JP2002511238A

JP2002511238A - プログラムされた細胞死およびカスパーゼ−１２

Info

Publication number: JP2002511238A
Application number: JP2000543481A
Authority: JP
Inventors: ジュニングユアン，; 信裕森島
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1998-04-16
Filing date: 1999-04-14
Publication date: 2002-04-16
Also published as: AU751167B2; EP1071696A4; AU3492899A; WO1999052925A1; US6642368B1; CA2327516A1; WO1999052925A9; EP1071696A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、カスパーゼ−１２をコードする核酸、ｃａｓｐ−１２核酸によってコードされるタンパク質、ベクター、およびベクターで形質転換した宿主に関する。カスパーゼ−１２はカスパーゼファミリーのメンバーであり、これはまた、哺乳動物インターロイキン１β変換酵素（ＩＣＥ）を含む。カスパーゼは、タンパク質分解事象のカスケードにおいて、アポトーシスの実行段階を実行すると考えられる。本発明はまた、プログラムされた細胞死を誘導するための、カスパーゼ−１２の使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の背景）（連邦政府から後援される研究および開発のもとでなされた発明の権利に関す
る記載）本発明の開発の間に行われた研究の一部は、合衆国政府基金を利用した。合衆
国政府は、本発明に特定の権利を有する。

【０００２】（発明の分野）本発明は、一般に、分子生物学の分野にある。本発明は、プログラムされた細
胞死の制御に関する。

【０００３】（関連分野）（プログラムされた細胞死）プログラムされた細胞死または制御された細胞死としても言及されるアポトー
シスは、生物体が不必要な細胞を排除する過程である。このような細胞死は、加
齢を通じておよび疾患において、動物の発生の正常な局面として、ならびに組織
の再構築および免疫の自己寛容の樹立においてのような組織のホメオスタシスに
おいて生じる（Ｒａｆｆ，Ｍ．Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ３５６：３９７−４００（
１９９２）；Ｇｌｕｃｋｓｍａｎｎ，Ａ．，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．Ｃａｍｂｒｉｄ
ｇｅＰｈｉｌｏｓ．Ｓｏｃ．２６：５９−８６（１９５０）；Ｅｌｌｉｓら，
Ｄｅｖ．１１２：５９１−６０３（１９９１）；Ｖａｕｘら，Ｃｅｌｌ７６：
７７７−７７９（１９９４）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｃ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ
２６７：１４５６−１４６２（１９９５））。プログラムされた細胞死はまた、
細胞数を調節するように、形態発生を促進するように、有害さもなければ異常な
細胞を除去するように、および既に細胞の機能を果たした細胞を排除するように
作用し得る。さらに、プログラムされた細胞死は、低酸素または虚血のような種
々の生理学的ストレスに応じて生ずると考えられている。アポトーシスの形態学
的な特徴としては、原形質膜小疱形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、核質および細胞質
の凝縮、ならびにヌクレオソーム間間隔での染色体ＤＮＡの分解が挙げられる。
（Ｗｙｌｌｉｅ，Ａ．Ｈ．，ＣｅｌｌＤｅａｔｈｉｎＢｉｏｌｏｇｙａ
ｎｄＰａｔｈｏｌｏｇｙ，ＢｏｗｅｎおよびＬｏｃｋｓｈｉｎ編，Ｃｈａｐｍ
ａｎおよびＨａｌｌ（１９８１），第９−３４頁）。

【０００４】アポトーシスは、内因性の細胞自殺機構を介して達成される（Ｗｙｌｌｉｅ，
Ａ．Ｈ．，ＣｅｌｌＤｅａｔｈｉｎＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＰａｔｈｏ
ｌｏｇｙ，ＢｏｗｅｎおよびＬｏｃｋｓｈｉｎ編，ＣｈａｐｍａｎおよびＨａｌ
ｌ（１９８１），第９−３４頁）。そしてアポトーシスは、細胞が内部的にコー
ドされるその自殺プログラムを、内部シグナルまたは外部シグナルのいずれかの
結果として活性化させる場合に生じる。自殺プログラムは、慎重に調節された遺
伝的プログラムの活性化によって実行される（Ｗｙｌｉｅ，Ａ．Ｈ．ら，Ｉｎｔ
．Ｒｅｖ．Ｃｙｔ．６８：２５１（１９８０）；Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｅ．ら，Ａｎ
ｎ．Ｒｅｖ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．７：６６３（１９９１）：Ｙｕａｎ，Ｙ．Ｃｕ
ｒｒ．Ｏｐ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：２１１−２１４（１９９５））。細胞死
はＲＮＡ合成またはタンパク質合成のインヒビターによって妨げられ得るので、
アポトーシスは多くの場合、遺伝子発現を必要とするようである（Ｃｏｈｅｎら
，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：３８−４２（１９８４）；Ｓｔａｎｉｓｉｃら，
Ｉｎｖｅｓｔ．Ｕｒｏｌ．１６：１９−２２（１９７８）；Ｍａｒｔｉｎら，Ｊ
．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０６：８２９−８４４（１９８８））。

【０００５】細胞死の急性および慢性の調節障害（ｄｉｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、多く
の主要なヒト疾患を引き起こすと考えられる（ＢａｒｒらＢｉｏｔｅｃｈ．１
２：４８７−４９３（１９９５）；ＴｈｏｍｐｓｏｎＣ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ２６７：１４５６−１４６２（１９９５））。これらの疾患としては、悪性
状態および前悪性状態、神経学的障害および神経変性障害、心臓病、免疫系障害
、腸障害、腎臓病、老化、ウイルス感染ならびにＡＩＤＳが挙げられるがこれら
に限定されない。

【０００６】悪性状態および前悪性状態は、固形腫瘍、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血
病、前立腺肥大、新生物発生前の肝病巣および化学療法に対する耐性を含み得る
。神経学的障害は、発作、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症、プリオン関
連障害および毛細血管拡張性運動失調を含み得る。心臓病は、虚血性心臓損傷お
よび化学療法によって誘導される心筋損傷を含み得る。免疫系障害は、ＡＩＤＳ
、Ｉ型糖尿病、エリテマトーデス、シェーグレン症候群および糸球体腎炎を含み
得る。腸障害は、赤痢、炎症性腸疾患、ならびに照射によって誘導される下痢お
よびＨＩＶによって誘導される下痢を含み得る。腎臓疾患は、多発性嚢胞腎疾患
および貧血／赤血球生成を含み得る。アポトーシスの調節障害に関するこれらの
多くの病態生理学的な状態に対する特定の参考文献は、Ｂａｒｒら（同書、表１
）に見出され得る。

【０００７】（カスパーゼ）カスパーゼは、アポトーシスの調節に関与するタンパク質のファミリーであり
、以前は、ＩＣＥまたはｃｅｄ−３タンパク質と称された。プログラムされた細
胞死の遺伝学的な経路は、線虫Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ
において確認された（Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｅ．ら，ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ
ｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ７：６６３−６９８（１９９１））。この遺
伝学的な経路において、遺伝子ｃｅｄ−３およびｃｅｄ−４が細胞死に必要とさ
れる。その一方で、別の遺伝子であるｃｅｄ−９は、細胞死のネガティブな調節
因子である。ｃｅｄ−３遺伝子は、システインプロテアーゼをコードする（Ｙｕ
ａｎ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ７５：６４１−６５２（１９９３））。このシステイ
ンプロテアーゼは、カスパーゼ−１とも呼ばれる、哺乳動物のインターロイキン
１β変換酵素（ＩＣＥ）と配列類似性を共有し、この酵素は、プロインターロイ
キン１βのその生物学的に活性な形態へのプロセシングを触媒する（Ｔｈｏｒｎ
ｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３５６：７６８−７７４（１９９２）
）。ＩＣＥおよびＣｅｄ−３の活性中心は、同一のペンタペプチドＱＡＣＲＧ（
配列番号３）で著しく保存されており、この中のシステインが触媒残基である（
Ｙｕａｎ，Ｊ．ら，Ｃｅｌｌ７５：６４１−６５２（１９９３）；Ｔｈｏｒｎ
ｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３５６：７６８−７７４（１９９２）
）。ＩＣＥおよびＣｅｄ−３は、切断のために、Ｐ１位のＡｓｐについて独特の
要求を示し、それらの基質内のＰ２位〜Ｐ４位については異なる選択性を有する
（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３５６：７６８−７７４
（１９９２）；Ｘｕｅ，Ｄ．ら，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
１０：１０７３−１０８３（１９９６））。システインプロテアーゼのＩＣＥ
／Ｃｅｄ−３ファミリーは、最近、名前がカスパーゼと変更され（Ａｌｎｅｍｒ
ｉ，Ｅ．Ｓ．ら，Ｃｅｌｌ８７：１７１（１９９６））、アスパラギン酸に特
異的なシステインプロテアーゼを代表する。少なくとも１０のヒトカスパーゼが
同定されている（Ｓｔｅｎｎｉｃｋｅ，Ｈ．Ｒ．およびＳａｌｖｅｓｅｎ，Ｇ．
Ｓ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（４１）：２５７１９−２５７２３（１
９９７））。

【０００８】ラット線維芽細胞株におけるＩＣＥの過剰発現はアポトーシスを生じ、これは
、線虫の細胞死サプレッサであるＣｅｄ−９のホモログである哺乳動物のＢｃｌ
−２によってブロックされ得る（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ７５：６５３
−６６０（１９９３））。Ｃｅｄ−３がＣ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて同定される
唯一のカスパーゼであるのに対し、哺乳動物においては、少なくとも１２のカス
パーゼが同定されている（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら，ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅ
ｌｏｐｍｅｎｔ８：１６１３−１６２６（１９９４）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら，Ｃ
ｅｌｌ７８：７３９−７５０（１９９４）；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ａｌｎｅｍ
ｒｉ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０７６１−３０７６４（１
９９４）；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ８１：８０１−８０９（１９９５）
；Ｆａｕｃｈｅｕ，Ｃ．ら，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１４：１９１
４−１９２２（１９９５）；Ｍｕｎｄａｙ，Ｎ．Ａ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．２７０：１５８７０−１５８７６（１９９５）；Ｄｕａｎ，Ｈ．ら，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６２１−１６２５（１９９６）；Ｗａｎｇ，Ｓ．
ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０５８０−２０５８７（１９９６）；
ＶａｎｄｅＣｒａｅｎ，Ｍ．ら，ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４０３：６１
−６９（１９９７））。

【０００９】カスパーゼファミリーのメンバーは、発生および成体の生涯の間に、複数の組
織および細胞型において発現される。従って、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓにおいて単一
のｃｅｄ−３遺伝子が全てのプログラムされた細胞死を制御するのとは異なり、
ＣＥＤ−３の複数のホモログが哺乳動物のアポトーシスを調節する。ＩＣＥおよ
びカスパーゼ−３についての変異体であるマウスを産生した遺伝子ノックアウト
実験から、興味深い結果が得られた（Ｌｉ，Ｐ．ら，Ｃｅｌｌ８０：４０１−
４１１（１９９５）；Ｋｕｉｄａ，Ｋ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２６７：２０００
−２００３（１９９５）；Ｋｕｉｄａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３８４：３６８
−３７２（１９９６））。これらの変異マウスの分析から明らかになった結果は
、これらのホモログが、並行する様式および連続的な様式の両方で作用してアポ
トーシスを調節するという仮説を支持する（Ｅｎａｒｉ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ
３８０：７２３−７２５（１９９６））。Ｉｃｅ−／−の胚性線維芽細胞およ
びＢリンパ芽球は、グランザイムＢ誘導アポトーシスに対して耐性である（Ｓｈ
ｉ，Ｌ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１１００
２−１１００７（１９９６））。カスパーゼ−３−／−の変異マウスは脳の発生
を欠損し、それらの胸腺細胞は種々のアポトーシス因子に正常に応答するが、ア
ポトーシスが存在しないことに起因し得る種々の過形成および組織崩壊を提示す
る（Ｋｕｉｄａ，Ｋ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３８４：３６８−３７２（１９９６）
）。これらの結果は、ＩＣＥまたはカスパーゼ−３のいずれかが、特定の細胞に
おける特定の型のアポトーシスに重要である一方で、他の細胞型におけるそれら
の機能が重複性であることを示唆する。

【００１０】カスーパーゼファミリーのインヒビターは、栄養因子欠乏、ＦａｓおよびＴＮ
Ｆのような種々のシグナルによって誘導されるアポトーシスを妨害する。このこ
とは、カスパーゼファミリーのメンバーは、哺乳動物のアポトーシスの決定的な
調節因子であることを示唆する（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら，Ｃｅｌｌ７５：６５３
−６６０（１９９３）；Ｇａｇｌｉａｒｄｉｎｉ，Ｖ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ２
６３：９７−１００（１９９４）；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．およびＤｉｘｉｔ，Ｖ．
Ｍ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：３２５５−３２６０（１９９５））。
細胞が複数のカスパーゼを発現することが見出されたので（Ｗａｎｇ，Ｌ．ら，
Ｃｅｌｌ７８：７３９−７５０（１９９４））、カスパーゼがタンパク質分解
カスケードに作用して細胞の死（ｅｘｅｃｕｔｉｏｎ）を実行し得ることが提唱
されている（Ｅｎａｒｉ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３８０：７２３−７２５（１
９９６））。カスパーゼはプロ形態で合成され、プロ形態のものは、活性化過程
の間での特異的Ａｓｐ残基の後ろでの切断によって活性化される。例えば、活性
なＩＣＥは、その４５ｋＤａの前駆体タンパク質から、４つのＡｓｐ残基での特
異的な切断によって生成される。この切断は、２０ｋＤａ（ｐ２０）サブユニッ
トおよび１０ｋＤａ（ｐ１０）サブユニットを生じる。

【００１１】カスパーゼファミリーに特有の特異性は、プロ形態の活性化が、自己プロセシ
ングまたは他のホモログによる切断のいずれかによって行われることを示唆する
。インビトロでは、プロＩＣＥは活性カスーパーゼ−４によって活性化され得（
Ｆａｕｃｈｅｕ，Ｃ．ら，ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１４：１９１４
−１９２２（１９９５））、プロカスパーゼ−３は、活性なＩＣＥによって活性
化され得（Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．，Ｃｅｌｌ８１：８０１−８０９（１９９５）
；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら，Ｎａｔｕｒｅ３７６：３７−４３（１９
９５））、そしてプロカスパーゼ−３およびプロカスパーゼ−７は、活性なカス
パーゼ−１０によって活性化され得る（Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ−Ａｌｎｅｍｒｉ．
Ｔ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７４６４−７
４６９（１９９６））。抗Ｆａｓ抗体によって誘導されるアポトーシスでは、Ｉ
ＣＥ様活性の一過性の増加は、カスパーゼ−３様活性の上昇の前に検出された。
このことは、プロテアーゼであるカスパーゼファミリーは、タンパク質分解カス
ケードにおいて作用するという見解を支持する（Ｅｎａｒｉ，Ｍ．ら，Ｎａｔｕ
ｒｅ３８０：７２３−７２５（１９９６））。

【００１２】（発明の要旨）本発明において、カスパーゼ−１２（ｃａｓｐ−１２、以前はＩｃｈ−４と称
された）をコードする遺伝子が、縮重ポリメラーゼ連鎖反応により単離され、そ
して配列決定された。ｃａｓｐ−１２は、少なくとも２つの選択的スプライシン
グ産物である、ｃａｓｐ−１２Ｓおよびｃａｓｐ−１２Ｌを有する。ｃａｓｐ−
１２Ｌは、４１９アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを含む。ｃａｓ
ｐ−１２Ｓは、３４９アミノ酸残基のオープンリーディングフレームを含む。以
下のカスパーゼ−１２のフラグメントもまた得られた：ｃａｓｐ−１２Δ（ｃａ
ｓｐ−１２Ｌのアミノ酸残基９５〜４１９についてのオープンリーディングフレ
ームからなる）；およびｃａｓｐ−１２Δ２（ｃａｓｐ−１２Ｌのアミノ酸残基
１４５〜４１９についてのオープンリーディングフレームからなる）。

