con >10 residuos de histidina, se lleva a cabo preferentemente con una superficie que tiene una densidad menor de grupos amida de ácido policarboxílico complejados con Ni2+ que la purificación de proteínas que tienen una marca de 6 residuos de histidina. A la inversa, la purificación en condiciones desnaturalizantes, por ejemplo en presencia de cloruro de guanidinio, se lleva a cabo preferentemente con una mayor densidad de grupos quelantes que una purificación en condiciones naturales.

En la siguiente etapa se lleva a cabo una reacción de condensación entre un grupo carboxilo del ácido policarboxílico y un grupo amino en la superficie. La figura 1 muestra una representación esquemática de esta reacción ejemplificada con EDTA como ácido policarboxílico.

La reacción se lleva a cabo en presencia de un agente de condensación, que se puede seleccionar de carbodiimidas, carbonatos tales como di(N-succinimidil)carbonato, tetrafluoroborato de O-(N-succinimidil)-N,N,N',N'-tetrametiluronio o compuestos análogos. Son preferentes las carbodiimidas tales como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDO) o N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC). Se han encontrado condiciones de reacción en las que un solo grupo carboxilo del ácido policarboxílico reacciona con los grupos amino de la fase sólida cuando el ácido policarboxílico está presente en un exceso molar suficiente con respecto a los grupos amino y/o al agente de condensación. En un modo de realización preferente, para obtener una matriz altamente específica para IMAC, se seleccionan unas condiciones de reacción en las que los grupos amino reaccionan sustancialmente de forma cuantitativa con el ácido policarboxílico. Por lo tanto, se deberá usar un exceso molar de al menos 2 veces, preferentemente un exceso molar de al menos 4 veces, del agente de condensación y un exceso de al menos 5 veces, preferentemente un exceso molar de al menos 10 veces y más preferentemente un exceso molar de al menos 25 veces, del ácido policarboxílico con respecto a los grupos amino (véanse los ejemplos).

La reacción se lleva a cabo preferentemente en fase acuosa. Las condiciones de reacción son preferentemente pH 5 9, más preferentemente pH 7-8,5. El ácido policarboxílico se usa preferentemente cerca del límite de saturación (por ejemplo, 0,5 M para EDTA y 0,1 M para EGTA) y el agente de condensación se usa a 1/10-1/50 de la concentración del ácido policarboxílico.

El producto de reacción es una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado a la misma por medio de un enlace amida de ácido carboxílico estable. Preferentemente, la fase sólida tiene la estructura de fórmula inmovilizada (la) como se indica anteriormente. Preferentemente, el residuo de ácido policarboxílico inmovilizado tiene todavía al menos 3, 4 o más grupos carboxilo y opcionalmente otros grupos quelantes, tales como grupos amino o éter.

Si el ácido policarboxílico es EDTA, la fase sólida puede tener una estructura de fórmula (II):

en la que SP es la fase sólida.

La fase sólida, por ejemplo la fase sólida de amida de EDTA, tiene una alta afinidad por iones metálicos polivalentes, tales como iones de metales de transición, por ejemplo iones Ni2+, Zn2+, Co2+ o Cu2+. Varias combinaciones de estos iones metálicos con quelantes inmovilizados de acuerdo con la presente invención proporcionan matrices altamente selectivas para unir proteínas marcadas con histidina, presentando menos uniones no específicas que el grupo NTA inmovilizado tradicionalmente (véanse las figuras 2 y 3).

