WO2004078828A1

WO2004078828A1 - アニオン性置換基を有する物質の捕捉剤

Info

Publication number: WO2004078828A1
Application number: PCT/JP2004/002730
Authority: WO
Inventors: Tohru Koike; Yohsuke Yamamoto; Hironori Takeda; Yoshio Sano; Satoko Yougai
Original assignee: Manac Inc.
Priority date: 2003-03-04
Filing date: 2004-03-04
Publication date: 2004-09-16
Also published as: US20060131239A1; EP1614706A1; US7473781B2; CN1756792A; DE602004021914D1; ATE435884T1; EP1614706B1; JP4266377B2; CN100528938C; JPWO2004078828A1; WO2004078342A1; EP1614706A4

Abstract

　一定条件下で、アニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合する性質を有すると共に、全体として溶媒難溶性（好ましくは溶媒不溶性）を示す、アニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質を捕捉することができ、且つ、容易に分離精製可能な、所定の亜鉛錯体基が直接又はスペーサーを介して共有結合したポリマー担体。

Description

明細書

ァニオン性置換基を有する物質の捕捉剤技術分野

本発明は、ァ-オン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質を分離精製するために有用な、所定の亜鉛錯体基が結合したポリマー担体、そのポリマー担体を含有する、ァユオン性置換基 (例えばリン酸基) を有する物質の捕捉剤、更に、この捕捉剤を充填した捕捉器具及びその捕捉方法に関する。背景技術

リン酸基を有する物質、例えばリン酸化された生体物質等を分析するための方法としては、従来より、酵素免疫法（E L I S A) による方法や放射性同位元素を用いる方法が知られている。

酵素免疫法は、抗体（又は抗原でもよい）が目標物質と特異的に結合する原理を利用している。そのため、目的物質固有の抗体を作製するのに、目的物質を多量に精製し入手する必要があるという問題点がある。更に、抗体の作製には動物の免疫反応を用いるため、抗体の作製に時間がかかるという問題点がある。また、数 k D a (ダルトン）以下の分子構造中のリン酸化部位に対する抗体を作製することができないため、そのような分子構造を持つリン酸化された生体物質を酵素免疫法によって分析することができないという問題点がある。

また、放射性同位元素を用いる方法は、放射性同位元素^{3 2} Pを用いる。そのため、実験室の放射線の管理及び廃液の管理に手間がかかるという問題点がある。排水中のリン酸濃度を下げるための方法として、特開平 1 1一 5 7 6 9 5号公報には、複合金属水酸化物を用いる方法が開示されている。一方、医薬の分野では、高リン血症の治療に用いられるものとして、特表平 8— 5 0 6 8 4 6号公報に記載のグァニジノ基が結合したポリマーがある。しかし、複合金属水酸化物及びグァニジノ基が結合したポリマーは、リン酸基に対する結合力が弱い。そのため、一定量のリン酸を捕捉するためには、多量のリン酸基結合基質としての複合金属水酸化物又はグァ -ジノ基が結合したポリマーを用いなければならないという問題点がある。

一方、 Vン酸基と強く結合する化合物として、ジャーナルオフ、、ザァメリカンケミカノレソサェティー (J o u r n a l o f t h e Am e r i c a 11 C h e m i c a l S o c i e t y ) , (米国）， 1 9 9 1年，第 1 1 3卷，第 23号， p. 8935-8941に記載の大環状ポリアミン亜鉛錯体がある。しかし、大環状ポリアミン亜鉛錯体は溶剤に可溶である。そのため、溶液中で、大環状ポリアミン亜鉛錯体と結合したリン酸基を有する物質の分離精製が非常に困難であるとレ、う問題点がある。

したがって、リン酸化された生体物質等のリン酸基を有する物質を分離精製するためには、一定条件下において、ァニオン性置換基の一つであるリン酸基と強く結合する性質及び分離精製が容易であるという性質を兼ね備え、且つ安全で安価な捕捉剤が望まれている。

本発明の目的は、一定条件下において、ァニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合すると共に、該置換基を有する物質の分離精製が容易な、安全で安価な捕捉剤並びにこの捕捉剤を充填した簡便な捕捉器具及びその迅速且つ容易な捕捉方法を提供することにある。発明の開示

本発明者らは、前記従来技術の問題点を解決すべく鋭意検討の結果、ポリマー担体に特定の亜鉛錯体基を結合させると、該ポリマー担体が、ァニオン性置換基

(例えばリン酸基）と強く結合する性質を有すると共に、全体として溶媒難溶性 (好ましくは溶媒不溶性）を示すので、分離精製が極めて容易となること、即ち、該置換基を有する物質の有用な捕捉剤になり得ることを見い出した。更に、この捕捉剤を充填した該物質の捕捉器具及びこの捕捉剤を用いた該物質の捕捉方法も確立し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明 (1) は、一般式 (1) ：

{式中、 Rは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が 1〜 16であるアルキル基；ァシル基、アルコキシカルボニル基、ァシルアルキル基アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルキル基、力ルバモイルアルキル基、シァノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、ァミノアルキル基又はハ口ァルキル基 (ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、 1〜16である) ；カルボキシル基；力ルバモイル基；シァノ基；ヒドロキシル基；ァミノ基；或いはハロゲノ基である } で示される亜鉛錯体基が直接又はスぺーサーを介して結合したポリマー担体である。

