JP2002528084A - 固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いる低密度リポタンパク質関連ホスホリパーゼａ２の精製方法 - Google Patents

固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いる低密度リポタンパク質関連ホスホリパーゼａ２の精製方法

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JP2002528084A JP2000578462A JP2000578462A JP2002528084A JP 2002528084 A JP2002528084 A JP 2002528084A JP 2000578462 A JP2000578462 A JP 2000578462A JP 2000578462 A JP2000578462 A JP 2000578462A JP 2002528084 A JP2002528084 A JP 2002528084A
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Abstract

(57)【要約】 組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２の新規な精製方法。そのようして得られた精製ＬＤＬ−ＰＬＡ２の使用もまた開示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、組換え低密度リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（ＬＤＬ−Ｐ
ＬＡ２）の新規な製法および該製法を容易にするＬＤＬ−ＰＬＡ２の発現を指示
する新規な組換えＤＮＡに関する。
【０００２】 （背景技術） 低密度リポタンパク質関連ホスホリパーゼＡ２（ＬＤＬ−ＰＬＡ２）は、短鎖
アシル基をｓｎ−２位に有するリン脂質の加水分解を触媒するセリン依存性ホス
ホリパーゼである（ＷＯ９５／００６４９、SmithKline Beecham; Tew, DGら、(
1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16, 591-599; Stremler, KEら、(19
89) J. Biol. Chem. 264, 5331-5334; Dennis, EA (1997) Trends Biochem. Sci
. 22, 1-2）。該酵素はまた、ＰＡＦを加水分解するその能力に基づいて、血漿
ＰＡＦアセチルヒドロラーゼ（ＷＯ９５／０９９２１、Icos; Tjoelkerら、(199
5), Nature, 374, 549; Stafforini DMら、(1997), J. Biol. Chem. 272, 17895
-17898）としても知られている。しかしながら、該酵素のイン・ビボにおける役
割が特異的にＰＡＦに対して作用することであるのか、またはより一般的に短鎖
をｓｎ−２位に有するリン脂質に対して作用することであるのかは、今だ確立さ
れていない。ＬＤＬ−ＰＬＡ２が、炭素原子９個までの長さのアシル鎖をｓｎ−
２位に有するリン脂質を加水分解できることは示されている（Stremler, KEら、
(1989) J. Biol. Chem. 264, 5331-5334）。また、ＬＤＬ−ＰＬＡ２は、カルボ
ニル基などの親水性ω−置換基を有するよりも、これらの短鎖ｓｎ−２アシル基
に対して著しい選択性を有する（Stremler, KEら、(1989) J. Biol. Chem. 264,
5331-5334）。明らかにこれらのリン脂質は、非常に長鎖のｓｎ−２アシル基、
典型的には炭素原子１４〜２０個のオーダーの長さを有することが予測される「
通常の」リン脂質ではなく、メチル基において終結している。しかしながら、不
飽和ｓｎ−２アシル置換基を有するリン脂質の酸化は、ＬＤＬ−ＰＬＡ２によっ
て基質であるために要求される形態の末端切断型アシル側鎖を生じることが知ら
れており（Patel, KDら、(1992) J. Biol. Chem. 267, 15168-15175）、「通常
の」リン脂質はＬＤＬ−ＰＬＡ２の適当な基質ではないが、これらのリン脂質の
酸化がそれらを基質に変換し、リゾ−ホスファチジルコリンと酸化型脂肪酸の両
方の生産を導くことが示された。しばしば長鎖ｓｎ−２置換基の酸化的切断によ
って生じる短鎖ｓｎ−２置換基を有するリン脂質およびＰＡＦの両方を加水分解
するＬＤＬ−ＰＬＡ２の能力のため、採用される正確なイン・ビボでの役割に依
存するプロ炎症性酵素および抗炎症性酵素の両方としての該酵素の役割にたいへ
ん興味がもたれている（Tew, DGら、(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol
. 16, 591-599）。
【０００３】 ＬＤＬ−ＰＬＡ２は、従来よりヒト血漿から得ることができるが、それは特に
豊富な酵素というわけではない（Tew, DGら(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc
. Biol. 16, 591-599; Stafforini DMら(1987) J Biol Chem. 262 4223-4230）
。近年、いくつかのグループがＬＤＬ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡのクローニングを報告
した（Tew, DGら(1996) Arterioscler, Thromb. Vasc. Biol. 16, 591-599およ
びＷＯ９５／００６４９, SmithKline Beecham; Tjoelker, LWら(1995) Nature
374 549-552およびCousensら、ＷＯ９５／０９９２１ (Icos); Karasawa, Kら、
(1996) J. Biochem. (Tokyo) 120, 838-844）。ＷＯ９５／０９９２１において
開示されたイー・コリ（E. coli）において発現された組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２
の精製のための１の方法は、銅リガンドアフィニティーカラムの使用からなる。
しかしながら、銅リガンドアフィニティーカラムの使用は、いくつかの発現系、
例えば、バキュロウイルスにおいて発現されたＬＤＬ−ＰＬＡ２の生物学的活性
に不利な影響を及ぼすという証拠がある。さらに、イー・コリ以外の発現系にお
ける組換え成熟ＬＤＬ−ＰＬＡ２の発現は、Ｎ末端で配列の異なるタンパク質の
不均質な集合を生じるということが見出された（Tew, DGら；公表された）。し
たがって、イー・コリ以外の発現系を用いて発現されるＬＤＬ−ＰＬＡ２の能率
のよい精製方法を開発するという要望が依然としてある。