La fase sólida carece sustancialmente cuantitativamente de grupos amino accesibles, por ejemplo grupos amino primarios, y/o grupos hidroxi, ya que los grupos amino que no han reaccionado pueden ser la causa de la unión de baja afinidad del Ni2+ y de la alta unión de fondo inespecífica de polipéptidos que no llevan una marca de His. Por tanto, puede ser deseable que >90 %, preferentemente >95 % y más preferentemente >99 % de los grupos amino accesibles, en particular grupos amino primarios en la superficie de la fase sólida, estén bloqueados, por ejemplo por reacción con el ácido policarboxílico mediada por el agente de condensación. La cantidad de grupos accesibles que no han reaccionado, por ejemplo grupos amino primarios, se puede determinar de acuerdo con procedimientos conocidos, por ejemplo mediante una prueba de ninhidrina o una reacción con OPA (orto-ftalaldehído/mercaptano).

Además, la fase sólida, por ejemplo la fase sólida de amida de EDTA, carece sustancialmente de iones metálicos polivalentes débilmente unidos, tales como iones N¡2+. Cuando una matriz de amida de EDTA se satura inicialmente con iones Ni2+, una cantidad significativa de los mismos puede permanecer unida a la misma solo débilmente, en particular cuando el soporte sólido todavía contiene grupos amino sin reaccionar. Esta fracción de Ni2+ débilmente unida se puede detectar con reactivos adecuados, por ejemplo dimetilglioxima. Por ejemplo, después de añadir 0,2-1 volúmenes de dimetilglioxima al 1 % p/v disuelta en etanol a una matriz cargada con Ni2+ en tampón Tris a pH 7,5 y de agitar la mezcla durante 15 minutos a 60 °C, cualquier ion Ni2+ débilmente unido se puede detectar como precipitado rosa. Los iones metálicos débilmente unidos pueden causar problemas, a saber, la contaminación de una muestra que contiene proteínas con iones Ni2+ tóxicos y oxidantes y el incremento de la unión no específica de proteínas sin marca de His.

Por tanto, la fase sólida preferentemente carece sustancialmente de iones metálicos débilmente unidos, en particular de iones de Ni2+ débilmente unidos. Los iones metálicos débilmente unidos se pueden, por ejemplo, eliminar de la fase sólida poniendo en contacto la fase sólida con un quelante de ácido policarboxílico libre, por ejemplo NTA o EGTA o EDTA, preferentemente a aproximadamente pH 7,5, por ejemplo, con NTA 40 mM o EGTA 10 mM o EDTA 10 mM, hasta que los iones metálicos débilmente unidos ya no se puedan detectar, por ejemplo, poniendo en contacto la matriz con un reactivo de detección adecuado para el ion metálico respectivo, por ejemplo dimetilglioxima para la detección de iones Ni2+. Después de la eliminación de los iones metálicos débilmente unidos, los iones restantes permanecen tan fuertemente unidos que incluso una incubación durante la noche a temperatura ambiente con un volumen igual de EDTA 0,5 M (pH 7,5) es insuficiente para que se desprendan por completo de la matriz de amida de EDTA. Por el contrario, cabe destacar que el prelavado de Ni-NTA-agarosa (Qiagen) disponible comercialmente o de una matriz de Ni-amida de NTA con ^{N t A}40 mM o EGTA 10 mM o EDTA 10 mM elimina no solo los iones Ni2+ débilmente unidos sino aparentemente todos los iones Ni2+ unidos (Fig. 4).

Sorprendentemente, no se ha encontrado ninguna indicación de que la conversión de un grupo carboxilo del EDTA en un grupo carboxamida debilite la afinidad por Ni2+ a pH neutro. En cambio, el oxígeno del carbonilo o el grupo amino de la carboxamida pueden aparentemente participar en un enlace coordinado con Ni2+, lo que sugiere que la amida de EDTA es un quelante realmente hexadentado. El hecho de que un grupo carboxamido puede formar un enlace coordinado con Ni2+ resulta evidente, por ejemplo, en el caso de las metil-coenzima M reductasas, donde 4 sitios de coordinación para Ni2+ son proporcionados por la coenzima F430 y el 5° por la carboxamida de una cadena lateral de glutamina (Ermler et al., Science 278 (1997), 1457).