【００１３】従って、本発明は、特に、図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配列
（配列番号１４）、またはＡＴＣＣ寄託番号２０９７１０に含まれるｃＤＮＡク
ローンによってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む
、単離された核酸分子に関する。本発明はまた、図９に示されるカスパーゼ−１
２Ｓのヌクレオチド配列（配列番号１３）を含む単離された核酸分子；カスパー
ゼ−１２Δ（配列番号２のアミノ酸残基９５〜４１９）をコードするヌクレオチ
ド配列を含む核酸分子；およびカスパーゼ−１２Δ２（配列番号２のアミノ酸残
基１４５〜４１９）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する。本
発明はまた、上記した配列に相補的なヌクレオチド配列を含む核酸分子に関する
。

【００１４】上記した核酸分子のいずれかに、少なくとも８０％、好ましくは８５％または
９０％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％
同一な核酸分子もまた提供される。上記した核酸分子のいずれかに、ストリンジ
ェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子もまた提供される。

【００１５】本発明はまた、上記した核酸分子を含む組換えベクター、およびそのようなベ
クターで形質転換された宿主細胞を提供する。

【００１６】図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配列（配列番号１４）、または
ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコードされ
るアミノ酸配列を含む単離されたポリぺプチド、ならびにカスパーゼ−１２Δの
アミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残基９５〜４１９）を含むポリぺプチド、
およびカスパーゼ−１２Δ２のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残基１４５
〜４１９）を含むポリぺプチドもまた提供される。上記したポリぺプチドのいず
れかに、少なくとも８０％、より好ましくは８５％または９０％、さらにより好
ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なポリぺプチドも
また提供される。

【００１７】細胞にプログラムされた細胞死を誘導するための方法もまた提供され、この方
法は、上記したポリぺプチドをこの細胞に接触させる工程を包含する。

【００１８】ラット線維芽細胞におけるｃａｓｐ−１２Ｌ、ｃａｓｐ−１２Ｓ、およびｃａ
ｓｐ−１２Δの過剰発現は、アポトーシスを引き起こした。カスパーゼ−１２の
アポトーシス活性は、ＣｒｍＡ（これは牛痘ウイルスによってコードされるセル
ピンであり、ＩＣＥの特異的なインヒビターである）、Ｂｃｌ−２（哺乳動物細
胞死サプレッサ）によって阻害し得なかった。プロカスーパーゼ−１２タンパク
質は、インビトロで、カスパーゼファミリーのいくつかの他のメンバーによって
効率的に切断されたが、組換えカスパーゼ−１２タンパク質およびそのフラグメ
ントは、プロカスパーゼ−１２自体を除いた他のカスパーゼを不十分に切断した
。従って、本発明は、アポトーシスを調節する方法を提供し、この方法は、細胞
をｃａｓｐ−１２Ｌ、ｃａｓｐ−１２Ｓ、ｃａｓｐ−１２Δまたはｃａｓｐ−１
２Δ２によってコードされるタンパク質と接触させる工程を包含する。

【００１９】（好ましい実施態様の詳細な説明）以下の記述において、種々の技術用語が使用される。これらの用語は、文脈上
他を示さない限り、当該分野で十分に認識されているそれらの通常の意味を有す
る。明細書および請求の範囲の明瞭かつより一貫した理解を提供するために、以
下の定義が提供される。

【００２０】（カスパーゼ）これは、アポトーシスタンパク質のＩＣＥ／Ｃｅｄ−３フ
ァミリーのメンバーについての現在の名称である。

【００２１】（カスパーゼ−１２活性）カスパーゼ−１２活性を有するポリペプチドは
、特定の生物学的アッセイにおいて測定されたカスパーゼ−１２タンパク質に対
して、類似であるが、同一の活性である必要はない「カスパーゼ−１２活性」を
有するポリペプチドであると理解されるべきである。例えば、カスパーゼ−１２
は、ラット胚線維芽細胞においてプログラムされた細胞死を誘導し得る。従って
、ラット胚線維芽細胞においてプログラムされた細胞死を誘導し得るポリペプチ
ドは、「カスパーゼ−１２活性」を有するという。

【００２２】（細胞抽出物）目的の核酸またはポリペプチドを含む細胞抽出物は、目的
のポリペプチドを発現するかまたは目的の核酸を含む細胞から得られた、ホモジ
ネートまたは細胞を含まない調製物のような調製物を意味することが理解される
べきである。用語「細胞抽出物」は、培養培地、特に細胞が取り除かれた使用済
の培養培地を含むことが意図される。

【００２３】（フラグメント）分子のフラグメントとは、参照核酸分子またはポリペプ
チドと比較して短縮されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を含む核酸分子
またはポリペプチドをいうことが理解されるべきである。そのフラグメントは、
全長核酸分子またはポリペプチドの１つ以上の所望の化学的特徴または生物学的
特徴を維持していても良いし、維持していなくても良い。カスパーゼ−１２フラ
グメントの例としては、ｃａｓｐ−１２Δまたはｃａｓｐ−１２Δ２がある。

【００２４】（機能的誘導体）カスパーゼ−１２の機能的誘導体とは、カスパーゼ−１
２の生物学的活性と実質的に類似の生物学的活性を保有するポリペプチド、また
はポリペプチドをコードする核酸をいうことが理解されるべきである。機能的誘
導体は、特定の機能の実行のためのそのような修飾の必要性に依存して、翻訳後
修飾（例えば、共有結合した炭水化物）を含んでいても良いし、含んでいなくて
も良い。用語「機能的誘導体」は、分子の「フラグメント」、「改変体」、「ア
ナログ」または「化学的誘導体」を含むことが意図される。誘導体は、親の遺伝
子またはタンパク質の天然に存在する機能の少なくとも１つを維持する。その機
能は、任意の調節遺伝子の機能、または最終的にプロセスされたタンパク質の任
意の機能で有り得る。その機能の活性の程度は、質的機能が、実質的に類似して
いる限り、カスパーゼ−１２活性に対して量的に同一である必要はない。

【００２５】（宿主）本明細書中で使用する場合、「宿主」または「宿主細胞」は、組
換え核酸が導入されている細胞である。異種宿主は、通常目的の遺伝子またはタ
ンパク質を発現しない宿主である。

【００２６】（単離された（する））本明細書で使用する場合、「単離された（する）
」分子とは、そのネイティブの環境から取り出された分子をいう。単離された核
酸分子は、組みかえベクターに含まれる核酸分子（溶液中の精製された核酸分子
）、および異種宿主細胞において生産される核酸分子を含む。単離されたポリペ
プチドは、組換えにより生成され、宿主細胞において発現されるポリペプチド；
当該分野で公知の任意の適切な技術によって本質的にまたは部分的に精製された
、ネイティブまたは組換えポリペプチド；および合成的に生成されたポリペプチ
ドを含む。

【００２７】（プログラムされた細胞死の調節）プログラムされた細胞死の調節とは、
細胞の操作によるプログラムされた細胞死の増加または減少のいずれかをいうこ
とが、理解されるべきである。そのような操作は、特定のｃａｓｐ−１２構築物
（例えば、ｃａｓｐ−１２Ｓ、またはｃａｓｐ−１２Ｌ）で細胞をトランスフェ
クトしたか、または形質転換した結果であり得る。あるいは、目的のポリペプチ
ドと細胞を接触し得る。

【００２８】（変異）「変異」とは、娘細胞に伝達され得る遺伝的物質、および変異細
胞または変異生物を生じる次の世代にさえおそらく伝達され得る遺伝的物質の検
出可能な変化をいうことが理解されるべきである。変異細胞の子孫が、多細胞生
物の体細胞にのみ生じた場合、細胞の変異スポットまたは領域が惹起される。有
性生殖細胞の生殖細胞系列での変異は、次の世代に配偶子により伝達され、体細
胞および生殖細胞の両方に新しい変異状態を有する個体を生じ得る。

【００２９】変異は、化学的または物理的な構成、変異性、複製、表現型の機能、または１
つ以上のヌクレオチドの組み変えに影響する検出可能な任意の（またはそれらの
組み合わせの）変化で有り得る。変異では、ヌクレオチドは、逆位を伴っておよ
び伴わずに、新規の位置に、付加、欠失、置換、逆位（ｉｎｖｅｒｔ）あるいは
転位（ｔｒａｎｓｐｏｓｅ）され得る。変異は、自然に生じ得るか、または変異
原の適用により実験的に誘導され得る。核酸分子の変異改変体は、変異により生
じる。変異ポリペプチドは、変異核酸分子より生じ得る。

【００３０】（ヌクレオチド配列）本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド配列」
は、ＤＮＡの場合は、一連のデオキシリボヌクレオチド、またはＲＮＡの場合は
、一連のリボヌクレオチドをいう。ヌクレオチド配列は、以下のように省略され
たデオキシリボヌクレオチドの配列として、本明細書中に提示される：Ａはアデ
ニン、Ｃはシトシン、Ｇはグアニン、そしてＴはチミンである。しかし、本明細
書中に提示されるヌクレオチド配列は、ＲＮＡ配列もまた表すことが意図され、
ここで各デオキシリボヌクレオチドのチミンは、リボヌクレオチドのウラシルに
より置換される。

【００３１】（作動可能に連結される（する））プロモーター機能の誘導がコード配列
の転写を生じる場合、および２つのＤＮＡ配列間の結合の性質が、以下：（１）
フレームシフト変異の導入を生じない；（２）コード配列の発現を指向する調節
配列の能力に干渉しない；または（３）プロモーター領域の配列により転写され
るべきコード配列の鋳型の能力に干渉しないような場合、２つのヌクレオチド配
列が「作動可能に連結される（する）」という。従って、プロモーター領域は、
プロモーターが、そのヌクレオチド配列の転写に影響し得る場合、ヌクレオチド
配列に作動可能に連結される。

【００３２】（同一性％）本明細書中で使用される場合、第一の核酸のヌクレオチド配
列が、第二の参照配列の各１００ヌクレオチドにつき５つまでの置換を含み得る
ことを除いて、第一のヌクレオチド配列が、完全長の参照配列に対して同一であ
る場合、第一のヌクレオチド配列は、第二の参照核酸のヌクレオチド配列に対し
て、例えば「９５％同一」であるという。これは、参照配列の各１００ヌクレオ
チドにつき５つまでの欠失、挿入、あるいは単一のヌクレオチド置換の任意の組
み合わせを含む。同様に、ヌクレオチド配列が、参照配列の各１００ヌクレオチ
ドにつき１５までの置換を含み得ることを除いて、核酸のヌクレオチド配列が、
参照配列に対して同一である場合、配列は、参照配列に対して「８５％同一」で
ある。これをアミノ酸配列に対しても同様に適用する。従って、あるアミノ酸配
列は、例えば、１００のうち９５の参照アミノ酸配列と同じアミノ酸を有するこ
とにより、第二のアミノ酸配列に対して９５％同一で有り得る。

【００３３】実際問題として、任意の特定の核酸分子が、例えば、図１（配列番号１）に示
したヌクレオチド配列に対してか、あるいは寄託されたｃＤＮＡクローンのヌク
レオチド配列に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、
９７％、９８％または９９％同一であるか否かは、Ｂｅｓｔｆｉｔプログラム（
ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＳｅｑｕｅｎｃｅＡｎａｌｙｓｉｓＰａｃｋａｇｅ、
Ｕｎｉｘのバージョン８、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ、
ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｋ、５７５Ｓｃｉｅｎｃｅ
Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ５３７１１）のような公知のコンピュー
タープログラムを用いて慣習的に決定され得る。２つの配列間の相同性が最大で
あるセグメントを見出すために、Ｂｅｓｔｆｉｔは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅ
ｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＡｐｐｌｉｅｄ
Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ２：４８２−４８９（１９９１））を使用する。特
定の配列が、本発明に従う参照配列に対して例えば、９５％同一であるか否かを
決定するために、Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列整列プログラムを使用す
る場合、パラメーターは、もちろん、同一性のパーセンテージが、参照ヌクレオ
チド配列の全長にわたって計算されるようなセットであり、そして参照配列のヌ
クレオチド総数の５％までの相同性のギャップが許容されるようなセットである
。

【００３４】（集団）「核酸分子の集団」とは、核酸分子の混合物であり、少なくとも
いくつかの核酸分子は、その混合物中の他の核酸分子に対して同一ではない。こ
れは、特に、１つの細胞型から作製されたｃＤＮＡライブラリー；ＤＮＡおよび
ＲＮＡの両方を含むか、またはＤＮＡのみまたはＲＮＡのみを含む異種細胞から
の抽出物；ならびに、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を含むか、またはＤＮＡのみま
たはＲＮＡのみを含む同種細胞からの抽出物を含む。

【００３５】（精製された（した））「精製された（した）」といわれる、生物学的細
胞または宿主から作製される調製物は、目的の核酸またはポリペプチドの粗抽出
物を含む示された核酸またはポリペプチドを含む、任意の細胞抽出物である。こ
のような調製物は、そのネイティブの環境から取り出された分子を含む。例えば
、ポリペプチドの場合、精製された調製物は、個別の技術または一連の調製技術
もしくは生化学的技術に従って獲得され得、そして目的のポリペプチドは、これ
らの調製物中に種々の程度の純度で存在し得る。この手順は、以下を含むが、そ
れらに限定されない：硫安分画、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ア
フィニティークロマトグラフィー、密度勾配遠心法、電気泳動、および当業者に
公知の他の技術。例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌ
ｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９
６）を参照のこと。

【００３６】「純粋な」核酸またはポリペプチドの調製は、このような核酸またはポリペプ
チドが、天然において通常関連する天然に存在する物質を含まない調製物を意味
することが理解されるべきである。「本質的に純粋」とは、目的の核酸またはタ
ンパク質を少なくとも９５％含む、「高度に」精製された調製物を意味すること
が理解されるべきである。「部分的に純粋」である目的の核酸またはポリペプチ
ドの調製物は、本質的に純粋な調製物よりも低い程度に純粋である。そして、こ
れは、粗精製された核酸またはポリペプチドを含む。

【００３７】（ストリンジェントなハイブリダイゼーション）ストリンジェントなハイ
ブリダイゼーション条件とは、核酸の相補的な断片間で少なくとも９０％の相同
性を確立するように、当業者によって通常使用されるハイブリダイゼーション条
件であると理解されるべきである。より低い相同性（例えば、少なくとも７０％
の相同性または好ましくは少なくとも８０％の相同性）もまた所望され得、そし
てこれはハイブリダイゼーション条件を変動させることによって獲得され得る。

【００３８】変性した核酸鎖へのハイブリダイゼーションを生じさせるのために、わずか２
つの必要条件が存在する：（１）サンプル中に相補的な一本鎖が存在しなければ
ならないこと、および（２）塩基が互いに接近し得るように、一本鎖核酸の溶液
のイオン強度は適度に高くなければならないこと（操作上、これは０．２Ｍより
高い）。第３の条件は、ハイブリダイゼーション速度に作用する：核酸濃度は、
分子間の衝突が適度な頻度で生じるように十分高くなければならない。

【００３９】当業者によって慣用的に使用される条件は、容易に入手可能な手順書（例えば
、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌ
ｏｇｙ、第Ｉ巻、第２．１０章、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｐｕｂ
ｌｉｓｈｅｒｓ（１９９４）またはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）（本明細
書中で、参考として援用される）において示される。当業者に公知であるように
、最終的なハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、実際のハイブリダ
イゼーション条件およびハイブリダイゼーション後の洗浄条件の両方を反映する
。当業者は、所望の結果を得るために、これらの条件を変更するための適切な様
式を知っている。