また、本発明（2) は、前記発明（1) のポリマー担体又は一般式（2)

で示される亜鉛錯体基が直接又はスぺーサーを介して結合したポリマー担体を含有する、ァユオン性置換基を有する物質の捕捉剤である。

更に、本発明（3) は、ァニオン性置換基がリン酸基である、前記発明（2) の捕捉剤である。

また、本発明 (4) は、捕捉剤がビーズの形態である、前記発明 (2) 又は

(3) の捕捉剤である。

更に、本発明（5) は、捕捉剤がプレートの形態である、前記発明（2) 又は

(3) の捕捉剤である。

また、本発明（6) は、捕捉剤が繊維の形態である、前記発明（2) 又は (3) の捕捉剤である。

更に、本発明 (7) は、前記発明 (2) 〜 (4) 又は (6) のいずれか一つの捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ、ァニォン性置換基を有する物質の捕捉器具である。

また、本発明 (8) は、ァニォン性置換基を有する物質を、前記発明（2) 〜

(6) のいずれか一つの捕捉剤に結合させることによって捕捉ずる工程を含む、ァニォン性置換基を有する物質の捕捉方法である

更に、本発明 (9) は、該捕捉工程の後、ァ-オン性置換基を有する物質を捕捉剤から解離させる工程を更に含む、前記発明（8) の方法である。図面の簡単な説明

図 1は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム—ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE) 図の前半である。図 2は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム一ポリアタリルァミドゲル電気泳動（ S D S— P A

GE) 図の後半である。図 3は、亜鉛を含まない錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリゥムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE) 図の前半である。図 4は、亜鉛を含まない錯体基が結合したポリマー担体を含有する捕捉剤を用いたドデシル硫酸ナトリウム一ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS— PAGE) 図の後半である。尚、これら図中、 1はゥシ血清アルブミン、 2はニヮトリ卵白アルブミン、 3はゥシ ]3—力ゼイン、 4はゥシ a _{S 1}—カゼイン非リン酸化型、 5はゥシ _{S 1}—カゼイン、 6はトリス一塩酸緩衝液 (pH 7. 0 ) と 0. 5 M塩化ナトリゥム水溶液の混合溶液 1回目、 7はトリス—塩酸緩衝液（pH 7. 0) と 0. 5M塩化ナトリゥム水溶液の混合溶液 2回目、 8はトリスー酢酸緩衝液 (pH 7. 0) 1回目

9はトリス—酢酸緩衝液（ p H 7. 0) 2回目、 1 0はトリス一酢酸緩衝液 (pH 7. 0) 3回目、 1 1はトリス—酢酸緩衝液（p H 7. 0) 4回目、 1 2は 1 0 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0)、 1 3は 1 5 mMリン酸緩衝液 (p H 7. 0)、 14は 20 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0)、 1 5は 25m Mリン酸緩衝液（ p H 7. 0 )、 1 6は 3 0 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 )、 1 7は 35 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0)、 1 8は 40 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)、 1 9は 45 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 )、 20は 5 0 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0)、 2 1は 60 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0 )、 22は 70 mMリン酸緩衝液 (p H 7. 0)、 23は 80 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)、 24は 90 mMリン酸緩衝液 (p H 7. 0 )、 25は 1 00 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0)、 26は 200 mMリン酸緩衝液（ p

H 7. 0)、 27は 300 mMリン酸緩衝液 (p H 7. 0)、 28は 400m

Mリン酸緩衝液 ( p H 7. 0)、 2 9は 5 0 0 mMリン酸緩衝液 ( p H 7. 0) のラインを示す。発明を実施するための最良の形態

まず、一般式（1) 又は一般式（2) で示される亜鉛錯体基が結合しているポリマー担体について説明する。「ポリマー担体」とは、該基と結合可能なポリマーであり、且つ、「担体」乃至は「支持体」として機能する限り、特に限定されない。但し、ポリマー担体が用いられる際に使用される溶剤や試薬に対して耐性を有し、且つ、濾過及び洗浄を行う際に必要な物理的強度をも備えていることが好適である。また、ァニオン性置換基を有する物質の捕捉に無影響であるものが好適である。具体例を例示すると、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアセチレン（ポリイン）、ポリ塩化ビュル、ポリビュルエステル、ポリビュルエーテル、ポリアクリル酸エステル、ポリアクリル酸、ポリアクリロニトリル、ポリアクリルアミド、ポリメタクリル酸エステル、ポリメタタリル酸、ポリメタクリロニトリル、ポリメタクリルァミド、ポリエーテル、ポリアセターノレ、ポリエステル、ポリエチレンテレフタレート (ポリテレフタル酸エチレン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ナイロン、ポリウレタン、ポリ尿素、ポリイミド、ポリイミダゾール、ポリ才キサゾーノレ、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリスルホンアミド、ポリマーァロイ、セノレロース、デキストラン、ァガロース、キトサン、シリカ等を挙げることができる。また、更なる物理的強度を確保するために架橋（橋かけ）構造をもつポリマー担体であってもよく、架橋（橋かけ）剤の具体例を例示すると、ジビュルベンゼン、ェピクロロヒドリン、 N, N' — メチレンビスアクリルアミド、ジィソシアン酸 4, 4， —ジフエニルメタン等を挙げることができる。