【０００４】 （発明の開示） したがって、本発明の第一の態様は： ａ）組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドを含有する細胞抽出液、上澄液また
は溶液を亜鉛キレートカラムに付し； ｂ）（ａ）由来の溶出液をブルーセファロース（Blue Sepharose）カラムに付
し；次いで ｃ）（ｂ）由来の溶出液をＱセファロースカラムに付す工程を特徴とする組換
えＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドの精製方法を提供する。
【０００５】 さらなる態様において、本発明は、さらに： ｉ）ヒスチジンタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドをコードしてい
るｃＤＮＡを含む組換えベクターを構築し； ｉｉ）（ａ）において構築された組換えベクターによってコードされるポリペ
プチドを適当な宿主中で発現させ； ｉｉｉ）回収培地または細胞ライゼートからポリペプチドを単離し； ｉｖ）金属マトリックスアフィニティーカラム、好ましくはニッケルカラムを
用いてポリペプチドを精製し；次いで ｖ）プロテアーゼ切断によってヒスチジンタグを除去する前工程を特徴とする
方法を提供する。
【０００６】 該前工程（ｉ）〜（ｖ）は、組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドを含む溶液
を高純度で調製するために実施される任意の工程である。次いで、このような溶
液を上記の工程（ａ）〜（ｃ）の処理に付してもよい。
【０００７】 さらなる具体例において、工程（ｉ）〜（ｖ）はまた、上記の精製工程（ａ）
〜（ｃ）とは無関係に実施してもよい。これらの環境下で、そのようにして調製
されたＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドを所望により、当該分野でよく知られたさ
らなる精製工程を包含するさらなる処理工程に付してもよい。
【０００８】 好ましい具体例において、工程（ｉ）の組換えベクターは、式（Ｉ）： Ｈｉｓ（ｎ）−Ｘ（ｒ）−ＬＤＬ-ＰＬＡ２−Ｙ（ｓ）−Ｈｉｓ（ｐ） （Ｉ） ［式中、 Ｈｉｓは天然のアミノ酸ヒスチジンを示し； ＬＤＬ−ＰＬＡ２は： ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ペプチド； ｂ）配列番号１の配列を有するポリペプチド； ｃ）配列番号２のポリヌクレオチドに対し少なくとも９５％の同一性を有する
ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
および ｄ）配列番号２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
または（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドの活性フラグメントよりなる群から選択さ
れるポリペプチドを含むポリペプチドを示し； Ｘ、Ｙはプロテアーゼ切断部位であり； ｎおよびｐは同一であっても異なっていてもよく、０〜１０であり； ｒおよびｓは同一であっても異なっていてもよく、０または１である］ で示されるヒスチジンタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドの発現を指
示する。
【０００９】 好ましい具体例において、ｎまたはｐは６であり、それにより、「ヘキサ−ヒ
スチジン」（ヘキサ−ｈｉｓ）タグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドを
提供し、該タグはＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドまたはそのフラグメントのＮ末
端（ｎが６の場合）またはＣ末端（ｐが６の場合）に位置する。特に好ましい具
体例において、ｎは６であってｐは０であり、ヘキサ−ｈｉｓタグをＮ末端に有
するＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドを提供する。好ましくは、ＸおよびＹは、エ
ンドペプチダーゼ切断によるポリヒスチジンタグの除去を容易にするためのエン
ドペプチダーゼ切断部位である。より好ましくは、ＸおよびＹはエンテロキナー
ゼ切断部位である。
【００１０】 好ましくは、ｒおよびｓのうち１つは１であり、他方は０である。より好まし
くは、ｒは１であって、ｓは０である。
【００１１】 本発明のＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドは、成熟ポリペプチドのコーディング
配列、例えば、配列番号２のヌクレオチド配列を単独で；または遺伝コードの重
複（縮重）の結果として、配列番号１のポリペプチドをコードする配列番号２に
含有される配列以外の配列；あるいはリーダーまたは分泌配列、プレ−またはプ
ロ−またはプレプロ−タンパク質配列または他の融合ペプチド部分をコードして
いる配列のような他のコーディング配列を有するリーディングフレーム中の成熟
ポリペプチドのコーディング配列を含んでいてもよいポリヌクレオチドから発現
される。ポリヌクレオチドは、また、転写、非翻訳配列、スプライシングおよび
ポリアデニル化シグナル、リボソーム結合部位およびｍＲＮＡを安定化させる配
列のような非コーディング５’および３’配列を含有していてもよい。
【００１２】 本発明の組換えポリペプチドは、発現ベクターを含む遺伝学的に操作された宿
主細胞から、当該分野でよく知られた方法によって調製してもよい。したがって
、さらなる態様において、本発明は、本発明のポリヌクレオチド（複数であって
もよい）を含む発現ベクターに関する。種々の発現ベクター、例えば、染色体、
エピソームおよびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バク
テリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメン
ト由来、酵母染色体エレメント由来、バキュロウイルス、ＳＶ４０のようなパポ
ーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、偽狂犬病
ウイルスおよびレトロウイルスのようなウイルス由来のベクター、およびそれら
の組み合わせ由来のベクター、例えば、コスミドおよびファージミドのようなプ
ラスミドおよびバクテリオファージ遺伝子エレメント由来のベクターを本発明の
方法に使用することができる。発現ベクターは、発現を調節ならびに発生させる
調節領域を含有していてもよい。一般に、宿主中でポリペプチドを生産するため
にポリヌクレオチドを維持、増殖または発現させることのできるいずれのベクタ
ーを使用してもよい。適当なヌクレオチド配列は、例えば、Sambrookら、Molecu