【００４０】例えば、プレハイブリダイゼーション溶液は、所望の温度および所望のプレハ
イブリダイゼーション時間での、固相マトリックス上での非特異的な部位へのハ
イブリダイゼーションを可能にするために、十分な塩および非特異的核酸を含有
するべきである。例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーションのために
、そのようなプレハイブリダイゼーション溶液は、６×塩化ナトリウム／クエン
酸ナトリウム（１×ＳＳＣとは、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０１５Ｍのクエン
酸ナトリウムである；ｐＨ７．０）、５×デンハルト溶液、０．０５％ピロリン
酸ナトリウム、および１００μ／ｍｌのニシン精子ＤＮＡを含有し得る。次いで
、適切なストリンジェントなハイブリダイゼーション混合物は、６×ＳＳＣ、１
×デンハルト溶液、１００μｇ／ｍｌの酵母ｔＲＮＡおよび０．０５％ピロリン
酸ナトリウムを含有し得る。

【００４１】核酸ハイブリッド分析のための代替的な条件は、以下を包含し得る：１）室温でのプレハイブリダイゼーション、および６８℃でのハイブリダイゼ
ーション；２）室温での、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでの洗浄；３）所望される場合、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでのさらな
る洗浄（中程度のストリンジェンシーの洗浄）；または４）所望される場合、６８℃での０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳでのさらな
る洗浄（高いストリンジェンシー）。

【００４２】以下の組成物を含有する公知のハイブリダイゼーション混合物（例えば、Ｃｈ
ｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８１：１９９１−１９９５（１９８４）のハイブリダイゼーション混合物）
もまた使用され得る：１％結晶グレードのウシ血清アルブミン／１ｍＭＥＤＴ
Ａ／０．５ＭＮａＨＰＯ₄（ｐＨ７．２）／７％ＳＤＳ。さらに、代替的では
あるが類似の反応条件はまた、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）において見出
され得る。所望であれば、ホルムアミドもまた、プレハイブリダイゼーション／
ハイブリダイゼーション溶液中に含ませ得る。

【００４３】これらの条件は、決定的であるかまたは限定的であることを意味されず、そし
て所望の目的を達成するために、当業者によって必要とされる場合には調整され
得ることが理解されるべきである。

【００４４】（ベクター）本明細書中で使用される場合、ベクターとは、宿主細胞内へ
の目的の核酸の移入のために適切な核酸環境を提供する媒体である。そのような
ベクターは、所望の配列（例えば、本発明の核酸をコードするカスパーゼ−１２
のヌクレオチド配列）を、適切な宿主中でクローニングまたは発現させるために
使用され得る。発現ベクターは、同種プロモーターもしくは異種プロモーター、
または制御配列に対して作動可能に連結された目的の核酸を含み得る。

【００４５】本発明の１つの実施態様において、カスパーゼ−１２に対応するアミノ酸配列
をコードするヌクレオチド配列を有する単離された核酸分子が提供される。１つ
の好ましい実施態様において、単離された核酸分子は、図９において示されるｃ
ａｓｐ−１２Ｓのアミノ酸配列（配列番号１４）をコードするヌクレオチド配列
を有する。別の好ましい実施態様において、単離された核酸分子は、ＡＴＣＣ受
託番号第２０９７１０号（１９９８年３月１８日、アメリカンタイプカルチャー
コレクション（ＡＴＣＣ）、１０８０１ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＢｏｕｌｅｖ
ａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、２０１１０−２２０９）として寄託されたｃ
ＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配
列を有する。別の好ましい実施態様において、単離された核酸分子は、ｃａｓｐ
−１２Δ（配列番号２のアミノ酸９５〜４１９）のアミノ酸配列をコードするヌ
クレオチド配列を有する。なお別の好ましい実施態様において、単離された核酸
分子は、ｃａｓｐ−１２Δ２（配列番号２のアミノ酸１４５〜４１９）のアミノ
酸配列をコードするヌクレオチド配列を有する。

【００４６】さらに、本発明の核酸分子は、リーダー配列を伴うかまたは伴わない、配列の
コード領域のみを含み得る。

【００４７】本発明の単離された核酸分子は、ＲＮＡの形態（例えば、ｍＲＮＡ）、または
ＤＮＡの形態（例えば、ｃＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡは、二本鎖または一本鎖
であり得る。一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡは、コード鎖（センス鎖としてもまた公
知）であり得るか、または非コード鎖（アンチセンス鎖としてもまた公知）であ
り得る。

【００４８】本発明の核酸分子は化学的に合成され得るか、またはそれらは、当該分野にお
いて周知の標準的なクローニング手順およびスクリーニング手順を使用して生成
され得る。例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕ
ｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ（１９９６）を
参照のこと。実施例１においては、本発明の核酸分子についてクローニングおよ
びスクリーニングするための、１つの好ましい方法の記載が提供される。

【００４９】当業者に理解され得るように、遺伝子暗号の縮重に起因して、本明細書中で具
体的に記載される核酸分子以外の核酸分子であって、図９に示されるｃａｓｐ−
１２Ｓのアミノ酸配列（配列番号１４）またはＡＴＣＣ受託番号第２０９７１０
号に含有されるｃＤＮＡクローンによってコードされるアミノ酸配列をコードす
る核酸分子が存在する。特許請求される配列のすべての縮重改変体はまた、本発
明によって包含される。遺伝子暗号は、当該分野において周知である。従って、
当業者にとって、本明細書中に具体的に記載される核酸以外の核酸であって、な
お本発明のアミノ酸配列をコードする核酸を生成することは慣用的である。

【００５０】本発明の別の実施態様においては、上記のヌクレオチド配列に対して少なくと
も８０％、および好ましくは少なくとも８５％または９０％、さらにより好まし
くは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレ
オチド配列を有する核酸分子が提供される。本発明は、上記に引用した核酸分子
がカスパーゼ−１２活性を有するポリペプチドをコードするか否かに関わりなく
、それらのヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一であるヌクレオチド
配列を有する核酸分子に指向される。これは、たとえ特定の核酸分子がカスパー
ゼ−１２活性を有するポリペプチドをコードしない場合でさえも、当業者はなお
その核酸分子を使用する方法（例えば、プローブとして）を知っているからであ
る。カスパーゼ−１２活性を有するポリペプチドをコードしない本発明の核酸分
子の使用としては、特に、ｃＤＮＡライブラリー中のカスパーゼ−１２遺伝子ま
たはその対立遺伝子改変体の単離；Ｖｅｒｍａら、ＨｕｍａｎＣｈｒｏｍｏｓ
ｏｍｅｓ：ａＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｐｅ
ｒｇａｍｏｎＰｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８８）に記載されるような
、カスパーゼ−１２遺伝子の正確な染色体位置を提供するための、中期染色体ス
プレッド（ｓｐｒｅａｄ）への蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（「Ｆ
ＩＳＨ」）；および特定の組織におけるカスパーゼ−１２ｍＲＮＡの発現を検
出するためのノーザンブロット分析が挙げられる。

【００５１】しかし、好ましいのは、上記の核酸分子のヌクレオチド配列に対して少なくと
も８０％、より好ましくは８５％または９０％、さらにより好ましくは少なくと
も９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるヌクレオチド配列を
有し、実際にカスパーゼ−１２活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子
である。当業者は直ちに、遺伝子暗号の縮重に起因して、上記の核酸分子のヌク
レオチド配列に対して少なくとも８０％、より好ましくは８５％または９０％、
さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％
同一であるヌクレオチド配列を有する大量の核酸分子が、本発明のポリペプチド
をコードすることを認識する。特許請求される分子の縮重改変体のすべてが、本
来の配列と同じポリペプチドをコードするので、縮重改変体が、たとえスクリー
ニングアッセイ（例えば、カスパーゼ−１２活性について）を実施することを伴
わなくとも、本来の配列の活性と類似の活性を有するポリペプチドをコードする
ことは、当業者に明らかである。カスパーゼ−１２活性を有するポリペプチドを
コードする核酸分子の使用としては、特に、細胞内にこの核酸分子を挿入するこ
とによってプログラムされた細胞死を調節すること、ならびにベクター中にこの
核酸分子を挿入し、このベクターを用いて宿主細胞を形質転換し、そしてポリペ
プチドの発現を誘導することによってカスパーゼ−１２活性を有するポリペプチ
ドを生成することが挙げられる。

【００５２】縮重改変体ではないそのような核酸分子についてさえ、適度な数のものはまた
、カスパーゼ−１２活性を有するポリペプチドをコードすることが、当業者にさ
らに認識される。これは、当業者が、タンパク質機能に有意に作用することがほ
とんどないかまたは全くないと思われる可能なアミノ酸置換を知っているからで
ある。

【００５３】例えば、「保存的」アミノ酸置換は、一般に、ポリペプチドの活性に対してほ
とんど効果を有さない。保存的アミノ酸置換として代表的にみなされるのは：芳
香族残基であるＰｈｅおよびＴｒｙの変換；塩基性残基であるＬｙｓおよびＡｒ
ｇの変換；アミド残基であるＡｓｎおよびＧｌｎの変換；酸性残基であるＡｓｐ
およびＧｌｕの変換；ヒドロキシル残基であるＳｅｒおよびＴｈｒの変換；なら
びに脂肪族残基であるＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間の変換である。
表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作製する方法に関するさらなるガイダン
スは、例えば、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６−１３１０（
１９９０）に提供される。

【００５４】本発明のさらなる実施態様は、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。本
発明において有用なベクターとしては、染色体由来ベクター、エピソーム由来ベ
クター、およびウイルス由来ベクター（例えば、細菌性プラスミド、酵母エピソ
ーム、酵母染色体エレメント、ウイルス（例えば、バクテリオファージ、バキュ
ロウイルス、パポバウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、およびレトロウイルス）由来の
ベクター、ならびにそれらの組合わせに由来するベクター（例えば、コスミドお
よびファージミド））が挙げられる。

【００５５】所望される場合、本発明のポリペプチドの融合産物をコードする組換えベクタ
ーが構築され得る。例えば、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列は、特定の宿主からのポリペプチドの分泌、または特定の宿主内でのポリペプ
チドの区画化を可能にするシグナル配列に連結され得る。そのようなシグナル配
列は、特定のプロテアーゼ部位を伴ってかまたは伴わずに設計され得、その結果
シグナルペプチド配列は、引き続いての除去を受けやすくされる。あるいは、ポ
リペプチドは、ポリペプチドのより容易な精製を可能にする配列（例えば、ヒス
チジンタグ）に融合され得る。

【００５６】ベクター中へのクローニングのために、本発明の核酸分子は、無作為に剪断さ
れるかまたは酵素的に切断され、そして適切なベクター中に連結される。ベクタ
ー中へ核酸をクローニングする方法は、当該分野において周知である。例えば、
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、ＣｏｌｄＳｐｒ
ｉｎｇＨａｒｂｏｒ（１９８９）を参照のこと。

【００５７】核酸分子は、ベクターで形質転換した細胞を同定する際の使用のために適切な
選択マーカーを含有するベクターに連結され得る。選択マーカーの例としては、
真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、
および細菌中での培養については、テトラサイクリン耐性遺伝子またはアンピシ
リン耐性遺伝子が挙げられる。

【００５８】特定の好ましいベクターは、核酸分子の特異的発現（これは、誘導的および／
または細胞型特異的であり得る）を提供する。そのようなベクターの中で特に好
ましいのは、容易に操作される環境的因子（例えば、温度または栄養添加物）に
よって誘導されるベクターである。これに関して、核酸挿入物は、適切なプロモ
ーター（例えば、ファージλＰＬプロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃプロモー
ター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ＣＭＶ即時型プロモーター（ｉｍ
ｍｅｄｉａｔｅｅａｒｌｙｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＨＳＶチミジンキナーゼプ
ロモーター、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、およびメタロチオネインプ
ロモーター）に作動可能に連結されるべきである。

【００５９】本発明のさらに別の実施態様は、上記のベクターを用いて形質転換された宿主
である。配列は、宿主細胞のゲノム中に組み込まれ得るか、または染色体外で維
持され得る。組換えベクターは、周知技術（例えば、感染、形質導入、トランス
フェクション、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロ
ポレーション、および形質転換）を使用して、宿主細胞中に導入され得る。

【００６０】適切な宿主の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない；細菌
細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍ
ｕｒｉｕｍ細胞）；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；昆虫細胞（例えば、Ｄｒｏ
ｓｏｐｈｉｌａＳ２細胞、およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａＳｆ９細胞）；動物
細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ヒト２９３細胞、
２９３Ｔ細胞、およびＨｅＬａ細胞）；および植物細胞。上記の宿主細胞につい
て適切な培養条件は、当該分野において公知である。

【００６１】宿主内での組換えベクターからの本発明のポリペプチドの発現は、そのような
宿主内で機能的な制御領域の存在を必要とし得る。遺伝子発現に必要とされる制
御領域の正確な性質は、種間または細胞型間で変動し得るが、一般的には、必須
物として、転写および翻訳の調節に関与する５’非転写配列および／もしくは非
翻訳配列、ならびに／または３’非転写配列および／もしくは非翻訳（非コード
）配列（例えば、ＴＡＴＡボックス、キャップ配列、ＣＡＡＴ配列、転写終結の
ための配列など）を含む。そのような５’非転写制御配列としては、作動可能に
連結された遺伝子の転写制御のためのプロモーターを含む領域を包含し得る。

【００６２】真核生物宿主において、転写が翻訳に関連付けられない場合、制御領域は、そ
のクローン化した配列が開始メチオニン（ＡＴＧ）コドンを含むか否かに依存し
て、そのようなメチオニンを提供するかもしれないし、または提供しないかもし
れない。そのような領域としては、一般的に、宿主細胞内でのＲＮＡ合成の開始
を指向するのに十分なプロモーター領域を含む。プロモーター領域は、同種プロ
モーターまたは異種プロモーターであり得る。異種プロモーターとは、発現され
る核酸と通常は関連のないプロモーターである。例えば、マウスＩＣＥ遺伝子と
サイトメガロウイルスプロモーターとの使用、またはマウスＩＣＥ遺伝子と作用
性（ａｃｔｉｎｇ）プロモーターとの使用は、異種プロモーターの使用である。
ｃａｓｐ−１２についての同種プロモーターとは、ｃａｓｐ−１２遺伝子が天然
に作動可能に連結されているプロモーターである。

【００６３】本発明のさらなる実施態様は、カスパーゼ−１２ポリペプチドに関する。１つ
の好ましい実施態様においては、図９において示されるカスパーゼ−１２Ｓのア
ミノ酸配列（配列番号１４）を有する単離されたポリペプチドが提供される。別
の好ましい実施態様においては、ＡＴＣＣ受託番号第２０９７１０号に含有され
るｃＤＮＡクローンによってコードされるカスパーゼ−１２Ｓアミノ酸配列を有
する単離されたポリペプチドが提供される。別の好ましい実施態様においては、
カスパーゼ−１２Δのアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残基９５〜４１９）
を有する単離されたポリペプチドが提供される。なお別の好ましい実施態様にお
いては、カスパーゼ−１２Δ２のアミノ酸配列（配列番号２のアミノ酸残基１４
５〜４１９）を有する単離されたポリペプチドが提供される。

【００６４】本発明のポリペプチドとしては、天然の精製産物、化学的に合成されたポリペ
プチド、および組換え技術によって生成されたポリペプチドが挙げられるが、こ
れらに限定されない。組換え技術によるポリペプチドの発現は、宿主細胞に依存
して、種々の翻訳後修飾を生じ得る。ポリペプチドのこれらの修飾形態もまた、
本発明に包含される。