De acuerdo con la invención, la fase sólida se utiliza en cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC). En este procedimiento cromatográfico, los polipéptidos que comprenden una pluralidad de residuos de histidina, por ejemplo residuos de histidina consecutivos, por ejemplo al menos seis residuos de histidina consecutivos, se unen selectivamente a la fase sólida del complejo metálico y se separan de otros componentes. El polipéptido se puede eluir de la fase sólida añadiendo un agente de elución adecuado, tal como imidazol. La concentración de imidazol se encuentra preferentemente en el intervalo de 1 a 1000 mM, dependiendo de la densidad de los grupos activos inmovilizados, la longitud de la marca de polihistidina y el estado multimérico de la proteína marcada.

Hasta ahora se suponía que, para que funcionara la purificación por IMAC de proteínas marcadas con His, el quelante inmovilizado debería ocupar sólo 3-5 de los 6 sitios de coordinación del Ni2+. Por lo tanto, es inesperado que los quelantes hexadentados inmovilizados, tales como la amida de EDTA o la hidroxamida de EDTA, e incluso quelantes con más de 6 grupos de coordinación funcionen extremadamente bien para esta aplicación. Aparentemente, las cadenas laterales de histidina pueden desplazar de forma transitoria grupos de coordinación débil dentro de un quelante dado. Por tanto, el quelante inmovilizado, es decir, la amida de ácido policarboxílico inmovilizada, tiene 6 o más grupos de coordinación, seleccionados en particular de grupos amino, carboxilo, carboxamido e hidroxamato.

En la fase sólida, por ejemplo la amida de EDTA, se pueden formar complejos cinéticamente muy estables, por ejemplo, con Ni2+. Las matrices resultantes son extremadamente resistentes a la extracción de Ni2+, por ejemplo, por EGTA o NTA. Incluso EDTA 0,5 M extrae el Ni2+ solo muy lentamente, es decir, a una escala de tiempo de horas a días. La resistencia a la extracción de Ni2+ se incrementa aún más al incluir imidazol, por ejemplo imidazol 1 mM, en el tampón. Por lo tanto, la IMAC con una fase sólida, por ejemplo una matriz de amida de EDTA, se puede realizar en presencia de un inhibidor de metaloproteasa quelante, por ejemplo EDTA a concentraciones de 1 a 10 mM, por ejemplo 5 mM.

Las matrices con quelato de Ni tradicionales, como la Ni-NTA-agarosa, se reducen fácilmente mediante agentes protectores de proteínas, tales como el ditiotreitol (DTT). Incluso concentraciones de DTT bajas del orden de milimolares extraen níquel en forma de productos de reducción parduzcos. Por el contrario, las matrices de Ni2+-amida de EDTA de las que se había eliminado el Ni2+ débilmente unido no presentan estos problemas. En cambio, en la Ni2+-amida de EDTA-sílice, se pudieron purificar con éxito proteínas marcadas con His en presencia de concentraciones extremadamente altas de DTT, por ejemplo DTT 0,5 M o 1 M (Figura 5), que es una concentración de DTT 100-1000 veces mayor que la utilizada en los esquemas típicos de purificación de proteínas. Por tanto, el ion metálico, por ejemplo el ion Ni2+, que contiene la fase sólida es estable en presencia de un agente reductor que contiene tiol o que contiene ditiol, por ejemplo DTT, a una concentración de al menos 10 mM, preferentemente de al menos 20 mM, más preferentemente de al menos 50 mM e incluso más preferentemente de al menos 100 mM o incluso de al menos 500 mM, y hasta 1000 mM o incluso mayor, preferentemente durante al menos 1 h a temperatura ambiente.