このポリマー担体は、一般式 (1) 又は一般式 (2) で示される亜鉛錯体基と直接又はスぺーサーを介して結合している。ここで、スぺーサ一とは、ポリマー担体から亜鉛錯体基を離すことによって、亜鉛錯体基への捕捉物質との結合を促す目的及び溶剤への膨潤度を増す目的で導入されたポリマーであり、具体例を例示すると、ポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリアミド、ボリエステル等を挙げることができる。また、亜鉛錯体基とポリマー担体又はスぺーサ一との結合様式の具体例を例示すると、炭素一炭素結合、エステル結合、カルボ-ル結合、アミド結合、エーテル結合、スルフィド結合、ァミノ結合、ィミノ結合等の共有結合を挙げることができる。

本発明に係る、一般式（1) で示される亜鉛錯体基が結合したポリマー担体の具体例を例示すると、 Z n^{2 +} ₂-N, N, N'， N，ーテトラキス [(2_ピリジル）メチル] — 1， 3—ジアミノー 2—プロポキシド基が結合した TOYOPE ARL (登録商標）：

や、 Z η ^{2 +} ₂-Ν, Ν， Ν,, Ν， —テトラキス [ ( 2—ピリジル) メチル] 一 ί , 3—ジァミノ一 2—プロポキシド基が結合した A r g o G e 1 (登録商標）：

Z n ^{2 +} a - N , N, N', N，ーテトラキス [ ( 2—ピリジル) メチル] -

3—ジァミノ _ 2—プロポキシド基が結合した T S K g e 1 (登録商標）：

や、 Z n ^{2 +} ₂— N N, N N' ーテトラキス [(2—ピリジル）メチル] - 1 , 3—ジァミノ一 2—プロボキシド基が結合した S e p h a r o s e (商標）：

等を挙げることができる。

本発明に係る、一般式 (2) で示される亜鉛錯体基が結合したポリマー担体の具体例を例示すると、 Z n ^{2 +}—サイクレン基が結合した TOYOPEARL

(登録商標) ：

^{2 +}—サイクレン基が結合した Ar g oGe 1 (登録商標）：

^{2 +}—サイクレン基を結合した T e n t a Ge 1 (登録商標）：

等を挙げることができる。

ァニオン性置換基とは、負の電荷を持つ置換基であり、ァニオンの具体例を例示すると、 2価のリン酸モノエステルァ-オン（一 OP〇₃ ²一）、 1価のリン酸ジエステルァェオン ((— O) ₂P0₂— )、 2価のホスホン酸ァニオン (-P o₃ ²— )、 1価のホスホン酸ァニオン（（一） ₂PO₂— )、 1価の炭酸エステルァ二オン（一〇co₂— )、 1価のカルボン酸ァユオン (一 co₂ -）、 1価の硫酸ェステルァニオン (一〇 S〇₃一）、 1価のスルホン酸ァニオン (一 S〇₃一) 等を挙げることができる。

リン酸基を有する物質とは、 2価のリン酸モノエステルァユオン (一 OP

〇₃ ²一）を有する物質であり、該物質の具体例を例示すると、リン酸化されたァミノ酸、 'リン酸化されたアミノ酸残基、リン酸化されたアミノ酸残基を有するタンパク質（リン酸化タンパク質）、リン酸化されたアミノ酸残基を有するポリべプチド（リン酸化ポリペプチド）、リン酸化されたァミノ酸残基を有するオリゴペプチド (リン酸化ォリゴぺプチド）、デォキシリボ核酸（D NA)、リン脂質、リン酸化された糖類、血中のリン酸成分、排水中のリン酸成分等を挙げることができる。

一般式（1 ) 又は一般式（2 ) で示される亜鉛錯体基自体は、使用される溶剤との関係では、通常可溶である。しかし、これをポリマー担体と結合させることにより、該溶剤との関係で難溶 (好ましくは不溶) となる。そのため、本発明に係るポリマー担体は、好適条件下では、溶液中のァニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質が捕捉可能であると共に、溶剤からの濾過や洗浄も可能となるので、迅速且つ容易に、溶液から該物質の分離精製が行えるようになる。更に、該物質の定量に捕捉剤を使用することも可能である。

ビーズの形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、金属固定化ァフィ二ティクロマトグラフィー（I MA C ) カラムなどのカラム担体、リン酸化タンパク質又はデォキシリボ核酸（D NA) 等のリン酸基を有する物質の精製又は濃縮を行うカラムの充填剤、リン酸基を有する物質の分離又は精製を行う磁性ビーズ、高リン血症の治療に用いる血中のリン酸成分を捕捉する製剤等を挙げることができる。

プレートの形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、マトリックス支援レーザー脱離ィオン化飛行時間型質量分析計（MA L D I - T O

F M S ) に用いる試料基板、タンパク質又はデォキシリボ核酸（D NA) 等の精製又は検出を行うチップ等を挙げることができる。

繊維の形態として利用する捕捉剤における用途の具体例を例示すると、リン酸基を有する物質とリン酸基を有さない物質との分離に用いる分離膜、中空糸膜フィルター等を挙げることができる。