【００６５】カスパーゼ−１２Ｓのいくつかのアミノ酸残基を、このタンパク質の構造また
は機能に対して有意に影響することなく改変し得ることが、当業者に容易に認識
される。そのような改変としては、欠失、挿入、逆位、反復、および型置換（ｔ
ｙｐｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）が挙げられる。表現型的にサイレントであ
りそうなアミノ酸変換に関するガイダンスは、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４７：３０６−１３１０（１９９０）に見出され得る。

【００６６】従って、本発明の別の実施態様は、上記のポリペプチドに対して８０％、より
好ましくは８５％または９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６
％、９７％、９８％、または９９％同一であるポリペプチドである。好ましくは
、これらのポリペプチドは、カスパーゼ−１２活性を示す。当業者は、タンパク
質の機能に有意に作用することがほとんどないかまたは全くないと思われる可能
なアミノ酸置換を十分に知っている。表現型的にサイレントなアミノ酸置換を作
製する方法に関するガイダンスは、例えば、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２
４７：１３０６−１３１０（１９９０）に提供される。

【００６７】本発明のポリペプチドは、当該分野で公知の標準的技術を用いて、ポリクロー
ナル抗体またはモノクローナル抗体を産生する目的のために使用され得る（Ｋｌ
ｅｉｎ，Ｊ．、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ＴｈｅＳｃｉｅｎｃｅｏｆＣｅｌ
ｌ−ＮｏｎｃｅｌｌＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆
Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｋｅｎｎｅｔｔら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ：ＡＮｅｗＤｉｍｅｎｓｉｏｎ
ｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｎａｌｙｓｅｓ、ＰｌｅｎｕｍＰｒｅｓｓ
、Ｎ．Ｙ．（１９８０）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ａ．、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ
ＡｎｔｉｂｏｄｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」：ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｃｈ
ｎｉｑｕｅｓｉｎＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ１３、Ｂｕｒｄｏｎら編、Ｅｌｓｅｉｖｅｒ、Ａｍｓｔｅｒ
ｄａｍ（１９８４）；ＨａｒｌｏｗａｎｄＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ
、ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎ．Ｙ．（１９８８））。このような抗体は、
遺伝子の発現を決定するためのアッセイ、および発現ライブラリーをスクリーニ
ングするためのアッセイにおいて使用され得る。精製されたタンパク質は、この
ようなアッセイにおいて、スタンダードとして使用される。

【００６８】本発明者らは、カスパーゼ−１２が細胞においてアポトーシスを誘導すること
を示した。従って、本発明の別の実施態様は、細胞におけるプログラムされた細
胞死を誘導する方法であり、この方法は、細胞を上記のポリペプチドと接触させ
る工程を含む。細胞におけるプログラムされた細胞死を誘導する目的のために、
本発明のポリペプチドは、インビトロまたはインビボで細胞に投与され得る。

【００６９】このポリぺプチドは、細胞に外来的に投与され得る。このポリペプチドはまた
、組換え発現を通して投与され得る。例えば、細胞中で本発明のポリペプチドを
発現するために相同組換えが用いられ得る。適切なヌクレオチド配列を有する染
色体外核酸もまた、細胞中に導入され得る。

【００７０】アポトーシスの誘導は、特に、悪性状態および前悪性状態ならびに自己免疫障
害を処置するために用いられ得る。悪性状態および前悪性状態としては、固形腫
瘍、Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病、前立腺肥大、前新生物肝臓病巣お
よび化学療法剤に対する耐性が挙げられ得る。

【００７１】以下は、代表的な、しかし非限定的な本発明の実施例として示される。他の適
切な改変は、本発明の範囲内であり、そして当業者に明らかである。

【００７２】（実施例１）（カスパーゼ−１２は、カスパーゼファミリーのメンバーである）カスパーゼファミリーのさらなるメンバーを単離するために、カスパーゼファ
ミリーのメンバーの間の２つの保存された領域の配列に基づく２つの縮重プライ
マーを設計した：活性システイン残基の近くのペンタペプチドモチーフＱＡＣＲ
Ｇ（配列番号３）およびＣ末端のヘキサペプチド配列ＦＹＬＦＰＧ（配列番号１
７）。この対の縮重プライマーを用いて、マウス胸腺由来のｃＤＮＡを増幅し、
カスパーゼと予想される４００ｂｐのフラグメントを生じた。このフラグメント
をクローニングし、そして制限酵素および配列分析に供し、これにより、この４
００ｂｐのバンドにおいていくつかの異なるｃＤＮＡ種が存在することが示され
た。それらのうち１つが、カスパーゼ−１２と称され、マウスＩＣＥと約３５％
の同一性を共有する推定アミノ酸配列を有するカスパーゼファミリーの新規メン
バーであった。マウスゲノムＤＮＡのサザンブロット分析は、カスパーゼ−１２
が単一の複製遺伝子であることを示した。このｃＤＮＡクローンをプローブとし
て用いて、マウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーから９つのクローンを単離した。こ
れらの９つの陽性クローンは、２つの群に分類され得る：長形態のカスパーゼ−
１２ｃＤＮＡ（プラスミドｐＮＢ６、ｃａｓｐ−１２Ｌ）および短形態ｃＤＮ
Ａ（プラスミドｐＮＢ７、ｃａｓｐ−１２Ｓ）。

【００７３】（方法）（カスパーゼ−１２ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅）分子クローニングの標準的技術は、他に言及されない限り、記載されるように
使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：
ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ（第２版）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ、ＮＹ（１９８９））。カスパーゼ−１２についての部分的ｃＤＮＡクローン
を、以下の縮重オリゴヌクレオチドプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（
ＰＣＲ）によりマウス胸腺ｃＤＮＡから増幅した：上流、５’−ＴＧ（ＧＡＴＣ
）ＣＣ（ＧＡＴＣ）ＧＧＧＡＡ（ＧＡＴＣ）ＡＧＧＴＡＧＡＡ−３’（配列
番号１５）；下流、５’−ＡＴＣＡＴ（ＡＴＣ）ＡＴＣＣＡＧＧＣ（ＧＡ
ＴＣ）ＴＧＣＡＧ（ＡＧ）ＧＧ−３’（配列番号１６）（括弧内の塩基は、縮
重ヌクレオチドを示す）。以下の条件をＰＣＲ反応のために用いた：５０μｌの
総容量中、１×反応緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１．５ｍＭＭｇＣｌ₂、２０
０ｍＭｄＮＴＰ、２ｍＭの各プライマー、１単位のＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）。ｃＤＮＡを、９４℃で１分間、４６℃で１分間、７２℃
で２分間の２５サイクルの前に９４℃で４分間変性させた。０．４ｋｂのＰＣＲ
産物を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）プラスミドベクター（Ｓｔｒ
ａｔａｇｅｎｅ）のＥｃｏＲＶ部位にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、
このプラスミドＤＮＡを用いて形質転換し、そしてＤＮＡ配列決定のために個々
のコロニーを単離し、そして調製した。新規のカスパーゼｃＤＮＡをＤＮＡ配列
に基づいて同定し、そしてカスパーゼ−１２と称した。

【００７４】この０．４ｋｂのｃＤＮＡフラグメントを、［³²Ｐ］ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）を用いて標識し、そして高ストリンジェントな条件下でマウス胸腺ｃＤＮ
Ａライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）をスクリーニングするために使用した
。９つの陽性クローンを、約１０⁷のファージクローンから同定した。プラスミ
ドＤＮＡを、インビボでの切り出しのプロトコル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）によ
り、ファージＤＮＡから切り出した。９つのクローンのうち８つが、４１９アミ
ノ酸残基のオープンリーディングフレームと同一の配列を含み、そしてカスパー
ゼ−１２Ｌと称された（図１Ａ）。９番目のクローンは、カスパーゼ−１２Ｌよ
りも２１０ｂｐ短い。なぜならば、このクローンはカスパーゼ−１２Ｌの９４〜
３０３塩基を含まないからである（図１Ｂ）。この喪失した配列は、ジヌクレオ
チド配列であるＧＴから始まり、これは、潜在的な哺乳動物のスプライスドナー
部位である。カスパーゼ−１２ゲノムクローンの分析は、塩基３０３／３０４が
、スプライス接合部に正確に位置すること、およびその塩基３０４がイントロン
配列中のジヌクレオチド配列ＡＧの後に位置し、スプライスドナー／アクセプタ
ー部位についてＧＴ／ＡＧ法則を形成することを示した（図１Ｂ）。従って、こ
の短い方のクローンは、代替的にスプライスされたｍＲＮＡ由来のようであった
。この短い形態のｍＲＮＡをカスパーゼ−１２Ｓと称した。これは、３４９アミ
ノ酸残基のオープンリーディングフレームを含む。

【００７５】プロカスパーゼ−１２Ｌにおける可能なプロセシング部位は、Ａｓｐ９４／Ｇ
ｌｙ９５（カスパーゼ−１２ＳにおけるＡｓｐ２４／Ｇｌｙ２５）に見出される
。カスパーゼ−１２Ｓにおいて喪失している２１０ｂｐの配列（コドン１７〜８
７）は、カスパーゼ−１２のプロドメイン内の配列をおそらくコードし（図１Ｂ
）、前駆体形態のタンパク質分解処理中に除去され、成熟タンパク質を生じ得る
。カスパーゼ−１２Ｌタンパク質およびカスパーゼ−１２Ｓタンパク質はともに
、別の可能なプロセシング部位（カスパーゼ−１２ＬにおけるＡｓｐ３１８／Ｔ
ｈｒ３１９、カスパーゼ−１２ＳにおけるＡｓｐ２４８／Ｔｈｒ２４９）を有し
、これは、ＩＣＥのｐ２０フラグメントとｐ１０フラグメントとの間の切断部位
に対応する。従って、カスパーゼ−１２Ｌとカスパーゼ−１２Ｓとの間の差異は
、それらのプロドメインにあり、そしてカスパーゼ−１２Ｌおよびカスパーゼ−
１２Ｓのプロセシングは、同一のサブユニット組成物および配列の成熟酵素を生
じる。

【００７６】カスパーゼファミリーは、それらのアミノ酸配列類似性に従って以下の３つの
サブファミリーに分類され得る；ＩＣＥサブファミリー、カスパーゼ−２サブフ
ァミリー、およびカスパーゼ−３サブファミリー（Ｄｕａｎ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６２１−１６２５（１９９６））。このカスパーゼ
−１２Ｌタンパク質は、ヒトＩＣＥと４１％の配列同一性を共有し（Ｔｈｏｒｎ
ｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３５６：７６８−７７４（１９９２）
）、マウスＩＣＥとは４１％の配列同一性（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ７
５：６５３−６６０（１９９３）；Ｎｅｔｔ，Ｍ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ
．１４９：３２５４−３２５８（１９９２））、マウスカスパーゼ−１１とは４
２％の配列同一性（Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０
５８０−２０５８７（１９９６））、ヒトカスパーゼ−４とは４９％（Ｆａｕｃ
ｈｅｕ，Ｃ．ら、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１４：１９１４−１９２
２（１９９５））、ヒトカスパーゼ−５とは４６％（Ｍｕｎｄａｙ，Ｎ．Ａ．ら
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５８７０−１５８７６（１９９５））、
ヒトカスパーゼ−２Ｌとは２１％（Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９
−７５０（１９９４））、ヒトカスパーゼ−３とは２０％（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ
−Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０７６１−３
０７６４（１９９４））、およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓＣｅｄ−３とは１８％（
Ｙｕａｎ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ７５：６４１−６５２（１９９３））を共有する
（図２Ａ〜Ｃ、表１）。カスパーゼ−１２のアミノ酸配列と他のカスパーゼファ
ミリーメンバーのアミノ酸配列との比較は、カスパーゼ−１２が、ＩＣＥ、カス
パーゼ−４、カスパーゼ−５およびカスパーゼ−１１を含むＩＣＥファミリーに
属することを示唆する。

【００７７】

【表１】ＩＣＥタンパク質のＸ線結晶は、ｐ１０サブユニットが明らかに基質のＰ２〜
Ｐ４アミノ酸残基と直接接触することを明らかにした（Ｗａｌｋｅｒ，Ｎ．Ｐ．
Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ７８：３４３−３５２（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｐ
．ら、Ｎａｔｕｒｅ３７０：２７０−２７５（１９９４））。ＩＣＥにおける
アミノ酸残基の３つの群は、Ｐ２〜Ｐ４基質決定因子を認識して結合する部分部
位（Ｓ２〜Ｓ４）であると推定される（図２Ｄ）。第１の群（ヒトＩＣＥにおけ
るＶａｌ３３８およびＴｒｐ３４０）は、カスパーゼファミリーの間で最も良好
に保存されている。第２の群（Ｈｉｓ３４２およびＰｒｏ３４３）は、ＩＣＥサ
ブファミリー（ＩＣＥ、カスパーゼ−１２およびカスパーゼ−１１）の間で最も
少なく保存されており、一方他の３つのメンバー（カスパーゼ−２、カスパーゼ
−３およびＣＥＤ−３）は、同様の組成物（ＡｓｎおよびＴｈｒ／Ｓｅｒ）を示
す。部分部位のアミノ酸組成におけるこの改変は、おそらく異なる基質特異性を
反映する。

【００７８】ＩＣＥとのカスパーゼ−１２の配列アラインメントは、この３つの残基がＩＣ
Ｅの触媒に関与することを明らかにする（Ｈｉｓ２３７、Ｇｌｙ２３８およびＣ
ｙｓ２８５、（Ｗａｌｋｅｒ，Ｎ．Ｐ．Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ７８：３４３−３５
２（１９９４）；Ｗｉｌｓｏｎ，Ｋ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３７０：２７０−
２７５（１９９４））は、カスパーゼ−１２（Ｈｉｓ２５０、Ｇｌｙ２５１およ
びＣｙｓ２９８、図２Ａ〜Ｃおよび２Ｄ）ならびにＩＣＥにおけるＰ１Ａｓｐ
結合ポケットの一部である残基（Ａｒｇ１７９、Ｇｌｎ２８３、Ａｒｇ３４１お
よびＳｅｒ３４７）（これは、残基３５６でＡｒｇがＬｙｓと置換されているだ
けのカスパーゼ−１２におけるＡｒｇ１９２、Ｇｌｎ２８６、Ｌｙｓ３５６、Ｓ
ｅｒ３６２に対応する）において保存される）。これは、カスパーゼファミリー
のメンバーが、この位置でこのような置換を示すという第１の例である。基質の
Ｐ２〜Ｐ４残基との結合のための溝を構成するＩＣＥにおける残基（Ｖａｌ３３
８、Ｔｒｐ３４０、Ｈｉｓ３４２、Ｐｒｏ３４３、Ａｒｇ３８３およびＧｌｎ３
８５）は、カスパーゼ−１２においてあまり保存されず、ＴｒｐおよびＧｌｎの
みが、対応するアミノ酸残基のＩｌｅ３５３、Ｔｒｐ３５５、Ｖａｌ３５７、Ｇ
ｌｙ３６８、Ｌｅｕ３９８およびＧｌｎ４００とともに保存されている（図２Ｄ
）。これらの結果は、カスパーゼ−１２が、Ｐ１Ａｓｐ特異性を有するカスパ
ーゼファミリーのメンバーであるが、ＩＣＥのメンバーと比較すると、その基質
においては、異なるＰ２〜Ｐ４が優先されるようであることを示唆する。

【００７９】（実施例２）（Ｃａｓｐ−１２の発現パターン）ｃａｓｐ−１２Ｌおよびｃａｓｐ−１２Ｓの両方の発現パターンを試験するた
めに、ｃａｓｐ−１２Ｌメッセージのフラグメントおよびｃａｓｐ−１２Ｓメッ
セージのフラグメントをＲＴ−ＰＣＲにより増幅した。