La cromatografía se lleva a cabo con un polipéptido recombinante que comprende una pluralidad de residuos de histidina en una «marca de histidina espaciada», preferentemente en una secuencia [HnSm]k, en la que H es histidina, S es un residuo espaciador seleccionado de glicina y/o serina y/o treonina, n es 1-4, m es 1-6, preferentemente 1-4, y k es 2-8, preferentemente 2-6. La longitud de la marca es preferentemente de 8 a 50 aminoácidos, más preferentemente de 12 a 40 aminoácidos. También se describen en el presente documento marcas de histidina espaciadas irregularmente, en las que las longitudes de las agrupaciones de oligohistidina y las longitudes de las regiones espaciadoras varían dentro de una secuencia de marca dada. La marca de histidina espaciada se localiza preferentemente en el extremo N y/o en el extremo C del polipéptido recombinante y/o se inserta en la secuencia del polipéptido recombinante.

Además, se proporcionan más detalles mediante las siguientes figuras y ejemplos.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Esquema para el acoplamiento de EDTA a un soporte que contiene amina. La reacción se lleva a cabo en condiciones en las que se produce una reacción selectiva entre un solo grupo carboxilo del EDTA y el grupo amino del soporte.

Figuras 2A, 2B, 2C: Comparación de la especificidad de unión a proteínas de diversas matrices cromatográficas que contienen Ni2+ en la IMAC.

Se muestran las características de unión a proteínas de diversas proteínas marcadas con His, a saber, una matriz comparativa (NTA-Qiagen) y tres matrices (amida de EDTA-sílice I, amida de EDTA-sílice II y amida de EDTA-sefarosa) (véase el ejemplo 5 para más detalles).

Figura 3: Combinación de diversos quelantes e iones de metales de transición para IMAC.

Se muestran las propiedades de unión a proteínas de diversas matrices (matrices de EDTA, EGTA y TTHA y una matriz de NTA) con diferentes quelantes en presencia de diversos iones de metales de transición (véase el ejemplo 6 para más detalles).

Figura 4: Resistencia de las matrices con quelato de Ni frente a la extracción de Ni2+ por quelantes libres.

Se muestra la fuerza de la unión de Ni2+ a una matriz de amida de EDTA y a matrices de NTA comparativas (véase el ejemplo 7 para más detalles).

Figura 5: Resistencia de diversas matrices con quelato de Ni frente a agentes reductores que contienen tiol.

Se muestra la resistencia de diversas matrices quelantes que contienen Ni2+ (una matriz de amida de EDTA y matrices de NTA comparativas) frente a la extracción y reducción de Ni2+ en presencia de DTT (véase el ejemplo 8 para más detalles).

Figura 6: Caracterización de marcas de polihistidina espaciadas.

A) Se muestran las características de unión de marcas de poli-His espaciadas (H14 espaciadas, H21 espaciadas y H28 espaciadas) y de marcas de His comparativas (MRGS6 y H10).

B) Se muestra la expresión de proteínas que contienen una marca de His espaciada y una marca de His comparativa (H10) (véase el ejemplo 9 para más detalles).

Ejemplos no de acuerdo con la invención

Ejemplo 1: Preparación de Ni-amida de EDTA-sefarosa 4B

En un embudo de vidrio se prelava 1 litro de sefarosa 4B con 1 litro de NaOH 0,1 M (en agua) y seguidamente 5 veces con un litro de agua pura, se transfiere a un matraz de 5 litros y se llena con agua hasta un volumen de 2 litros. Se añaden 0,8 mol de NaOH, la temperatura se ajusta a 25 °C y seguidamente se añade 1,0 mol de epibromhidrina. A continuación, la mezcla se agita durante 2 horas a 25 °C y se enfría en hielo. La sefarosa activada con epoxi resultante se recupera posteriormente mediante filtración a través de un embudo de vidrio, se lava con agua y se resuspende en NH4Cl 2 M (concentración final en agua, volumen final 2 litros). Se añaden 4 mol de NH³a partir de una solución acuosa al 25 % y la mezcla se agita durante la noche a temperatura ambiente.