本発明のァユオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉器具は、前記ポリマー担体を含有する捕捉剤又はビーズ若しくは繊維の形態である捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ。ここで、フィルタ ^"とは、これらの捕捉剤及びこれらの捕捉剤に結合した該置換基を有する物質とこれらの捕捉剤に結合しない該置換基を有さない物質が溶解した溶液、或いは、こららの捕捉剤とこれらの捕捉剤から解離した該置換基を有する物質が溶解した溶液を、簡便な個液分離により濾別する目的で導入された分離材であり、具体例を例示すると、ガラスフィルター、金属焼結フィルター、メンプランフィルター、限外濾過膜、石綿、グラスウー/レ、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリテトラフルォロェチレン、ポリエーテルスルホン、セルロース等を挙げることができる。また、このフィルタ一は、これらの捕捉剤の下だけでなく上下にあってもよく、 2つのフィルターでこれらの捕捉剤を挾むことによって、これらの捕捉剤の流動範囲を抑制する効果も併せ持つ。

本発明に係るァニオン性置換基（特にリン酸基）を有する物質の捕捉器具の具体例を例示すると、 Z n^{2 +} ₂— N, N, N，, N，ーテトラキス [(2—ピリジル）メチル] _ 1， 3—ジアミノー 2—プロポキシド基が結合した TO YOPE ARL (登録商標）カラム、 Zn^{2 +} ₂— N, Ν， Ν', N' —テトラキス [(2— ピリジル）メチル] 一 1， 3—ジアミノー 2—プロポキシド基が結合した S e ρ h a r o s e (商標）カラム、 Z n ^{2 +}—サイクレン基が結合した T O Y O P E

ARL (登録商標）カラム、 Zn^{2 +} ₂_N， Ν， Ν', Ν，一テトラキス [(2— ピリジル）メチル] —1, 3—ジァミノ一 2—プロボキシド基が結合した S e ρ h a r o s e (商標）遠心式フィルターュニット等を挙げることができる。

本発明のァニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、ポリマー担体に結合した亜鉛錯体基が、該物質と結合する、という原理を利用している。尚、該物質を捕捉するときの規模又は形態に応じ、例えば、ビーズ、プレート、繊維等のポリマー担体を選択することで、用途別に対応した該物質の捕捉を行うことができる。

また、本発明のァニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、例えば、生理条件である中性条件下等で該物質と本発明に係るポリマー担体とを結合させ、次いで、例えば、溶液の pH、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等を変化させることで、結合した該物質を本発明に係るポリマー担体から解離させるものである。該物質を捕捉し、更に捕捉した該物質を放出できるのは、該物質と本発明に係るポリマー担体との結合が、例えば、溶液の pH、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等により変化するからでめる。

更に、本発明のァユオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の捕捉方法は、例えば、エチレンジァミン四酢酸 (EDTA) 等のキレート化剤を添加することで、結合した該物質を本発明に係るポリマ一担体から解離させるものも含む。捕捉した該物質を放出できるのは、該物質と本発明に係るポリマー担体との結合から、例えば、エチレンジァミン四酢酸 (EDTA) 等のキレート化剤が亜鉛ィオンを引き抜くことにより、結合していた該物質が解離するからである。

これらにより、迅速且つ容易な捕捉方法を用いたァニオン性置換基（例えばリン酸基）を有する物質の分離精製及び回収が、例えば、溶液の pH、緩衝作用を有する酸とその塩又は塩基とその塩の種類、緩衝液又は溶液に含まれる塩の濃度等を変化させること、或いは、例えば、エチレンジァミン四酢酸（EDTA) 等のキレート化剤を添加することにより、自在に行うことができる。実施例

以下に、実施例を挙げて、本発明をより具体的に説明するが、本発明は、下記に記載する実施例に限定されるものではない。尚、これらの例中の亜鉛イオン (Z n²⁺) 担持量（単位 mmo 1 Z n²⁺Zg又は μπιο ΐ Z n ²⁺/m L) は、亜鉛錯体基が結合したポリマー担体全体量に対する、亜鉛イオン含有量を表す値である。

実施例 1

TOYOPEARL (登録商標） AF— Ep o x y— 650M 10 gとサイクレン 6. 9 gと炭酸力リウム 2. 2 gのエタノール溶液 75mLを、 40°C で 4日間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと硝酸亜鉛六水和物 1 2 gの水溶液 75 m Lを、 40 °Cで 2日間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、減圧乾燥を行うと、 Z n^{2 +}—サイクレン基が結合した TOYOPEARL

(登録商標） 1 2 g (0. 3mmo 1 Zn²⁺/g) が得られた。

実施例 2 ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムに、 z n ^{2 +}—サイクレン基が結合した TOYOPEARL (登録商標） l O Omg (0. 3 mm o 1 Z n ^{2 +} / g ) を充填して、 Z n ^{2 +}—サイクレン基が結合した TO YO P E AR L (登録商標）カラムを作製した。

実施例 3

Z n ^{2 +}—サイクレン基が結合した TOYOP EARL (登録商標) カラムを、 50 mlviトリス一塩酸緩衝液 (pH 7. 0) で膨潤させた。カラムに 50 mlvi トリス一塩酸緩衝液（ p H 7. 0) で調整した 10 mM 4—ュト口安息香酸ナトリウム溶液 1. OmLを添加し、その後 5 OmMトリス一塩酸緩衝液 (pH 7. 0) 2. OmLを添カ卩し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 1価の 4—ニトロ安息香酸ァニオンの捕捉率を測定したところ、 1 00%であった。