【００８０】（方法）（ＲＴ−ＰＣＲ）ｍＲＮＡを、ＭｉｃｒｏＦａｓｔｍＲＮＡ単離キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ
ｎ）を用いてマウスの脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓および腸から単離
した。１マイクログラムのｍＲＮＡを、ランダムプライマーおよびモロニーマウ
ス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて
逆転写のために使用した。カスパーゼ−１２ｃＤＮＡをＰＣＲで増幅した、Ｐ
ＣＲの条件は、以下の通りであった：９４℃、１分；５０℃、２分；７２℃、２
分を３０サイクル。使用したプライマーは、以下であった：上流、５’−ＧＡＧ
ＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＣＡＡＧＡＴＣ−３’（配列番号１８）；下流、５’−Ｃ
ＡＣＣＡＣＡＧＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧ−３’（配列番号１９）。これらの２つの
特異的なプライマーは、ｃａｓｐ−１２Ｓにおいて欠失した２１０ｂｐ領域まで
広がり、そして別々のエキソン由来の配列を用いて設計され、その結果、夾雑し
たゲノムＤＮＡの増幅の可能性を除去し得た。

【００８１】ＰＣＲ反応において、ｃａｓｐ−１２Ｌおよびｃａｓｐ−１２Ｓの両方は、同
時に増幅されて、それぞれ６１７ｂｐおよび４０７ｂｐのＤＮＡフラグメントを
生成し得る。両方のフラグメントを、脳、胸腺、肺、心臓、肝臓、腎臓、脾臓お
よび腸を含む試験した全ての組織から増幅した（図３）。これらの結果は、カス
パーゼ−１２Ｌおよびカスパーゼ−１２Ｓの両方が成体組織において偏在的に発
現することを示す。カスパーゼファミリーのいくつかのメンバーの偏在的な発現
は、成体組織において見出されるので（Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、ＧｅｎｅｓＡｎ
ｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ８：１６１３−１６２６（１９９４）；Ｗａｎｇ
，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９−７５０（１９９４）；Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ
−Ａｌｎｅｍｒｉ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３０７６１−３
０７６４（１９９４）；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．、Ｃｅｌｌ８１：８０１−８０９
（１９９５）；Ｆａｕｃｈｅｕ，Ｃ．ら、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ
１４：１９１４−１９２２（１９９５）；Ｍｕｎｄａｙ，Ｎ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１５８７０−１５８７６（１９９５）；Ｄｕａｎ，Ｈ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６２１−１６２５（１９９６）；Ｗ
ａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０５８０−２０５８７（
１９９６）；ＶａｎｄｅＣｒａｅｎ，Ｍ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ
４０３：６１−６９（１９９７））、カスパーゼ−１２タンパク質は、単一の細
胞においてカスパーゼファミリーの他のメンバーと同時発現されるようである。

【００８２】ＲＴ−ＰＣＲ産物の各レーンにおいて、別の強度の９００ｂｐのバンドが存在
した（図３）。このフラグメントのクローニングおよび配列決定により、このフ
ラグメントは、ｃａｓｐ−１２と類似性を含まないことが示され、そしてｃａｓ
ｐ−１２ゲノムクローンにハイブリダイズしなかった。このことは、このバンド
が異なる遺伝子座から増幅されたことを示す。

【００８３】（実施例３）（ｃａｓｐ−１２ｃＤＮＡの過剰発現が哺乳動物細胞においてアポトーシス
を誘導する）カスパーゼ−１２の発現がアポトーシスを誘導するか否かを試験するために、
一過性の発現系を使用して、哺乳動物細胞においてカスパーゼ−１２を過剰発現
させた。Ｅ．ｃｏｌｉｌａｃＺと融合したＩＣＥ、ｃａｓｐ−２およびｃａｓ
ｐ−１１の発現構築物を首尾良く使用して、これらのＩＣＥファミリーのメンバ
ーの発現がアポトーシスを誘導することが、実証されている（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．
ら、Ｃｅｌｌ７５：６５３−６６０（１９９３）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌ
ｌ７８：７３９−７５０（１９９４）；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７１：２０５８０−２０５８７（１９９６））。トランスフェクトさ
れた細胞は、ｌａｃＺのβ−ガラクトシダーゼ活性により、Ｘ−ｇａｌで染色す
ることによって容易に検出される。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ
ーを含むｐｃＤＮＡ３ベクター中のｌａｃＺ遺伝子と融合したｃａｓｐ−１２Ｌ
およびｃａｓｐ−１２Ｓの発現構築物を、作製した。これらの発現構築物をトラ
ンスフェクションによりＲａｔ−１細胞に導入し、そしてこの遺伝子の発現を、
トランスフェクションの２４時間後にＸ−ｇａｌ反応を用いて試験した。

【００８４】（方法）（プラスミドの構築）ｐＮＢ６内の長形態のカスパーゼ−１２ｃＤＮＡ（ｃａｓｐ−１２Ｌ）を、
ＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）お
よび以下のプライマー：上流、５’−ＣＴＣＧＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＧ
ＧＣＣＡＧＧＡＧＧＡＣＡＣＡＴＧ−３’（配列番号２０）；およ
び下流、５’−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＡＡＧ
ＧＴＡＧ−３’（配列番号２１）を用いて増幅した。この増幅されたフラグメ
ントを、ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いでｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩＳＫ（−）（ｐＢＳＩ９５）にクローニングした。ｐＢＩ９５Ｚを、ｌ
ａｃＺのＢａｍＨＩフラグメント（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ７５：６５
３−６６０（１９９３））をｐＢＳＩ９５に挿入するすることによって作製した
。ｃａｓｐ−１２−ｌａｃＺ融合遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩを用いてｐ
ＢＩ９５Ｚから切断し、そしてＫｐｎＩおよびＸｂａＩで消化したｐｃＤＮＡ３
ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に挿入し、ｐＮＢ１５を作製した。ｐｃＤＮ
Ａ３ベクター中の発現構築物ｐＮＢ１６（短形態のカスパーゼ−１２ｃＤＮＡ
（ｃａｓｐ−１２Ｓ）とｌａｃＺとの融合物）は、ｐＮＢ６の代わりにｐＮＢ７
をＰＣＲのための鋳型として使用して、上記と同じ戦略を通して作製された。

【００８５】カスパーゼ−１２Δ（配列番号２のアミノ酸残基９５〜４１９）の発現構築物
について、ｃａｓｐ−１２Ｌの一部分を、以下のプライマー：上流、５’−ＣＴ
ＣＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＴ
ＡＣ−３’（配列番号２２）；および下流、５’−ＣＴＣＧＴＣＧＡＣ
ＣＣＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２
３）を用いたＰＣＲにより増幅した。この上流プライマーは、人工的開始コドン
であるＡＴＧを含む。この増幅されたフラグメントを、ＫｐｎＩ／ＳａｌＩで消
化し、そしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（−）ベクター中のｌａｃＺと
融合した。ｃａｓｐ−１２Δ−ｌａｃＺ融合遺伝子を、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ
を用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベースのプラスミドから切り出し、そしてｐｃ
ＤＮＡ３ベクターのＫｐｎＩ／ＸｂａＩ部位に挿入した。

【００８６】（細胞培養および一過性トランスフェクション）Ｒａｔ−１、ラット胚線維芽細胞、ＮＧ１０８−１５、ＨｅＬａおよびＣＯＳ
−１を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）および
５０単位／ｍｌのペニシリンおよび５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉ
ｇｍａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地において、５％ＣＯ₂、３７℃での
培養で維持した。トランスフェクションの前の日に、細胞を１．３×１０⁴細胞
／ｃｍ²の密度で播種した。発現構築物を、以前に記載されるようにリン酸カル
シウムまたはリポフェクタミン（ＧＩＢＣＯＢＲＬ）のいずれかで細胞に移入し
た（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ７５：６５３−６６０（１９９３）；Ｋｕ
ｍａｒ，Ｓ．ら、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ８：１６１３
−１６２６（１９９４）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９−７５０
（１９９４））。細胞におけるキメラ遺伝子の発現を、以前に記載されるように
、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルβ−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ｇａｌ
）を用いて細胞を染色することによって検出した（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌ
ｌ７５：６５３−６６０（１９９３）；Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、Ｇｅｎｅｓａ
ｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ８：１６１３−１６２６（１９９４）；Ｗａｎ
ｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９−７５０（１９９４））。トランスフェク
トされた細胞の免疫染色を、マウスモノクローナル抗ｌａｃＺ抗体を用いて以前
に記載されるように行った（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ７５：６５３−６
６０（１９９３）；Ｋｕｍａｒ，Ｓ．ら、ＧｅｎｅｓａｎｄＤｅｖｅｌｏｐ
ｍｅｎｔ８：１６１３−１６２６（１９９４）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９−７５０（１９９４））。

【００８７】ｃａｓｐ−１２−ｌａｃＺ融合構築物でトランスフェクトされたＸ−ｇａｌ陽
性細胞の半分よりも多くは丸く、そしてｌａｃＺのみでトランスフェクトされた
健常なＸ−ｇａｌ陽性細胞より小さい。このような細胞の大きさの減少は、アポ
トーシス細胞特有の特徴である（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ７５：６５３
−６６０（１９９３）；Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３６１
：３６５−３６９（１９９３））。ｃａｓｐ−１２の過剰発現がアポトーシスを
もたらすことを確認するために、ｃａｓｐ−１２の発現により誘導される細胞死
の核形態を、抗β−ガラクトシダーゼ抗体およびＨｏｅｃｈｓｔｄｙｅ３３
２５８を用いてＲａｔ−１細胞をトランスフェクトしたｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌａ
ｃＺを染色することにより試験した。ｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌａｃＺでトランスフ
ェクトされたβ−ガラクトシダーゼ陽性の丸い細胞は、アポトーシスを受けてい
る細胞の特徴である、縮合かつ断片化した核を有した（図４Ａおよび４Ｂ）。

【００８８】Ｒａｔ−１細胞においてカスパーゼ−１２Ｌおよびカスパーゼ−１２Ｓにより
誘導される細胞死の割合は、約６０％である（図４Ｃ）。ラット胚線維芽細胞の
初代培養をもちいた場合、同様の結果が得られた。トランスフェクトされたラッ
ト胚線維芽細胞の約６０％が丸くかつ小さかった（図４Ｃ）。従って、ｃａｓｐ
−１２の過剰発現は、樹立された細胞株および初代細胞の両方の細胞死を引き起
こす。しかし、ｃａｓｐ−１２のアポトーシス活性は、ＩＣＥおよびｃａｓｐ−
２のアポトーシス活性より弱い。なぜならば、ＩＣＥおよびｃａｓｐ−２の過剰
発現は、９０％を超える細胞に死をもたらしたからである（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら
、Ｃｅｌｌ７５：６５３−６６０（１９９３）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ
７８：７３９−７５０（１９９４））。並行実験において（図４Ｃ）、Ｒａｔ
−１細胞の同じ培養物は、ＩＣＥの過剰発現により効率よく殺傷された（Ｍｉｕ
ｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ７５：６５３−６６０（１９９３））。

【００８９】カスパーゼファミリーのＮ末端プロドメインは、前駆体タンパク質のタンパク
質分解性活性を調節する役割を有し得、そしてプロドメインの除去が、しばしば
より高い活性において生じる（Ｙｕａｎ，Ｊ．ら、Ｃｅｌｌ７５：６４１−６
５２（１９９３）；Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３５６
：７６８−７７４（１９９２）；Ｄｕａｎ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２７１：１６２１−１６２５（１９９６））。カスパーゼ−１２とカスパーゼフ
ァミリーの他のメンバーとの配列相同性に基づき、カスパーゼ−１２ＬのＡｓｐ
９４−Ｇｌｙ９５を、可能な切断部位として同定した（図１Ｂ）。カスパーゼ−
１２のプロドメインがカスパーゼ−１２の細胞殺傷活性を減少させる阻害的機能
を有し得る可能性を試験するために、Ｇｌｙ９５−Ａｓｎ４１９（カスパーゼ−
１２Δ）がｌａｃＺ配列に融合されたままである、カスパーゼ−１２Ｌの最初の
９４アミノ酸を欠く発現構築物を、作製した。このｃａｓｐ−１２Δ−ｌａｃＺ
融合構築物を、Ｒａｔ−１細胞にトランスフェクトし、そして細胞殺傷の効率を
Ｘ−ｇａｌ染色により試験した。短縮型構築物は、カスパーゼ−１２Ｌおよびカ
スパーゼ−１２Ｓの細胞殺傷活性に匹敵する細胞殺傷活性を示した（６０％の細
胞死、図４Ｃ）。従って、カスパーゼファミリーの他のメンバーのプロドメイン
とは異なり（Ｄｕａｎ，Ｈ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６２１−
１６２５（１９９６））、カスパーゼ−１２のプロドメインは、カスパーゼ−１
２のアポトーシス活性に対して阻害的に機能しないようである。カスパーゼ−１
２の相対的に低い細胞殺傷活性は、プロドメインの阻害に起因するよりもむしろ
カスパーゼ−１２タンパク質に固有であるようである。この結果はまた、カスパ
ーゼ−１２タンパク質のＧｌｙ９５〜Ａｓｎ４１９部分がその殺傷活性を示すの
に十分であることを示す。

【００９０】全長のカスパーゼ−１２または短縮型カスパーゼ−１２Δ ｃＤＮＡのいずれ
かの過剰発現により誘導されるアポトーシス細胞の割合は、互いに匹敵するが、
全長カスパーゼ−１２タンパク質は、インビトロでは活性ではない。従って、イ
ンビボでのカスパーゼ−１２の成熟は、他のカスパーゼを必要とするようである
。

【００９１】（実施例４）（カスパーゼ−１２細胞傷害性に対する細胞死サプレッサーの効果）ＩＣＥ、ｃａｓｐ−２およびｃａｓｐ−１１の過剰発現により誘導される細胞
死は、ｂｃｌ−２により効果的に阻害され得る（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ
７５：６５３〜６６０（１９９３）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７
３９〜７５０（１９９４）；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７
１：２０５８０〜２０５８７（１９９６））。ｂｃｌ−２は、Ｃ．ｅｌｅｇａｎ
ｓのｃｅｄ−９遺伝子の哺乳動物ホモログであり、これは、蠕虫における細胞死
サプレッサーである（Ｅｌｌｉｓ，Ｒ．Ｅ．ら、ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗ
ｏｆＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ７：６６３〜６９８（１９９１））。Ｃｒｍ
Ａは、ＩＣＥに対して高親和性ならびにカスパーゼ−２およびカスパーゼ−３に
対して低親和性を有するカスパーゼファミリーの差別的インヒビターである、牛
痘ウイルスによりコードされるセルピンである（Ｒａｙ，Ｃ．Ａ．ら、Ｃｅｌｌ
６９：５９７〜６０４（１９９２）；Ｋｏｍｉｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：１９３３１〜１９３３７（１９９４））。ＩＣＥおよび
カスパーゼ−１１により誘導されるがカスパーゼ−２により誘導されないアポト
ーシスは、ＣｒｍＡにより抑制され得る（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ７５
：６５３〜６６０（１９９３）；Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９〜
７５０（１９９４）；Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２
０５８０〜２０５８７（１９９６））。ｂｃｌ−２またはｃｒｍＡのいずれかの
発現は、異なる刺激により誘導される多数の細胞型のアポトーシスを妨げる（Ｍ
ｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅｌｌ．７５：６５３〜６６０（１９９３）；Ｇａｇｌｉ
ａｒｄｉｎｉ，Ｖ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６３：９７〜１００（１９９４）；
Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．およびＤｉｘｉｔ，Ｖ．Ｍ．、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２
７０：３２５５〜３２６０（１９９５）；Ｔｅｗａｒｉ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ
．Ｃｈｅｍ．２７０：２２６０５〜２２７０８（１９９５）；Ｅｎａｒｉ，Ｍ．
ら、Ｎａｔｕｒｅ３７５：７８〜８１（１９９５）；Ｌｏｓ，Ｍ．ら、Ｎａｔ
ｕｒｅ３７５：８１〜８３（１９９５）；Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：８３１８〜８３２２（１９９５））
。