La NH²-sefarosa 4B resultante se recupera por filtración, se lava con agua hasta que ya no se pueda detectar NH³libre y se resuspende en EDTA/Na+ 0,5 M a pH 8,0 (concentración final, volumen final 2 litros). A continuación, se añaden 50 mmol de EDC y la mezcla se agita durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto, se añade otra alícuota de 50 mmol de EDC y se deja que la reacción prosiga durante la noche.

La amida de EDTA-sefarosa resultante se recupera por filtración y se lava hasta que la concentración de EDTA libre haya disminuido por debajo de 1 mM. A continuación, la sefarosa se carga con NiCl²20 mM en tampón Tris a pH 7,5, hasta que aparezca Ni2+ libre en la fracción no unida. Los iones Ni2+ libres y débilmente unidos se eliminan a continuación lavando con agua, NTA 10 mM a pH 7,5, agua y finalmente se resuspende en etanol al 30 % imidazol/HCl 10 mM NTA 1 mM a pH 7,5 para su almacenamiento a largo plazo.

Las propiedades de la Ni2+-amida de EDTA-sefarosa se pueden ajustar variando la etapa de activación con epoxi. El acoplamiento a una temperatura más alta (hasta 40 °C) y el uso de concentraciones mayores de epiclorhidrina y NaOH (hasta epiclorhidrina 1,2 M y NaOH 1,0 M, respectivamente) dará como resultado una mayor densidad de acoplamiento, pero también una mayor unión de fondo. Una temperatura más baja (hasta 18 °C) usando una concentración menor de epiclorhidrina y NaOH (hasta epiclorhidrina 0,2 M y NaOH 0,1 M, respectivamente) dará como resultado una menor densidad de acoplamiento y una unión de fondo aún menor, pero también una capacidad de unión específica menor, en particular para proteínas con marcas de His cortas.

Ejemplo 2: Preparación de microesferas magnéticas con amida de EDTA.

Se lavan 5 ml de microesferas magnéticas terminadas en amina (Sigma n.° 17643-5 ml) en agua y se resuspenden en un volumen final de 5 ml en EDTA/Na+ 0,5 M a pH 8,0. Se añade una alícuota de125 pmol de EDC y la reacción se agita durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de esto, se añade otra alícuota de 125 pmol de EDC y la reacción continúa durante la noche.

Las microesferas magnéticas con amida de EDTA resultantes se recuperan mediante separación magnética, se lavan con agua y se cargan con Ni2+ u otro ion metálico de forma análoga al ejemplo 1.

Ejemplo 3: Preparación de amida de EDTA-sílice de alta densidad

Se resuspenden 100 g de Davisil XWP1000Á 90-130 (Grace) en 500 ml de 3 % (v/v) de aminopropiltrietoxisilano, 4 % de agua, 93 % de etanol y se agitan suavemente durante 2 horas a 40 °C y, a continuación, durante la noche a temperatura ambiente. La sílice modificada con amino se recupera por filtración y el silano libre se elimina lavando con agua pura. El acoplamiento covalente a EDTA y la carga con Ni2+ se realizan como se describe para sefarosa 4B. Para el almacenamiento a largo plazo, el producto se puede secar para eliminar el agua o isopropanol.

Ejemplo 4: Preparación de amida de EDTA-sílice con una superficie pasivada

La Ni2+-amida de EDTA-sílice del ejemplo 3 todavía adolece de una intensa unión de fondo cuando se usa en la IMAC. Esta unión de fondo probablemente sea el resultado de los grupos amino y silanol residuales (que, por motivos estéricos, no pudieron reaccionar con el EDTA activado) y/o a las altas concentraciones superficiales de amida de EDTA. El problema del fondo se puede resolver incluyendo un silano pasivante durante la modificación de la sílice con aminopropilsilano. El mejor silano pasivante hasta la fecha es el producto de reacción entre glicidiloxipropiltrimetoxisilano y 3-mercapto-1,2-propanodiol.