実施例 4

Z n^{2 +} _サイクレン基が結合した TOYOPEARL (登録商標）カラムを、 5 OmMトリス一塩酸緩衝液（pH 7. 0) で膨潤させた。カラムに 5 OmM トリスー塩酸緩衝液（pH 7. 0) で調整した 1 OmM 4—ュトロフユニルリン酸ニナトリウム溶液 1. OmLを添カ卩し、その後 5 OmMトリス一塩酸緩衝液（pH 7. 0) 2. OmLを添カ卩し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 2価の 4一二トロフエ二ルリン酸ァ二オンの捕捉率を測定したところ、 98%であった。

実施例 5

1， 3—ジァミノ一 2—プロパノール 33 gと 2—ピリジンカルボキシアルデヒド 1 1 6 gとシァノトリヒドロほう酸ナトリウム 5 0 gのメタノール溶液 50 OmLを、室温で 3日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィ一で精製すると、合成中間体 34 gが得られた。

合成中間体 18 gと 6一プロモメチルニコチン酸メチル 1 2 gと炭酸力リゥム 14 gの N, N—ジメチルホルムァミド溶液 225 m Lを、 50 °Cで 1時間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、メチルエステル体 22 gが得られた。メチルエステル体 1 7 gと 1. 0M水酸化ナトリゥム水溶液 8 3mLのメタノール溶液 4 OmLを、室温で 1時間撹拌した。中和した後、カラムクロマトグラフィ一で精製すると、 N- ( 5—カルボキシ一 2—ピリジル) メチル一 N, N，， N， —トリス [ ( 2—ピリジル) メチル] — 1 , 3—ジァミノ一 2—プロパノール.1 3 gが得られた。

実施例 6

TOYO PEARL (登録商標） AF_Am i n o— 6 5 OM 1. 2 gと N— (5—カルボキシ _ 2—ピリジル）メチル— N, Ν', Ν，ートリス [(2— ピリジル）メチル] ― 1 , 3—ジァミノ一 2—プロパノール 4 5 Om gとジシク口へキシノレカルボジィミド 2 1 0 m gと 1—ヒドロキシベンゾトリァゾール

1 5 0mgのN, N—ジメチルホルムアミド溶液 1 OmLを、 40°Cで 1 8時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと酢酸亜鉛二水和物 4 8 0 m gと 1 0 M水酸化ナトリウム水溶液 0. 1 0 m Lのェタノール溶液 7. 0 m Lを、 40 °Cで 1 8時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、得られたビーズと 1. 0 M過塩素酸ナトリウム水溶液 3. OmLの水溶液 7. 0 m Lを、

4 0°Cで 1 8時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、減圧乾燥を行うと、 Z n ^{2 +} ₂— N， N， N，， N' ーテトラキス [ ( 2 _ピリジル）メチル] 一 1， 3—ジァミノー 2—プロボキシド基が結合した TO YO PEARL (登録商標） 1. 0 _g (0. 5mmo 1 Z n²⁺/g) が得られた。

実施例 7

ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムに、 z n ^{2 +} ₂ - N, N, Ν', Ν，一テトラキス [ ( 2—ピリジル) メチル] — 1 , 3—ジァミノー 2—プロボキシド基が結合した TOYQ P EARL (登録商標） l O Omg (0. 5mmo 1 Z n ²⁺/g) を充填して、 Z n^{2 +} ₂— N, N， N，， N，一テトラキス [ ( 2—ピリジル) メチル] 一 1 , 3—ジァミノ一 2—プロボキシド基が結合した TOYOPEARL (登録商標) カラムを作製した。

実施例 8

Z n ^{2 +} ₂-N, N， N，， N，ーテトラキス [( 2—ピリジル）メチル] 一 1， 3—ジァミノ一 2—プロボキシド基が結合した T〇Y〇P EARL (登録商標）カラムを、 50 mMトリスー塩酸緩衝液（pH 7. 0) /ァセトニトリル ( 1 / 1 ) 溶液で膨潤させた。カラムに 5 0 mMトリス一塩酸緩衝液 ( p H 7. 0) Zァセトニトリル（1/1) 溶液で調整した 1 OmM 4一二トロ安息香酸ナトリウム溶液 1. 0 m Lを添加し、その後 5 0 mMトリス一塩酸緩衝液 (pH 7. 0) /ァセトニトリル（lZl) 溶液 2. OmLを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 1価の 4一二トロ安息香酸ァニオンの捕捉率を測定したところ、 1 0 0 %であった。続いて、 5 0 mMリン酸緩衝液（pH 3. 0) ァセトニトリル（1/1) 溶液 5 0 m Lを添加し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 1価の 4一-トロ安息香酸ァニオンの回収率を測定したところ、 1 0 0%であった。

実施例 9

Z n ^{2 +} ₂— N, N, N，， N，ーテトラキス [ ( 2—ピリジル) メチル] 一 1， 3—ジアミノー 2—プロポキシド基が結合した TOYOP EARL (登録商標）カラムを、 5 OmMトリスー塩酸緩衝液（pH 7. 0) で膨潤させた。力ラムに 5 OmMトリス一塩酸緩衝液（pH 7. 0) で調整した 1 OmM 4— -トロフエニルリン酸ニナトリウム溶液 1. OmLを添加し、その後 5 OmMトリス一塩酸緩衝液 ' (pH 7. 0) 2. OmLを添カ卩し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 2価の 4一二トロフエ-ルリン酸ァニオンの捕捉率を測定したところ、 1 00%であった。続いて、溶離液として