lar Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)に記載の方法のような種々のよく知ら
れた慣用技術のうちのいずれかによって、発現ベクター中に挿入してもよい。翻
訳されたタンパク質が小胞体内腔、細胞周辺腔または細胞外環境内に分泌される
ように、適当な分泌シグナルを所望のポリペプチド中に組み込んでもよい。これ
らのシグナルは、ポリペプチドに対して内因性であってもよく、またはそれらは
異種シグナルであってもよい。好ましい具体例において、組換えベクターはバキ
ュロウイルスベクターである。より好ましい具体例において、ヘキサ−ｈｉｓタ
グを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２を発現する場合、組換えベクターはＮ末端ヘキサ
−ｈｉｓタグベクター、ｐＢｌｕｅｂａｃＨｉｓ２Ｂ（InVitrogenより入手可能
）よりなる。
【００１３】 無細胞翻訳系もまた、該組換えベクター由来のＲＮＡを用いる本発明のＬＤＬ
−ＰＬＡ２ポリペプチドを生産するために使用できることは明らかであろう。
【００１４】 さらなる態様において、本発明は、本発明の組換えベクターで形質転換された
宿主細胞に関する。適当な宿主細胞の代表例は、連鎖球菌、ブドウ状球菌、イー
・コリ、ストレプトミセス属およびバシラス・サチリス（Bacillus subtilis）
細胞のような細菌細胞；酵母細胞およびアスペルギルス細胞のような真菌細胞；
ドロソフィラ（Drosophila）Ｓ２およびスポドプテラ（Spodoptera）Ｓｆ９細胞
のような昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＢＨＫ、Ｈ
ＥＫ２９３およびボウズ（Bowes）黒色腫細胞のような動物細胞；および植物細
胞を包含する。好ましくは、昆虫細胞スポドプテラＳｆ９細胞を宿主細胞として
使用する。組換えベクターの宿主細胞への導入は、Davisら、Basic Methods in
Molecular Biology (1986)およびSambrookら（上掲）のような多くの標準的研究
室マニュアルにおいて記載された方法によって行うことができる。好ましいこの
ような方法は、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デ
キストラン媒介トランスフェクション、マイクロインジェクション、カチオン性
脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、トランスダクション
、スクレープ・ローディング（scrape loading）、バリスティック導入または感
染を包含する。
【００１５】 さらなる態様において、本発明は、上記の方法によって得られるＬＤＬ−ＰＬ
Ａ２を提供する。タグを除去したＬＤＬ−ＰＬＡ２（すなわち、ｈｉｓタグを除
去した）は、Ｋｍおよびｋｃａｔ値がわずかに異なるが、天然供給源から単離さ
れたＬＤＬ−ＰＬＡ２タンパク質と非常に類似した活性プロファイルを有し、単
一分子種として単離される。本発明の方法によって得られるＬＤＬ−ＰＬＡ２は
、酵素の活性の解明に貢献するであろう構造およびメカニズム研究に用いてもよ
く、また、イン・ビボでの酵素の活性に対して洞察を与える。本発明のベクター
および方法を用いて生産および精製されたＬＤＬ−ＰＬＡ２酵素は、酵素活性の
阻害または活性化のいずれかによって、該酵素と相互作用する化合物を同定する
ためのスクリーニングにおいて使用することができる。さらに、本発明のＬＤＬ
−ＰＬＡ２酵素は、例えば、診断のような応用に使用するためのモノクローナル
またはポリクローナル抗体を生産するために使用してもよい。
【００１６】 下記の定義は、上記で頻繁に使用されるある特定の用語の理解を助けるために
提供される。 「ＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチド」なる語は： ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するポリ
ペプチド； ｂ）配列番号１の配列を有するポリペプチド； ｃ）配列番号２のポリヌクレオチドに対し少なくとも９５％の同一性を有する
ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
および ｄ）配列番号２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
または（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドの活性フラグメントよりなる群から選択さ
れるポリペプチドを含むポリペプチドである。
【００１７】 活性フラグメントは、配列番号１のポリペプチドに対し少なくとも９５％の同
一性を有するポリペプチド由来のポリペプチドであり、それはＬＤＬ−ＰＬＡ２ 活性を示す。このようなフラグメントは、当該分野でよく知られた方法を用いて
、単離したＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドのタンパク質分解性切断によって形成
されてもよく、または組換えＤＮＡ技術を用いてポリペプチドフラグメントとし
て合成されてもよい。組換え技術によって生産されたＬＤＬ−ＰＬＡ２活性フラ
グメントは、さらなる処理を必要としない成熟ポリペプチドとして、または次い
で活性フラグメントを放出するように処理されるより大きなポリペプチドの一部
として合成されてもよい。
【００１８】 そのフラグメントを包含するこのようなＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドは、付
加的に、リーダーまたは分泌ポリペプチド配列またはプレ−、プロ−もしくはプ
レプロ−ポリペプチド配列のような他のタンパク質またはポリペプチドと融合し
ていてもよい。
【００１９】 限定するものではないが、特許および特許出願を包含する本明細書に引用した
全出版物は、本明細書において、あたかも個々の出版物が特別に個別に、出典明
示により十分に記載されるかのごとく本明細書の一部とされることを意図された
かのように、出典明示により本明細書の一部とされる。 本発明は、ここに、下記の実施例によって説明される。
【００２０】 実施例 実施例１−バキュロウイルス発現トランスファーベクターの構築 Ａ）ＬＤＬ−ＰＬＡ２ ＬＤＬ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡ（ＷＯ９５／００６４９、SmithKline Beecham）を
ＸｂａＩおよびＸｈｏＩで消化し、標準技術（Sambrookら（上掲））を用いて、
約１．３ｋｂフラグメントをＸｂａＩおよびＸｈｏＩで切断したｐＢａｃＰａｃ
９ベクター（Clontech）中に連結した。