Se mezclan 3 ml de glicidiloxipropiltrimetoxisilano con 3 ml de 2-mercapto-1,3-propanodiol, 90 ml de metanol, 4 ml de agua y 10 pl de 4-metilmorfolina y se deja que la reacción transcurra durante 30 minutos a 25 °C. Se añaden 150 pl de aminopropiltrimetoxisilano y la mezcla resultante se usa para modificar 30 g de Davisil XWP1000A 90-130 como se describe anteriormente. La proporción entre el aminosilano y el silano pasivante se define en este ejemplo como un 5 %. Sin embargo, puede variar entre un 1 % y un 50 %. La amino-sílice pasivada resultante se hace reaccionar a continuación con EDTA u otro grupo quelante, se carga con iones metálicos y se trata para eliminar los iones metálicos débilmente unidos como se describe anteriormente.

Ejemplo 5: Comparación de soportes cromatográficos que contienen Ni2+ en la IMAC

Se sometieron a prueba los siguientes soportes cromatográficos:

Se resuspendieron células de E. coli en tampón (Tris/HCl 50 mM pH 7,5, acetato de magnesio 2 mM, NaCl 50 mM, mercaptoetanol 5 mM). Se preparó un lisado y se separó mediante ultracentrifugación. A continuación, se añadió 1 pM de una proteína de fusión ("NES-YFP-H¹⁰") que comprendía una señal de exportación nuclear (NES), la proteína fluorescente amarilla (YFP) y una marca de deca-His C terminal, o 1 pM de una fusión entre la proteína de unión a maltosa (MBP) y una marca de hexa-His C terminal ("MBP-H6") o 0,5 pM de una proteína de fusión que contenía una marca de deca-His, una marca zz y la exportina CRM1 de ratón ("Hi0-zz-CRM1") y se usaron como materiales de partida para los experimentos de unión. Para la purificación de las proteínas marcadas con deca-His, los materiales de partida se complementaron con imidazol 1 mM.

Se mezclaron durante la noche a 4 °C 400 pl de cada material de partida con 10 pl de soporte cromatográfico. Después de lavar con 5 ml de tampón, las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 0,4 M, pH 7,5. El análisis se realizó mediante SDS-PAGE en gel de acrilamida al 12 %, seguido de tinción con Coomassie. La carga corresponde a 0,5 pl de matriz.

La figura 2 muestra los resultados para NES-YFP-H¹⁰(panel A), MBP-H6 (panel B) y H¹⁰-ZZ-CRM¹(panel C). Todas las matrices sometidas a prueba presentan una unión eficaz de proteínas marcadas con His. Sin embargo, las matrices de la presente invención muestran fondos significativamente menores en comparación con la matriz NTA-Qiagen.

Ejemplo 6: Ensayo de diversos quelantes e iones de metales de transición para IMAC

Se conjugó amino-sílice con una densidad de acoplamiento del 5 % (como se describe en el ejemplo 4) con EDTA, EGTA, NTA o TTHA. A continuación, cada una de las matrices resultantes se cargó con Ni2+, Co2+, Zn2+ o Cu2+. Los ensayos de unión para NES-YFP-H¹⁰se realizaron como se describe en el ejemplo 5, pero incluyendo NaCl 100 mM en el tampón de lavado.

La figura 3 muestra que las combinaciones sometidas a prueba de matrices e iones metálicos muestran una unión eficaz de NES-YFP-H¹⁰.

Ejemplo 7: Resistencia de las matrices con quelato de Ni frente a la extracción de Ni2+ por quelantes libres.