【００９２】ｂｃｌ−２およびｃｒｍＡの発現が、ｃａｓｐ−１２の過剰発現により誘導さ
れるアポトーシスを阻害し得るか否かを決定するために、ｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌ
ａｃＺ融合構築物を、ｂｃｌ−２またはｃｒｍＡのいずれかを過剰発現する、Ｒ
ａｔ−１の安定な細胞株中にトランスフェクトした（Ｍｉｕｒａ，Ｍ．ら、Ｃｅ
ｌｌ７５：６５３〜６６０（１９９３））。細胞死を、上記のようにアッセイ
した（実施例３）。この結果は、ｃａｓｐ−１２の過剰発現により誘導される細
胞死は、Ｂｃｌ−２によって非常に弱く阻害され得るのみ（図５Ａ）であり、Ｃ
ｒｍＡには阻害され得ない（図５Ｂ）ことを示した。ｃａｓｐ−１２の過剰発現
の毒性に対するｂｃｌ−２抑制の強度は、およそ１０％（Ｒａｔ−１に対しては
６０％、Ｒａｔ−１／ｂｃｌ−２に対しては５０％）であり、これはＩＣＥおよ
びｃａｓｐ−２に対して観察されたものよりも非常に小さい（図５Ａ；Ｗａｎｇ
，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９〜７５０（１９９４））。統計学的分析は、
Ｂｃｌ−２によるカスパーゼ−１２の抑制が、ｔ値が０．３５で有意でないこと
を示唆する（Ｐ＜０．０５）。ＩＣＥ誘導性アポトーシスは、Ｒａｔ−１／ｃｒ
ｍＡ細胞において５０％程度まで抑制されるが（Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ
７８：７３９〜７５０（１９９４））、カスパーゼ−１２誘導性アポトーシスは
、同じ安定な細胞株で抑制されない（図５Ｂ）。

【００９３】ＣｒｍＡは、自殺基質として公知であり、このＣｒｍＡは、ＩＣＥと当モルの
複合体を形成する（Ｋｏｍｉｙａｍａ，Ｔ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
９：１９３３１〜１９３３７（１９９４））。従って、この結果は、カスパーゼ
−１２はＩＣＥサブファミリーに属し得るが、その基質特異性はＩＣＥの基質特
異性と著しく異なっていることを示す。カスパーゼファミリーに対する別のウイ
ルスインヒビターであるバキュロウイルスｐ３５は、カスパーゼ−１２の細胞殺
傷活性を効果的に抑制し得ないことが見出された（Ｎ．Ｍｏｒｉｓｈｉｍａら、
未公開データ）。ｐ３５が、ＩＣＥ、カスパーゼ−２およびカスパーゼ−３の効
果的なインヒビターであるように（Ｘｕｅ，Ｄ．、およびＨｏｒｖｉｔｚ，Ｈ．
Ｒ．、Ｎａｔｕｒｅ３７７：２４８〜２５１（１９９５））、カスパーゼ−１
２の基質特異性は、カスパーゼファミリーのメンバーの中で独特であるようであ
る。

【００９４】ＩＣＥ、ｃａｓｐ−２およびｃａｓｐ−１１とは異なり、ｃａｓｐ−１２過剰
発現の細胞傷害性は、Ｂｃｌ−２により効果的に抑制されなかった。従って、カ
スパーゼ−１２は、Ｂｃｌ−２の阻害に感受性でないアポトーシス経路を制御し
得る。Ｂｃｌ−２は、多くの環境下で細胞死の強力なインヒビターであるが、い
くつかの型の細胞死がＢｃｌ−２作用に対して抵抗性であることが示されている
。例えば、Ｆａｓ誘導性アポトーシスは、試験したいくつかの細胞型において、
Ｂｃｌ−２により阻害可能ではない（Ｍｅｍｏｎ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．１５５：４６４４〜４６５２（１９９５）；Ｓｔｒａｓｓｅｒ，Ａ．ら、
ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ１４；６１３６〜６１４７（１９９５））
。カスパーゼ−１２は、このようなＢｃｌ−２抵抗性細胞死経路に関与し得る。
あるいは、カスパーゼ−１２は、アポトーシス経路におけるＢｃｌ−２阻害の点
から下流である段階を制御し得る。この仮定は、Ｂｃｌ−２により阻害可能であ
る段階でまたはその前に、ＩＣＥ、カスパーゼ−２およびカスパーゼ−１１がア
ポトーシスを活性化し、一方カスパーゼ−１２がその段階後にアポトーシスを活
性化することを予測する。Ａｒｍｓｔｒｏｎｇら（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ｒ．Ｃ
．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１６８５０〜１６８５５（１９９６）
）は、Ｂｃｌ−２がプロカスパーゼ−３プロセシングを妨げることを示した。従
って、カスパーゼ−３により活性化される下流のエフェクターは、Ｂｃｌ−２に
非感受性であるようである。この証拠は、プロカスパーゼ−１２がカスパーゼ−
３により切断され得、一方カスパーゼ−１２は、試験した他のカスパーゼを効果
的に切断し得ないことを示す。

【００９５】（実施例５）（カスパーゼ−１２細胞傷害性の細胞型特異性）カスパーゼ−１２の細胞傷害性効果は、細胞型特異性を提示した。ｃａｓｐ−
１２Ｌ−ＬａｃＺ構築物を、ＮＧ１０８−１５、ＨｅＬａおよびＣＯＳ−１細胞
にトランスフェクトし、そしてカスパーゼ−１２が腫瘍細胞株およびＲａｔ−１
線維芽細胞株を殺傷するか否かを観察するために、細胞殺傷効果をアッセイした
。この結果は、これらの腫瘍細胞株がｃａｓｐ−１２Ｌ発現により誘導されるア
ポトーシスに抵抗性があることを示した（図６）。ＣＯＳ−１細胞は、ＳＶ４０
を用いてサル腎臓細胞を形質転換することによって樹立され（Ｇｌｕｚｍａｎ，
Ｙ．Ｃｅｌｌ２３：１７５〜１８２（１９８１）、そしてＩＣＥおよびｃａｓ
ｐ−２の過剰発現により誘導されるアポトーシスに抵抗性である（Ｗａｎｇ，Ｌ
．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９〜７５０（１９９４））。しかし、神経芽細胞腫
／神経膠腫ハイブリッド細胞株ＮＧ１０８−１５細胞およびＨｅＬａ細胞は、Ｉ
ＣＥおよびｃａｓｐ−２の過剰発現により誘導されるアポトーシスに感受性であ
る（Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７３９〜７５０（１９９４））。Ｉｃ
ｅ−ｌａｃＺ構築物を使用するコントロール実験は、ＩＣＥの過剰発現が同じ実
験条件下で両方の腫瘍細胞株のアポトーシスを効果的に誘導したことを示した（
ＮＧ１０８−１５に関しては約７０％の死んだ細胞およびＨｅｌａについては９
０％）。これらの結果は、カスパーゼ−１２の活性を誘導するアポトーシスがＩ
ＣＥおよびカスパーゼ−１２の形質転換状態よりも細胞の形質転換状態により感
受性であり得ることを示唆する。

【００９６】カスパーゼ−１２は、その細胞型特異性のためにカスパーゼの中で独特である
；線維芽細胞は、その過剰発現に感受性であり、一方試験した腫瘍細胞株は、抵
抗性である。従って、ｃａｓｐ−１２の１つの使用は、線維芽細胞を特異的に殺
傷することであり得る。カスパーゼ−１２殺傷活性のスペクトルは、細胞死の調
節機構に関与し得る。１つの可能性は、カスパーゼ−１２が示す作用スペクトル
が細胞形質転換に関する差異にどうも関与するということである。腫瘍細胞は、
カスパーゼ−１２の基質またはアクチベーターのいずれかを欠損し得るか、ある
いは腫瘍細胞は、カスパーゼ−１２の特異的インヒビターを有し得る。今や十分
に認識される腫瘍形成の局面は、細胞が腫瘍増殖の間にアポトーシスを受ける能
力を損なうということである（Ｓｙｍｏｎｄｓ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ７８：７０
３〜７１１（１９９４）；Ｗｈｉｔｅ，Ｅ．、Ｎａｔｕｒｅ３７１：２１〜２
２（１９９４）；Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．Ｅ．、Ｃｅｌｌ７８：５３９〜５４２（
１９９４））。従って、カスパーゼ−１２と相互作用するタンパク質の同定は、
重要であり、そしてアポトーシスおよび腫瘍形成の両方へのさらなる洞察を提供
し得る。

【００９７】（実施例６）（カスパーゼ−１２のインビトロでの切断）最近のデータは、カスパーゼの秩序だった活性化を示唆する（Ｅｎａｒｉ，Ｍ
．ら、Ｎａｔｕｒｅ３８０：７２３〜７２５（１９９６））。カスパーゼ−１
２タンパク質がカスパーゼファミリーの他のメンバーに対する基質であるか否か
を試験するために、［³⁵Ｓ］−標識カスパーゼ−１２前駆体を、カスパーゼファ
ミリーのメンバーを含有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ溶解液とインキ
ュベートした。

【００９８】（方法）（プラスミド構築）ｃａｓｐ−１２Ｌを、以下のプライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：上流
、５’−ＣＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＴＧＧＣＧＧＣＣＡＧＧＡＧ
ＧＡＣＡＣＡＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＣ−３’（配列番号２４）；お
よび下流、５’−ＣＴＣＧＴＣＧＡＣＣＣＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡ
ＡＡＡＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２５）。Ｃａｓｐ−１２Δを、以下の
プライマーを用いてＰＣＲにより増幅した：上流、５’−ＣＴＣＧＧＴＡＣ
ＣＡＴＧＧＧＡＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＣ−３’（
配列番号２２）；および下流、５’−ＣＴＣＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＴ
ＣＣＣＧＧＧＡＡＡＡＡＧＧ−３’（配列番号２６）。増幅したフラ
グメントを、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩまたはＫｐｎＩ／ＸｈｏＩのいずれかによっ
て切断して、そしてｐｃＤＮＡ３中にクローニングした。

【００９９】（インビトロでの切断）ＩＣＥ、ｃａｓｐ−２およびｃａｓｐ−３を、ｐＥＴ−１５ｂベクター（Ｎｏ
ｖａｇｅｎ）中にクローニングして、そしてそれらの発現を、０．２〜０．３ｍ
ＭＩＰＴＧの存在下で誘導した（Ｗａｎｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．２７１：２０５８０〜２０５８７（１９９６）；Ｃｒｙｎｓ，Ｖ．Ｌ．ら、Ｊ
．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１２７７〜３１２８２（１９９６））。ＩＣ
Ｅ様プロテアーゼを含有する細菌溶解液を、記載されたように調製した（Ｗａｎ
ｇ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２０５８０〜２０５８７（１９
９６）；Ｃｒｙｎｓ，Ｖ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１２７
７〜３１２８２（１９９６））。［³⁵Ｓ］−標識タンパク質を、ＴＮＴ結合化網
状赤血球ライセート系（Ｐｒｏｍｅｇａ）および［³⁵Ｓ］メチオニン（Ａｍｅｒ
ｓｈａｍ）を使用して、インビトロでの転写および翻訳により調製した。標識し
たタンパク質を、精製したカスパーゼ−１２Δ２と３７℃でインキュベートする
か、またはカスパーゼファミリーメンバーを含有するＥ．ｃｏｌｉ溶解液と３０
℃でインキュベートした。この反応混合物は、５ｍＭＥＤＴＡ、５ｍＭジチ
オトレイトール、１０％スクロース、１０μｇ／ｍｌロイペプチンおよび２
５０μＭフェニルメチルスルホニルフッ化物を含有する２５ｍＭＨｅｐｅｓ
（ｐＨ７．５）を含んだ。切断反応に使用したタンパク質の量は、部分的に精
製したカスパーゼ−１２Δ２については０．１μｇ、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解液につい
ては２５〜７０μｇであった。カスパーゼ−１２Δ２をチオール試薬で不活性化
するために、精製したカスパーゼー１２Δ２を、１ｍＭ５，５’−ジチオ−ビ
ス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）と２５℃で６０分間、または２ｍＭヨ
ードアセアミド（ｉｏｄｏａｃｅａｍｉｄｅ）と０℃で６０分間のいずれかで、
還元剤（例えば、ジチオトレイトール）の非存在下で予めインキュベートして、
続いてこの酵素溶液を、［³⁵Ｓ］−標識タンパク質との反応のために使用した。
ＤＴＮＢを使用する阻害実験については、ジチオトレイトールを、反応混合物か
ら取り除いた。ペプチドインヒビターであるＹＶＡＤ−ＣＨＯ（Ｔｈｏｒｎｂｅ
ｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３５６：７６８〜７７４（１９９２））お
よびＤＥＶＤ−ＣＨＯ（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３７
６：３７〜４３（１９９５））を、ＰｅｐｔｉｄｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅＩｎ
ｃ．（Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）から購入した。切断産物を、１０％ＳＤＳポリ
アクリルアミドゲルまたは１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルいずれかの電気
泳動により分析した。タンパク質の検出を、以前に記載されたように、ＥＮＬＩ
ＧＨＴＮＩＮＧ溶液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を使用して、
フルオログラフィー（ｆｌｕｏｒｏｇｒａｐｈｙ）により実行した（Ｃｒｙｎｓ
，Ｖ．Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：３１２７７〜３１２８２（１
９９６））。

【０１００】カスパーゼ−２およびカスパーゼ−３は、プロカスパーゼ−１２タンパク質を
切断して、約４０ｋＤａのより小さなフラグメントを生成することが見出された
（図７）。従って、カスパーゼ−１２の前駆体形態は、いくつかのカスパーゼの
基質であり得る。これらのプロテアーゼの中で、カスパーゼ−３が注目された。
なぜなら、プロカスパーゼ−１２における推定プロセシング部位（Ａｓｐ₉₁Ｇｌ
ｕ₉₂Ａｓｐ₉₃Ａｓｐ₉₄／Ｇｌｙ₉₅）は、カスパーゼー３の切断についてのコンセ
ンサス配列、ＤＸＸＤ（配列番号３０）に適合するからである；Ｎｉｃｈｏｌｓ
ｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３７６：３７〜４３（１９９５））。カスパ
ーゼ−３によるこの部位でのカスパーゼ−１２前駆体の切断は、３８ｋＤａのフ
ラグメントを生成し、この大きさは、カスパーゼ−３を用いた切断実験で観察さ
れたフラグメントの大きさに匹敵する。カスパーゼ−２は、ＤＸＸＤ（配列番号
３０）配列に優先性を有し、一方その切断効率はまた、Ｐ５残基に依存し、この
ことはこの酵素をカスパーゼファミリーの中で独特にする（ＶａｎｄｅＣｒ
ａｅｎ，Ｍ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ４０３：６１〜６９（１９９７）
）。カスパーゼ−２によるプロカスパーゼ−１２の切断は、カスパーゼー３消化
と比較して、低い切断効率でおよそ４０ｋＤａのフラグメントを生成した。