【００２１】 Ｂ）ヘキサ−ｈｉｓタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２ ｈｉｓ−タグ融合発現のために、ＬＤＬ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡ（ＷＯ９５／００
６４９、SmithKline Beecham）をＨｉｎｃＩＩ−ＸｈｏＩで消化し、１２０６ｂ
ｐフラグメントをｐＢｌｕｅｂａｃＨｉｓ２Ｂ（InVitrogen）のＮ末端ヘキサ−
ｈｉｓタグを用いてフレーム内でサブクローン化した。これを容易にするために
、ｐＢｌｕｅｂａｃＨｉｓ２ＢをＢａｍＨＩで切断し、ＤＮＡポリメラーゼ大型
（クレノウ）フラグメントを用いることによって５’突出末端を平滑末端に変え
、次いで、ＸｈｏＩでさらに消化した。次いで、標準技術（Sambrookら（上掲）
）を用いて、１２０６ｂｐ ＨｉｎｃＩＩ−ＸｈｏＩ ＬＤＬ−ＰＬＡ２フラグメ
ントをベクターフラグメント中に連結した。ＬＤＬ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡの該１２
０６ｂｐフラグメントは、推定のシグナルペプチドを包含するＮ末端の３９個の
アミノ酸を欠失するポリペプチドをコードする。ヒト血漿試料の以前の分析では
、最初の４１個のアミノ酸が除去された酵素がヒト血漿由来の単離形態であるこ
とが示された（Stafforini D.M.ら、(1997), J Biol. Chem. 272, 17895-17898
）。タグを除去したタンパク質が配列ＤＰＳＳＲＳＡＡＧＴＭＮＫＩＱＶＬ（下
線はＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチド配列の開始を示す）で開始するように、上記
のように、ヘキサ−ｈｉｓタグおよびエンテロキナーゼ部位をＬＤＬ−ＰＬＡ２ ポリペプチド中に導入した。
【００２２】 実施例２−細胞培養およびトランスフェクション スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）細胞系統をthe European Collection
of Animal Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）から入手した。細胞は、慣例により、
振盪フラスコ培養として維持され、０．２−２ｘ１０６細胞ｍｌ−１の濃度範囲
で培養し、１２０−１６０ｒｐｍで振盪し、２７℃でインキュベートした。細胞
は、慣例により、１ｘ脂質補足剤、１ｘ酵母限外濾過液および０．２％Ｐｌｕｒ
ｏｎｉｃＦ−６８を含有するＩＰＬ−４１（Life Technologies, Inc）中で培養
した。全ての補足剤はSigma-Aldrichより入手した。胎仔ウシ血清（５％ｖ／ｖ
）を長期保管のためのウイルスストックに添加して、ウイルス力価の喪失を防い
だ。組換えウイルスの単離は、製造者のガイドラインに従い、Ｂｓｕ ３６Ｉ消
化ＡｃＭＮＰＶ ＤＮＡ（Ｂａｃ−Ｎ−Ｂｌｕｅ；InVitrogen）を用いる移入プ
ラスミドのリポソーム媒介トランスフェクションを用いて行われた。組換えウイ
ルスプラークをアガロースオーバーレイから単離し、新鮮なＳｆ９細胞を再感染
させるために用いた。酵素活性は、以前に記載されたように細胞ライゼートから
測定した（Tew, D.Gら(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16, 591-599
）。
【００２３】 大規模なタンパク質発現の場合、培養物の同時感染を確実にするために、１．
５−２ｘ１０６細胞ｍｌ−１の細胞濃度で血清不含培養物に適当な組換えバキュ
ロウイルスを細胞あたり５ウイルス粒子の感染多重度（ｍｏｉ）で感染させた。
時間推移研究は感染後４４−４８時間で細胞生存力の著しい喪失を示し、次いで
培養培地中に酵素活性の喪失を伴うので、該時点で培養物を遠心分離（１０００
ｘｇ、１０分）によって回収した。
【００２４】 実施例３−組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２の精製 細胞ライゼートは、１Ｌ培養基由来の実施例１Ａの発現ベクターを含むＳｆ９
細胞を溶解バッファー４０ｍｌ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１
０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌペプスタチンＡ
、０．０１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、０．０１ｍｇ／ｍｌロイペプチン、０．０
１ｍｇ／ｍｌアンチパイン、０．０５ｍｇ／ｍｌベンズアミジン、ｐＨ７．５）
中に再懸濁することによって調製した。細胞を液体窒素を用いる３回の冷凍−解
凍に付した。放出されるＤＮＡに起因する試料の粘性を減少させるために、ＤＮ
Ａｓｅ（２ｍｇ）を加えた。ライゼートを１８０００ｘｇで３０分間遠心分離し
て、細胞破片をペレット化した。上澄液を予め平衡化した（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ
、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）１００ｍｌの亜鉛キ
レーティングセファロース（chleating Sepharose）カラム上に添加し、４カラ
ム容量の平衡化バッファーを用いて洗浄した。ＬＤＬ−ＰＬＡ２を５０ｍＭＴｒ
ｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、５０ｍＭイミダ
ゾールを用いて溶出した。活性フラクションをプールし、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ
中における１Ｍ ＭＥＳ酸溶液の滴下によってｐＨを６．０に減少させた。ｐＨ
の調整後、試料を５０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ
、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．０中で予め平衡化した１００ｍｌのブルーセファ
ロースカラム上に添加した。カラムを５カラム容量の平衡化バッファー、次いで
、８カラム容量の５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５Ｍ ＮａＣ
ｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で洗浄した。ＬＤＬ−ＰＬＡ２は、５カラム
容量の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、２Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤ
ＴＡ、ｐＨ８．５を用いて溶出された。活性フラクションをプールし、限外濾過
（ＹＭ３０）によって濃縮し、次いで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰ
Ｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０に対して４℃で透析した。透析後、タンパク
質溶液を遠心分離（１８０００ｘｇ）していずれの沈殿物も除去した。上澄液を
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０で予
め平衡化した高性能Ｑセファロース（high performance Q Sepharose）カラム（
８ｍｌ、ＨＲ１０／１０）上に添加した。２８０ｎｍの吸光度が安定したベース
ラインに達するまでカラムを平衡化バッファーで洗浄した。ＬＤＬ−ＰＬＡ２は
、１５カラム容量に及ぶ０−１．０Ｍ ＮａＣｌの線形勾配を用いて溶出された
。活性は約０．４Ｍ塩で溶出した。活性フラクションをプールし、限外濾過（Ｙ
Ｍ３０）によって濃縮し、純粋な物質を４℃で保管した。
【００２５】 実施例４−ヘキサ−ｈｉｓタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２の精製 細胞ライゼートは、１Ｌ培養基由来の実施例１Ｂの発現ベクターを含むＳｆ９
細胞を溶解バッファー４０ｍｌ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１
０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１ｍｇ／ｍｌペプスタチンＡ
、０．０１ｍｇ／ｍｌアプロチニン、０．０１ｍｇ／ｍｌロイペプチン、０．０
１ｍｇ／ｍｌアンチパイン、０．０５ｍｇ／ｍｌベンズアミジン、ｐＨ７．５）
中に再懸濁することによって調製した。細胞を液体窒素を用いる３回の冷凍−解
凍に付した。放出されるＤＮＡに起因する試料の粘性を減少させるために、ＤＮ
Ａｓｅ（２ｍｇ）を加えた。ライゼートを１８０００ｘｇで３０分間遠心分離し
て、細胞破片をペレット化した。上澄液を予め平衡化したニッケルＮＴＡカラム
（５ｍｌ）上に直接添加し、２８０ｎｍの吸光度がベースラインに達するまで、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭイミダゾール、０．５Ｍ
ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて洗浄した。ヘキサ−ｈｉｓタグを付加したＬＤＬ
−ＰＬＡ２は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５Ｍイミダゾー
ル、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を用いて溶出した。活性フラクションをプ
ールし、Ａｍｉｃｏｎ ＹＭ３０膜上の限外濾過によって濃縮した。５０ｍＭ Ｍ
ＥＳ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．０に対して４℃にて
一晩透析後、ヘキサ−ｈｉｓタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２を透析バッファー
中で予め平衡化した１ｍｌハイトラップ・ブルー（Hi-Trap Blue）（Pharmacia
）カラム上に添加した。カラムを８カラム容量の透析バッファー、次いで、５カ
ラム容量の５０ｍＭ ＭＯＰＳ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐ
Ｈ７．５で洗浄した。ヘキサ−ｈｉｓタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２活性は、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１０ｍＭ ＣＨＡＰＳ、２Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５で溶出
された。活性フラクションをプールし、濃縮し（Amicon YM30)、４℃で保管した
。製造者のプロトコール（R&D Systems）に従い、組換えエンテロキナーゼを用
いてヘキサ−ｈｉｓタグを除去した。簡単に言えば、０．０５ｍｇの純粋なＬＤ
Ｌ−ＰＬＡ２を１単位のエンテロキナーゼと一緒に切断バッファー（２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２、ｐＨ７．４）の存在下、室
温にて１６時間インキュベートした。タグの除去は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗
−ヘキサ−ｈｉｓ抗体を用いるウェスタンブロッティングの両方によって確認さ
れた。ヘキサ−ｈｉｓタグの除去後、上記で用いたニッケルＮＴＡカラム上に添
加することによってＬＤＬ−ＰＬＡ２をさらに精製した。タグを除去したＬＤＬ
−ＰＬＡ２は、ボイド容積中に溶出した。活性タンパク質は４℃で保管した。
【００２６】 実施例５ ＬＤＬ−ＰＬＡ２アッセイ 全アッセイは、別記しないかぎり、３７℃にて５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０
ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．４中で行った。合成ＬＤＬ−ＰＬＡ２基質ＤＮＧＰ
（１−デカノイル−２−（４−ニトロフェニルグルタリル）ホスファチジルコリ
ン）をメタノール中の１０ｍＭストック溶液として調製し、必要に応じてバッフ
ァー中に希釈した。ＬＤＬ−ＰＬＡ２を３７℃でバッファー中における５０μＭ
ＤＮＧＰに添加した。吸光度の増加は、カイネティック・モードにおいて運転
するダイオードアレイ分光光度計（Hewlet-Packard）または９６ウェルプレート
リーダー（Molecular Devices, Tmax）のいずれかを用いて４００ｎｍで追跡さ
れた。生産物は、公知の吸光率、ε４００＝１５０００ｃｍ−１Ｍ−１を用いて
定量した。ＫｍおよびＫｃａｔは、５〜２００μＭの濃度範囲の基質に対して速
度を測定することによって決定した。次いで、Grafit（Leatherbarrow, R.J. (1
992) Grafit Version 3.0, Erithacus Software Ltd., Staines, U.K.）を用い
る非線形回帰によって、初速度を下記の方程式（１）に適合させた。 速度＝ｋｃａｔ ＊［Ｅ］＊［Ｓ］／（Ｋｍ＋［Ｓ］） （１） タンパク質は、Pierce BCAアッセイキットを用いて、製造者の指示にしたがっ
て測定した。
【００２７】 表１は、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞系において発現された組換えＬＤＬ