Se lavaron 1 ml de cada una de Ni2+-amida de EDTA-sílice (densidad de acoplamiento del 50 %; preparada de acuerdo con el ejemplo 4), Ni2+-amida de NTA-sílice (densidad de acoplamiento del 50 %) o Ni2+-NTA-agarosa (Qiagen) con 30 ml de tampón Tris o EDTA 10 mM a pH 7,6 o EGTA 10 mM a pH 7,6 o NTA 40 mM a pH 7,6 durante un periodo de tiempo de 45 min, seguido de un equilibrado en tampón de unión (Tris/HCl 50 mM a pH 7,5, NaCl 500 mM, MgCh 5 mM). A continuación, se usaron 10 pl de cada matriz pretratada para unir una fusión His¹⁰-MBP-GFP (concentración 10 pM) procedente de 600 pl de lisado de E. coli. La fracción unida se eluyó con 75 pl de imidazol/HCl 1 M, pH 7,5. A continuación, se analizó 1 pl de cada eluato mediante SDS-PAGE, seguido de tinción con Coomassie. Los resultados se muestran en la figura 4A. La matriz de Ni2+-amida de EDTA-sílice según la invención fue completamente resistente a todas las soluciones quelantes sometidas a prueba. Las matrices comparativas fueron significativamente menos resistentes. La Ni2+-NTA-agarosa se descargó con cualquiera de los tratamientos quelantes. La Ni2+-amida de NTA-sílice se descargó completamente con EDTA 10 mM y NTA 40 mM, pero retuvo una ligera actividad después del tratamiento con EGTA.

Las matrices lavadas con quelantes del panel que se muestra en la figura 4A se equilibraron en Tris/HCl 100 mM a pH 7,5, se mezclaron con un volumen igual de dimetilglioxima al 1 % (disuelta en etanol) y se incubaron durante 15 min a 60 °C y posteriormente durante la noche a temperatura ambiente, después de lo cual se tomaron fotografías. Los resultados se muestran en la figura 4B. Un precipitado rosa de dimetilglioxima-Ni2+, que representa Ni2+ unido débilmente, se generó con Ni2+-amida de NTA-sílice sin tratar y con Ni2+-NTA-agarosa sin tratar, pero no con Ni2+-amida de EDTA-sílice. El prelavado de Ni2+-amida de NTA-sílice o de Ni2+-NTA agarosa con los quelantes mencionados anteriormente eliminó el Ni2+ unido débilmente en la misma medida en que redujo la capacidad de unir la proteína marcada con histidina.

Por tanto, la unión de los iones Ni2+ a la matriz de amida de EDTA según la invención es significativamente más fuerte que a las matrices de NTA comparativas.

Ejemplo 8: Resistencia de las matrices quelantes de Ni frente a agentes reductores que contienen tiol.

Se sometió a prueba la resistencia de diversas matrices quelantes que contenían Ni2+ frente al ditiotreitol (DTT), un agente reductor que contiene tiol.

NTA-agarosa (Qiagen), amida de NTA-sílice y amida de EDTA-sílice se dejaron sin tratar o se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con DTT 1 M tamponado con Tris/HCl 1 M a pH 7,5. Los resultados se muestran en la figura 5A. El tratamiento con DTT convirtió el Ni2+ de la NTA-agarosa (Qiagen) y de la amida de NTA-sílice en productos de reducción parduzcos. Por el contrario, la Ni2+-amida de EDTA-sílice permaneció totalmente inalterada.

Las matrices anteriores (“ 50 pl) se resuspendieron en 1 ml de Tris/HCl 1 M a pH 7,5 o Tris/HCl 1 M a pH 7,5 DTT 1 M. Transcurridos 5 minutos, se añadió una proteína fluorescente roja marcada con His¹⁰y las reacciones de unión se agitaron durante la noche a temperatura ambiente. Las matrices se dejaron sedimentar por gravedad y se tomaron fotografías. Los resultados se muestran en la figura 5B (panel superior). El color rojo de las microesferas indica la unión de la proteína marcada con His. En ausencia de DTT, todas las matrices se unieron muy bien a la proteína marcada con His. El tratamiento con DTT eliminó por completo la unión a Ni2+-NTA-agarosa (Qiagen) y a Ni2+-amida de NTA-sílice. Las fracciones no unidas contenían productos de reducción de Ni2+ parduzcos que se desprendieron de las microesferas. Por el contrario, la unión de la proteína fluorescente roja marcada con His a Ni2+-amida de EDTA-sílice según la invención no se vio afectada por el tratamiento con DTT.