5 OmMリン酸緩衝液（p H 3. 0) 5 0 m Lを添加し流出させ、流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 2価の 4—-トロフエ-ルリン酸ァニオンの回収率を測定したところ、 8 9%であったが、溶離液として 5 OmM トリス一塩酸酸緩衝液 (pH 7. 0) 5 OmLを添加し流出させ、流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 2価の 4一-トロフ二ルリン酸ァニオンの回収率を測定したところ、 0%であった。

実施例 1 0

1， 3—ジアミノー 2—プロパノール 3 3 gと 2—ピリジンカルボキシアルデヒド 1 1 6 gとシァノトリヒドロほう酸ナトリウム 5 0 gのメタノール溶液 500mLを、室温で 3日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトダラフィ一で精製すると、合成中間体 34 gが得られた。

合成中間体 18 gと 6一プロモメチルニコチン酸メチル 12 gと炭酸力リゥム 14 gの N， N—ジメチルホルムァミド溶液 225mLを、 50。Cで 1時間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、メチルエステル体 22 gが得られた。

メチルエステル体 10 gとエチレンジァミン 23 gのメタノール溶液 100m Lを、室温で 3日間撹拌した。後処理をした後、カラムクロマトグラフィーで精製すると、 N— { 5 - [N- (2—ァミノ) ェチル〕力ルバモイルー 2—ピリジル} メチルー N, N，， N， —トリス [ ( 2—ピリジル) メチル] —1， 3—ジァミノー 2—プロパノール 10 gが得られた。

実施例 1 1

NH S-a c t i v a t e d S e p h a r o s e (商標） 4 F Fの 20 m Mァセトニトリル溶液 5. OmLと N— { 5 - [N— (2—ァミノ）ェチル] 力ルバモイルー 2—ピリジル } メチル一 N, Ν', N' 一トリス [ ( 2—ピリジ /レ) メチル] 一 1 , 3—ジァミノ一 2—プロパノールの 5. OmMァセトニトリル溶液 5. 0 m Lを、 50 °Cで 1時間撹拌した。反応液を濾過洗浄した後、 20 mM 炭酸ナトリウム水溶液で洗浄すると、 N， N, Ν', N' —テトラキス [(2—ピリジル）メチル] 一 1 , 3—ジァミノー 2—プロパノール基が結合した S e p h a r o s e (商標） 5. OmLが得られた。

実施例 12

ポリプロピレン製のフィルターが付いたカラムに N， N, N，， N' ーテトラキス [ ( 2—ピリジノレ) メチル] 一 1， 3—ジァミノ一 2—プロパノール基が結合した S e p h a r o s e (商標) 1. OmLを充填し、 100 mM 2— （N 一モルホリノ）エタンスルホン酸（MES) 緩衝液 (p H 6. 0) と 20 ηιΜ酢酸亜鉛水溶液の混合溶液 5. 0mL 100 mM 2 - (N—モルホリノ）エタンスルホン酸（MES) 緩衝液（pH6. 0) と 0. 1 mM酢酸亜鉛水溶液の混合溶液 5. OmL, トリスー塩酸緩銜液（pH 7. 0) と 0. 5M塩化ナトリゥム水溶液の混合溶液 5 . 0 m Lで平衡化させて、 Z η ² + ₂— N， N， N，， N' ーテトラキス [(2—ピリジル）メチル] 一 1， 3—ジァミノ一 2—プロポキシド基が結合した S e p h a r o s e (商標) カラムを作製した。実施例 1 3

Z n ^{2 +} ₂ - N , N, N， , N' ーテトラキス [( 2—ピリジル）メチル] - 1， 3—ジァミノー 2—プロポキシド基が結合した S e p h a r o s e (商標）カラムに、ゥシ血清アルブミン（分子量 6 6 , 0 0 0 リン酸化セリン残基 X 0) 50 μ gと-ヮトリ卵白アルブミン（分子量 4 5， 0 0 0 リン酸化セリン残基 X 2) 5 0 μ gとゥシ a _{s l}—カゼイン（分子量 24, 0 0 0 リン酸化セリン残基 X 8 ) 5 0 _§ とゥシひ _{S 1}—カゼイン非リン酸化型（分子量 24, 000 リン酸化セリン残基 X 0) 5 0 μ gとゥシ ]3—カゼイン（分子量

2 5, 0 00 リン酸化セリン残基 X 5) 50 gを添加した。続いて、トリス一塩酸緩衝液（p H 7. 0) と 0. 5M塩化ナトリウム水溶液の混合溶液 1. OmLを 2回、トリスー酢酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmLを 4回、 1 0 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 1 5 mMリン酸緩衝液 ( p H 7. 0) 1. OmL, 20mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、

2 5 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 3 0 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0) 1. OmL、 3 5 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL, 40 mMリン酸緩衝液（p H 7. 0) 1. OmL, 4 5 mMリン酸緩衝液 ( p H 7. 0) 1. OmL、 5 0 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 6 0 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 70 mMリン酸緩衝液（ p

H 7. 0) 1. OmL、 8 0 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 9 OmMリン酸緩衝液（p H 7. 0) 1. OmL, l O OmMリン酸緩衝液 ( p H 7. 0 ) 1. O mL、 2 0 0 mMリン酸緩衝液（p H 7. 0 ) 1. OmL, 300 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL, 400 mM リン酸緩衝液（p H 7. 0) 1. O mL, 5 0 0 mMリン酸緩衝液（p H