−ＰＬＡ２の精製を要約する。Ｚｎ２＋キレーティングセファロースカラムから
ＬＤＬ−ＰＬＡ２を溶出するために用いたイミダゾールの吸光度が２８０ｎｍで
のタンパク質の吸光度を覆い隠すので、該カラムについて図を示さない。表１の
データは該工程が精製に関して非生産的であることを示唆するが、すなわち、精
製度１が示されるが、該工程に含まれるものは、良好な総合的精製を得るために
必須であることがわかった。該工程はおそらく、ＣＨＡＰＳによって可溶化され
る脂質および非タンパク質性物質の除去に効果的であり、さもなければ、それは
下流のクロマトグラフィーに不利な影響を及ぼす。工程２のブルーセファロース
クロマトグラフィーは、透析を必要とせずにＺｎ２＋キレーティングセファロー
ス溶出液のｐＨの迅速な調整を可能にする。天然酵素の精製（Tew, DGら、(1996
) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16, 591-599）と同様に、ブルーセファ
ロースクロマトグラフィーは、組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２のための重要な精製工程
を提供し、バッチ様式の洗浄ならびにｐＨおよび塩濃度段階の組み合わせを用い
る溶出を用いて容易に達成される。最終的に、陰イオン交換クロマトグラフィー
が高純度および高収率のタンパク質を提供する。全ＬＤＬ−ＰＬＡ２活性は単一
のピークとして溶出する。この第３および最終工程における見かけの収率が＞１
００％であることに注目されたい。おそらく、該工程の前にＺｎ２＋キレーティ
ングセファロースおよびブルーセファロースクロマトグラフィー中を通過した脂
質成分が該ホスホリパーゼの阻害剤として作用しうる。そこで、陰イオン交換に
おける該阻害成分の除去が見かけの＞１００％収率の原因となるのであろう。
【００２８】 Ｎ末端配列決定を用いて、ＬＤＬ−ＰＬＡ２としての精製タンパク質の同一性
を確認した。しかしながら、Ｎ末端配列決定はいくつかのＮ末端を示した。配列
決定データの注意深いデコンヴォリューションは、精製ＬＤＬ−ＰＬＡ２におい
て少なくとも３つのＮ末端が存在することを示した。３つのＮ末端の全ては、Ｌ
ＤＬ−ＰＬＡ２由来であったが、予想される全長遺伝子産物由来のものはなかっ
た。これらのデータを表２に示す。
【００２９】
【表１】 （上記のデータは２．５Ｌの粗細胞ライゼート由来である）
【００３０】
【表２】
【００３１】 ヘキサ−ｈｉｓタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２の精製を表３に要約する。第
１工程はＮＴＡ−ニッケルカラムである。濃縮および透析後、ブルーセファロー
スクロマトグラフィーにより、妥当な非活性および高純度のタンパク質を得る。
精製のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ブルーセファロースクロマトグラフィー後に単
一のタンパク質が存在することを示す。エンテロキナーゼを用いるタグの除去、
次いで、ＮＴＡ−ニッケルカラムの反復により、ここでボイド容積中に溶出する
均一のタグを除去したＬＤＬ−ＰＬＡ２を得る。Ｎ末端配列決定により、タグを
除去したタンパク質のＮ末端の信憑性を確認した。
【００３２】 各々、タグを除去したＬＤＬ−ＰＬＡ２について得られたＫｍ値は２０μＭで
あり、一方、ｋｃａｔ値は６８ｓ−１である。比較すると、ヒト血漿から精製さ
れたＬＤＬ−ＰＬＡ２は、１２μＭのＫｍ値および１００ｓ−１のｋｃａｔ値を
有する（Tew, DGら、(1996) Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 16, 591-599
）。したがって、ＬＤＬ−ＰＬＡ２のタグを除去した組換え形態は、ヒト血漿か
ら単離された天然酵素に著しく類似する。わずかに小さいＫｍ値は、該タンパク
質のＮ末端の欠失に起因しうる。
【００３３】
【表３】
【００３４】 配列情報 配列番号１−ＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドのアミノ酸配列 MVPPKLHVLFCLCGCLAVVYPFDWQYINPVAHMKSSAWVNKIQVLMAAASFGQTKIPRGNGPYSVGCTDLMF DHTNKGTFLRLYYPSQDNDRLDTLWIPNKEYFWGLSKFLGTHWLMGNILRLLFGSMTTPANWNSPLRPGEKY PLVVFSHGLGAFRTLYSAIGIDLASHGFIVAAVEHRDRSASATYYFKDQSAAEIGDKSWLYLRTLKQEEETH IRNEQVRQRAKECSQALSLILDIDHGKPVKNALDLKFDMEQLKDSIDREKIAVIGHSFGGATVIQTLSEDQR FRCGIALDAWMFPLGDEVYSRIPQPLFFINSEYFQYPANIIKMKKCYSPDKERKMITIRGSVHQNFADFTFA TGKIIGHMLKLKGDIDSNAAIDLSNKASLAFLQKHLGLHKDFDQWDCLIEGDDENLIPGTNINTTNQHIMLQ NSSGIEKYN
【００３５】 配列番号２−ＬＤＬ−ＰＬＡ２のヌクレオチド配列 10 20 30 40 50 TGAGAGACTAAGCTGAAACTGCTGCTCAGCTCCCAAGATGGTGCCACCCA M V P P K 60 70 80 90 100 AATTGCATGTGCTTTTCTGCCTCTGCGGCTGCCTGGCTGTGGTTTATCCT L H V L F C L C G C L A V V Y P 110 120 130 140 150 TTTGACTGGCAATACATAAATCCTGTTGCCCATATGAAATCATCAGCATG F D W Q Y I N P V A H M K S S A W 160 170 180 190 200 GGTCAACAAAATACAAGTACTGATGGCTGCTGCAAGCTTTGGCCAAACTA V N K I Q V L M A A A S F G Q T K 210 220 230 240 250 AAATCCCCCGGGGAAATGGGCCTTATTCCGTTGGTTGTACAGACTTAATG I P R G N G P Y S V G C T D L M 260 270 280 290 300 TTTGATCACACTAATAAGGGCACCTTCTTGCGTTTATATTATCCATCCCA F D H T N K G T F L R L Y Y P S Q 310 320 330 340 350 AGATAATGATCGCCTTGACACCCTTTGGATCCCAAATAAAGAATATTTTT D N D R L D T L W I P N K E Y F W 360 370 380 390 400 