Las fracciones unidas se eluyeron con imidazol 1 M, pH 7,3, y se analizaron mediante SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie. Los resultados se muestran en la figura 5B (panel inferior). El análisis confirmó que DTT 1 M eliminó completamente la unión de la proteína marcada con His a Ni2+-NTA-agarosa o Ni2+-amida de NTA-sílice, mientras que la unión a Ni2+-amida de EDTA-sílice según la invención no se vio afectada en absoluto.

Ejemplo 9: Caracterización de las marcas de polihistidina espaciadas

Una mezcla de derivados de DHFR marcados con diversas marcas de histidina se unió a Ni2+-amida de EDTA-sílice y se eluyó lentamente con un gradiente de concentración de imidazol creciente. Los resultados se muestran en la figura 6A. (Las concentraciones reales se indican encima de los carriles). El panel muestra el análisis de las fracciones eluidas mediante SDS-PAGE / tinción con Coomassie. Las marcas con mayor número de histidinas confieren una unión más fuerte a la matriz, una elución a una concentración de imidazol mayor y, por tanto, una mejor separación de los contaminantes que no están marcados con polihistidina. Se han utilizado las siguientes marcas (aminoácidos en código de una sola letra):

MRGS6 = MRGSHHHHHH (SEQ ID NO: 1)

H10 = MHHHHHHHHHH (SEQ ID NO: 2)

H14 espaciada = MSKHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHH (SEQ ID NO: 3)

H21 espaciada = MSKHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHTGHHHHSGSHHH (SEQ ID NO: 4)

H28 espaciada = MSKHHHHSGHHHTGHHHHSGSHHHTGHHHHSGSHHHTGHHHHSGSHHH (SEQ ID NO: 5)

Aunque las marcas de His con mayor número de histidinas confieren una unión más específica a las matrices con quelato de Ni, plantean el problema de que los tramos continuos de demasiadas histidinas comprometen los niveles de expresión y la solubilidad en E. coli. La interrupción de los tramos continuos de polihistidina con espaciadores que contienen Gly, Ser y/o Thr resuelve estos problemas. En el ejemplo representativo mostrado, el marcado de DHFR con una marca His14 espaciada duplicó el rendimiento de proteína soluble durante la expresión recombinante en E. coli en comparación con una marca de His¹⁰continua convencional (figura 6B).

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un quelante inmovilizado que tiene 6 o más grupos de coordinación en cromatografía de iones metálicos inmovilizados (IMAC) para la purificación de polipéptidos recombinantes que comprenden marcas de polihistidina, en el que el quelante inmovilizado es una fase sólida que tiene un ácido policarboxílico inmovilizado en la misma que tiene una estructura de fórmula (lb):

O SP —O-H-PCA (Ib)

en la que SP es una fase sólida;

PCA es el residuo de un ácido policarboxílico, en particular de un ácido aminopolicarboxílico, o una sal del mismo, y en la que

el quelante forma un complejo con un ion metálico, por ejemplo un ion de metal de transición, tal como un ion Ni2+.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que el quelante inmovilizado es un éster de ácido policarboxílico que tiene 6 o más grupos de coordinación, que se seleccionan en particular de grupos amino, carboxilo, carboxamido e hidroxamato.

3. El uso de la reivindicación 1 o 2, en el que el ácido policarboxílico se selecciona de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DPTA) y ácido trietilentetramino-N,N,N',N',N",N"-hexaacético (TTHA), en particular de EDTA o sales del mismo.

4