【０１０１】カスパーゼ−３がＡｓｐ９４とＧｌｙ９５との間のペプチド結合を切断するか
否かを試験するために、カスパーゼ−１２Δのインビトロでの切断を試みた。ｃ
ａｓｐ−１２Δを、人工的な開始コドンを有するｐｃＤＮＡ３ベクター中にクロ
ーニングした。図７は、短縮型形態がカスパーゼー３の消化によりプロカスパー
ゼ−１２から生成したフラグメントと大きさが同一であることを示す。短縮型形
態のカスパーゼ−３処理は、いずれのより小さいフラグメントをも生成しなかっ
た。これらの結果は、この短縮型タンパク質がカスパーゼ−３に対する切断部位
を含まないこと、そしてカスパーゼ−３がＡｓｐ９４とＧｌｙ９５との間を切断
するようであることを示唆する。

【０１０２】カスパーゼ−１２は、カスパーゼファミリーの他のメンバー（カスパーゼ−２
、カスパーゼ−３）により切断され得る。カスパーゼ−１２のＮ末端部分（Ｍｅ
ｔ１〜Ａｓｐ９４）の除去は、カスパーゼ−１２がＥ．ｃｏｌｉ中に発現された
場合、短縮型タンパク質の自己プロセシングを生じた。これらの結果は、カスパ
ーゼ−１２が、Ｎ末端プロドメインの除去を介して、インビボでカスパーゼ−３
（または、カスパーゼ−３様プロテアーゼ）によって活性化され得る可能性を示
唆する。しかし、カスパーゼ−３の作用により生成されたカスパーゼ−１２の３
８ｋＤａフラグメントは、さらにプロセシングされなかった。ＩＣＥの自己プロ
セシングは、特定の条件下で生じる（Ｒａｍａｇｅ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃ
ｈｅｍ．２７０：９３７８〜９３８３（１９９５））。

【０１０３】（実施例７）（組換えカスパーゼ−１２のプロテアーゼ活性）カスパーゼ−１２の酵素学的特性を研究するために、カスパーゼ−１２ｃＤ
ＮＡを、タンパク質産生のためにＥ．ｃｏｌｉ中で発現させた。

【０１０４】（方法）（プラスミド構築）ヒスチジンタグ化タンパク質の産生のために、ｃａｓｐ−１２Δを、原核生物
発現ベクターであるｐＲＳＥＴ−Ａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に挿入した。使
用したプライマーは：上流、５’−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＧＧＡＣＣＴ
ＣＡＧＡＡＧＡＴＡＴＧＴＡＣ−３’（配列番号２７）；および下流、
５’−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＴＴＣＣＣＧＧＧＡＡＡＡ
ＡＧＧＴＡＧ−３’（配列番号２８）であった。増幅したフラグメントを、
ＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＲＳＥＴ−Ａ（これは、Ｎ末端ヒスチジンタグを
コードする）のＢａｍＨＩ部位中に挿入した。同様に、カスパーゼ−１２Δ２（
配列番号２のアミノ酸残基１４５〜４１９）についての細菌発現プラスミドを、
別の上流プライマー、５’−ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧ
ＣＴＴＴＧＴＣＣＡＣＧ−３’（配列番号２９）を使用することによっ
て構築した。

【０１０５】（組換えカスパーゼ−１２タンパク質の産生）ｃａｓｐ−１２Δおよびｃａｓｐ−１２Δ２を、ｐＲＳＥＴ−Ａベクター（Ｉ
ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、そして得られたプラスミドを、Ｅ．
ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ中に導入した。ヒスチジンタグ化タンパ
ク質の産生を、０．１ｍＭイソプロピル−１−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド（ＩＰＴＧ）により誘導して、そしてこのタンパク質を、製造業者のプロト
コルに従って、ｐＥＴ系（Ｎｏｖａｇｅｎ）で精製した。精製したタンパク質を
、１００ｍＭＮａＣｌおよび５０％グリセロールを含有する５０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）中で−８０℃で貯蔵した。Ｎ末端の配列決定を、Ａｐ
ｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４７３Ａｐｒｏｔｅｉｎｓｅｑｕｅｎ
ｃｅｒを用いて、Ｍａｔｓｕｄａｉｒａ（ＬｅＧｅｎｄｒｅ，Ｎ．およびＭａｔ
ｓｕｄａｉｒａ，Ｐ．、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：１５４〜１５９（１
９８８））の方法に従って行った。

【０１０６】Ｅ．ｃｏｌｉから発現され、そして精製した全長のカスパーゼ−１２タンパク
質は、インビトロではプロセシングおよびプロテアーゼ活性のいずれもなく安定
であった。従って、短縮型カスパーゼ−１２ｃＤＮＡ（Ｇｌｙ９５〜Ａｓｎ４
１９）に対応するカスパーゼ−１２Δ）を、Ｎ末端プロドメインコード領域の除
去およびそのＮ末端をＨｉｓに富む配列でタグ化した後に、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発
現させた。Ｅ．ｃｏｌｉからのＨｉｓタグ化カスパーゼ−１２Δタンパク質（お
よそ４２ｋＤａ（４．２ｋＤａのタグ部分を含む））を部分的に精製した。この
精製したタンパク質は、４２ｋＤａ、１７ｋＤａおよび１０ｋＤａの３つのポリ
ペプチドからなっていた（図８Ａ）。これらのポリペプチド鎖の小配列決定（ｍ
ｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｅｉｎｇ）は、４２ｋＤａのポリペプチドがＮ末端のＨ
ｉｓタグを含むことを示し、このことは、４２ｋＤａのポリペプチドがカスパー
ゼ−１２Δのインタクトな形態であることを示唆する。１０ｋＤａのポリペプチ
ドは、２つのポリペプチドの混合物（おおまかには当量）であり、このうちの一
方は、Ｎ末端のＨｉｓタグを有する。１０ｋＤａの他方のポリペプチドは、その
配列がカスパーゼー１２配列におけるＡｓｐ３１８の後の右から開始する、カス
パーゼ−１２Δの予測された小サブユニットである。１７ｋＤａのポリペプチド
は、Ｅ．ｃｏｌｉのＨｉｓに富むタンパク質（鉄（ＩＩ）取り込み調節タンパク
質）を夾雑していることが明らかになった。Ａｓｐ特異性を示す細菌起源のプロ
テアーゼが報告されていないので、カスパーゼ−１２タンパク質の自己プロセシ
ングは、短縮型タンパク質の精製の前またはその間のいずれかで、Ａｓｐ３１８
の位置で生じたようである。このより小さなサブユニットは、インタクトな形態
のカスパーゼ−１２Δとのその物理的会合のために、Ｎｉカラムクロマトグラフ
ィーにより得られたこともまたありそうである。

【０１０７】より小さなタグ化タンパク質（１０ｋＤａ）の存在は、別の自己プロセシング
がＧｌｙ９５からおよそ５０残基離れているＡｓｐ残基で生じる（タグを含む約
９０残基）ことを示唆する。Ｎ−末端Ｈｉｓタグは、自己プロセシングにより除
去されるので、カスパーゼ−１２のこの成熟ｐ２０サブユニットは、失われたと
推測された（図８Ｂ）。カスパーゼ−１２の成熟形態（ｐ２０およびｐ１０）を
回収するために、Ｍｅｔ１〜Ａｓｐ１４４の領域を欠いた短縮型カスパーゼ−１
２の別のバージョン（カスパーゼ−１２Δ２）を発現させた。図８Ａは、精製し
たカスパーゼ−１２Δ２が２つの主要なフラグメント（ｐ２４およびｐ１０）か
らなることを示す。ｐ２４は、Ｈｉｓタグを有し、このｐ１０のＮ末端は、小配
列決定により示されるように、Ｔｈｒ３１９から開始する配列を有した。ｐ１０
の配列は、Ａｓｐ３１８での自己プロセシングがカスパーゼ−１２Δ２およびカ
スパーゼ−１２Δにおいて再度生じたことを示す（図８Ｂ）。精製したタンパク
質のサブユニット組成（２つのポリペプチド）および大きさ（４．２ｋＤａのＨ
ｉｓに富む配列とタグ化した２０ｋＤａサブユニットおよび１０ｋＤａの他のサ
ブユニット）は、２０ｋＤａおよび１０ｋＤａのサブユニットからなるＩＣＥの
成熟形態と類似している。

【０１０８】Ｈｉｓタグ化カスパーゼ−１２組換えタンパク質を、インビトロでカスパーゼ
ファミリーの他のメンバーと共にインキュベートして、カスパーゼ−１２がこれ
らのプロ酵素を切断し得るか否かを決定した。試験したカスパーゼファミリーの
メンバーの中でも、カスパーゼ−１２Δ２は、プロカスパーゼ−１２（４８ｋＤ
ａ）をフラグメントに効率的に処理し得る。インタクトなプロカスパーゼ−１２
の消失とともに、カスパーゼ−１２Δ２による約３５ｋＤａおよび１３ｋＤａの
フラグメントを生成した（図８Ｃ）。［³⁵Ｓ］−標識カスパーゼ−１２Δを、活
性なカスパーゼ−１２Δ２と共にインキュベートした場合、この３８ｋＤａのポ
リペプチドを、２６ｋＤａのフラグメントおよび１３ｋＤａのフラグメントに切
断した（図８Ｃ）。従って、短縮型ポリペプチドは、カスパーゼ−１２Δ２をＮ
末端２６ｋＤａおよびＣ末端１３ｋＤａに分割する主要な切断部位を含む。

【０１０９】しかし、プロＩＣＥ、プロカスパーゼ−２およびプロカスパーゼ−３を含むフ
ァミリーの他のメンバーは、組換えカスパーゼ−１２Δ２に抵抗性であった。な
ぜなら、切断産物のかすかなバンドのみが、同じ時間の間（図８Ｃ）またはより
長い時間の間（３ｈｒ）での、カスパーゼ−１２Δ２とのインキュベーション後
に現れるからである。カスパーゼ−１２Δ２切断に対するＩＣＥ、カスパーゼ−
２およびカスパーゼ−３の抵抗性は、これらのプロテアーゼがインビボでカスパ
ーゼ−１２に対する基質ではないようであるということを示唆する。

【０１１０】カスパーゼ−１２Δ２によるプロカスパーゼ−１２の切断は、チオール試薬に
より阻害された。５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）またはヨード
アセトアミドのいずれかでのカスパーゼ−１２Δ２の前処理は、そのタンパク質
分解活性を完全に阻害した。この結果は、カスパーゼ−１２がシステインプロテ
アーゼであることを実証する。一方、カスパーゼ−１２切断活性は、１０μＭま
でのＹＶＡＤ−ＣＨＯ（ＩＣＥに優先的なペプチドインヒビター（Ｔｈｏｒｎｂ
ｅｒｒｙ，Ｎ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３５６：７６８〜７７４（１９９２））
、または１０μＭまでのＤＥＶＤ−ＣＨＯ（ＣＰＰ３２に優先的なペプチドイン
ヒビター（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３７６：３７〜４
３（１９９５））により阻害され得ない。この結果と一貫したのは、精製したカ
スパーゼ−１２Δ２が、それぞれＩＣＥおよびカスパーゼ−３に対する好ましい
基質である、プロＩＬ−１βおよびポリ（ＡＤＰリボース）ポリメラーゼの切断
に対してほとんど活性を示さなかったことである。これらのデータは、カスパー
ゼ−１２成熟タンパク質の基質特異性が公知のカスパーゼの中でも独特であるこ
とを示唆する。従って、カスパーゼ−１２およびｃａｓｐ−１２の短縮形態（例
えば、ｃａｓｐ−１２Δ２）の１つの使用は、ポリペプチドマッピングのために
タンパク質を特異的に切断することであり得る。

【０１１１】（実施例８）（カスパーゼ−１２をコードするＤＮＡのクローニング）カスパーゼ−１２タンパク質をコードするＤＮＡ分子を、例えば、ＤＮＡ配列
番号１またはＤＮＡ配列番号１３の配列またはアンチセンス配列に対して、スト
リンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、所望のＤＮＡ分子をハイブリ
ダイズさせることによってクローニングする。プローブ配列にハイブリダイズす
るＤＮＡ分子を選択して、そして宿主細胞中に形質転換する。カスパーゼ−１２
を発現する形質転換体を選択し、そしてクローニングする。

【０１１２】カスパーゼ−１２タンパク質をコードするＤＮＡのクローニングについての可
能性のあるハイブリダイゼーション条件の１つのセットは、以下である：１）１時間のプレハイブリダイゼーション；２）ハイブリダイゼーション緩衝液中での６５℃で一晩のハイブリダイゼーシ
ョン；および３）２×ＳＳＸ中での室温で１５分間の１回の洗浄、次いで０．１×ＳＳＣお
よび０．１％ＳＤＳ中での６０℃で３０分間の２回の洗浄。

【０１１３】（実施例９）（分子量マーカー）組換え産生されたカスパーゼ−１２タンパク質を、当該分野において慣用的な
方法（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉ
ｏｌｏｇｙ、第２巻、第１０章、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、出版社
（１９９４））により精製する。推定アミノ酸配列が公知であるので、これらの
タンパク質の分子量を正確に決定し得、そしてこのタンパク質を、ゲル電気泳動
の分子量マーカーとして使用し得る。推定アミノ酸配列に基づいて算定されたカ
スパーゼ−１２タンパク質全長の分子量は、４８ｋＤａである。

【０１１４】（実施例１０）（カスパーゼ−１２での細胞の処理）カスパーゼ−１２はプログラムされた細胞死を誘導し得るので（実施例３を参
照のこと）、カスパーゼ−１２を使用して、細胞における細胞死を調節する。こ
れは、カスパーゼ−１２ポリペプチドと細胞とを接触させることによって達成さ
れる。カスパーゼ−１２Ｌ、カスパーゼ１２Ｓ、カスパーゼ−１２Δ、またはカ
スパーゼ−１２Δ２を、この目的のために使用する。

【０１１５】本明細書中で言及された全ての技術は、参考として本開示に援用される。ここ
で、明瞭および理解の目的のための例証および実施例により本発明は十分に記載
され、特定の変更および改変が、開示された実施態様においてなされ得ることが
当業者に明らかであり、そしてこのような改変は、本発明の範囲内であることが
意図される。

【０１１６】

【表２】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ】カスパーゼ−１２ｃＤＮＡ。図１Ａは、カスパーゼ−１２のｃＤＮＡ配列（
配列番号１）および推定アミノ酸配列（配列番号２）を示す。水平方向の矢印は
、マウス胸腺ｃＤＮＡライブラリーの初回スクリーニングのために使用する縮重
ＰＣＲプライマーの位置を示す。選択的スプライシング部位を、垂直方向の矢印
で示す。ひし形は、終止コドンの位置を示す。

【図１Ｂ】カスパーゼ−１２ｃＤＮＡ。図１Ｂは、カスパーゼ−１２の選択的スプライ
シングおよびタンパク質構造の図である。それらの間のエキソンおよびイントロ
ンを、それぞれ帯および線で示す（上図）。エキソン／イントロンの境界でのヌ
クレオチドを示す。帯の上の数は、カスパーゼ−１２ＬｃＤＮＡ配列中のヌク
レオチド数に対応する。カスパーゼ−１２Ｌ（４１９残基）タンパク質とカスパ
ーゼ−１２Ｓ（３４９残基）タンパク質との概略的な比較を下に示す。前駆体タ
ンパク質の成熟のための潜在的切断部位を、その部位での残基を有する帯の下に
示す。

【図２Ａ】カスパーゼ−１２の配列アラインメント。図２Ａ〜Ｃは、以下のカスパーゼフ
ァミリーの他のメンバーとのカスパーゼ−１２タンパク質の配列アラインメント
を示す：カスパーゼ−５（配列番号４）、ｈＩＣＥ（配列番号５）、ｍＩＣＥ（
配列番号６）、カスパーゼ−１１（配列番号７）、カスパーゼ−４（配列番号８
）、カスパーゼ−５（配列番号９）、カスパーゼ−２（配列番号１０）、カスパ
ーゼ−３（配列番号１１）、およびＣＥＤ−３（配列番号１２）。カスパーゼフ
ァミリーの間でよく保存されている７つのアミノ酸残基は、アスタリスク（触媒
残基）または黒ひし形（Ｐ１結合）のいずれかで印付けられる。白ひし形は、Ｓ
２−Ｓ４サブサイトの残基を示す。