GGGGTCTTAGCAAATTTCTTGGAACACACTGGCTTATGGGCAACATTTTG G L S K F L G T H W L M G N I L 410 420 430 440 450 AGGTTACTCTTTGGTTCAATGACAACTCCTGCAAACTGGAATTCCCCTCT R L L F G S M T T P A N W N S P L 460 470 480 490 500 GAGGCCTGGTGAAAAATATCCACTTGTTGTTTTTTCTCATGGTCTTGGGG R P G E K Y P L V V F S H G L G A 510 520 530 540 550 CATTCAGGACACTTTATTCTGCTATTGGCATTGACCTGGCATCTCATGGG F R T L Y S A I G I D L A S H G 560 570 580 590 600 TTTATAGTTGCTGCTGTAGAACACAGAGATAGATCTGCATCTGCAACTTA F I V A A V E H R D R S A S A T Y 610 620 630 640 650 CTATTTCAAGGACCAATCTGCTGCAGAAATAGGGGACAAGTCTTGGCTCT Y F K D Q S A A E I G D K S W L Y 660 670 680 690 700 ACCTTAGAACCCTGAAACAAGAGGAGGAGACACATATACGAAATGAGCAG L R T L K Q E E E T H I R N E Q 710 720 730 740 750 GTACGGCAAAGAGCAAAAGAATGTTCCCAAGCTCTCAGTCTGATTCTTGA V R Q R A K E C S Q A L S L I L D 760 770 780 790 800 CATTGATCATGGAAAGCCAGTGAAGAATGCATTAGATTTAAAGTTTGATA I D H G K P V K N A L D L K F D M 810 820 830 840 850 TGGAACAACTGAAGGACTCTATTGATAGGGAAAAAATAGCAGTAATTGGA E Q L K D S I D R E K I A V I G 860 870 880 890 900 CATTCTTTTGGTGGAGCAACGGTTATTCAGACTCTTAGTGAAGATCAGAG H S F G G A T V I Q T L S E D Q R 910 920 930 940 950 ATTCAGATGTGGTATTGCCCTGGATGCATGGATGTTTCCACTGGGTGATG F R C G I A L D A W M F P L G D E 960 970 980 990 1000 AAGTATATTCCAGAATTCCTCAGCCCCTCTTTTTTATCAACTCTGAATAT V Y S R I P Q P L F F I N S E Y 1010 1020 1030 1040 1050 TTCCAATATCCTGCTAATATCATAAAAATGAAAAAATGCTACTCACCTGA F Q Y P A N I I K M K K C Y S P D 1060 1070 1080 1090 1100 TAAAGAAAGAAAGATGATTACAATCAGGGGTTCAGTCCACCAGAATTTTG K E R K M I T I R G S V H Q N F A 1110 1120 1130 1140 1150 CTGACTTCACTTTTGCAACTGGCAAAATAATTGGACACATGCTCAAATTA D F T F A T G K I I G H M L K L 1160 1170 1180 1190 1200 AAGGGAGACATAGATTCAAATGCAGCTATTGATCTTAGCAACAAAGCTTC K G D I D S N A A I D L S N K A S 1210 1220 1230 1240 1250 ATTAGCATTCTTACAAAAGCATTTAGGACTTCATAAAGATTTTGATCAGT L A F L Q K H L G L H K D F D Q W 1260 1270 1280 1290 1300 GGGACTGCTTGATTGAAGGAGATGATGAGAATCTTATTCCAGGGACCAAC D C L I E G D D E N L I P G T N 1310 1320 1330 1340 1350 ATTAACACAACCAATCAACACATCATGTTACAGAACTCTTCAGGAATAGA I N T T N Q H I M L Q N S S G I E 1360 GAAATACAATT K Y N
【００３６】 実施例１Ａに記載されたサブクローニングに使用されるＸｂａＩおよびＸｈｏ
Ｉ部位は、ＬＤＬ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡ（ＷＯ９５／００６４９、SmithKline Bee
cham）を含むλＵｎｉｚａｐ ＸＲベクター（Stratagene）ベクターによって提
供された。したがって、上記の配列には示さない。 実施例１Ｂに記載のサブクローニングに使用される位置１５２のＨｉｎｃＩＩ
部位には、下線が付される。ＸｈｏＩ部位は、ＬＤＬ−ＰＬＡ２ｃＤＮＡ（ＷＯ
９５／００６４９，SmithKline Beecham）をクローニングするために使用された
λＵｎｉｚａｐ ＸＲベクター中において終止コドンの約４０ｂｐ下流にある。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ａ６１Ｋ 38/46 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ヘレン・ボイド イギリス、シーエム19・５エイダブリュ ー、エセックス、ハーロウ、サード・アベ ニュー、ニュー・フロンティアーズ・サイ エンス・パーク・サウス、スミスクライ ン・ビーチャム・ファーマシューティカル ズ (72)発明者 デイビッド・グラハム・テュウ アメリカ合衆国19406ペンシルベニア州キ ング・オブ・プルシア、スウェードラン ド・ロード709番、スミスクライン・ビー チャム・ファーマシューティカルズ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA11 CA04 CA07 DA02 EA02 EA04 GA13 HA03 4B050 CC04 CC05 DD11 EE01 FF01C FF03E FF05E FF14E FF20C LL01 LL03 LL05 4B065 AA90X AA93Y AB01 AC14 BA05 BB01 BC03 BC11 BC26 BD01 BD15 BD17 BD45 CA31 CA44 CA46 4C084 AA06 BA23 CA25 CA49 CA53 CA56 DC02 NA14 ZB112 4H045 AA20 BA10 CA40 DA89 EA20 EA50 FA74 GA01 GA15 GA26