7. 0) 1. OmLの順に添加し流出させた。流出液を濃縮した後にスポットし、ドデシル硫酸ナトリウムーボリァクリルァミドゲル電気泳動 (S D S -P AG E) で分離した後、クマシ一ブリリアントプル一（CB B) 染色した。電気泳動図の前半を図 1、後半を図 2に示す。図 1及び図 2において、始めにリン酸化セリン残基を有さないゥシ血清アルブミン、続いてリン酸化セリン残基の数が少ない順に、ニヮトリ卵白アルブミン、ゥシ] 3—カゼイン、ゥシ a _{s l}—カゼインの流出が確認できた。

実施例 14

マイク口ピぺットチップにセルロース製のフィノレターを詰め、 Z n ^{2 +} ₂ -

N, N, Ν', N' —テトラキス [(2—ピリジル）メチル] 一 1 3—ジァミノ一 2—プロボキシド基が結合した S e p h a r o s e (商標) カラムから取り出した、 Zn^{2 +} ₂— N N, N N' ーテトラキス [ ( 2—ピリジル) メチル] ― 1, 3—ジァミノー 2—プロポキシド基が結合した S e p h a r o s e (商標） l O ^u Lを充填し、その後セルロース製のフィルターで蓋をして、 Zn^{2 +} ₂—

N, N, N N' —テトラキス [(2—ピリジル）メチル] 一 1 3—ジァミノ一 2—プロボキシド基が結合した S e p h a r o s e (商標）チップを作製した。実施例 15

Z η ^{2 +} ₂-Ν, Ν Ν', Ν，ーテトラキス [(2—ピリジル）メチル] 一 1, 3—ジァミノ一 2—プロポキシド基が結合した S e p h a r 0 s e (商標）チップを取りつけたマイクロピペットで、 0. 5 0M硝酸ナトリウム含有 100 mMトリスー酢酸緩衝液（p H 7. 4) で調整した 0. 22 mM p 60 ぺプチド 521— 533と 0. 18 mMリン酸化 p 60 ぺプチド 521— 533の混合溶液 10 μ Lを吸入し、 5分間平衡化させた後、吐き出した。その後、 0. 50Μ硝酸ナトリウム含有 10 OmMトリスー酢酸緩衝液

(pH7. 4) l O / Lで 5回洗浄した。続いて、 1 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 0) で 6回洗浄し、洗液を収集して、高速液体クロマトグラフィーを用いて純度を測定したところ、リン酸化 p 6 0 ぺプチド 5 2 1— 533が 100% p 60 ^{c_sr £}ぺプチド 521— 533が 0 %であった。

実施例 16

P S 20 P r o t e i n Ch i p (登録商標) A r r a yに、 100 mM 炭酸水素ナトリゥム水溶液 Zァセトニトリル（ 1 / 3 ) 溶液で調整した 0. 38M N— {5— [N— (2—ァミノ）ェチル] 力ルバモイル一 2—ピリジル } メチル一 N, N' N' —トリス [(2—ピリジル）メチル] 一 1, 3—ジアミノー 2—プロパノール溶液 3. 0 μ ∑を载せ、室温で 4時間反応した。更に、 1 0 O mM炭酸水素ナトリウム水溶液で調整した 0. 5 0M 2—アミノエタノール溶液 3. 0 μ Lを载せ、室温で 4時間反応した。洗浄した後、 1 0 0 mM 2一 (N—モルホリノ）エタンスルホン酸 (ME S) 緩衝液 (p H 6. 0) で調整した 0. 5 0M酢酸亜鉛溶液で洗浄すると、 Z n ^{2 +} ₂_N, N, N'， N，一テトラキス [ ( 2—ピリジノレ) メチル〕一 1， 3—ジァミノ一 2—プロポキシド基が結合した P r o t e i n C h i p (登録商標) A r r a yが得られた。実施例 1 7

Z n ^{2 +} ₂ -N, N, N，, N，ーテトラキス [( 2—ピリジル）メチル] 一 1 , 3—ジァミノ一 2—プロポキシド基が結合した P r o t e i n C h i p (登録商標） A r r a yに、 1 0 0 mMトリス一酢酸緩衝液（ p H 7 · 4) で調整した 0. 9 4 mM 4—メチルゥンベリフェリルリン酸ニナトリウム溶液 3. 0 / Lを載せ、室温で 1時間平衡化させた後、回収した。回収液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて回収液から 2価の 4ーメチルゥンベリフェリルリン酸ァ-オンの捕捉率を測定したところ、 1 6 %であった。

比較例 1

ポリエチレン製のフィルターが付いたカラムに TO YO P EAR L (登録商標） AF— E p o x y— 6 5 0M 1 0 0m gを充填し、 5 OmMトリス一塩酸緩衝液（ P H 7. 0) で膨潤させた。カラムに 5 0 mMトリス一塩酸緩衝液 (p H 7. 0) で調整した 1 0mM 4—-トロフエ-ルリン酸ニナトリウム溶液 1. OmLを添加し、その後 5 OmMトリス一塩酸緩衝液（p H 7. 0) 2. OmLを添カ卩し流出させた。流出液を収集し、紫外可視分光光度計を用いて流出液から 2価の 4一二トロフエ二ルリン酸ァ二オンの捕捉率を測定したところ、 0, 5%であった。