【図２Ｂ】カスパーゼ−１２の配列アラインメント。図２Ａ〜Ｃは、以下のカスパーゼフ
ァミリーの他のメンバーとのカスパーゼ−１２タンパク質の配列アラインメント
を示す：カスパーゼ−５（配列番号４）、ｈＩＣＥ（配列番号５）、ｍＩＣＥ（
配列番号６）、カスパーゼ−１１（配列番号７）、カスパーゼ−４（配列番号８
）、カスパーゼ−５（配列番号９）、カスパーゼ−２（配列番号１０）、カスパ
ーゼ−３（配列番号１１）、およびＣＥＤ−３（配列番号１２）。カスパーゼフ
ァミリーの間でよく保存されている７つのアミノ酸残基は、アスタリスク（触媒
残基）または黒ひし形（Ｐ１結合）のいずれかで印付けられる。白ひし形は、Ｓ
２−Ｓ４サブサイトの残基を示す。

【図２Ｃ】カスパーゼ−１２の配列アラインメント。図２Ａ〜Ｃは、以下のカスパーゼフ
ァミリーの他のメンバーとのカスパーゼ−１２タンパク質の配列アラインメント
を示す：カスパーゼ−５（配列番号４）、ｈＩＣＥ（配列番号５）、ｍＩＣＥ（
配列番号６）、カスパーゼ−１１（配列番号７）、カスパーゼ−４（配列番号８
）、カスパーゼ−５（配列番号９）、カスパーゼ−２（配列番号１０）、カスパ
ーゼ−３（配列番号１１）、およびＣＥＤ−３（配列番号１２）。カスパーゼフ
ァミリーの間でよく保存されている７つのアミノ酸残基は、アスタリスク（触媒
残基）または黒ひし形（Ｐ１結合）のいずれかで印付けられる。白ひし形は、Ｓ
２−Ｓ４サブサイトの残基を示す。

【図２Ｄ】カスパーゼ−１２の配列アラインメント。図２Ｄは、基質結合に関与するアミ
ノ酸残基のアラインメントを示す。カスパーゼファミリーの各メンバーのアミノ
酸残基は、以下に一文字コードにより記載される：ＩＣＥ（配列番号３１）、カ
スパーゼ−１２（配列番号３２）、カスパーゼ−１１（配列番号３３）、カスパ
ーゼ−２（配列番号３４）、カスパーゼ−３（配列番号３５）、およびＣＥＤ−
３（配列番号３６）。残基の上の数字は、ヒトＩＣＥの位置に対応する。ＩＣＥ
のＰ１活性ポケットを形成する７つの残基は、触媒作用に関与する残基（Ｈｉｓ
、Ｇｌｙ、Ｃｙｓ）および結合するための残基（Ａｒｇ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅ
ｒ）にグループ分けされる。

【図３】マウスの成体組織におけるカスパーゼ−１２のＲＴ−ＰＣＲ分析。ｃＤＮＡサ
ンプルを脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および腸から単離されたｍＲ
ＮＡから逆転写した。レーン１２Ｌは、陽性コントロールとしてカスパーゼ−１
２Ｌ（ｃａｓｐ−１２Ｌ）を使用することによるＰＣＲ産物（６１７ｂｐ）であ
る。レーン１２Ｓは、陽性コントロールとしてカスパーゼ−１２Ｓ（ｃａｓｐ−
１２Ｓ）を使用することによるＰＣＲ産物（４０７ｂｐ）である。矢印は、これ
らのカスパーゼ−１２Ｌおよびカスパーゼ−１２Ｓ特異的フラグメントを示す。
Ｍは、分子量標準として、λファージＤＮＡのＨｉｎｄＩＩＩ消化物である。Ｎ
は、陰性コントロールであり、ここではＤＮＡの鋳型をＰＣＲに使用しなかった
。

【図４Ａ】図４Ａは、カスパーゼ−１２の過剰発現により誘導される細胞死。図４Ａは、
ｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌａｃＺ構築物で一過的にトランスフェクトされ、２４時間
後に固定され、そして抗βガラクトシダーゼ抗体（左のパネル）またはヘキスト
色素３３２５８（右のパネル）で染色されたＲａｔ−１細胞を示す。ｃａｓｐ−
１２Ｌ−ｌａｃＺ融合タンパク質を発現する円形細胞は、凝縮されそして断片化
した核を示す。

【図４Ｂ】図４Ｂは、カスパーゼ−１２の過剰発現により誘導される細胞死。図４Ｂは、
コントロールｌａｃＺベクターで一過的にトランスフェクトされ、そしてＡのよ
うに処理されたＲａｔ−１細胞を示す。βガラクトシダーゼ陽性細胞における核
の形態は正常であり、そして凝縮されていない（矢印により示される）。

【図４Ｃ】図４Ｃは、カスパーゼ−１２の過剰発現により誘導される細胞死。図４Ｃは、発
現構築物でトランスフェクトされ、２４時間後に固定され、そしてＸ−Ｇａｌ溶
液で３時間染色された、Ｒａｔ−１細胞およびラット胚線維芽細胞を示す。示さ
れるこのデータは、計数した青色細胞の総数のうちの円形青色細胞のパーセンテ
ージである。各トランスフェクションにおいて、２００を超える青色細胞を、無
作為に選択し、そして計数した。Ｒａｔ−１細胞のデータは、少なくとも３つの
別々の実験から収集した。構築物は、以下を使用した：ｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌａ
ｃＺ、ｃａｓｐ−１２Ｓ−ｌａｃＺ、ｃａｓｐ−１２Δ−ｌａｃＺ、ＩＣＥ−ｌ
ａｃＺ、ｌａｃＺ。ラット胚線維芽細胞（ＲＥＦ）をまた、ｃａｓｐ−１２Ｌ−
ｌａｃＺまたはｌａｃＺのいずれかでトランスフェクトした。

【図５Ａ】カスパーゼ−１２の殺傷活性に対する細胞死抑制の効果。図５Ａは、Ｒａｔ−
１／ｂｃｌ−２（ｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌａｃＺで一過的にトランスフェクトした
ｂｃｌ−２発現の安定なトランスフェクト体）を示す。細胞死を図４Ｃに記載し
たようにアッセイした。親性細胞株（Ｒａｔ−１（図４Ｃ））のトランスフェク
ションからのデータを、比較のために図中に含む。ｌａｃＺ構築物をまた、コン
トロールとしてトランスフェクションに使用した。

【図５Ｂ】カスパーゼ−１２の殺傷活性に対する細胞死抑制の効果。図５Ｂは、Ｒａｔ−
１／ｃｒｍＡ（ｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌａｃＺで一過的にトランスフェクトしたｃ
ｒｍＡ発現のトランスフェクト体）を示す。親性細胞株（Ｒａｔ−１（図４Ｃ）
）のトランスフェクションからのデータを、比較のために図中に含む。ｌａｃＺ
構築物をまた、コントロールとしてトランスフェクションに使用した。

【図６】カスパーゼ−１２誘導細胞殺傷活性の細胞型特異性。ＮＧ１０８−１５細胞、
ＨｅＬａ細胞およびＣＯＳ−１細胞を、ｃａｓｐ−１２Ｌ−ｌａｃＺ、ｃａｓｐ
−１２Ｓ−ｌａｃＺ、ｌａｃＺまたはＩＣＥ−ｌａｃＺでトランスフェクトした
。トランスフェクト体の染色を行ない、そしてそのデータを図４Ｃのように示す
。

【図７】カスパーゼファミリーの他のメンバーによるカスパーゼ−１２のインビトロ切
断。［³⁵Ｓ］標識したカスパーゼ−１２（ｃａｓｐ−１２Ｌまたはｃａｓｐ−１
２Δのいずれか）を、他のカスパーゼ（１、ＩＣＥ；２、カスパーゼ−２；３、
カスパーゼ−３）を発現するＥ．ｃｏｌｉ溶解物とともに３０℃にて３時間イン
キュベートした。コントロールサンプル（−）を、Ｅ．ｃｏｌｉ溶解物の非存在
化でインキュベートした。

【図８Ａ】カスパーゼ−１２Δ２のプロテアーゼ活性。図８Ａは、部分的に精製したタン
パク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を示す。Δは、ｃａｓｐ−１
２Δ（配列番号２のアミノ酸残基９５〜４１９）；Δ２は、ｃａｓｐ−１２Δ２
（配列番号２のアミノ酸残基１４５〜４１９）。タンパク質を１５％のゲルで泳
動し、そしてクマシーブリリアントブルー染色により検出した。矢印は、カスパ
ーゼ−１２タンパク質由来のポリペプチドを示す。ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動のためのサンプル緩衝液の添加に伴う反応は、煮沸により停止させ
た。キロダルトンの分子サイズを左に示す。

【図８Ｂ】カスパーゼ−１２Δ２のプロテアーゼ活性。図８Ｂは、カスパーゼ−１２Δお
よびカスパーゼ−１２Δ２のプロセシング部位の図である。

【図８Ｃ】カスパーゼ−１２Δ２のプロテアーゼ活性。図８Ｃは、部分的に精製したカス
パーゼ−１２Δ２とともに（＋）か、または部分的に精製したカスパーゼ−１２
Δ２なしで（−）、３７℃にて１時間インキュベートした［³⁵Ｓ］標識されたタ
ンパク質を示す。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動のためのサンプル緩
衝液の添加に伴う反応は、煮沸により停止させた。キロダルトンの分子サイズを
左に示す。

【図９】カスパーゼ−１２Ｓ（ｃａｓｐ−１２Ｓ）の配列。カスパーゼ−１２ＳのｃＤ
ＮＡ配列（配列番号１３）および推定アミノ酸配列（配列番号１４）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 1/15 ４Ｃ０８６Ｃ０７Ｈ 21/04 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/50 1/21 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 9/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＡＦターム(参考） 4B024 AA01 BA14 CA04 DA02 DA06 EA02 EA04 GA11 HA17 4B050 CC03 DD07 LL01 4B065 AA90X AA91X AA91Y CA33 CA44 4C057 BB02 BB05 DD01 MM02 MM04 MM09 4C084 AA06 AA07 AA13 BA22 CA53 CA56 CA59 DC01 ZA011 ZA361 ZB071 ZB211 ZB261 4C086 AA04 EA16 NA20 ZA01 ZA36 ZB07 ZB21 ZB26

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】単離された核酸分子であって、以下：（ａ）図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配列（配列番号１４）を
コードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を
含む核酸分子；（ｃ）図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓのヌクレオチド配列（配列番号１３
）を含む核酸分子；（ｄ）カスパーゼ−１２Δ（配列番号２のアミノ酸残基９５〜４１９）をコー
ドするヌクレオチド配列を含む核酸分子；（ｅ）カスパーゼ−１２Δ２（配列番号２のアミノ酸残基１４５〜４１９）を
コードするヌクレオチド配列を含む核酸分子；および（ｆ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）または（ｅ）に相補的なヌクレオチド
分子を含む核酸分子、からなる群から選択される核酸分子に、少なくとも９０％同一な核酸分子。
【請求項２】前記核酸分子が、図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓのアミ
ノ酸配列（配列番号１４）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記
載の核酸分子。
【請求項３】前記核酸分子が、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１０に含まれる
ｃＤＮＡクローンによってコードされるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配列をコ
ードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】前記核酸分子が、図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓ（配列
番号１４）のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】前記核酸分子が、カスパーゼ−１２Δ（配列番号２のアミノ
酸残基９５〜４１９）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の
核酸分子。
【請求項６】前記核酸分子が、カスパーゼ−１２Δ２（配列番号２のアミ
ノ酸残基１４５〜４１９）をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記
載の核酸分子。
【請求項７】請求項１に記載の核酸分子に、ストリンジェントな条件下で
ハイブリダイズする核酸分子。
【請求項８】カスパーゼ−１２Ｓポリぺプチドをコードする、単離された
核酸分子であって、該核酸分子が、以下の工程：（ａ）核酸分子の集団を、配列番号１３のセンスヌクレオチド配列またはアン
チセンスヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズさせる工程であって
、ここで、該ハイブリダイゼーションが、ストリンジェントなハイブリダイゼー
ション条件下で行われる、工程；（ｂ）配列番号１３のセンスヌクレオチド配列またはアンチセンスヌクレオチ
ド配列を含む該核酸分子にハイブリダイズする、該集団の核酸分子を選択する工
程；および（ｃ）カスパーゼ−１２Ｓをコードする（ｂ）の核酸分子を選択する工程、を包含するプロセスによって調製される、核酸分子。
【請求項９】前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が、以
下：（ａ）予め１時間ハイブリダイズさせること；（ｂ）ハイブリダイゼーション緩衝液中で、６５℃で一晩ハイブリダイズさせ
ること；および（ｃ）室温で１５分間、２×ＳＳＣ中で一度洗浄し、次いで、６０℃で３０分
間、０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で二度洗浄すること、を包含する、請求項８に記載の単離された核酸分子。
【請求項１０】請求項１に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項１１】請求項１０に記載のベクターで形質転換された、宿主。
【請求項１２】核酸構築物であって、異種プロモーターに作動可能に連結
された、カスパーゼ−１２Ｓポリぺプチドをコードする核酸分子を含む、核酸構
築物。
【請求項１３】カスパーゼ−１２ポリぺプチドを作製するための方法であ
って、以下の工程：（ａ）請求項１に記載の核酸分子をベクターに挿入する工程；（ｂ）宿主を該ベクターで形質転換する工程；および（ｃ）該宿主を、カスパーゼ−１２ポリぺプチドの発現を誘導する条件下で培
養する工程、を包含する、方法。
【請求項１４】単離されたポリぺプチドであって、以下：（ａ）図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配列（配列番号１４）を
含む、単離されたポリぺプチド；（ｂ）ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１０に含まれるｃＤＮＡクローンによってコ
ードされるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配列を含む、単離されたポリぺプチド
；（ｃ）カスパーゼ−１２Δ（配列番号２のアミノ酸残基９５〜４１９）のアミ
ノ酸配列を含む、単離されたポリぺプチド；および（ｄ）カスパーゼ−１２Δ２（配列番号２のアミノ酸残基１４５〜４１９）の
アミノ酸配列を含む、単離されたポリぺプチド、からなる群から選択されるポリぺプチドに、少なくとも９０％同一な単離された
ポリぺプチド。
【請求項１５】前記ポリぺプチドが、図９に示されるカスパーゼ−１２Ｓ
のアミノ酸配列（配列番号１４）を含む、請求項１４に記載の単離されたポリぺ
プチド。
【請求項１６】前記ポリぺプチドが、ＡＴＣＣ寄託番号２０９７１０に含
まれるｃＤＮＡクローンによってコードされるカスパーゼ−１２Ｓのアミノ酸配
列を含む、請求項１４に記載の単離されたポリぺプチド。
【請求項１７】前記ポリぺプチドが、カスパーゼ−１２Δ（配列番号２の
アミノ酸残基９５〜４１９）のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単離さ
れたポリぺプチド。
【請求項１８】前記ポリぺプチドが、カスパーゼ−１２Δ２（配列番号２
のアミノ酸残基１４５〜４１９）のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の単
離されたポリぺプチド。
【請求項１９】細胞におけるプログラムされた細胞死を調節するための方
法であって、該細胞を請求項１４に記載のポリぺプチドと接触させる工程を包含
する、方法。
【請求項２０】線維芽細胞を選択的に殺すための方法であって、該細胞を
請求項１０に記載のベクターでトランスフェクトする工程を包含する、方法。