Claims (13)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ａ）組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドを含有する細胞抽
    出液、上澄液または溶液を亜鉛キレートカラムに付し； ｂ）（ａ）由来の溶出液をブルーセファロースカラムに付し；次いで ｃ）（ｂ）由来の溶出液をＱセファロースカラムに付す工程を特徴とする組換
    えＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドの精製方法。
  2. 【請求項２】 さらに、 ａ）ヒスチジンタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドをコードしてい
    るｃＤＮＡを含む組換えベクターを構築し； ｂ）（ａ）において構築された組換えベクターによってコードされるポリペプ
    チドを適当な宿主中で発現させ； ｃ）回収培地または細胞ライゼートからポリペプチドを単離し； ｄ）金属マトリックスアフィニティーカラムを用いてポリペプチドを精製し；
    次いで ｅ）プロテアーゼ切断によってヒスチジンタグを除去する前工程を特徴とする
    請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 金属マトリックスアフィニティーカラムがニッケルマトリッ
    クスである請求項２記載の方法。
  4. 【請求項４】 組換えＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドがバキュロウイルス／
    スポドプテラ・フルギペルダ（ｓｆ９）発現系において発現される請求項１〜３
    のいずれか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 ａ）ヒスチジンタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチ
    ドをコードしているｃＤＮＡまたはそのフラグメントを含む組換えベクターを構
    築し； ｂ）（ａ）において構築された組換えベクターによってコードされるポリペプ
    チドを適当な宿主中で発現させ； ｃ）回収培地または細胞ライゼートからポリペプチドを単離し； ｄ）金属マトリックスアフィニティーカラムを用いてポリペプチドを精製し；
    次いで ｅ）プロテアーゼ切断によってヒスチジンタグを除去する工程を特徴とする組
    換えＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドの精製方法。
  6. 【請求項６】 ＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドが： ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するポリ
    ペプチド； ｂ）配列番号１の配列を有するポリペプチド； ｃ）配列番号２のポリヌクレオチドに対し少なくとも９５％の同一性を有する
    ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
    および ｄ）配列番号２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
    または（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドのフラグメントよりなる群から選択される
    ポリペプチドを含む請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 式（Ｉ）： Ｈｉｓ（ｎ）−Ｘ（ｒ）−ＬＤＬ-ＰＬＡ２−Ｙ（ｓ）−Ｈｉｓ（ｐ）
    （Ｉ） ［式中、 Ｈｉｓは天然のアミノ酸ヒスチジンを示し； ＬＤＬ−ＰＬＡ２は： ａ）配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有するポリ
    ペプチド； ｂ）配列番号１の配列を有するポリペプチド； ｃ）配列番号２のポリヌクレオチドに対し少なくとも９５％の同一性を有する
    ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド；
    および ｄ）配列番号２のポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド；
    または（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドの活性フラグメントよりなる群から選択さ
    れるポリペプチドを含むポリペプチドを示し； Ｘ、Ｙはプロテアーゼ切断部位であり； ｎおよびｐは同一であっても異なっていてもよく、０〜１０であり； ｒおよびｓは同一であっても異なっていてもよく、０または１である］ で示されるヒスチジンタグを付加したＬＤＬ−ＰＬＡ２ポリペプチドの発現を指
    示する組換えベクター。
  8. 【請求項８】 コードされるポリペプチドに関し、ｎが６であってｐが０で
    あるか、またはｐが６であってｎが０である請求項７記載の組換えベクター。
  9. 【請求項９】 ＸおよびＹがエンテロキナーゼ切断部位であり、ｒが１であ
    てｓが０であるか、またはｓが１であってｒが０である請求項７または８記載の
    組換えベクター。
  10. 【請求項１０】 ｎが６であり、ｐが０であり、ｒが１であり、ｓが０であ
    って、Ｘがエンテロキナーゼ切断部位である請求項７〜９のいずれか１項記載の
    組換えベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項７〜１０のいずれか１項記載の組換えベクターを含
    む宿主細胞。
  12. 【請求項１２】 昆虫細胞スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｆ９）である請
    求項１１記載の宿主細胞。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜６のいずれか１項記載の方法を用いて調製され
    るＬＤＬ−ＰＬＡ２。
JP2000578462A 1998-10-28 1999-10-27 固定化金属アフィニティークロマトグラフィーを用いる低密度リポタンパク質関連ホスホリパーゼａ２の精製方法 Pending JP2002528084A (ja)

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