比較例 2

ポリプロピレン製のフィルターが付いたカラムに N, N, Ν', Ν，一テトラキス [( 2—ピリジル）メチル] 一 1 , 3—ジアミノー 2—プロパノ一ル基が結合した S e p h a r o s e (商標） 1. O mLを充填し、トリスー塩酸緩衝液 (p H 7. 0) と 0. 5 M塩化ナトリウム水溶液の混合溶液 5. OmLで平衡化させた。カラムにゥシ血清アルブミン（分子量 66, 000 リン酸化セリン残基 X 0) 50 μ gと-ヮトリ卵白アルブミン（分子量 4 5 , 0 0 0 リン酸化セリン残基 X 2 ) 5 0 z g とゥシ a _{s i} —カゼイン（分子量 24， 000 Vン酸化セリン残基 X 8 ) 50 ^ gとゥシ a _{S 1}—カゼイン非リン酸化型（分子量 24， 000 リン酸化セリン残基 X 0) 50 u gとゥシ3— カゼィン（分子量 25, 000 リン酸化セリン残基 X 5) 50 μ gを添加した。続いて、トリス一塩酸緩衝液（ p H 7. 0) と 0. 5 M塩化ナトリウム水溶液の混合溶液 1. OmLを 2回、トリス一酢酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL を 4回、 10 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0) 1. OmLヽ 15mMリン酸緩衝液（p H 7. 0) 1. OmL 20mMリン酸緩衝液（pH 7. 0 )

1. OmL, 25 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0) 1. OmL, 30 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL, 35 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0) 1. OmL, 40 mMリン酸緩衝液 (pH 7. 0) 1. OmL, 45 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 50 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0) 1. OmL, 6 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 70mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 80 mMリン酸緩衝液（ p H 7. 0) 1. OmL, 9 OmMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 l O OmMリン酸緩衝液（p H 7. 0 ) 1. OmL, 200 mMリン酸緩衝液（p H 7. 0) 1. OmL, 300 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 400 mMリン酸緩衝液（pH 7. 0) 1. OmL、 500 mMリン酸緩衝液

(pH 7. 0) 1. OmLの順に添カ卩し流出させた。流出液を濃縮した後にスポットし、ドデシル硫酸ナトリゥムーポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SD S -PAGE) で分離した後、クマシ一ブリリアントブルー (CBB) 染色した。電気泳動図の前半を図 3、後半を図 4に示す。図 3及ぴ図 4において、始めからゥシ血淸アルプミン、 -ヮトリ卵白アルブミン、ゥシ /3—カゼイン、ゥシ a _s i一カゼィンの流出が確認できた。産業上の利用可能性

本発明に係る、所定の亜鉛錯体基が結合したポリマー担体は、一定条件下で、ァニオン性置換基（例えばリン酸基）と結合すると共に、全体として溶媒難溶性 (好ましくは溶媒不溶性）であるので、該置換基を有する物質の分離精製が容易な、安全で安価な捕捉剤となる。更に、このポリマー担体を用いることにより、フィルターで簡便な分離精製が可能となる捕捉器具及び中性条件下で結合させ、次いで、一定条件下で解離させる迅速且つ容易な捕捉方法が提供される。

Claims

請求の範囲一般式 ( 1 ) ：

{式中、 Rは、相互に同一又は異なっていてもよく、水素原子；炭素数が 1〜 1 6であるアルキル基；ァシル基、アルコキシカルボニル基、ァシルアルキル基、アルコキシカルボニルアルキル基、カルボキシアルキル基、力ルバモイルアルキル基、シァノアルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基又はハロアルキル基（ここで、これらの基のアルキル部分の炭素数は、 1〜1 6である）；カルボキシル基；力ルバモイル基；シァノ基；ヒドロキシル基；ァミノ基；或いはハロゲノ基である } で示される亜鉛錯体基が直接又はスぺーサーを介して結合したポリマー担体。

2 . 請求の範囲第 1項記載のポリマー担体又は一般式（2 ) ：

で示される亜鉛錯体基が直接又はスぺーサーを介して結合したポリマー担体を含有する、ァニオン性置換基を有する物質の捕捉剤。

3 . ァニオン性置換基がリン酸基である、請求の範囲第 2項記載の捕捉剤。

4 . 捕捉剤がビーズの形態である、請求の範囲第 2項記載又は第 3項記載の捕捉剤。

5 . 捕捉剤がプレートの形態である、請求の範囲第 2項記載又は第 3項記載の捕捉剤。

6 . 捕捉剤が繊維の形態である、請求の範囲第 2項記載又は第 3項記載の捕捉剤。

7 . 請求の範囲第 2項〜第 4項又は第 6項のいずれか一項記載の捕捉剤を充填し、フィルターで濾別する機能を持つ、ァニオン性置換基を有する物質の捕捉器具。

8 . ァユオン性置換基を有する物質を、請求の範囲第 2項〜第 6項のいずれか一項記載の捕捉剤に結合させることによって捕捉する工程を含む、ァニオン性置換基を有する物質の捕捉方法。

9 . 該捕捉工程の後、ァニオン性置換基を有する物質を捕捉剤から解離させるェ程を更に含む、請求の範囲第 8項記載の方法。